땅콩(Arachis hypogaea L.)은 콩과(Fabaceae)에 속하는 1년생 초본 식물로(Stalker, 1997) 유지 함량이 높기 때문에 유지원료 작물로 재배되며, 식용 기름으로 이용되거나 제품의 원료로써 다양한 형태로 가공되어 전 세계적으로 널리 소비되는 견과류이다(Kim 등, 2019). 최근 유지의 지용성 영양성분, 산화 안정성 및 이화학적 특성에 대한 연구(Lim 등, 2017)와 함께 땅콩은 기능성 식품으로 주목받고 있다. 땅콩은 페놀 화합물, stilbene, lignan, isoflavonoid 및 phytosterol과 같은 생리활성 화합물을 함유하고 있어 다양한 질병과 관련된 항산화 활성을 나타낸다(Jung 등, 2020). 땅콩의 섭취는 항산화, 항암 효과(Wang 등, 2005)뿐만 아니라 동맥경화 예방(Reaven, 1994), 지질산화 방어(Inal 등, 2001; Koh 등, 1999) 등의 기능이 있는 것으로 보고되었다. 또한, 땅콩은 혈중 콜레스테롤 저하 및 심혈관계 질환 예방에 직접적인 역할을 할 수 있다(Kris-Etherton 등, 2001).

땅콩의 주요 생리활성 성분은 추출과정 중 불검화물에서 찾아볼 수 있다. 불검화물이란 유지 내 검화되지 않는 미량성분을 말하며, 불검화물에는 squalene, lipophilic pigment, tocopherol 및 phytosterol 등이 포함되어 있다. 이 중 phytosterol은 가장 중요한 생리활성 인자로 알려져 있으며(Kamal-Eldin, 2005), 불검화물의 대부분을 차지한다(Moreau 등, 2002). Phytosterol은 구조적으로 콜레스테롤과 유사하기 때문에 장내 콜레스테롤 흡수를 경쟁적으로 저해하여 혈중 콜레스테롤 농도를 낮추며, HDL-콜레스테롤 수준을 향상시킨다(Ostlund 등, 2002). 따라서 phytosterol은 혈청 지질 프로필을 개선하고 심혈관 질환 위험을 줄일 수 있다(Arya 등, 2016). 이 밖에도 항산화, 항염 및 항암 활성 등의 효과가 알려지면서 phytosterol 섭취의 중요성이 대두되고 있다(Bacchetti 등, 2011; Wang 등, 2002).

최근 소비자들의 소득수준이 높아지면서 건강에 관한 관심도 높아지고 관련된 식품시장 규모 또한 커지고 있는 경향이다(Kim 등, 2023). 식품에 대한 의존도가 증가함에 따라 올바른 영양성분의 함량을 제공하는 것의 중요함을 인식한 선진국에서는 주요성분에 대한 데이터베이스를 구축하기 시작하였다. 미국은 자체적으로 식품의 영양성분 데이터베이스를 농무부(US Department of Agriculture)에서 제공하며(Sebastian 등, 2023), 일본의 국립건강영양연구소는 기능성 식품 인자 데이터베이스(Japan Functional Food Factor database)를 발행한 적이 있다(Yang 등, 2012). 우리나라도 농촌진흥청을 중심으로 농식품올바로 데이터베이스가 운영되고 있으나 phytosterol 정보는 제공되고 있지 않다. 따라서 향후 식품의 영양성분 데이터베이스를 제공하기 위해서는 phytosterol을 포함한 다양한 성분의 데이터베이스를 구축하는 것이 필요하다. 우리나라에서 소비되는 다양한 식품의 phytosterol 분석을 위해서는 식품마다 적용할 수 있는 신속 정확한 분석 방법의 확보가 중요하다.

