현대사회에 들어오면서 경제, 의료기술 및 과학기술의 발달로 평균수명이 연장됨에 따라 현대인들이 건강에 대한 관심도가 높아지고 있는 추세이다(Kim 등, 2015; Lee, 2016). 이에 따라 신체 내적의 건강뿐만 아니라 외적의 건강 및 아름다움에 관한 관심 또한 고조되고 있다(Lee, 2016; Seo, 2012). 특히 피부는 인체의 외적인 부분에서 가장 많은 부분을 차지하고 있는 조직으로 외부로부터의 물리적 및 화학적 물질과 자극에 대해 신체를 보호하는 기능을 한다(Lee와 Kim, 2007). 피부는 세월이 흘러 점차 나이가 들어가며 피부의 생리적인 기능이 감소하면서 자연적으로 노화하기 시작하지만, 과거와는 다르게 현대에 들어와 산업이 발달함에 따라 여러 환경오염인자의 노출, 그에 따른 오존층의 파괴로 인한 자외선 광량의 증가 및 스트레스 등으로 인해 피부의 탄력성을 감소시키며 피부색소를 침착시킬 뿐만이 아니라 주름이 생기는 등 피부 노화 현상을 촉진시키고 있다(Lee와 Kim, 2007). 이러한 현상의 원인은 환경적 및 유전적으로 복잡한 현상으로, 피부의 노화를 촉진하는 가장 대표적인 원인으로 직접적인 자외선의 노출이 손꼽히고 있다. 현대사회에서 산업의 발달로 환경오염인자들의 사용이 증가하면서 성층권의 오존층이 파괴되어 지상에 도달하는 자외선의 광량이 늘어나고 늘어난 수명으로 그에 따라 축적되는 자외선의 양 또한 증가하게 된다(Lee와 Kim, 2007). 다양한 자외선 중에서도 ultraviolet-B 파장 자외선은 표피와 진피 유두층의 모세혈관까지 침투하여 과도한 세포 내 활성산소종(reactive oxygen species)을 생성시켜 산화적 스트레스를 유발해 생체 내 세포나 지질 등에 산화적 손상을 입히게 되고, 결과적으로 콜라겐의 생성을 방해하고 감소시키며 엘라스틴의 결합을 변성시켜 피부의 탄력 및 견고성을 손실시킬 뿐만 아니라 주름 생성 및 색소침착 등 피부 노화를 일으킨다(Lee, 2016; Lee와 Kim, 2007).

피부 노화의 주요 원인 요소인 활성산소 생성에 의한 자유라디칼의 생성을 억제하기 위한 수단으로 합성 항산화제인 butylated hydroxyanisole(BHA), dibutyl hydroxy toluene(BHT), prostaglandin(PG) 및 천연 항산화제 ascorbic acid, polyphenol과 항산화 효소(superoxide dismutase, catalase, glutathione reductase)가 존재한다(Im, 2020; Lee 등, 2004). 그 외에도 다양한 방법들이 존재하지만 최근에는 합성 화합물의 부작용과 독성으로 인한 논란으로 소비자들이 부작용이 없이 안전하고 건강하며 생리활성이 높은 천연 소재를 활용한 제품에 선호도가 증가하고 있다(Im, 2020). 또한 산화작용에 의해 발생하는 활성산소는 피부 균형을 손상시켜 산화적 스트레스가 생기게 하고, 이것은 생체 구성 성분들을 손상시켜 주름 생성, 탄력감소 등의 피부노화 등을 유발한다(Hong, 2009). 피부노화 억제에 관해서는 식물에 함유된 flavonoid와 같은 폴리페놀 화합물에 의해 주름 유발 효소인 collagenase나 elastase를 억제하여 주름 발생을 억제하는 연구가 진행되고 있다(Lee 등, 2020).

현재 기능성 화장품은 본래 화장품의 기능인 피부 보호와 단순 외적 아름다움을 위한 목적 이외에 피부미백, 주름개선, 자외선 차단 및 노화 방지 등 새로운 기능을 추가하면서 피부를 더욱더 안전하고 건강하게 유지시켜주는 기능성 화장품 제품이 발전되었다(Choo, 2001; Lee, 2016). 소비자들 역시 건강한 아름다움과 노화 방지에 관한 관심이 높아짐에 따라 기능성 화장품에 대한 요구와 수요가 늘어나면서 기능성 화장품의 생산량은 매년 증가하고 있는 경향이며(Lee, 2016; Lee 등, 2020), 천연 소재를 이용한 기능성 화장품 제품의 연구가 계속 진행되고 있다(Han, 2013; Kim, 2016).

이팝나무(Chionanthus retusa)는 물푸레나무과에 속하는 다년생 낙엽교목으로 국내에서는 제주도를 비롯하여 남부지방, 중부지방에서 자생하고 국외에서는 일본, 중국, 대만 등에서 자생한다(Lee, 2004; Lee 등, 2004). 이팝나무의 어린잎은 나물로 무쳐 먹거나 차로 끓여 식용되며, 이외에도 공업용 염료재, 건위 및 중풍, 치매 등의 질병에 대한 약용, 해열제 및 이뇨제로 일상생활 속 다양한 분야에서 사용되고 있다(Lee, 2004). 또한 이팝나무 잎과 관련한 연구는 잎의 일반성분에서는 수분이 가장 많이 함유되었으며, 무기성분에서는 Ca, K가 다른 무기성분들보다 높은 함량을 보였다고 보고(Lee, 2004)하였으나 이팝나무의 화장품 원료화를 시도한 연구는 거의 없는 실정이다.

