콩은 단백질과 지방질이 풍부하고 필수아미노산과 필수지방산 함량이 높아 식품, 사료, 산업용으로 이용성이 다양해 전 세계적으로 널리 재배되고 있는 작물이다. 또한 이소플라본, 올리고당, 사포닌, phytate 등 만성질환 및 성인병에 효과가 있는 기능성 성분이 많이 함유되어 있다고 알려져 있다(Eom 등, 2009). 콩의 용도는 크게 장류용, 두부•두유용, 나물용, 검정콩 중심의 밥밀용, 그리고 풋콩용으로 구분할 수 있다. 콩의 가공과 이용상 용도에 맞는 품종을 선택해야 하는데 장류나 두부로 가공할 경우에는 대립종, 콩나물 용도로 사용할 경우에는 소립종 품종이 적당하다. 하지만 우리나라에서 콩 품종들은 엄격하게 그 용도가 구분되어 재배되거나 유통되지는 않고 있다.

콩을 발아시킨 콩나물은 고려시대 이전부터 식용으로 이용되어 온 우리나라 고유의 전통 식품으로, 생육기간이 짧고 재배가 비교적 손쉬울 뿐만 아니라 저렴한 가격의 대중적인 식품이다(Choi 등, 2000). 나물용 콩은 우리나라 콩 생산량에서 약 10%를 차지하고 있으며 100립의 무게가 25 g 이상으로 굵은 대립종과 달리 7~14 g 정도의 소립종으로 발아특성이 우수하고 배죽의 신장속도가 빠르며 경실립, 부패립의 수가 적어 좋은 품질로 여겨진다(Edward와 Hartwig, 1971; Kim 등, 2014; RDA, 2021). 나물콩은 수확 후 6~9개월 이상 실온에서 저장하면 발아율이 감소한다고 알려져 있으며(Singh 등, 1993), 발아되지 못한 나물콩은 품질이 낮은 등외콩으로 분류되어 폐기되기 때문에 이를 이용한 가공방법이 필요한 실정이다.

청국장은 고추장, 된장과 함께 우리나라의 대표 발효식품 중의 하나이며 대두를 삶아 고초균(Bacillus subtilis)으로 발효시켜 독특한 풍미를 내는 전통 식품이다(Chang 등, 2010). 청국장은 일반적으로 2~3달을 발효시키는 장류들과는 달리 2~3일간 빠르게 발효시키는 속성 발효장이다. 청국장은 콩 원물에 비해 비타민 B₁, B₂, 나이아신, 판토텐산 등 영양성분의 함량이 높으며(In 등, 2002), 균주의 효소활성을 통해 대두 내의 단백질을 peptone, polypeptide, dipeptide, amino acid로 분해해 체내 이용흡수율을 높인다(Kim과 Hahm, 2003). 또한 배당체 형태의 이소플라본은 발효과정 중 당이 제거되어 genistein, daidzein 같은 aglycone으로 분해되고 이러한 aglycone은 항산화 작용 및 항균 작용을 갖는다고 알려져 있다(Choe 등, 1996; Iwai 등, 2002).

본 연구에서는 콩나물 제조 시 발아되지 못해 폐기되는 미발아 풍산나물콩을 활용하여 청국장을 제조하고 일반 대원콩으로 제조한 청국장과 발효특성과 기능성분을 비교하여 고부가가치 가공식품으로 활용하고자 하였다. 또한 제조한 청국장을 대상으로 총 페놀성 화합물, 총 플라보노이드 함량과 자유라디칼 소거 활성 비교를 통한 항산화 활성 비교, 이소플라본과 유리 아미노산 함량을 측정함으로써 미발아 풍산나물콩을 활용한 청국장의 품질 우수성을 평가하였다.

청국장 제조

청국장은 Park 등(2013)의 방법을 변형하여 제조하였다. 실험에 사용한 콩은 전주콩나물영농조합에서 제공받아 사용하였다. 선별한 대원콩(Daewon-soybeans, DS)과 미발아 풍산나물콩(non-germinated Pungsannamul-soybean, NPS) 100 g을 수세한 후 10배수의 물을 첨가하여 24시간 침지하였다. 이후 30분 동안 수분을 제거하고 121°C에서 40분간 증자하였고 30°C 이하로 냉각하였다. Starter 균주는 B. subtilis 표준균주인 KCTC 3135 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다. 균주는 nutrient broth에 접종하여 37°C에서 18시간 진탕배양 하여 전배양액을 제조하였고 균수를 10⁹ CFU/mL로 조정하여 증자된 콩에 2%(v/w) 접종하였다. 이후 40°C의 incubator에서 24, 48, 72시간 동안 발효하여 제조하였다.