식품에서 발견되는 주된 phytosterol은 β-sitosterol, campesterol 및 stigmasterol이며, 유리 형태로 존재하거나 에스테르 및 글리코시드 결합 형태로 존재한다(Lagarda 등, 2006). 결합된 sterol은 정량 전에 검화를 이용하여 유리 형태로 가수분해하는 것이 필수적이다(Islam 등, 2017). 이러한 검화는 에스테르 결합을 가수분해하여 총 phytosterol을 분석하는 일반적인 단계이다(Feng 등, 2022). 검화를 이용한 추출은 용매, KOH의 농도, 검화 시간, 검화 온도, 유도체화 시간 등과 같은 조건의 영향을 받는다(Garcia-Llatas 등, 2021). 최근에는 식품에서 이와 같은 검화 매개변수의 최적화를 통해 효율적인 검화 추출법이 제안되고 있다. 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)은 실험변수에 따라 서로 다른 경향을 가지는 목표치에 대해 최적의 추출조건을 예측할 수 있는 최적화 방법이다(Lee 등, 2017). 따라서 본 연구에서는 반응표면분석법을 이용하여 땅콩으로부터 주요 phytosterol인 campesterol, stigmasterol 및 β-sitosterol의 추출조건을 최적화하고자 하였다.

재료

본 연구에 사용된 땅콩은 2020년 전라북도 고창에서 생산된 신팔광 품종으로 대형마트에서 구입하였다. 땅콩은 속껍질까지 제거하였으며 분쇄기(Artlon Gold Mix, model DA338-G)를 이용하여 분말 형태로 분쇄한 후 -20°C에서 보관하여 분석용 시료로 사용하였다. Campesterol, stigmasterol, β-sitosterol, 5α-cholestane 표준품과 N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamid(MSTFA)는 Sigma-Aldrich 제품을 사용하였고 pyridine은 Junsei에서 구입하였으며, KOH와 NaCl은 Samchun에서 구입하여 사용하였다.

실험설계

Box-Behnken design(BBD)에 따라 3가지 독립변수(X₁: 60% KOH의 양 5~15 mL, X₂: 75°C에서의 검화 시간 15~55 min, X₃: 최종 에탄올 농도 25~45%)를 설정하였다. 3개 독립변수의 범위를 설정하고 -1, 0, 1, 총 3단계로 부호화하였다. BBD에 따라 총 15구간을 설정하여 추출실험을 진행하였으며 중심점(10 mL KOH, 35 min 검화 시간, 35% 에탄올 농도)에서만 3회 반복하여 이들의 편차를 이용하여 다른 실험 조건의 차이를 통계적으로 검증하였다(Table 1). 종속변수로 campesterol, stigmasterol 및 β-sitosterol 함량을 측정하였다.

Table 1

Saponification and extraction variables, levels, and experimental data.

Treatment no.1)	Variables			Phytosterols
	Amount of 60% KOH (mL) X1	Saponification time at 75°C (min) X2	Final ethanol concentration (%)2)X3	Campesterol (mg/100 g)	Stigmasterol (mg/100 g)	β-Sitosterol (mg/100 g)
1	15(1)3)	55(1)	35(0)	9.20	5.37	47.20
2	15(1)	15(−1)	35(0)	8.70	5.19	45.48
3	5(−1)	55(1)	35(0)	7.50	4.79	38.49
4	5(−1)	15(−1)	35(0)	8.11	4.68	41.49
5	15(1)	35(0)	45(1)	9.62	5.63	50.10
6	15(1)	35(0)	25(−1)	7.17	4.04	38.15
7	5(−1)	35(0)	45(1)	9.49	5.61	48.81
8	5(−1)	35(0)	25(−1)	5.64	3.30	29.02
9	10(0)	55(1)	45(1)	10.22	5.91	52.26
10	10(0)	55(1)	25(−1)	6.46	3.86	33.03
11	10(0)	15(−1)	45(1)	8.84	5.25	46.25
12	10(0)	15(−1)	25(−1)	6.43	3.84	33.67
13	10(0)	35(0)	35(0)	7.86	4.67	40.68
14	10(0)	35(0)	35(0)	8.20	4.82	42.39
15	10(0)	35(0)	35(0)	7.91	4.63	40.77

¹⁾Treatments were run in a random order without repetition..

²⁾Final ethanol concentration was adjusted by 2% NaCl solution..