따라서 본 연구에서는 이팝나무 잎 추출물을 이용하여 total phenolic 함량, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거능, elastase와 collagenase 억제 효과를 측정하여 항산화능과 주름개선 효과를 알아보고 이팝나무 잎의 천연 화장품 소재로써의 적용 가능성을 확인하고자 하였다.

실험 재료

본 실험에 사용된 시료는 이팝나무 잎으로, 경북대학교에서 재배하고 있는 이팝나무(Chionanthus retusa)의 잎을 채취하였으며, 채취한 이팝나무 잎은 건조기(FO-600M, Jeio Tech)를 이용하여 50°C에서 열풍 건조하였다. 건조물은 분쇄기(RT-08, Mill Tech)를 이용하여 40 mesh로 분쇄하고 밀폐용기에 담아 4°C 시료용 냉장고에서 보관하며 실험에 사용하였다.

이팝나무 잎 추출물 제조

열수 추출물의 경우 이팝나무 잎 분말 1 g을 증류수 200 mL에 넣고 100 mL가 될 때까지 가열교반기(SMHS-3, Daihan Scientific)에서 250°C로 설정하여 가열하고 상온까지 식혀주었다. 에탄올 추출물의 경우 10~100%의 에탄올 100 mL에 이팝나무 잎 분말 1 g을 각각 첨가하였다. 식힌 열수 추출물과 10~100%의 에탄올 추출물을 24시간 동안 shaking incubator에서 200 rpm으로 진탕배양하여 추출한 다음, Whatman No. 1 filter paper(Whatman Inc.)를 이용하여 여과하였다. 여과된 추출물들은 4°C에서 냉장 보관하며 total phenolic content(TPC)와 DPPH 라디칼 소거능과 주름개선 효과 등을 측정하기 위해 사용하였다. 화장품 제조를 위한 추출물의 제조는 열수 추출물과 에탄올 추출물을 대상으로 각각 제조하였으며, 잎 분말에 중량 대비 50배의 추출용매를 첨가하여 4°C에서 24시간 진탕 추출하고 여과한 후 농축하였다. 화장품 제조에는 농축물을 동결건조하여 제조된 분말 고형분을 사용하였다.

TPC 측정

이팝나무 잎 열수 및 에탄올 추출물에 함유된 TPC의 함량은 Folin과 Denis의 방법(1912)에 준하여 시행하였다. 시험관에 에탄올 1 mL, 증류수 5 mL, 1 N Folin reagent 0.5 mL와 이팝나무 잎 추출물 1 mL를 넣은 후 교반시켰다. 5% Na₂CO₃ 1 mL를 넣어 다시 교반하고 암실에서 1시간 동안 반응시킨 후, 725 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 gallic acid를 이용한 표준곡선에 대입하여 추출물의 TPC의 함량을 정량하였다.

DPPH 라디칼 소거능 측정

이팝나무 잎이 함유된 열수 및 에탄올 추출물의 항산화 작용을 확인하기 위해 DPPH 라디칼 소거능을 Blois 방법(1958)에 따라 측정하였다. 열수 및 60% 에탄올 추출 고형분을 모두 50, 100, 150, 200 μg/mL의 농도로 시료를 준비한 다음 시료 1 mL에 60 μM DPPH 3 mL를 넣어주었으며 대조구에는 증류수 1 mL에 60 μM DPPH 3 mL를 넣어주었다. 이후 교반기로 교반해 주고 15분간 암실에서 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로는 합성항산화제인 BHT를 사용하여 양성대조군으로 비교하였다. 라디칼의 소거 작용(%)은 다음 식으로 계산하였다. 라디칼 소거 작용(%)＝[1－(control의 흡광도－시료의 흡광도/ control의 흡광도)]×100.

Elastase 저해 측정

Elastase 저해 효과는 Kraunsoe 등의 방법(1996)을 준하여 측정하였다. 시료 0.1 mL에 기질[0.8 mM N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide(Sigma Aldrich Co.)/0.2 M Tris-HCl buffer(pH 8.0)] 0.1 mL를 넣고 Tris-HCl buffer(pH 8.0) 1 mL를 추가하였다. 혼합액에 효소액[0.3125 U/mL Porcine pancreatic elastase(Sigma Aldrich Co.)/0.2 M Tris-HCl buffer(pH 8.0)] 0.1 mL를 넣고, vortexing 한 후 37°C의 water bath에서 20분간 효소반응시켰다. 반응 후 반응액은 ice water에서 5분간 식힌 다음 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 (-)-epigallocatechin-3-o-gallate(EGCG)를 사용하였으며, elastase inhibition rate(%)는 (대조구의 흡광도－반응구의 흡광도/ 대조구의 흡광도)×100에 대입하여 나타내었다.

