인체의 장관은 장내 미생물의 저장소로서 음식물의 소화, 흡수 및 배설 등 중요한 기능을 수행한다(Kim과 Ho, 2010). 그중 장 내막에 분포하고 있는 goblet cell은 mucin이라 불리는 점액질을 분비하여 장 내강의 일차적인 방어막을 형성할 뿐만 아니라, TFF-3와 같은 단백질을 분비하여 장 상피세포의 tight junction(TJ) 형성을 강화한다(Hwang 등, 2017). TJ는 장관을 구성하는 장 상피세포가 형성하는 세포 및 단백질 접합 복합체로, 활성화된 장 상피세포가 분비하는 ZO-1, occluding, claudin-1과 같은 다양한 단백질들이 관여하는 것으로 알려져 있다(Smith 등, 2004). 이러한 TJ는 구강을 통해 체내로 유입된 감염원, 미생물, 병원체 등에 대해 선택적인 투과성을 부여하기 때문에 mucin과 더불어 장내 환경을 유지함에 있어서 매우 중요한 기능을 수행한다(Suzuki, 2013). 특히 mucin과 TJ가 형성하는 장내 일차적 방어막이 손상될 경우 감염원에 대해 직접적으로 노출된 면역세포들은 폭발적인 염증 반응으로 이어지는데, 이는 곧 새는 장 증후군(leaky gut syndrome)으로 이어져 세포 혹은 조직에 직접적인 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다(Rao, 2008; Son 등, 2022). 이러한 세포 및 조직 손상이 지속적으로 유지될 경우 복통, 설사, 체중감소, 소화불량, 혈변과 같은 병리적 증상들이 나타나는데, 이를 염증성 장질환(inflammatory bowel disease)이라 부르며, 그 정도와 병변의 위치에 따라 다시 크론병(Crohn’s disease) 혹은 궤양성 대장염(ulcerative colitis)으로 구분할 수 있다(Gismera와 Aladrén, 2008; Son 등, 2022; Yang 등, 2008). 따라서 mucin과 TJ와 같은 장내 환경을 정상 수준으로 유지 혹은 강화하는 것은 체내 항상성 유지에 기여할 뿐만 아니라 최근 확산일로에 있는 염증성 장질환을 예방함에 있어 중요한 인자로 작용한다고 말할 수 있다.

갈락토올리고당(galactooligosaccharide, GOS)은 인간 모유에 존재하는 human milk oligosaccharide와 구조적으로 유사하여 유아용 조제분유 첨가물로써 널리 사용되고 있다(Guo 등, 2018). 이외에도 많은 연구를 통해 프리바이오틱스 효과뿐 아니라 다양한 생리활성을 갖는 것으로 밝혀져 새로운 기능성 소재로 주목받고 있다. 이러한 GOS는 주로 lactose와 효소를 이용한 반응을 통해 제조되는데, β-galactosidase에 의해 lactose는 glucose와 galactose로 가수분해되고, 다시 glucose와 galactose 분자들이 당 사슬에 재결합되는 transgalactosylation 반응을 통해 생성된다(Warmerdam 등, 2013). 이렇게 생성된 GOS는 매우 다양한 당쇄 결합 양식을 갖게 되며 그 중합도(degree of polymerization)는 2~9 사이를 갖는 것으로 알려져 있다(Yin 등, 2017a, 2017b). GOS는 매우 복잡한 당쇄 결합 양식을 갖기 때문에 소화 과정에 의해 분해되지 않고 대장으로 이동해 장내 미생물의 영양원으로 작용하는데, 이때 장내 미생물의 대사 과정 중 단쇄지방산과 같은 생리활성 물질을 생성하는 것으로 밝혀져 있다(Pan 등, 2009). 이에 따라 본 연구진은 B. circulans를 이용하여 생물 전환된 GOS가 dextran sulfate sodium으로 유도된 염증성 장질환 마우스 모델에서 강력한 개선효과가 보임을 기 보고한 바 있다(Park 등, 2021). 따라서 본 연구에서는 B. circulans를 이용하여 생물 전환된 GOS가 장관을 구성하는 goblet cell과 장 상피세포 유래 세포주 LS174T와 Caco-2에 대해 어떠한 효과가 있는지 in vitro 상에서 확인함으로써 GOS의 항염증성 장질환 효과에 대한 세부 기작을 제시하고자 하였다.