이화학 특성

이화학 특성은 시료에 4배수의 증류수를 첨가하여 혼탁하였고 이를 원심분리(4°C, 10,000×g, 10분)하여 상등액을 실험에 사용하였다. pH는 pH meter(PP-15, Sartorius)를 사용하여 측정하였고, 수용성 고형분은 당도계(pal-1, Atago)를 사용하여 분석하였다. 수분함량은 시료 1 g을 칭량하여 적외선 수분측정기(HE53, Mettler-Toledo)를 사용하여 측정하였다. 총 산도는 시료를 10배 희석하여 1% phenolphthalein 용액을 40 µL 첨가한 후 미홍색이 30초 이상 유지될 때까지 0.1 N NaOH solution으로 적정하였다. 그리고 다음의 식을 이용하여 계산하였다.

V: 0.1 N NaOH 용액의 적정치 소비량(mL)

F: 0.1 N NaOH 용액의 역가

A: 0.1 N NaOH 용액 1 mL에 상당하는 유기산의 양(g)(초산: 0.0060)

D: 희석배수

S: 시료의 채취량(mL)

효소활성 측정

청국장의 효소활성은 Vermelho 등(1996)과 Yoon 등(2014)을 참고하여 paper disc 확산법으로 측정하였다. 청국장 시료에 물을 4배수 첨가하여 2시간 동안 초음파 추출하였고 원심분리(4°C, 10,000×g, 10분)하여 상등액을 실험에 사용하였다. Amylase 활성은 1% soluble starch를 함유한 starch agar 배지(Sim 등, 2017), protease 활성은 2% skim milk를 함유한 skim milk agar 배지(Vermelho 등, 1996), cellulase 활성은 1% carboxymethyl cellulose(CMC)를 함유한 CMC agar 배지(Baek 등, 2009)를 사용하였다. 배지에 6 mm paper disc(Toyo Roshi Kaisha Ltd.)를 올리고 조효소액 20 µL를 분주하여 37°C에서 24시간 배양하였다. 그 후 iodine 시약으로 5분간 염색하고 증류수로 세척한 후 생기는 clear zone의 지름을 측정하여 균 집락 지름과의 크기 비율을 상대활성도로 나타내었다.

아미노태 질소 함량 측정

아미노태 질소 함량은 Formol 적정법(Lee 등, 2012)으로 측정하였다. 시료 추출액 5 mL, 중성 formalin 용액 10 mL, 증류수 10 mL를 넣은 플라스크에 0.5% phenolphthalein 용액을 20 µL 첨가한 후 0.1 N NaOH로 미홍색이 될 때까지의 적정량과 시료 5 mL, 증류수 20 mL를 넣은 플라스크에 0.5% phenolphthalein 용액을 20 µL 첨가한 후 0.1 N NaOH로 미홍색이 될 때까지의 적정량을 이용하여 아미노태 질소 함량을 산출하였다.

암모니아태 질소 함량 측정

암모니아태 질소 함량은 phenol-hypochloride 반응에 의해 측정하였다. 아미노태 질소 함량 측정과 같이 시료 추출액 0.1 mL를 취한 후 A 용액(phenol 10 g과 sodium nitroprussidedihydrate 0.05 g/ 증류수 1 L)과 B 용액(Na₂HPO₄·12H₂O 9 g, NaOH 6 g과 NaOCl 10 mL/증류수 1 L)을 각각 2 mL씩 넣고 37°C에서 20분간 반응시켜 630 nm에서 흡광도를 측정하였으며, ammonia sulfate를 이용한 표준곡선을 이용하여 암모니아태 질소량을 계산하였다.

총 페놀성 화합물 함량 측정

청국장은 메탄올로 추출하여 농도별로 희석하여 실험에 사용하였다. 시료 추출물과 표준물질 100 µL에 10% Folin & Ciocalteu’s phenol reagent 500 µL를 혼합한 후 37°C에서 5분 동안 반응하였다. 이후 2% sodium carbonate 용액 600 µL를 첨가한 후 상온에서 30분간 반응하고 765 nm 파장에서 microplate reader(Thermo Scientific Co., Ltd.)로 흡광도를 측정하였다. 이때 표준곡선은 gallic acid를 사용하였고, 이에 대한 mg GAE/g으로 함량을 표기하였다.