Collagenase 저해 측정

Collagenase 저해 효과는 Wunsch와 Heindrich의 방법(1963)에 준하여 측정하였다. 시료 추출물 0.1 mL에 기질[0.4 mM 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg/0.1 M Tris-HCl buffer(pH 7.5) with 4 mM CaCl₂] 0.25 mL를 넣어주었다. 그다음 Tris-HCl buffer (pH 7.5) 0.15 mL를 넣고 효소액(100 U/mL collagenase from clostridium histolyticum) 0.15 mL를 추가하였다. 혼합액은 25°C의 water bath에서 20분간 효소반응시킨 후 종료 시약으로 6% citric acid를 0.5 mL 넣고, ethyl acetate를 2 mL 넣은 후, vortexing 한 후 320 nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다. Positive control로 EGCG를 사용하였으며, 저해율(%)은 (대조구의 흡광도－반응구의 흡광도/ 대조구의 흡광도)×100에 대입하여 나타내었다.

이팝나무 잎 추출물이 함유된 기능성 에멀션 제형 제조

화장품(에멀션) 제조의 기능성 원료는 동결건조하여 얻어진 이팝나무 잎의 고형분이 사용되었다. 본 실험에 사용된 에멀션의 제조 원료비는 다음의 Table 1과 같다. A상과 B상의 모든 원료의 무게를 재고 A, B상을 구분하여 각각의 비커에 랩을 씌워 water bath에서 가온하여 완전 용해시켰다. 용해된 A상을 B상에 투입하여 homogenizer(AM-11 Ace 116 homogenizer)를 이용하여 3,000 rpm으로 3분 동안 유화시켜 주었다. C상은 먼저 비커에 증류수 100 mL를 넣어준 뒤 분말 형태의 두 원료의 무게를 재어 조금씩 투입하여 homogenizer를 이용하여 섞어주었다. A, B, C상을 homogenizer를 이용하여 혼합하고 45°C까지 냉각시켰다. 마지막으로 D상과 E상(고형분 0, 0.1, 0.5, 1, 2% 농도)을 homogenizer를 이용해 혼합하여 이팝나무 잎 추출물이 함유된 에멀션을 제조하였다(Fig. 1).

Fig 1. The picture of emulsions with water and ethanol extracts from Chionanthus retusa leaves. C: emulsion with 0% extract, W(0.1): emulsion with 0.1% water extract, W(0.5): emulsion with 0.5% water extract, W(1): emulsion with 1% water extract, W(2): emulsion with 2% water extract, E(0.1): emulsion with 0.1% ethanol extract, E(0.5): emulsion with 0.5% ethanol extract, E(1): emulsion with 1% ethanol extract, E(2): emulsion with 2% ethanol extract.

Table 1

Ingredients of emulsions with Chionanthus retusa leaves.

Group (phase)	Ingredients	Contents (%)
A	Water	64.20
	EDTA-2Na	0.03
	Dipotassium glycyrrhizinate	0.05
	Methyl prraben	0.20
	Triethanolamine	0.20
	1,3-Butylene glycol	3.00
B	Steric acid	0.50
	LANETTE 16 (Cetyl Alcohol)	1.50
	Arlacel 165	0.30
	Alatone 2121	2.00
	Tween 60	0.35
	Arlacel 135	0.25
	Glycerin	7.00
	Eutanol-GM	1.50
	Petrolatum snow white EC	3.00
	KF 96-100CS	0.30
	Dragosantol	0.05
	BP	0.05
	PP	0.10
C	1% carbomer 941	12.00
	1% carbomer 940	3.00
D	Fragrance	0.12
E	Ethanol extract (0, 0.1, 0.5, 1, 2%)	0.30

이팝나무 잎 추출물을 첨가한 에멀션의 pH, 색도 및 점도 측정

에멀션의 pH는 pH meter(Orion 3-star, Thermo)를 사용하여 농도별로 6 반복을 수행하여 측정하였다. pH 측정은 총 4주간 7일 간격으로 측정하며 변화를 관찰하였다. 에멀션의 색도는 비색계(JP/CR-400, Minolta)를 사용하여 calibration 한 후 농도별로 6 반복을 수행하여 L(lightness), a(redness), b(yellowness)값을 측정하였다. 색도 측정은 총 4주간 7일 간격으로 측정하며 변화를 관찰하였다. 화장품의 점도를 측정하기 위해 점도계(DV-Ⅱ+Pro, Brookfield)의 수평을 맞춘 viscometer에 64번 spindle을 이용해 6 rpm에서 1분간 측정하였다. 10개의 에멀션은 6 반복으로 수행하였고, 점도 측정은 일주일에 한 번씩 총 4주간 관찰하였다.

이팝나무 잎 추출물이 함유된 에멀션의 patch test

이팝나무 잎 추출 동결건조물이 각각 0, 0.1, 0.5, 1, 2% 함유된 에멀션이 피부에 대해 알레르기 반응을 일으키는지 확인하고자 하였다. 본 실험은 Finn chamber(Smartpractice, Phoenix)를 이용하여 20대를 기준으로 하여 각 10명의 남녀를 대상으로 10종의 에멀션이 묻혀진 Finn chamber를 팔목 안쪽에 첩포한 다음 24시간 이후 제거하는 과정으로 진행되었다. 결과는 국제 접촉피부염 연구회(International Contact Dermatitis Research Group, ICDRG)에 의한 기준으로, 육안으로 판독되었다(Table 2). 본 patch test는 경북대학교 생명윤리심의위원회(IRB)의 심의를 통해 승인(IRB 승인번호: KNU-2022-0019)을 받은 후 진행하였다.