재료 및 시약

본 실험에서 사용한 GOS(NeoGOS-P70^TM)는 공동연구기관인 (주)네오크레마로부터 lactose를 기질로 하여 생물전환을 통해 생산한 시판 제품을 제공받아 사용하였다. GOS의 제조 공정은 Fig. 1에 제시된 바와 같다.

Fig 1. Manufacturing process of GOS.

본 연구에 사용된 세포주인 LS174T와 Caco-2는 한국세포주은행에서 분양받았으며 37°C, 5% CO₂ 조건의 세포배양기에서 배양하였다. 세포주 배양을 위해 사용된 fetal bovine serum(FBS)과 RPMI 1640 medium은 Welgene 사의 제품을 사용하였으며 penicillin/streptomycin과 DMEM medium은 Gibco 사에서 합성하여 사용하였다. RT-PCR을 위해 사용된 primer는 Bioneer 사에서 합성하여 사용하였고, 양성 대조군으로 사용된 propionate는 Sigma-Aldrich 사의 제품을 사용하였다.

LS174T를 이용한 증식능 측정

GOS가 LS174T의 증식능에 미치는 영향을 확인하기 위해 1.5×10⁵ cells/mL로 조제한 세포용액을 96-well plate에 100 µL씩 분주하였으며, 24시간 동안 37°C, 5% CO₂ 조건의 세포배양기에서 배양하였다. 그 후 다양한 농도의 GOS를 처리하고 24시간 배양하였으며 상등액을 제거하였다. 음성대조군으로는 배지만을 사용하였다. 이후 EZ-cytox(DoGen)를 phosphate buffered saline(PBS)에 10배 희석하여 100 µL씩 처리하였으며 spectrophotometer를 이용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

LS174T를 이용한 mRNA 발현량 측정

GOS가 LS174T의 MUC2와 TFF-3의 mRNA 발현량에 미치는 영향을 확인하기 위해 4×10⁵ cells/mL의 농도로 현탁한 LS174T를 6-well plate에 2 mL씩 분주하였으며, 24시간 동안 37°C, 5% CO₂ 세포배양기에서 배양하였다. 이후 다양한 농도의 GOS를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 음성대조군으로는 배지를, 양성대조군으로는 propionate(1 mM)를 사용하였다. 그 후 RNeasy Mini kit(QIAGEN)을 이용하여 mRNA를 추출하였으며, Nanodrop 2000 spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 추출된 mRNA를 정량하였다. 이어서 cDNA synthesis kit(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 cDNA 합성을 진행한 후 rtPCR을 위해 사용하였다. 이후 PowerSYBR^® Green PCR Master Mix(Applied Biosystems), cDNA 및 primer를 혼합하여 rtPCR을 진행하였고, relative mRNA expression은 Step One Plus System(Applied Biosystems)을 이용하여 확인하였다. rtPCR의 조건은 95°C(15 s), 60°C(15 s), 72°C(30 s)로 설정하였으며 40 cycle을 반복하여 증폭시켰다. 측정된 comparative Ct 값은 housekeeping gene으로 사용된 GAPDH의 Ct 값을 뺀 값으로 상대 정량값을 계산하였다. 사용된 primer의 염기 서열은 Table 1에 제시한 바와 같다.

Table 1

Human TFF-3, MUC2, ZO-1, Occludin, Claudin-1, and GAPDH primers for rtPCR.