총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량 측정은 Sembiring 등(2018)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 추출물과 10% aluminum chloride(w/v)를 1:1의 비율로 혼합한 후 37°C에서 5분간 incubation 하여 415 nm 파장에서 microplate reader로 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 quercetin을 사용하였고 이에 대한 mg QE/g으로 함량을 표기하였다.

항산화 활성 측정

2,2-Diphenyl-1-picorylhydrazyl(DPPH)에 대한 수소공여능은 96-well plate에 시료액 20 µL와 DPPH 용액 80 µL를 혼합하여 암소에서 30분간 실온에 방치한 후 517 nm에서 microplate reader로 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 라디칼 소거 효과를 다음과 같이 계산하여 백분율(%)로 나타냈으며 양성대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다.

2,2′-Azinobis-(3-ethybenzthazoline-6-sulphonic acid)(ABTS) 라디칼 소거 활성 측정은 80 mM ABTS 용액에 30 mM potassium persulfate를 혼합하여 암소에서 1시간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도 값이 1.0이 되도록 조절한 ABTS solution을 사용하였다. 시료액 10 µL에 ABTS solution 90 µL를 혼합하여 37°C에서 30분 동안 암실에서 반응시킨 후 734 nm의 파장에서 microplate reader로 흡광도를 측정하였다. 결괏값은 추출물 첨가구와 무첨가구를 양성대조군과 비교하여 라디칼 소거능을 백분율(%)로 나타냈으며 양성대조군으로는 Trolox를 사용하였다.

이소플라본 함량 분석

청국장의 이소플라본 분석을 위한 시험용액의 제조와 정량분석방법은 Lee(2017)의 방법을 변형하여 수행하였다. 이소플라본 중 daidzin(Sigma-Aldrich Co.), daidzein(Sigma-Aldrich Co.), genistin(Sigma-Aldrich Co.), genistein(Sigma-Aldrich Co.)을 표준 성분으로 high performance liquid chromatography(HPLC, Waters 2690XE, Waters Corp.)를 이용하여 분석하였으며 컬럼은 NOVA-Pack^® C18(150×3.9 mm, 4 µm) column을 사용하였다. 발효물은 동결건조 후 50 mesh 이하로 분쇄하여 시료 0.5 g에 80% 메탄올을 10 mL 첨가하여 초음파 추출하였다. 추출액의 일정량을 취해 원심분리(4°C, 10,000×g, 10분)하여 상등액을 취하였고 0.45 µm membrane filter(Waters, Millipore)로 여과하여 분석하였다.

유리아미노산 함량 분석

청국장의 유리아미노산은 Lee 등(2010)의 방법을 변형하여 측정하였다. 일정량의 시료를 취해 70% 에탄올을 첨가하여 균질화하였고 실온에 방치시켜 단백질을 침전･제거하였다. 이후 상등액을 10,000×g에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 취해 중탕가열로 건조하였다. 이후 시료를 0.12 N sample dilution buffer(pH 2.20)에 10배 희석하고 0.22 µm membrane filter(Futexs Co., Ltd.)로 여과하여 amino acid analyzer(S433, SYKAM)를 이용하여 분석하였다.

통계분석

각 실험에서 얻은 결과는 SPSS package program(Ver. 12.0, SPSS Inc.)을 사용하여 평균과 표준편차로 나타내었다. 시료 간의 유의성은 P<0.05 수준에서 one-way ANOVA로 분산분석한 후 Duncan’s multiple range test로 사후분석을 수행하였다.