Table 2

The estimated standard of patch test by ICDRG.

Signature	Criteria
－	No reaction
±	A slight erythema
+	Erythema, edema
++	Erythema, edema, vesicle, papule
+++	Big blister, necrosis

ICDRG: International Contact Dermatitis Research Group..

이팝나무 잎 추출물이 함유된 에멀션의 관능 평가

이팝나무 잎 추출 동결건조물을 이용해 제조한 에멀션의 관능 평가는 20대 남녀 각각 10명을 대상으로 총 20명에게 시행하였다. 실온(25°C)에서 보관된 추출 동결건조물로 제조한 에멀션(0, 0.1, 0.5, 1, 2%)의 순서를 무작위로 하여 관능 평가를 시행하였으며 색상, 향, 발림성, 흡수도, 전체적인 기호도를 평가하였다. 점수는 1~7점(1점: 매우 나쁨, 2점: 나쁨, 3점: 조금 나쁨, 4점: 보통, 5점: 조금 좋음, 6점: 좋음, 7점: 매우 좋음)으로 나누어 평가하였다. 본 관능 평가는 경북대학교 생명윤리심의위원회(IRB)의 심의를 통해 승인(IRB 승인번호: KNU-2022-0019)을 받은 후 진행하였다.

통계처리

모든 실험은 3회 이상 반복 측정하여 평균값±표준편차로 표시하였고, 결과에 대한 통계처리는 IBM SPSS statistics 26 for Windows(IBM Corp.)를 이용하여 P<0.05의 유의수준에서 일원배치 분산분석(one-way ANOVA) 하였으며, Duncan’s multiple range test를 실시하여 시료 간 유의차를 분석하였다.

TPC 측정

식물에 많이 함유된 2차 대사산물 phenolic contents는 다양한 크기와 분자량으로 구성되어 있고, phenolic hydroxyl 기를 가지고 있어 단백질 등과 같은 거대 분자와 결합하는 성질이 있어 항산화, 항균 활성 등 다양한 생리활성 기능을 가진다(Kim, 2016). 이팝나무 잎의 TPC는 열수 추출물의 경우 17.85 mg gallic acid equivalents (GAE)/g을 함유하고 있으며, 60% 에탄올 추출물에서 36.66 mg GAE/g의 함량으로 가장 높은 함량을 나타내었고, 60% 이상의 범위에서는 첨가되는 에탄올 농도가 높아질수록 TPC의 함량은 농도 의존적으로 감소하였다(Fig. 2). 이상의 결과에 따라 열수 추출물과 TPC 함량이 가장 높게 나타난 60% 에탄올 추출물을 이용하여 이후 연구에 적용하였다.

Fig 2. Total phenolic contents in water and ethanol extracts from Chionanthus retusa leaves. Means with different letters are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

DPPH 라디칼 소거능 측정

사람의 인체 내에서 발생하는 활성산소에 의해 세포 손상이 발생하는 과정을 억제하는 반응을 항산화 반응이라고 한다(Thanan 등, 2015). 산화반응으로부터 세포를 보호하기 위하여 체내에서도 항산화 효소가 분비되며, 이를 내인성 항산화 물질이라고 한다(Li 등, 2015). 하지만 내인성 항산화 물질만으로는 산화를 완벽히 억제할 수 없으므로 추가적인 항산화 물질의 공급이 필요하다(Kim 등, 2011; Lin 등, 2021). 안정한 자유라디칼인 DPPH는 보통 진보라색을 띠고 있으며 항산화 물질과 반응을 하게 되면 전자를 공여해주고 라디칼이 소거하게 된다. 이로 인해 DPPH의 색이 점점 옅어져 노란색으로 변하는 것을 흡광도의 감소로 측정함으로써 라디칼 소거능을 확인할 수 있다(Pillai 등, 2005). 라디칼 소거능은 홀전자를 가지고 있는 DPPH가 항산화 작용을 하는 전자공여체와 만나면 라디칼이 소거되면서 본래의 보라색의 DPPH가 노란색으로 변함에 따라 흡광도가 감소하는 것을 통해서 라디칼 소거능을 확인할 수 있다.

이팝나무 잎의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과(Fig. 3)는 열수 추출물의 경우 50~200 μg/mL 농도에서 각각 89.46, 89.33, 89.66, 89.20%의 라디칼 소거 활성을 나타내었고, 60% 에탄올 추출물의 경우 91.12, 92.38, 92.71, 91.52%의 라디칼 소거 활성으로 유의적인 차이를 나타내었으며, 열수 및 에탄올 추출물 모두 전 농도에서 매우 높은 항산화능이 확인되었다. 대조군으로 사용했던 BHT의 경우는 50~200 μg/mL 농도에서 83.56, 88.27, 87.13, 86.93%의 라디칼 소거능을 나타내었으며, 이팝나무 잎 열수 및 에탄올 추출물 모두 BHT보다 높은 DPPH 항산화능을 가지고 있음을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 이팝나무 잎은 높은 DPPH 라디칼 소거능을 나타내어 높은 항산화 활성을 가지고 있으며 항노화 화장품에 적용이 가능할 것으로 판단되었다.