TFF-3	Forward Reverse	CAG CTT TTC TGT CCC TTT GC CAC GAC GCA GCA GAA ATA AA
MUC2	Forward Reverse	ACC CGC ACT ATG TCA CCT TC GGA CAG GAC ACC TTG TCG TT
ZO-1	Forward Reverse	TGA GGC AGC TCA CAT AAT GC GGT CTC TGC TGG CTT GTT TC
Occludin	Forward Reverse	TTT GTG GGA CAA GGA ACA CA TCA TTC CTT TGC CAT TGG AT
Caludin-1	Forward Reverse	CGA TGA GGT GCA GAA GAT GA CCA GTG AAG AGA GCC TGA CC
GAPDH	Forward Reverse	GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG

LS174T를 이용한 mucin 생성능 측정

GOS가 LS174T의 mucin 생성에 미치는 영향을 육안으로 관찰하였다. 먼저 12 mm glass cover slip을 1% gelatin으로 24-well plate 상에서 코팅한 후 2.0×10⁵ cells/mL로 현탁한 LS174T를 500 µL씩 분주하였으며, 24시간 동안 37°C, 5% CO₂ 세포배양기에서 배양하였다. 그 후 다양한 농도의 GOS를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 음성대조군으로는 배지를, 양성대조군으로는 propionate(1 mM)를 사용하였다. 이후 배양 상등액을 제거하고 4% formaldehyde로 15분간 세포를 고정한 후 5% FBS/0.1% Triton X-100/1X PBS를 처리하여 1시간 동안 37°C에서 blocking을 진행하였다. Blocking 후 1차 항체(MUC2 ANTI-BOD, GTX 100664, 1:500)(GeneTex)를 1% BSA/0.3% Triton X-100/1X PBS에 희석하여 250 µL씩 24시간 동안 37°C에서 처리하였다. 이후 2차 항체(Alexa Flour 488 Anti-rabbit IgG, 4412S, 1:1,000)(Cell Signaling Technology)를 앞선 1차 항체 희석액과 동일한 용액에 희석하여 250 µL를 가하고 37°C에서 70분간 방치하였다. 그 후 DAPI(Vectashield) 염색 과정을 거쳐 confocal microscopy(Carl Zeiss Microscopy)를 통해 mucin의 분비를 육안으로 관찰하였다.

Caco-2를 이용한 mRNA 발현량 측정

GOS가 Caco-2의 TJ 관련 단백질들의 mRNA 발현량에 미치는 영향을 확인하기 위해 3.0×10⁵ cells/mL의 농도로 현탁한 Caco-2를 6-well plate에 2 mL씩 분주하였으며, 24시간 동안 37°C, 5% CO₂ 세포배양기에서 배양하였다. 그 후 다양한 농도의 GOS 및 GOS로 자극한 LS174T의 배양 상등액을 처리하였으며 24시간 동안 37°C, 5% CO₂ 조건의 세포배양기에서 배양하였다. 음성대조군으로는 배지를, 양성대조군으로는 propionate(1 mM)를 사용하였다. 이후의 과정은 앞서 LS174T를 이용한 mRNA 발현량 측정에 관한 방법과 동일하게 수행하였으며 사용된 primer의 염기 서열은 Table 1에서 제시한 바와 같다.

Caco-2를 이용한 TJ 강화 활성 측정

GOS가 Caco-2의 TJ 강화에 미치는 영향 측정하기 위하여 high pore density 0.4 µm insert가 장착된 24-well plate에 1.5×10⁵ cells/mL의 농도로 현탁된 Caco-2를 transwell의 상층부에 300 µL씩 분주하고 하층부에 배지를 700 µL씩 분주한 후 전기저항값(transepithelial electrical resistance, TEER; Ω･cm²)이 500Ω이 될 때까지 배양하였다. 그 후 transwell 상층부에 다양한 농도의 GOS 및 GOS로 자극한 LS174T의 배양 상등액을 처리하였다. 이후 37°C, 5% CO₂ 조건의 세포배양기에서 배양하며 전기저항치 변화를 측정하였다.

Caco-2 세포주를 이용한 단층막 투과도 측정

GOS가 Caco-2의 TJ 강화에 미치는 영향을 측정하기 위하여 high pore density 0.4 µm insert가 장착된 24-well plate에 1.5×10⁵ cells/mL의 농도로 현탁 된 Caco-2를 transwell의 상층부에 300 µL씩 분주하고 하층부에 배지를 700 µL씩 분주한 후 TEER 값이 500Ω이 될 때까지 배양하였다. 그 후 transwell 상층부에 다양한 농도의 GOS 및 GOS로 자극한 LS174T의 배양 상등액을 처리하였다. 이후 FITC-dextran(Sigma-Aldrich)을 처리하고 37°C, 5% CO₂ 조건의 세포배양기에서 6시간 동안 방치하였으며, SpectraMax GSmini EM fluorometer(Molecular Devices)를 이용해 excitation 490 nm, emission 520 nm 범위에서 형광 측정하였다.