³⁾(−1), (0), and (1) are coded levels..

Phytosterol 추출

환류냉각기가 달린 실린더에 땅콩 분말 2 g을 취하여 6% pyrogallol을 함유한 에탄올 20 mL를 넣은 후 60% KOH를 실험설계에 따라 일정량 첨가한 후 75°C water bath에서 검화하였다. 상온에서 냉각 후 2% NaCl을 함유한 증류수를 넣어 에탄올 농도를 조정하고 20 mL의 추출용매(hexane 100%, 0.01% BHT 함유)로 3회 추출하였으며 MgSO₄를 통하여 추출액의 수분을 제거하고 최종 50 mL로 정용하였다.

GC-FID를 이용한 phytosterol 성분 분석

Phytosterol은 Schothorst와 Jekel(1999)의 방법을 변형하여 분석하였다. 50 mL로 정용한 땅콩 추출물 5 mL를 질소로 농축한 후 101.16 μg/mL 농도로 5α-cholestane을 함유한 chloroform 1 mL를 첨가하여 재용해하고 유도체화를 진행하였다. 유도체화는 MSTFA와 pyridine을 각각 50 μL 첨가하여 60°C에서 20분간 진행하였다. 유도체화가 완료된 반응액은 0.45 µm PTFE membrane filter(Whatman)로 여과하여 GC-flame ionization detector(FID)로 분석하였다. GC(Agilent Technologies 7890A)의 분석 조건은 다음과 같다. 컬럼은 SAC^TM-5 FUSED SILICA Capillary Column(30 m×0.25 mm×0.25 μm, Supelco), 검출기는 FID를 사용하여 측정하였다. 주입구 온도와 검출기 온도는 300°C로 하였으며 오븐 온도는 285°C에서 20분간 유지시켰다. Injection volume은 2 μL이며, carrier gas는 N₂ gas(99.999%)를 흘려주었고 split ratio 10:1, flow rate 1.0 mL/min으로 하였다.

Phytosterol 정량

Phytosterol 정량은 internal standard(5α-cholestane)를 이용하여 계산된 internal response factor(IRF)가 사용되었다. IRF는 phytosterol 표준품(campesterol, stigmasterol 및 β-sitosterol)과 internal standard(5α-cholestane)를 동일한 농도로 주입하여 구하였다. IRF는 다음과 같이 계산되었으며 P는 peak area이고 A는 amount이다.

시료의 phytosterol 함량은 다음과 같이 IRF를 기반으로 한 공식으로 계산되었다.

통계처리

반응표면분석법은 독립변수 X_i와 X_j에 대한 종속변수 Y(campesterol, stigmasterol 및 β-sitosterol 함량)를 다음과 같은 2차 회귀식으로 나타내었으며, β₀는 상수이고 β_i, β_ii, β_ij는 회귀계수이다.

반응표면 그래프는 Minitab ver. 14.12(Minitab Inc.)를 사용하였다. 통계처리는 SAS ver. 9.4 소프트웨어를 사용하였으며, 모델의 적합성을 회귀계수(R²)를 분석하여 평가하였다. 데이터 간의 유의적인 차이는 one-way ANOVA의 Duncan’s multiple range test를 통해 P<0.05 수준에서 검증하였다.