Fig 3. DPPH radical scavenging activity of the water and ethanol extracts from the Chionanthus retusa leaves. Means with different letters are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test. BHT: dibutyl hydroxy toluene.

Elastase 저해 활성 비교

자외선으로 인해 발생하는 산화 과정에서 활성산소종은 피부의 노화와 직접적인 관련이 있으며, 산화에 의해 collagenase와 elastase 효소의 발현을 촉진시켜 피부 구조단백질인 collagen과 구성단백질인 elastin이 분해되어 피부 진피층의 구조를 붕괴시켜 탄력감소 및 주름 발생을 유발하게 된다(DeWitt 등, 1981; Lee 등, 2010; Tsuji 등, 2001; Tsukahara 등, 2006). 이러한 피부 주름을 해결하는 작용을 나타내는 것이 elastase와 collagenase 저해제이다(Lim 등, 2018).

Elastase 저해 활성(Fig. 4A)은 열수 추출물 150~600 μg GAE/mL 농도에서 각각 11.73~79.42%의 저해율을 나타내었으며, 60% 에탄올 추출물 150~600 μg GAE/mL 농도에서 각각 36.31~99.63%의 저해율을 농도 의존적으로 나타내었다. Positive control인 EGCG는 150~600 μg/mL 농도에서 31.53~91.53% 저해율을 나타내어 이팝나무 잎 추출물의 효능이 상대적으로 더 우수하였다.

Fig 4. Elastase inhibitory activity (A) and collagenase inhibitory activity (B) of the water and ethanol extracts from the Chionanthus retusa leaves. Means with different letters are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Collagenase 저해 활성 비교

Collagen은 elastin과 hyaluronic acid 등과 더불어 진피층의 구성 성분이다. 진피층을 구성하는 단백질의 약 90%를 차지하는 collagen은 가교결합으로 피부의 형태를 유지하는 역할을 한다. 따라서 collagenase의 활성이 증가하면 collagen 분해가 일어나면서 진피층의 구조가 파괴되어 주름이 발생하게 된다(Kim, 2010).

Collegenase 저해 활성(Fig. 4B)은 열수 추출물 150~600 μg/mL 농도에서 각각 11.35~37.29%의 저해율을 나타내었으며, 60% 에탄올 추출물 150~600 μg/mL 농도에서 각각 19.60~59.03%의 저해율을 농도 의존적으로 나타냈다. Positive control인 EGCG는 150~600 μg/mL 농도에서 80.84~97.64% 저해율에 비하면 다소 낮지만 60% 에탄올 추출물에서 60%의 높은 collagenase 억제율이 관찰되어 elastase 억제능과 더불어 주름개선 효과가 우수할 것으로 판단되었다.

이팝나무 잎 추출 동결건조물을 첨가한 에멀션의 pH

열수 추출 동결건조물과 에탄올 추출 동결건조물을 0.1~2%의 농도로 첨가하여 제조한 에멀션을 각각 실온(25°C)에서 보관하며 4주간 7일 간격으로 pH를 측정한 결과(Fig. 5), 열수 추출물과 에탄올 추출물을 첨가하여 제조한 에멀션 모두 농도가 높아질수록 pH의 값은 6.5 정도에서 5.7 정도로 약간 감소하는 경향을 나타내었으나 큰 폭의 하락은 관찰되지 않았다. 따라서 이팝나무 잎 추출물을 첨가한 에멀션이 저장기간에 안정적임을 확인할 수 있었다.

Fig 5. The pH of emulsions with water and ethanol extract from Chionanthus retusa leaves for storage time. A: emulsion with water extract, B: emulsion with ethanol extract.

이팝나무 잎 추출 동결건조물을 첨가한 에멀션의 색도

열수 추출 동결건조물과 에탄올 추출 동결건조물을 0.1~2%의 농도로 첨가하여 제조한 에멀션을 대상으로 색도를 4주간 측정한 결과(Table 3), 추출물을 첨가한 농도에 따라 색도의 변화가 다소 나타났다. 열수 추출 동결건조물로 제조한 에멀션의 경우 Table 3A와 같이 L값은 농도가 높아질수록 값이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 첨가된 시료의 농도가 높아질수록 제조된 에멀션의 색이 어두워져서 나타나는 현상으로 확인되었다. 반면에 a값과 b값은 농도가 높아질수록 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 60% 에탄올 추출 동결건조물로 제조한 에멀션의 경우 Table 3B와 같이 L값은 농도가 높아질수록 명도가 낮아지는 것을 확인할 수 있었고, 이는 시료가 더 많이 첨가될수록 제조된 에멀션의 색이 어두워짐을 나타냈다. a값은 농도가 높아질수록 감소하였고 b값은 농도가 높아질수록 증가하였다. 이는 에탄올 추출물로 제조한 에멀션은 농도가 높아질수록 더욱 진한 초록빛을 띠었기 때문에 a값이 감소한 것으로 판단되었다. 4주간 저장기간 동안 L값의 변화는 Table 3에서 확인할 수 있듯이 열수 추출 동결건조물로 제조한 에멀션에서만 L값이 2%의 농도에서 67.40±1.45에서 56.31±1.42로 감소하였다. 그리고 열수 추출 동결건조물로 제조한 에멀션의 모든 농도에서 a값은 저장기간이 변화함에 따라 전체적으로 증가하였다. 그러나 열수 추출물로 제조한 에멀션의 b값과 에탄올 추출물로 제조한 에멀션의 L, a, b값에서는 유의한 변화가 나타나지 않았다.