청국장의 발효특성

청국장의 발효특성은 DS와 NPS에 B. subtilis KCTC 3135 균주를 접종하여 40°C의 incubator에서 24, 48, 72시간 동안 발효한 청국장을 샘플링하여 분석하였으며, 그 결과는 Fig. 1과 같다. DS와 NPS로 제조한 청국장의 pH는 발효 전 6.48±0.11, 6.49±0.00에서 72시간 후 각각 8.20±0.14, 8.18±0.04로 비슷한 수준으로 나타났으며, 총산도는 발효 전 0.05±0.00%, 0.03±0.00%에서 발효 72시간 후 0.14±0.02%, 0.20±0.02%로 측정되었다. 이는 Im 등(2006)의 청국장 발효기간이 경과되면서 탈아미노화 현상이 일어나 암모니아가 생성되기 때문에 pH가 증가하였다는 보고와 비슷한 수준이었으며, NPS가 DS에 비해 발효 품질이 떨어지지 않음을 알 수 있다. Son 등(2000)의 연구에서 청국장의 발효기간에 따라 acetic acid, propionic acid, lactic acid와 같은 유기산이 증가하여 총 유기산 함량이 증가하였다. 따라서 본 연구 결과도 총 유기산이 증가하여 총 산도가 증가한 것으로 사료된다. 수분함량은 발효 72시간 후 DS와 NPS가 각각 57.39±0.29%, 56.48±1.58% 수준이었으며, 전통 청국장(Kim 등, 2006)의 경우 수분함량이 평균 57.00±3.10%로 보고되어 본 실험 결과와 유사한 수준이었다. DS의 수용성 고형분은 발효 전 1.1±0.0°Brix에서 발효 24시간 후 2.3±0.4°Brix로 증가하였고 이후 소폭 감소하다가 증가하는 경향을 보였다. Shon 등(2001)은 잔존 환원당의 함량이 24시간에 가장 많게 나타났으며, 이는 콩의 다당류들이 24시간까지는 저분자의 환원당으로 많이 생성되다가 24시간 이후부터는 발효 미생물의 증식에 필요한 영양원과 화학적 반응에 이용된다고 보고하였다. NPS의 수용성 고형분은 발효 전 1.3±0.0°Brix에서 발효시간에 따라 연속적으로 증가하여 발효 72시간 후 3.7±0.7°Brix로 유의적으로 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 미생물 증식에 소모되는 환원당의 양보다 발효에 따른 생성 환원당이 더 빠른 속도로 증가한 것으로 판단된다.

Fig 1. Physicochemical properties of Cheonggukjang prepared with DS and NPS. Different lower-case letters (a,b) in the same property indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05). DS means Daewon-soybeans, NPS means non-germinated Pungsannamul-soybeans.

아미노태 및 암모니아태 질소 함량

청국장의 구수한 맛의 척도인 아미노태 질소는 발효숙성 중 미생물이 생산하는 protease 활성에 의해 생성된 아미노산에 기인하며(Lee 등, 2013), 아미노태 질소의 함량은 장류 발효의 품질 지표로서 구수한 맛이나 감칠맛의 척도로 사용된다. 또한 아미노태 질소의 함량이 적정 이상일 경우 성분 면에서도 좋은 것으로 평가된다(Kim 등, 2021). 현재 식품공전에 따르면 청국장의 아미노태 질소 함량은 270 mg% 이상으로 규정되어 있다(aT, 2021). DS와 NPS의 발효에 따른 아미노태 질소함량은 Fig. 2와 같다. DS의 아미노태 질소 함량은 발효 전 168.0±0.0 mg%에서 발효 48시간 후 280±0.0 mg%, 72시간 후 406.0±19.7 mg%로 증가하였다. NPS는 발효 전 168.0±0.0 mg%에서 210.0±19.7 mg%, 420.0±39 mg%, 700.0±79.2 mg%로 증가하여 발효 72시간 경과 후 가장 큰 유의차를 보였다. DS와 NPS의 최종 발효물은 식품공전 기준 270 mg%를 초과하여 식품공전 상의 아미노태 질소 함량 기준을 충족하였으며, NPS는 발효 48시간에 기준을 초과하여 청국장 품질조건 달성이 DS에 비하여 더 빠른 것으로 확인되었다. 생청국장 적합 품종 선정을 위한 가공특성 비교 연구(Kim 등, 2021)에서 풍산나물콩 품종의 청국장에서 아미노태 질소 함량이 550.1 mg%로 측정되어 발효성이 높은 것으로 평가된바, NPS의 발효 우수성을 확인할 수 있었다.

Fig 2. Amino (A) and ammonia (B) type nitrogen content of Cheonggukjang prepared with DS and NPS. Error bar indicates the standard deviation of the mean. Different lower-case letters (a-d) in the same bar indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05). DS means Daewon-soybeans, NPS means non-germinated Pungsannamul-soybeans.

한편 단백질 분해과정에서 deamination에 의해 생성되는 암모니아태 질소는 식품 내에 과량으로 축적되면 부패취로 작용하여 일반 장류 제품에서 변패 또는 이상발효의 지표로 사용된다(Lee 등, 2014). 암모니아태 질소의 과잉 생산은 청국장 냄새에 영향을 미쳐 소비 기피를 유발하는 중요한 물질로 알려져 있다. 본 연구에서 두 가지 청국장의 암모니아태 질소 함량은 발효 전 2.1±0.1, 2.2±0.0 mg%에서 발효 48시간 2.3±0.0, 2.3±0.1 mg%로 소폭 증가하다가 발효 72시간 후 4.6±0.3, 3.9±0.5 mg%로 측정되었다. 아미노태 질소와는 반대로 DS보다 NPS에서 더 낮은 함량을 나타내었다.