통계 분석

모든 실험 결과는 3 반복으로 수행된 측정 항목에 대해 평균과 표준편차로 나타내었으며, 실험군 간의 차이는 SPSS Statistics version 21.0(IBM Corp.)을 이용하여 일원배치 분산분석 및 Duncan’s multiple test를 통해 분석하였다. 유의차는 P<0.05 수준에서 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

GOS의 goblet cell에 대한 활성화 효과

본 실험에서는 인간 유래 goblet cell 세포주인 LS174T를 이용하여 GOS에 의한 증식능 및 장내 환경 개선효과를 확인하고자 하였다. 실험 결과, 다양한 농도의 GOS와 배양된 LS174T는 어떠한 시료도 처리되지 않은 음성대조군에 비해 농도 의존적으로 세포 증식이 증가하는 것으로 확인되었다(Fig. 2A). 특히, 5,000 µg/mL 농도의 GOS가 처리된 실험군은 음성대조군 대비 약 1.6배의 증식 효과를 확인할 수 있었다. 또한 GOS가 LS174T에서 MUC2와 TFF-3의 mRNA 발현량에 미치는 영향을 확인하고자 LS174T에 다양한 농도의 GOS를 처리한 후 RT-PCR을 통해 확인하였다. 실험 결과, 양성대조군으로 사용된 propionate는 MUC2의 발현량을 음성대조군에 비해 약 5배 증가시키는 것을 확인할 수 있었으나, GOS를 500 µg/mL의 농도로 처리한 실험군은 음성대조군과 통계적인 유의차를 나타내지 않았다. 반면에 1,000 µg/mL 이상의 농도로 GOS가 처리된 실험군은 MUC2의 발현량이 크게 증가하는 경향을 확인할 수 있었으며, 양성대조군의 절반에 미치는 효과인 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2B). 이외에도 GOS는 TFF-3의 발현량을 농도 의존적으로 증가시킴을 확인할 수 있었으며, 특히 5,000 µg/mL의 농도로 처리된 실험군은 양성대조군으로 사용된 propionate보다 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다(Fig. 2C).

Fig 2. Effects of GOS on proliferation (A), mRNA expression (B, C) in LS174T cells. LS174T cells were incubated with GOS (500, 1,000, 2,500, and 5,000 µg/mL) for 24 h, and cell proliferation was measured by WST assay with EZ-cytox. Only media and propionate (1 mM) were used as negative (NC) and positive (PC) controls, respectively. MUC2 (B) and TFF-3 (C) mRNA expression were quantified by rtPCR and normalized to housekeeping gene (GAPDH). Means described with different letters indicate significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test (n=3).

앞선 결과를 통해 GOS는 LS174T에서 MUC2 및 TFF-3의 mRNA 발현을 효과적으로 유도하는 것으로 확인되었다. 따라서 이러한 MUC2의 발현이 실제로 MUC2의 분비 강화로 이어지는지 확인하고자, LS174T에 시료를 처리한 후 세포의 핵을 DAPI로 MUC2를 FITC로 염색하여 confocal microscopy를 이용해 관찰하였다. 실험 결과, 음성대조군은 세포로부터 분비된 MUC2의 양이 매우 적어 세포의 핵이 뚜렷하게 관찰되었으나 propionate를 처리한 양성대조군은 세포로부터 분비된 MUC2에 의해 세포의 핵이 불분명하게 관찰되는 것으로 확인되었다(Fig. 3). 또한 500 및 1,000 µg/mL의 시료를 처리한 실험군은 음성대조군과 비슷한 수준으로 MUC2가 분비되는 것으로 관찰되었으나 2,500 및 5,000 µg/mL의 시료를 처리한 실험군은 양성대조군과 유사한 수준의 MUC2 분비가 관찰되었다.