Table 3

Hunter’s color value (L, a, b) of emulsions with the water (A) and 60% ethanol (B) extracts.

(A)	Storage period (days)	Concentration (%)
		0	0.1	0.5	1	2
L	0	94.44±0.59	89.38±0.55	77.83±1.04	79.85±0.74	67.40±1.45
	7	92.41±0.87	89.33±0.63	81.46±1.54	77.09±0.95	68.16±1.60
	14	89.73±0.76	89.89±0.66	83.77±0.51	77.85±0.47	67.05±1.56
	21	92.30±0.45	90.78±0.19	83.27±0.91	79.20±1.37	67.82±1.42
	28	93.04±0.72	88.18±1.56	81.87±1.20	77.35±1.68	56.31±1.42
	t-test	***	***	***	***	***
a	0	−0.03±0.01	−0.81±0.08	−0.45±0.07	0.14±0.17	1.80±0.16
	7	−0.33±0.07	−0.60±0.02	0.03±0.12	0.57±0.20	1.95±0.15
	14	−0.33±0.08	−0.51±0.03	0.30±0.12	0.85±0.23	2.12±0.31
	21	−0.36±0.03	−0.46±0.05	0.11±0.21	0.87±0.17	1.87±0.25
	28	−0.10±0.05	−0.25±0.09	0.30±0.07	0.78±0.09	3.56±0.24
	t-test	***	***	***	***	***
b	0	2.35±0.09	11.13±0.62	17.22±0.15	23.67±0.66	25.86±0.46
	7	4.09±0.21	9.72±0.20	17.96±0.42	22.11±0.13	24.84±0.80
	14	3.52±0.16	10.55±0.45	18.86±0.17	21.89±0.22	25.49±0.77
	21	3.88±0.18	10.53±0.14	18.37±0.53	21.63±0.32	25.29±0.65
	28	3.10±0.20	11.88±0.25	18.90±0.26	23.47±0.31	26.84±0.16
	t-test	***	***	***	***	***

(B)	Storage period (days)	Concentration (%)
		0	0.1	0.5	1	2
L	0	94.44±0.59	82.21±1.03	70.19±1.49	62.67±1.07	55.12±0.99
	7	92.41±0.87	85.62±1.02	73.78±1.11	61.79±0.57	54.71±0.63
	14	89.73±0.76	85.80±0.52	71.20±1.67	60.60±1.36	51.18±0.37
	21	92.30±0.45	86.43±0.56	73.82±1.58	62.19±1.60	53.48±1.51
	28	93.04±0.72	81.26±1.48	71.96±1.05	59.86±1.12	54.36±1.21
t-test	***	***	***	***	***
a	0	−0.03±0.01	−3.17±0.07	−4.84±0.05	−5.31±0.11	−5.28±0.14
	7	−0.33±0.07	−2.58±0.03	−3.23±0.13	−4.11±0.07	−3.81±0.03
	14	−0.33±0.08	−2.34±0.12	−2.96±0.17	−3.92±0.08	−4.53±0.23
	21	−0.36±0.03	−2.19±0.07	−3.34±0.43	−3.88±0.19	−3.78±0.47
	28	−0.10±0.05	−2.46±0.12	−3.21±0.10	−4.07±0.25	−4.08±0.14
t-test	***	***	***	***	***
b	0	2.35±0.09	14.55±0.51	23.15±0.77	27.87±0.43	29.48±0.45
	7	4.09±0.21	12.80±0.28	18.72±0.14	24.41±1.01	21.23±0.50
	14	3.52±0.16	13.54±0.31	19.75±0.55	22.92±0.70	28.52±0.94
	21	3.88±0.18	13.38±0.54	19.92±0.56	24.72±0.56	23.65±1.59
	28	3.10±0.20	14.85±0.34	19.22±0.30	24.73±0.55	26.44±0.89
	t-test	***	***	***	***	***

Values are presented as mean±standard deviation (n=3). The significant difference from the control group was verified at P<0.001 by Student’s t-test..