효소활성

청국장은 발효과정에서 여러 미생물에 의해 각종 분해효소가 생성된다(Ryu, 2003). 이로 인해 콩은 발효 중 다양한 성분 변화가 일어나 단백질 및 올리고 다당류 분해에 따른 아미노산과 유리당 조성이 증가하고(Baek 등, 2010; Ra 등, 2004) 이소플라본의 비배당체화와 같은 기능성을 나타내는 2차 대사산물이 생성된다(Hwang 등, 2017).

Amlylase 활성은 청국장 발효과정에서 환원당을 유리해 당분의 감미성분 등에 관여하므로 청국장의 품질 면에서 중요한 효소라고 할 수 있다(Park 등, 1995). 본 연구에서 청국장의 효소활성을 측정한 결과는 Table 1과 같다.

Table 1

Enzyme activity of Cheonggukjang prepared with DS and NPS.

Raw materials1)	Fermentation time (h)	Amylase	Protease	Cellulase
DS	0	1.00a2)3)	1.00a	1.00a
	24	1.69±0.09b4)	1.81±0.09b	2.44±0.09b
	48	1.94±0.09c	1.81±0.09b	2.81±0.09d
	72	2.19±0.09d	1.75±0.00b	2.94±0.09d
NPS	0	1.00a	1.00a	1.00a
	24	1.63±0.00b	1.94±0.09bc	2.63±0.00c
	48	2.06±0.09cd	1.81±0.09b	2.81±0.09d
	72	2.19±0.09d	2.13±0.18c	2.94±0.09d

¹⁾DS means Daewon-soybeans, NPS means non-germinated Pungsannamul-soybeans..

²⁾Halo diameter/ Colony diameter..

³⁾1.00 means no activity..

⁴⁾Means±SD (n=2). Different lower-case letters (a-d) in the same enzyme indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05)..

두 가지 청국장 모두 발효 후 amylase 활성이 증가하여 DS에서는 1.69±0.09, 1.94±0.09, 2.19±0.09로 증가하였고 NPS는 1.63±0.00, 2.06±0.09, 2.19±0.09로 비슷한 수준으로 나타났다. Protease 활성은 DS 발효 24시간 후 1.81±0.09로 증가하였고 이후 큰 변화는 없었다. 반면 NPS의 경우 발효 24시간 후 1.94±0.09로

증가하였고 72시간 이후 2.13±0.18로 가장 높은 활성을 보였다. Protease는 청국장 발효에 관여하는 미생물이 생산하며 대두 단백질의 소화성과 영양성 개선에 큰 역할을 하여 구수한 맛을 내는 아미노태 질소 함량과도 연관성이 있어(Jung 등, 2009) 청국장 특유의 맛을 내는 데 중요하게 작용한다. 따라서 발효 72시간이 경과한 NPS의 품질이 가장 우수할 것으로 판단된다. Cellulase는 식물세포벽 구성성분 중 대부분을 차지하고 있는 cellulose를 분해할 수 있어 장내 이용성 증진을 위해 널리 사용되는 효소이다(Song 등, 2015). Cellulase는 청국장 발효 24시간 후 DS와 NPS가 각각 2.44±0.09, 2.63±0.00으로 크게 증가하였고, 이후로도 점차 증가하여 발효 72시간 후 2.94±0.09로 동일하게 나타났다.

총 페놀성 화합물 및 플라보노이드 함량

페놀성 물질은 식물계에 널리 분포되어 있는 대사산물 중 하나로서 다양한 구조를 갖는데, 특히 이 중 phenolic hydroxyl기가 항산화 등과 같은 생리활성 기능을 나타낸다(Gramaza 등, 2006; Lee와 Min, 2006). 원재료를 달리하여 제조한 청국장 추출물의 총 페놀성 화합물 함량(Table 2)은 발효 기간에 따라 증가하는 양상을 보였다. DS는 발효 전 83.52±3.23 µg GAE/g에서 93.25±6.70 µg GAE/g, 94.92±4.74 µg GAE/g, 111.97±5.24 µg GAE/g으로, NPS는 96.33±0.16 µg GAE/g에서 98.08±3.66 µg GAE/g, 119.83±3.69 µg GAE/g, 121.89±4.74 µg GAE/g으로 함량이 증가하였다. 특히 NPS는 발효 전 원물에서부터 대두보다 총 페놀성 화합물 함량이 높았으며 발효 48시간 이후부터 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다.

Table 2

Antioxidant activity of Cheonggukjang prepared with DS and NPS.