모델의 적합성 평가

Phytosterol은 장내 콜레스테롤 흡수를 억제하여 혈장 콜레스테롤 수치를 감소시키는 인체에 유익한 생리활성 성분으로 주목받고 있다(Deng 등, 2016). 식품의 phytosterol 추출은 초임계 유체 추출, 마이크로웨이브 추출, 고체상 추출 및 알칼리 가수분해 등을 사용할 수 있는데, 그중 알칼리 가수분해법인 검화는 가장 일반적으로 사용되는 방법으로 본 실험에 phytosterol 추출을 위해 적용하였다(Garcia-Llatas 등, 2021). 반응표면분석법을 이용하여 땅콩으로부터 phytosterol의 효율적인 추출조건을 도출하기 위해 60% KOH의 양(5~15 mL), 75°C에서의 검화 시간(15~55분), 최종 에탄올 농도(25~45%)를 독립변수로 설정하였다. 종속변수는 주요 phytosterol인 campesterol, stigmasterol 및 β-sitosterol로 설정하였다. BBD에 의해 설계된 15구간의 추출조건에서 얻어진 종속변수의 결과는 Table 1과 같다. 각 조건에 따른 phytosterol 함량은 campesterol 5.64~10.22 mg/100 g, stigmasterol 3.30~5.91 mg/100 g 및 β-sitosterol이 29.02~52.26 mg/100 g으로 나타났으며, 60% KOH를 10 mL 첨가하고 75°C에서 55분 동안 검화하여 최종 에탄올 농도를 45%로 추출한 조건에서 3가지 phytosterol 모두 최댓값을 보였다. 이는 Shin 등(2010)의 상업용 땅콩의 주요 phytoserol이 β-sitosterol, campesterol 및 stigmasterol 순서로 많이 존재한다는 결과와 같았으며, 분석한 phytosterol 함량과도 유사한 경향을 나타냈다. Feng 등(2020)은 히코리 껍질의 phytosterol 추출 최적화에서 총 phytosterol 수율의 최솟값과 최댓값 차이가 약 2배로 나타났으며, 조건에 따라 총 phytosterol 함량이 약 2배 차이를 보인 본 연구 결과와 유사한 차이를 보였다.

추출조건과 실험값을 바탕으로 도출한 2차 회귀식에 대한 상수 및 회귀계수는 Table 2에 나타냈다. 2차 회귀식의 적합성 평가는 독립변수가 종속변수에 미치는 영향을 판단하는 주요 요소로 P값이 0.05보다 작을수록 높은 통계적 의미가 있는 것으로 판단한다(Lee 등, 2018). 도출된 2차 회귀식의 일차항 중 75°C에서의 검화 시간(β₂) 및 최종 에탄올 농도(β₃)는 모든 종속변수에 대해 P값이 0.05 이하로 유의적인 결과를 보였으며, stigmasterol에 대해서는 일차항에서 최종 에탄올 농도(β₃)의 P값이 0.01 이하로 유의성이 인정되었다. 독립변수 중 최종 에탄올 농도가 phytosterol의 추출효율에 가장 큰 영향을 주는 것으로 사료된다. 회귀분석 결과를 바탕으로 종속변수인 campesterol, stigmasterol 및 β-sitosterol 모델식의 적합도를 평가하였다(Table 3). 3가지 종속변수 모두 회귀모델의 R² 값이 0.98 이상으로 98% 이상의 신뢰 수준에서 적합성이 인정되었다. 적합성 결여 검정(lack of fit)은 3가지 phytosterol 함량에 대해 P>0.1로 유의성이 기각되어 반응표면모형이 이들의 campesterol, stigmasterol 및 β-sitosterol 함량의 변화를 설명하는 데 적합함을 확인하였다.

Table 2

Regression coefficients of the second-order polynomial equations.

Coefficient1)	Campesterol	Stigmasterol	β-Sitosterol
β0	0.766	−0.547	4.216
β1	0.095	0.074	0.696
β2	−0.113*	−0.056*	−0.529*
β3	0.307*	0.224**	1.463*
β11	0.008	0.005	0.042
β22	0.0005	0.0005*	0.002
β33	−0.002	−0.002*	−0.008
β12	0.003	0.0002	0.012
β13	−0.007	−0.004*	−0.039*
β23	0.002	0.0008*	0.008*

¹⁾β₀ represents intercept and β₁, β₂, and β₃ represent amount of 60% potassium hydroxide, saponification time at 75°C and final ethanol concentration, respectively..

Significant at ^*P<0.05, ^**P<0.01..

Table 3

Analysis of variance for saponification and extraction variables as linear, quadratic term, and interactions on response variables.