이팝나무 잎 추출 동결건조물을 첨가한 에멀션의 점도 측정 결과

열수 추출 동결건조물을 0.1~2%의 농도로 첨가하여 제조한 에멀션을 일주일 간격으로 점도를 측정한 결과, 0.1% 함유된 에멀션이 0일 차에 28,677.33±658.53으로 가장 큰 값을, 2% 함유된 에멀션이 21일 차에 9,848.00±83.67로 가장 작은 값을 나타내었다(Fig. 6A). 60% 에탄올 추출 동결건조물로 제조한 에멀션(0, 0.1, 0.5, 1, 2%)에서는 0.1% 함유된 에멀션이 0일 차에 39,608.33±953.33으로 가장 큰 값을, 0.5% 함유된 에멀션이 28일 차에 10,598±126.49로 가장 작은 값을 나타내었다(Fig. 6B). 점도는 저장기간에 따른 변화가 나타나지 않았다고 볼 수 있으므로 이팝나무잎 추출 동결건조물을 이용해 제조한 에멀션은 저장기간 동안 물성 변화는 크게 발생하지 않는 것으로 판단하였다.

Fig 6. The viscosity change of emulsions with water and ethanol extract (Chionanthus retusa leaves) for storage time. (A) emulsion with water extract, (B) emulsion with 60% ethanol extract.

이팝나무 잎 추출 동결건조물이 함유된 에멀션의 patch test 결과

이팝나무 잎 열수 추출 동결건조물과 60% 에탄올 추출 동결건조물을 0.1~2%의 농도로 첨가하여 제조한 에멀션의 피부에 대한 알러지 반응을 확인하기 위해 팔목 안쪽에 첩포하여 24시간 이후 확인한 결과, 피부의 모습은 Fig. 7과 같이 나타났다. ICDRG의 기준에 의해 육안으로 판독한 결과, Table 4와 같이 20대 남녀 모두에게 알러지 반응은 일어나지 않은 것으로 판단되었다. 이상의 결과를 토대로 이팝나무 잎 추출물은 항산화, 주름개선 등의 기능성이 우수하며, 기능성 화장품에 적용하였을 때 저장 안정성이 우수하고 피부 발작을 일으키지 않아 기능성 화장품 원료로 안전하게 사용할 수 있을 것으로 판단되었다.

Fig 7. Finn chamber patch test of emulsions with the water and ethanol extracts from Chionanthus retusa leaves.

Table 4

Reaction to emulsions with the CRL extract by patch test.

Gender	Signature
Male	－
Female	－

이팝나무 잎 추출 동결건조물이 함유된 에멀션의 관능 평가 결과

화장품의 관능 평가를 시행한 결과 Table 5와 같이 열수 추출 동결건조물로 제조한 에멀션의 경우 남성과 여성 모두에서 색상과 전체적인 기호도는 추출물의 농도가 높아질수록 낮아졌다. 60% 에탄올 추출 동결건조물로 제조한 에멀션의 경우 열수와 마찬가지로 남성과 여성 모두에서 색상과 전체적인 기호도가 추출물의 농도가 높아질수록 낮아졌다. 이는 이팝나무 잎 추출물의 농도가 높아질수록 에멀션의 색상이 더욱 진하게 나타난 것이 에멀션의 색상과 전체적인 기호도에 영향을 주었기 때문으로 판단된다. 열수 추출물로 제조한 에멀션의 경우 노란빛을 띠는 반면 에탄올 추출물로 제조한 에멀션의 경우 더욱 초록빛이 강했기 때문에 에멀션의 색에 대한 평가에서 60%

Table 5

Sensory evaluation of emulsions with the water (A) and 60% ethanol (B) extracts.

(A)	List	Concentration (%)
		0	0.1	0.5	1	2
Male	Color	6.3±0.7b	6.0±0.7b	5.0±1.1a	5.1±0.7a	4.5±0.8a
	Scent	4.2±0.6a	4.3±0.9a	4.0±0.9a	4.1±0.9a	4.3±1.3a
	Spreading	5.7±0.7a	5.7±0.8a	5.6±1.0a	5.9±0.9a	5.6±0.8a
	Absorption	5.1±1.3a	5.6±1.1a	4.9±1.3a	5.0±0.9a	4.7±1.1a
	Whole preference	5.3±0.7a	5.8±1.1a	5.1±0.9a	5.1±0.7a	5.0±0.7a
Female	Color	5.6±1.1b	5.9±0.6b	5.3±1.3ab	4.9±1.5ab	4.2±1.2a
	Scent	4.9±0.9a	5.3±1.1a	4.3±1.1a	4.2±1.3a	4.2±1.5a
	Spreading	5.1±1.1a	5.2±1.1a	5.3±1.3a	4.6±1.1a	5.1±1.2a
	Absorption	4.8±1.2a	5.1±1.3a	5.2±1.3a	4.5±0.8a	4.8±1.3a
	Whole preference	5.0±1.2a	5.6±0.8a	5.0±1.3a	5.0±0.8a	4.6±1.3a

(B)	List	Concentration (%)
		0	0.1	0.5	1	2
Male	Color	6.3±0.7b	6.0±0.7b	3.9±0.9a	3.7±0.9a	3.7±1.2a
	Scent	4.2±0.6a	4.9±1.0a	4.5±1.0a	4.5±1.0a	4.9±1.2a
	Spreading	5.7±0.7a	5.3±1.2a	5.3±1.5a	4.9±1.2a	5.2±0.8a
	Absorption	5.1±1.3a	4.7±1.2a	4.8±1.5a	5.0±1.1a	5.1±0.9a
	Whole preference	5.3±0.7ab	5.4±0.7a	4.7±1.1ab	4.4±1.3a	4.7±1.1ab
Female	Color	5.6±1.1c	6.0±0.8c	4.5±1.3b	3.5±1.1ab	3.2±1.3a
	Scent	4.9±0.9a	5.2±1.0a	4.6±1.4a	4.7±1.2a	5.0±1.1a
	Spreading	5.1±1.1a	5.3±1.2a	5.2±0.9a	5.6±1.2a	6.0±0.8a
	Absorption	4.8±1.2a	5.1±1.2ab	5.6±1.1ab	5.3±1.1ab	5.9±0.7b
	Whole preference	5.0±1.2a	5.6±0.8a	5.2±0.9a	5.1±0.6a	4.9±0.6a

Data are mean±SD (n=10). Means with different letters are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..