Raw materials1)	Fermentation time (h)	TPC2) (µg GAE/g)	TFC3) (µg QE/g)	DPPH radical scavenging activity (%)	ABTS radical scavenging activity (%)
DS	0	83.52±3.23a4)	12.99±1.08a	68.89±1.02a	18.04±6.10a
	24	93.25±6.70b	19.83±7.75ab	69.83±0.16a	20.96±2.75a
	48	94.92±4.74b	19.61±6.15ab	87.37±0.41c	59.61±5.63c
	72	111.97±5.24c	32.36±7.12c	91.80±4.24c	96.86±0.33e
NPS	0	96.33±0.16b	20.28±1.44ab	72.50±0.29a	30.58±2.03b
	24	98.08±3.66b	25.38±5.14bc	77.40±1.10b	70.22±2.79d
	48	119.83±3.69d	48.40±7.84d	89.75±2.96c	94.35±0.59e
	72	121.89±4.74d	64.26±7.41e	106.24±4.69d	98.60±0.73e

¹⁾DS means Daewon-soybeans, NPS means non-germinated Pungsannamul-soybeans..

²⁾Total phenolic contents. ³⁾Total flavonoid contents..

⁴⁾Means±SD (n=3). Different lower-case letters (a-e) in the same row indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05)..

청국장 추출물의 총 플라보노이드 함량(Table 2)은 DS와 NPS가 발효 전 12.99±1.08 µg QE/g, 20.28±1.44 µg QE/g으로 측정되었으며, 발효 24, 48, 72시간 후 DS는 19.83±7.75 µg QE/g, 19.61±6.15 µg QE/g, 32.36±7.12 µg QE/g으로 증가하였고 NPS는 25.38±5.14 µg QE/g, 48.40±7.84 µg QE/g, 64.26±7.41 µg QE/g으로 측정되어 앞선 결과와 같이 발효 기간에 따른 항산화 활성의 유의적 증가를 확인하였다.

퀴노아를 첨가하여 제조한 청국장의 발효 기간이 증가함에 따라 총 페놀성 화합물 함량과 항산화 활성이 유의적으로 증가하여(Lee 등, 2018) 본 연구와 유사성을 확인하였다. 한편, α-amylase 활성 증가는 발효 중 대사산물을 만드는 데 도움을 주어 항산화능이 증가하였다는 연구 결과가 있다(Jung 등, 2022). 본 실험의 결과 역시 amylase 활성이 발효 72시간에 급격하게 증가하여 항산화 활성과 그에 따른 총 플라보노이드 및 총 페놀성 화합물 함량 역시 증가한 것으로 사료된다.

항산화 활성

청국장 추출물의 항산화 활성은 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능으로 확인하였다(Table 2). DPPH 라디칼 소거능은 DS 발효 전 68.89±1.02%에서 발효 48시간 이후부터 증가하여 87.37±0.41%, 91.80±4.24%로 측정되었다. NPS는 발효 24시간 후 77.40±1.10%로 측정되어 항산화 활성이 소폭 증가하였고 이후 48, 72시간에서 89.75±2.96%, 106.24±4.69%로 모든 실험군 중 가장 높게 나타났다.

ABTS 라디칼 소거능은 72시간 발효 후 DS와 NPS에서 원물 대비 4배 이상 증가하는 경향을 보였다. DS는 발효 전 18.04±6.10%의 소거능을 보이다가 앞선 실험과 마찬가지로 48시간 발효 후 증가하는 경향을 보였다. NPS는 발효 전 30.58±2.03%에서 24시간 후 70.22±2.79%로 증가하였고 72시간 경과 후 98.60±0.73%로 가장 높은 활성을 보였다.

콩을 이용한 식품의 항산화 효과는 원료인 콩의 분해로 생성된 여러 아미노산 및 펩타이드, tocopherol, phenolic acid, aglycone isoflavone 등에 의한 것이라고 보고된다(Lee 등, 2009). 본 연구에 따르면 DS와 NPS는 발효가 진행됨에 따라 항산화 활성이 증진되었고, 특히 NPS의 경우 빠른 시간 내에 항산화 활성이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한 발효가 진행될수록 NPS의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 빠른 시간 내에 증가함에 따라 항산화 활성도 같이 증가하는 것으로 나타났다. 이는 소립종인 풍산나물콩의 특성상 물리적인 분해 및 효소활성에 따른 분해가 대립종인 대원콩보다 가속화된 결과라고 판단된다.