Fig 3. Effects of GOS on MUC2 secretion on LS174T cells. Immunocytofluorescence of MUC2 in LS174T cells (A). Quantification of the fluorescence intensity of FITC-labled MUC2 (B). LS174T cells were incubated with GOS (500, 1,000, 2,500, and 5,000 µg/mL) on the 12 mm cover slip coated with 1% gelatin for 24 h. Only media and propionate (1 mM) used as negative (NC) and positive (PC) controls, respectively. Means described with different letters indicate significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test (n=2).

장관을 구성하는 goblet cell은 mucin과 같은 점액을 다량 분비하여 외부로부터 침입하는 감염체 및 병원균과 같은 유해인자들에 대해 일차적인 방어막 역할을 수행해 염증성 장질환과 같은 질병 예방에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Yang과 Yu, 2021). 또한 goblet cell에서 분비되는 단백질인 TFF는 장 상피의 회복 및 장 상피세포 간의 TJ 강화를 촉진하며(Eder 등, 2017; Shestopalov 등, 2019), TFF family 중 하나인 TFF-3는 주로 장내 goblet cell에서 mucin과 함께 분비되어 Claudin-1 및 ZO-1과 같은 장 상피세포의 TJ 조절 단백질 발현 및 분비를 유도함으로써 장벽을 강화한다고 알려져 있다(Aihara 등, 2017; Olivo-Martinez 등, 2023). 따라서 본 연구 결과에서 GOS가 goblet cell 유래 세포주인 LS174T에 대하여 긍정적인 효능을 갖는 것이 확인된바, 장 환경에 긍정적인 효능을 가질 수 있을 것으로 사료되었다.

GOS의 장 상피세포에 대한 활성화 효과

앞선 결과에서 B. circulans로부터 생물전환을 통해 제조한 GOS는 LS174T에 대해 mucin 분비의 촉진과 TFF-3의 mRNA 발현을 촉진함을 확인할 수 있었다. 이러한 goblet cell의 활성화는 장 상피세포와의 활성화와도 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있기 때문에 장 상피세포 유래 세포주인 Caco-2를 이용하여 추가적인 효과를 확인하고자 하였다. 먼저 TJ 형성에 깊게 관여하는 것으로 알려진 ZO-1, Occludin, Claudin-1의 mRNA 발현량에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 이때 Caco-2에 다양한 농도의 GOS를 직접 처리한 후 시료가 세포에 직접적으로 미치는 효과와 GOS가 처리된 LS174T의 배양 상등액을 Caco-2에 처리하여 LS174T를 경유한 효과를 모두 확인하고자 하였다. 실험 결과(Fig. 4A), 시료를 Caco-2에 직접 처리한 경우 ZO-1과 Occludin은 농도 의존적으로 mRNA 발현량이 증가하는 것으로 관찰되었으며, 시료를 각각 500 및 1,000 µg/mL 이상 처리하였을 때 양성대조군 이상의 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다. 반면 Claudin-1은 시료를 5,000 µg/mL로 처리한 실험군에서만 통계적으로 유의한 차이를 나타냈으며, 2,500 µg/mL 이하의 농도를 처리한 실험군에서는 어떠한 효과도 확인할 수 없었다. 한편, GOS가 처리된 LS174T의 배양 상등액을 처리한 실험군은 ZO-1과 Occlduin의 경우, 시료를 직접 처리하였을 때보다 mRNA의 발현량이 감소하였지만 농도 의존적인 효과는 유지하는 것으로 확인되었다(Fig. 4B). 특히 Claudin-1의 발현량은 Caco-2에 시료를 직접 처리한 경우와 비교하였을 때 폭발적으로 증가한 것을 관찰할 수 있었으며, 이에 따라 시료에 의한 Claudin-1의 발현은 직접적인 처리를 통한 자극보다는 LS174T를 경유하였을 때 효과적인 것으로 사료되었다.

Fig 4. mRNA expression of ZO-1, Occludin, and Claudin-1 on Caco-2 cells. Caco-2 cells were incubated with GOS (500, 1,000, 2,500, and 5,000 µg/mL) (A) and the culture supernatant of GOS (500, 1,000, 2,500, and 5,000 µg/mL)-supplemented LS174T cells (B) for 24 h. Only media and propionate (1 mM) were used as negative (NC) and positive (PC) controls, respectively. ZO-1, Occludin, and Claudin-1 mRNA expression levels were quantified by rtPCR and normalized to housekeeping gene (GAPDH). Means described with different letters indicate significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test (n=3).