에탄올 추출 동결건조물을 1% 함유한 에멀션의 경우 남녀 각각 3.7점, 3.5점으로 열수 추출 동결건조물을 1% 함유한 에멀션의 남녀 각각 5.1점, 4.9점보다 점수가 낮게 나온 것으로 판단된다.

마찬가지로 60% 에탄올 추출 동결건조물을 2% 함유한 에멀션의 경우 남녀 각각 3.7점, 3.2점으로 열수 추출 동결건조물을 2% 함유한 에멀션의 남녀 각각 4.5점, 4.2보다 점수가 낮게 나온 것으로 판단되었다. 반면 남성과 여성 모두에서 에탄올로 추출한 에멀션의 흡수도는 농도가 높아질수록 증가하였다. 남성의 경우 60% 에탄올 추출 동결건조물을 0.1% 함유한 에멀션에서 4.7점을 나타내고 60% 에탄올 추출 동결건조물을 2% 함유한 에멀션의 경우 5.1점으로 평가되었다. 여성의 경우 60% 에탄올 추출 동결건조물을 0.1% 함유한 에멀션에서 5.1점을 나타내고 60% 에탄올 추출 동결건조물을 2% 함유한 에멀션에서 5.9점으로 평가되었다. 이를 통해 60% 에탄올 추출물로 제조한 에멀션의 흡수도는 농도가 높아질수록 증가함을 판단할 수 있다. 또한 에탄올 추출물의 경우 여성에서 발림성이 60% 에탄올 추출 동결건조물을 0.1% 함유한 에멀션에서 5.3점, 60% 에탄올 추출 동결건조물을 2% 함유한 에멀션에서 6점으로 평가된 것을 통해 에탄올 추출물로 제조한 에멀션의 발림성도 농도가 높아질수록 증가함을 판단할 수 있다.

이러한 결과들을 종합하여 볼 때 색과 전체적인 기호도는 추출물 특유의 색 때문에 농도가 높아질수록 점수가 낮아지기는 하지만 에탄올 추출물이 함유된 에멀션에서 흡수도와 발림성에 대한 평가가 첨가농도가 높아질수록 증가하는 것을 보아 색상에 대한 문제점을 보완한다면 화장품 소재로서 이용이 가능할 것으로 판단되었다.

본 연구에서는 이팝나무(Chionanthus retusa) 잎 추출물을 사용하여 항산화와 주름개선 효과를 측정하고, 에멀션 제형의 화장품을 제조하여 안정성(pH, 색도, 점도, patch test 및 관능 평가)을 평가하였다.

이팝나무 잎의 total phenolic compounds 함량은 열수 및 에탄올 추출물에서 각각 17.85, 36.66 mg GAE/mL의 함량을 나타내었다. 이팝나무 잎 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 각각 89.20, 91.52%의 효과를 나타내었다. Elastase 억제 효과는 에탄올 추출물 600 μg/mL 농도에서 99.63%의 저해율을 나타내었으며, collagenase 저해 효과는 에탄올 추출물 600 μg/mL 농도에서 59.03%의 저해율을 나타내어 매우 우수한 주름생성 억제 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이팝나무 추출물을 활용한 화장품을 4주간 저장하며 pH, 색도, 점도를 측정한 결과, pH, 점도에서는 차이를 보이지 않았다. 색도의 경우 추출 시료를 첨가한 농도에 따라 전체적으로 변화가 있었으며, 4주 동안 저장기간에 따른 변화는 열수 추출물에서만 L값이 2%의 농도에서 감소하였고 a값은 전체적으로 증가하였다. 화장품의 patch test에서는 화장품으로 인해 일어날 수 있는 피부 알레르기 반응은 나타나지 않았다. 화장품의 관능 평가에서는 화장품의 색, 향, 발림성, 흡수도, 전체적인 기호도에서 이팝나무 잎 추출 동결건조물 첨가 농도가 높아질수록 색과 전체적인 기호도에서 남녀 모두 평가 점수가 낮아졌으며, 흡수도의 경우 에탄올 추출물로 제조한 화장품에서 점수가 높았다. 발림성의 경우 에탄올 추출물 화장품에서만 여성 평가자의 점수가 증가하였으며, 그 외의 향과 발림성에서는 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과에 따라서 이팝나무 잎 추출물의 페놀성 화합물 함유량과 항산화 활성, 주름개선 효과 및 화장품 안정성을 확인하여 기능성을 가지는 화장품 제조 원료로 개발 가능성을 확인하였다.