이소플라본 함량 변화

콩에 함유된 이소플라본은 daidzein, genistein, glycitein의 aglycone과 각각의 배당체인 daidzin, genistin, glycitin 그리고 malonyl화 배당체, acetyl화 배당체가 존재한다(Kim 등, 2004). 콩은 충분히 발효시키면 대부분 이소플라본은 비배당체로 전환되는 것으로 알려져 있으며(Lee 등, 2015), 이소플라본은 nonionic passive diffusion 기작에 의해 흡수되므로 비배당체 형태가 흡수 메커니즘에 유리하다고 보고되고 있다(Setchell 등, 2001).

DS와 NPS로 제조한 청국장의 발효 중 이소플라본 함량 변화는 Table 3과 같다. DS는 발효 전 배당체인 daidzin, genistin 함량이 발효 48시간까지 감소하다가 72시간 후 증가하는 경향을 보였다. 이와 함께 total aglycone 함량은 33.71 µg/g에서 발효가 진행됨에 따라 증가하여 발효 종결점에는 244.14 µg/g으로 측정되었다. NPS의 발효 전 배당체 함량은 364.31 µg/g, 354.19 µg/g으로 DS보다 높은 함량을 보였고 마찬가지로 발효 48시간까지 감소하다가 72시간 후 증가하였다. 또한 전체적인 aglycone 함량은 NPS가 DS에 비해 높았으며, 발효 전 총배당체는 65.70 µg/g에서 발효 종결점에는 285.85 µg/g으로 측정되었다. 이는 Lee 등(2015)의 연구에서 배양액을 첨가하지 않은 청국장보다 B. subilis HJ18-9, HJ25-8 균주를 접종하여 제조한 청국장의 48시간 발효 후 aglycone이 유의적으로 높게 측정된 것과 유사한 결과였다. 콩에 함유된 β-glucosidase가 가공식품 제조 중 행해지는 수침이나 가열과정을 통해 용출되어 배당체를 genistein이나 daidzein인 aglycone 형태로 분해하는데(Setchell 등, 2001), 이러한 과정이 발효, 열처리 등에 의해 가속화된 것으로 판단된다.

Table 3

Isoflavone contents of Cheonggukjang prepared with DS and NPS (µg/g).

Isoflavone		Fermentation time (h)
		DS1)				NPS
		0	24	48	72	0	24	48	72
Glucoside	Daidzin	249.81	158.43	65.46	98.98	364.31	178.08	71.86	155.60
	Genistin	285.50	197.60	104.50	134.30	354.19	200.53	103.69	174.19
Aglycone	Daidzein	33.71	72.98	89.61	150.60	31.11	106.00	148.71	205.25
	Genistein	0.00	59.59	62.76	93.54	34.59	79.88	81.70	80.60
Total aglycone		33.71	132.56	152.37	244.14	65.70	185.87	230.41	285.85
Total isoflavone		569.02	488.60	322.34	477.42	784.20	564.48	405.96	615.64

¹⁾DS means Daewon-soybeans, NPS means non-germinated Pungsannamul-soybeans..

유리아미노산 함량 변화

청국장은 발효과정 중에 생성되는 다양한 가수분해효소에 의해 대두의 영양성분들이 분해되어 유리아미노산, 이소플라본, aglycone 등의 함량이 높아지게 되며(Ann, 2011; Lee 등, 2014) 이러한 분해과정을 통해 소화율이 향상되고 청국장 특유의 향미와 구수한 맛을 내게 된다.

본 연구에서는 17종의 주요 유리아미노산 함량의 변화를 발효 기간에 따라 분석하면서 원재료를 달리하여 제조한 청국장의 유리아미노산 증감을 확인하였다(Table 4). 발효 종말점인 72시간 후 DS는 histidine이 16.53 µmol/g으로 가장 높았고 순서대로 alanine, lysine, glutamic acid, valine이 12.78, 11.34, 10.35, 9.46 µmol/g의 함량을 보였다. NPS에서도 histidine이 21.23 µmol/g으로 가장 높았고 lysine, glutamic acid, alanine, aspartic acid가 17.53, 16.61, 15.76, 11.94 µmol/g의 함량을 나타냈다. 청국장의 맛은 발효 중에 생성되는 아미노산의 조성과 관련이 있는 것으로 보고되고 있으며 glutamic acid와 aspartic acid의 함량이 높으면 구수한 맛이 강해지고, alanine, glycine 및 lysine의 함량이 높으면 단맛이 강해진다고 알려져 있다(Kim 등, 1998). 본 연구에서 맛에 영향을 주는 아미노산은 대부분 발효에 따라 증가하는 경향을 보였으며 특히 발효 종결점에서는 NPS 청국장의 아미노산 함량이 DS에 비해 더 높은 것으로 분석되었다.