장벽 세포 간의 TJ는 장 표피에 걸쳐 분자의 확산을 제한하는 장관 내 주요 구조이다(Kim 등, 2015). 이 구조는 외부로부터 장 내로 유입되는 다양한 외부 물질들이 침투하지 못하도록 방어벽 역할을 하는 동시에 일부는 선택적으로 통과, 흡수시키는 이중적인 기능을 수행한다(Lee 등, 2012). 장관 내 TJ의 약화 또는 손상이 발생하게 되면 이러한 선택적 통과의 기능이 저하되어 감염원의 무분별한 침입이 발생하고, 장관 내 면역 시스템의 혼란, 염증반응 또는 점막 손상으로 인한 다양한 장 질환이 유발된다(Lee 등, 2021; Rao, 2008). GOS와 같은 난소화성 프리바이오틱스의 섭취는 장내 미생물들에게 영양원으로 이용되고 그 발효 산물들은 스트레스, 감염, 염증성 사이토카인으로부터 기인한 TJ의 구조 변화를 억제함으로써 장벽

손상을 완화할 수 있다고 알려져 있다(Aihara 등, 2017). TJ를 구성하는 단백질로는 claudin, occlaudin, ZO family 등이 있다. 이들은 세포 투과성을 조절하는 데 매우 중요한 역할을 수행한다(Otani와 Furuse, 2020). 특히 claudin-1은 TJ 복합체의 구성에 있어서 중추적인 역할을 한다고 알려져 있는데, occludin과 함께 사슬 형태로 배열되어 두 세포 사이를 밀봉함으로써 TJ를 강화하고 세포 투과도를 감소시키는 데 관여한다고 알려져 있다(Lee 등, 2021; Park 등, 2015). 또한 ZO family 중 하나인 ZO-1은 세포들 사이의 막간 단백질을 연결하는 역할을 수행한다(Park 등, 2015). 따라서 GOS의 TJ 강화 효과는 장벽 기능 유지에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 사료되었다.

GOS의 장 상피세포에 대한 TJ 강화 효과

앞선 결과에서 GOS는 LS174T와 Caco-2에서 TJ 강화에 깊게 관여하는 것으로 알려진 TFF-3, ZO-1, Occludin, Claudin-1의 mRNA 발현을 유도하는 것으로 확인되었다. 따라서 이러한 시료의 효과가 실제로 세포의 TJ 및 세포 투과도에 어떠한 영향을 주는지 확인하고자 Caco-2를 trans membrane well에 단층을 형성할 때까지 배양한 후 GOS 및 GOS가 처리된 LS174T의 배양 상등액을 Caco-2에 처리하여 24, 48시간 이후의 TEER 값을 측정하였다. 실험 결과(Fig. 5A), 음성대조군과 GOS를 직접 처리한 모든 실험군은 처리 시간이 지남에 따라 TEER 값이 증가하는 것으로 관찰되었으며, 특히 24시간 및 48시간 이후 모두 2,500 및 5,000 µg/mL의 농도로 시료를 처리한 실험군은 음성대조군에 비해 높은 TEER 값을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한 GOS가 처리된 LS174T의 배양 상등액을 처리한 실험군은 24시간 이후에는 뚜렷한 유의차가 나타나지 않았으며, 48시간 이후 2,500 및 5,000 µg/mL의 농도로 처리된 실험군만이 음성대조군에 비해 높은 TEER 값을 나타내는 것으로 관찰되었다(Fig. 5B).

Fig 5. Effects of GOS on enhancement of TEER value on Caco-2 cells. Caco-2 cells were incubated for 14 days. When TEER value reached at >500Ω, the cells were incubated with GOS (500, 1,000, 2,500, and 5,000 µg/mL) (A) and the culture supernatant of GOS (500, 1,000, 2,500, and 5,000 µg/mL)-supplemented LS174T cells (B). Only media and propionate (1 mM) used in negative (NC) and positive (PC) controls. TEER value was monitored every 24 h for 48 h and calculated by initial values as 100%. Means described with different letters indicate significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test (n=3).