Source	Degree of freedom	Sum of square
		Campesterol	Stigmasterol	β-Sitosterol
Model	9	23.304**	7.862**	615.251**
Linear	3	21.599**	7.317**	573.733**
Quadratic	3	0.451	0.312*	9.526
Cross product	3	1.254	0.233	31.992*
Lack of fit	3	0.341	0.057	6.178
Pure error	2	0.067	0.02	1.852
Total error	5	0.408	0.077	8.03
R2		0.9828	0.9903	0.9871

R²=coefficient of determination..

Significant at ^*P<0.05, ^**P<0.01..

추출조건이 phytosterol 함량에 미치는 영향

추출조건에 따른 땅콩의 phytosterol 함량 변화는 Table 4에 나타내었다. 60% KOH의 양은 campesterol 및 stigmasterol 함량에 있어서 유의수준 P<0.05로 유의적인 영향을 주었으며, β-sitosterol 함량에서는 P<0.01의 유의수준을 보였다. 이는 Lee 등(2000)의 토마토 및 브로콜리에서 검화 시 첨가하는 60% KOH 양이 α-tocopherol 함량에 있어서 유의수준 P<0.05로 유의적인 영향을 주어 중요한 요소로 작용했다는 결과와 유사했다. 75°C에서의 검화 시간은 stigmasterol 함량에만 유의수준 P<0.01로 유의적인 영향을 주었다. 최종 에탄올 농도는 campesterol, stigmasterol 및 β-sitosterol 함량에 모두 유의수준 P<0.01로 가장 유의적인 영향을 주었다.

Table 4

Analysis of variance showing significance of the variables on responses.

Independent variables1)	Degree of freedom	Sum of square
		Campesterol	Stigmasterol	β-Sitosterol
KOH	4	2.88*	0.61*	91.83**
TIME	4	1.12	0.35*	21.28
EtOH	4	20.53**	7.12**	533.68**

¹⁾KOH, TIME, and EtOH represent amount of 60% potassium hydroxide, saponification time at 75°C and final ethanol concentrated adjusted by 2% NaCl solution, respectively..

Significant at ^*P<0.05, ^**P<0.01..

2차 회귀식에 기반한 반응표면 그래프에 따르면 첨가되는 60% KOH의 양이 많아짐에 따라 campesterol 및 stigmasterol 함량이 약간 증가하지만 최종 에탄올 농도에 비해서는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 최종 에탄올 농도가 높아질수록 campesterol, stigmasterol 및 β-sitosterol 함량이 증가함을 알 수 있다(Fig. 1).

Fig 1. Response surface plots for the concentration (mg/100 g) of campesterol (A∼C) and stigmasterol (D∼F), β-sitosterol (G∼I) depending on three variables, amount of 60% KOH (KOH, mL), saponification time at 75°C (TIME, min), and final ethanol concentration (EtOH, %).

따라서 독립변수에서 최종 에탄올 농도가 phytosterol의 함량에 가장 큰 영향을 주는 것을 확인하였다. 이는 sterol이 활성을 띠고 수소 결합을 형성할 수 있는 수산기 화합물이기에 에탄올 농도에 따라 달라지는 극성이 결합에 영향을 미쳤기 때문으로 판단된다(Shen 등, 2021). 반면에 Zan 등(2021)은 작약 씨 기름에서 α-linolenic acid의 검화 추출 시 에탄올의 농도가 증가할수록 추출수율이 감소하나 전체적인 변동이 작아 에탄올의 농도는 거의 영향을 미치지 않음을 보고하였다. 75°C에서의 검화 반응 시간에 따라서는 영향이 없거나 phytosterol 함량이 약간 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 Almeida 등(2020)의 식물성 기름의 phytosteol 분석에서 검화 시간이 증가할수록 추출효율이 증가한다는 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 시간이 길어짐에 따라 용매로의 sterol 이동 시간이 생기면서 효율이 향상될 수 있으나 장기간 추출 시 수율은 증가하지 않는다(Shen 등, 2021). Souza 등(2014)은 땅콩으로부터 토코페롤 분석을 위한 추출 시 KOH의 농도와 검화 시간이 증가할수록 추출효율이 감소한다고 보고하여 본 연구와는 다른 결과를 보였다.