Table 4

Free amino acid contents of Cheonggukjang prepared with DS and NPS (µmol/g).

Free amino acid		Fermentation time (h)
		DS1)				NPS
		0	24	48	72	0	24	48	72
Essential amino acid	Leucine	0.56	0.52	2.71	3.16	0.52	0.37	3.12	3.66
	Isoleucine	0.29	0.11	1.73	2.41	0.25	0.12	2.37	2.82
	Methionine	0.20	0.28	1.60	3.15	0.21	0.14	2.06	2.71
	Threonine	0.22	0.06	0.70	2.93	0.24	0.11	2.57	4.36
	Phenylalanine	0.74	1.90	3.52	3.89	0.64	1.54	3.87	4.19
	Lysine	0.06	0.06	0.66	11.34	0.07	0.05	4.22	17.53
	Valine	0.56	0.37	3.93	9.46	0.52	0.28	6.94	10.65
	Histidine	0.20	0.16	2.52	16.53	0.54	0.14	8.03	21.23
Non essential amino acid	Glycine	0.28	0.03	0.52	5.41	0.17	0.07	3.71	8.07
	Serine	0.17	0.05	0.20	1.45	0.22	0.07	1.97	2.68
	Glutamic acid	1.88	2.81	3.17	10.35	1.63	5.25	8.75	16.61
	Proline	0.49	0.70	2.37	7.63	0.36	1.32	5.79	8.31
	Tyrosine	0.22	1.33	3.61	6.23	0.24	0.50	5.06	5.48
	Alanine	1.54	0.26	2.84	12.78	2.93	0.36	9.68	15.76
	Asparagine	0.66	0.00	0.01	0.27	1.11	0.00	0.38	0.37
	Aspartic acid	0.59	0.11	0.16	3.01	0.49	0.14	1.81	11.94
	Arginine	0.12	0.00	0.05	1.44	0.58	0.00	0.66	1.31
Total		8.78	8.75	30.30	101.44	10.72	10.46	70.99	137.68

¹⁾DS means Daewon-soybeans, NPS means non-germinated Pungsannamul-soybeans..

본 연구에서는 콩나물 제조 시 발아되지 못해 폐기되는 미발아 풍산나물콩을 활용하여 청국장을 제조하고 이에 가공식품으로서의 활용방안을 제시하고자 하였다. 청국장은 대원콩(DS)과 풍산나물 미발아콩(NPS)에 B. subtilis 표준균주인 KCTC3135 전배양액을 2% 접종하여 제조하였으며 0, 24, 48, 72시간 발효하여 실험에 사용하였다. NPS는 발효 72시간 후 pH 8.18±0.04, 총산도 0.20±0.02%, 수분함량 56.48±1.58%, 수용성 고형분 3.70±0.70°Brix로 분석되어 DS와 이화학적 발효특성이 유사하였다. 또한 장류 숙성의 지표로 사용되는 아미노태 질소는 NPS가 DS보다 1.75배 높았으며 장류에서 아미노산을 생성하는 효소인 protease 활성도 1.2배 높게 측정되었다. 총 페놀성 화합물과 총 플라보노이드 함량은 NPS에서 121.89±4.74 µg/g, 64.26±7.41 µg/g로 측정되어 DS보다 유의적으로 높았으며 DPPH 라디칼 소거 활성 또한 DS보다 높은 항산화 활성을 확인하였다. 청국장의 이소플라본은 발효 중 배당체 형태에서 당이 제거되어 총 aglycone 함량이 증가하였으며 NPS에서 41.71 µg/g 더 높게 분석되었다. 한편 장류의 맛과 향미를 나타내는 유리아미노산 함량은 대부분 발효에 따라 증가하였으며, 특히 구수한 맛을 내는 glutamic acid, aspartic acid 함량은 DS보다 NPS에서 1.6, 3.9배 높았고 단맛을 내는 alanine, glycine은 1.23, 1.49배 높게 분석되었다. 따라서 콩나물로 발아되지 못해 폐기되던 미발아 풍산나물콩은 발효 시 발효특성과 기능성에서 가치가 있으며 발효를 통해 항산화 효과 증진과 이소플라본, 유리아미노산 증가 등의 생리활성 성분이 향상되어 청국장 제조 등 가공식품 원료로서의 활용 가치가 있다고 판단되었다.

본 논문은 전주시 농산자원 고부가 관광상품 개발사업의 연구비 지원으로 이루어졌으며, 이에 감사드립니다.