앞선 mRNA 발현량에 이어서 GOS는 Caco-2의 TJ를 강화하는 것을 TEER 값의 변화를 통해 확인하였으며, 이에 따라 실제로 외부 물질들에 대한 세포 투과도의 변화를 확인하고자 Caco-2를 trans membrane well에 단층을 형성할 때까지 배양한 후 GOS 및 GOS가 처리된 LS174T의 배양 상등액을 Caco-2에 처리하였다. 이어서 FITC-dextran을 처리하고 6시간 후 형광 측정을 통해 세포 투과도의 변화를 관찰하였다. 실험 결과(Fig. 6A), GOS를 직접 처리한 실험군은 농도 의존적으로 세포 투과도가 감소하는 것을 관찰할 수 있었고, 이는 양성대조군으로 사용된 propionate보다 우수한 효과임을 확인할 수 있었다. 또한 GOS가 처리된 LS174T의 배양 상등액을 처리한 실험군은 농도 의존적인 효과를 나타냈으나 시료를 직접 처리한 실험군에 비해 미비한 효과인 것으로 관찰되었다(Fig. 6B).

Fig 6. Effects of GOS on cell permeability on Caco-2 cells. Caco-2 cells were incubated for 14 days. When TEER value reached at >500Ω, the cells were incubated with GOS (500, 1,000, 2,500, and 5,000 µg/mL) (A) and the culture supernatant of GOS (500, 1,000, 2,500, and 5,000 µg/mL)-supplemented LS174T cells (B). Only media and propionate (1 mM) used in negative (NC) and positive (PC) controls. The permeability of Caco-2 monolayer was measured by transportation of 4-kDa FITC dextran from the apical to the basolateral well. Means described with different letters indicate significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test (n=3).

이상의 결과들을 종합해 보았을 때 GOS는 장 상피세포 유래 세포주인 Caco-2에 직접적인 자극을 통해 TJ 관련 강화 인자들을 상향 조절시킬 뿐만 아니라 TJ를 강화시킴으로써 Caco-2 단층막의 세포 투과도를 감소시키는 것으로 확인되었다. 또한 이러한 효과는 LS174T를 경유하였을 때 일부 상향 조절되는 것으로 관찰되었다. 이는 GOS는 장내 TJ 강화에 있어 장 상피세포에 직접적인 자극뿐만 아니라 goblet cell을 경유함으로써 MUC2 및 TFF-3를 비롯한 TJ 강화 인자들의 발현 및 분비를 통해 TJ를 강화시키고, 나아가 세포 투과도를 감소시킬 수 있음을 시사한다. 따라서 GOS는 장 상피세포 및 goblet cell을 활성화시켜 장내 환경을 강화 및 개선할 수 있는 유용한 소재로 활용될 가능성을 시사하였다.

본 연구에서는 B. circulans를 활용한 생물전환을 통해 생성한 GOS(NeoGOS-P70^TM)가 장벽을 구성하는 세포에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 실험 결과, GOS는 장관을 구성하는 세포들의 TJ 형성에 긍정적인 효능을 갖는 것으로 확인되었다. GOS는 체내에서 분비되는 효소에 의해 분해되지 않고 대장에 존재하는 장내 미생물에게 영양원으로 이용될 수 있으며, 장내 병원성 미생물의 군집화를 방해하는 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한 장내 미생물의 대사에 의해 생산되는 단쇄지방산과 같은 물질들은 장관을 구성하는 세포들에 직접적인 에너지원으로 이용될 수 있는 것으로도 밝혀져 있기 때문에 산업적 이용에 대한 수요가 증가하고 있다. 따라서 본 연구 결과는 GOS를 활용한 새로운 개념의 장 건강 기능성식품 개발에 대한 기초자료로 사용될 수 있을 것으로 판단되었다.

본 연구는 2022년 경기대학교 대학원 연구원장학생 장학금 지원에 의하여 수행되었음에 감사드립니다. 또한, 본 연구의 일부는 (주)네오크레마의 연구지원에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.