Phytosterol 최적 추출조건의 검증

땅콩으로부터 주요 phytosterol 성분인 campesterol, stigmasterol 및 β-sitosterol을 보다 효율적으로 동시에 추출하기 위한 최적 추출조건은 첨가되는 60% KOH의 양 11.2 mL, 75°C에서의 검화 시간 44.5분, 최종 에탄올 농도 43.4%였다. Table 5는 최적 추출조건에서 얻은 예측치와 그 조건에서 실제 실험에 의해 얻은 실측치를 비교하였다. 3가지 독립변수에 따른 phytosterol 함량 관계를 나타낸 이차다항식은 다음과 같다.

Table 5

Predicted value of the responses at optimized conditions.

Responses	Optimum conditions1)			Predicted value (mg/100 g)	Experimental value2) (mg/100 g)
	Amount of 60% KOH (mL)	Saponification time at 75°C (min)	Final ethanol concentration (%)
Campesterol	11.44	44.28	43.38	9.52(9.51)3)	9.28±0.14
Stigmasterol	10.76	45.95	43.23	5.56(5.55)	5.45±0.03
β-Sitosterol	11.50	42.82	43.70	49.06(48.97)	48.99±0.54

¹⁾Optimum conditions were obtained from ridge analysis..

²⁾Experimental values were obtained using 11.2 mL (amount of 60% KOH), 44.5 min (saponification time) and 43.4% (final ethanol concentration) for peanut..

³⁾The values in parenthesis were predicted values using 11.2 mL of 60% KOH, 44.5 min of saponification time, and 43.4% of final ethanol concentration..

여기서 Y는 phytosterol 함량이며 독립변수인 60% KOH의 양 X₁, 검화 시간 X₂, 최종 에탄올 농도 X₃로 상관시켰다.

최적 추출조건에서 예측된 값은 campesterol, stigmasterol 및 β-sitosterol이 각각 9.51 mg/100 g, 5.55 mg/100 g 및 48.97 mg/100 g이었다. 실측치는 campesterol 9.28 mg/100 g, stigmasterol 5.45 mg/100 g 및 β-sitosterol 48.99 mg/100 g으로 유의적인 차이는 없었으며, 예측값의 신뢰성을 뒷받침하여 본 조건이 땅콩의 phytosterol 추출조건 최적화에 적용될 수 있음을 보여준다.

견과류 및 종실류에 속하는 땅콩은 phytosterol이 풍부한 식품으로 알려져 있다. 본 연구에서는 Box-Behnken design으로 설계한 반응표면분석법을 이용하여 땅콩으로부터 주요 phytosterol 성분의 추출조건을 최적화하였다. 추출 및 검화 단계의 최적화를 위해 60% KOH의 양(5~15 mL), 75°C에서의 검화 시간(15~55분) 및 최종 에탄올 농도(25~45%)에 따른 땅콩의 campesterol, stigmasterol 및 β-sitosterol 3가지 함량을 평가하였다. 회귀분석 결과를 바탕으로 유의미한 결정계수가 나타났으며 적합성 결여 검정의 유의성이 기각되어 반응표면 모델이 적합함을 확인하였다. 능선분석을 통해 얻은 최적 조건은 60% KOH의 양 10.76~11.50 mL, 75°C에서의 검화 시간 42.82~45.95분 및 최종 에탄올 농도 43.23~43.70%였다. 최적 조건에서 추출한 phytosterol 성분 함량의 실측치는 예측치와 유사한 값을 나타내었다. 따라서 반응표면분석법과 능선분석을 이용하여 땅콩의 phytosterol 함량 분석을 위한 추출조건을 최적화하였다. 본 연구에서 도출한 최적 추출조건은 땅콩뿐만 아니라 비슷한 매트릭스를 가지는 다양한 견과류에도 적용될 수 있을 것으로 사료되며 식품의 phytosterol 성분 기능성 데이터베이스 구축에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구는 농촌진흥청 연구비 지원(과제번호 P5017079)에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.