갈색거저리(Tenebrio molitor, mealworm)는 딱정벌레목 거저리과로 분류되며, 한국을 비롯한 전 세계에 분포되어 있다. 알, 유충, 번데기와 성충의 시기를 거치는 완전변태를 거치는 곤충으로, 2016년 식품의약품안전처로부터 일반식품 원료로 허용받았다. 그뿐만 아니라 중국, 네덜란드 등 국외에서 식용곤충(edible insect)으로 이용되고 있다(Kang 등, 2017). 식용곤충이란 식용을 목적으로 하는 곤충을 통칭하며 현재 아프리카, 아시아, 남아메리카 및 호주 등의 많은 지역에서 동물 단백질, 필수아미노산 및 미량영양소 섭취를 위해 메뚜기, 흰개미, 딱정벌레 등의 다양한 곤충을 식용으로 이용하고 있다(Yoo 등, 2013). 갈색거저리 유충에 관한 연구는 아직은 초기 단계이나, 갈색거저리 유충에는 단백질과 불포화지방산 등의 함량이 높고, 양질의 단백질과 필수지방산 급원 식품임이 밝혀져 있으며(Kang 등, 2017), 기능성 소재로의 개발을 위한 연구 또한 활발히 진행되고 있다. 높은 항산화 활성 및 노화 억제 효과와 더불어 갈색거저리 세포사를 억제함으로 탈모 예방의 가능성이 보고되었다(Baek 등, 2017). 갈색거저리에서 분리한 항진균 단백질을 이용한 항균 효과 검증과 건조 방법별 항산화 효과, 항염증 효과 등이 보고되었으며, 동의보감과 본초강목에는 간경화, 간암, 파상풍 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Yu 등, 2016). 그러나 심혈관계 질환과 밀접한 관련이 있는 인체 혈소판에 미치는 영향은 연구되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 갈색거저리 유충 70% 에탄올 추출물(Tenebrio molitor extract, TME)을 사용하여 항혈소판 효과를 평가하였다.

혈소판은 지혈을 위한 필수적인 세포이며 동시에 혈전증을 일으킬 수 있는 세포이다. 따라서 혈소판 응집을 저해시킬 수 있는 다양한 약물이 심혈관계 질환의 예방을 위해 사용되고 있다(Jackson, 2011; Schwartz 등, 1990). 일반적인 지혈 과정에서 혈소판은 혈관의 손상 부위에 노출된 콜라겐을 매개로 활성화되며, 활성화된 phospholipase C에 의해서 혈소판 막의 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate는 inositol-1,4,5-triphosphate(IP₃)와 diacylglycerol로 가수분해하고, 생성된 IP₃는 혈소판 내부의 Ca²⁺ 농도를 증가시킨다. 이후 다양한 신호전달 분자들을 통하여 혈소판 막의 인테그린 αIIb/β3가 활성화되어 fibrin을 매개로 한 지혈 마개가 형성된다(Jennings, 2009; Ruggeri과 Mendolicchio, 2007). Clot retraction 작용은 활성화된 혈소판과 내인계 및 외인계 응고인자의 활성에 의해 생성된 fibrin의 작용에 의해서 일어나는 반응으로 지혈 마개를 더욱 견고하게 해주는 작용을 한다.

본 연구에서는 거저리 추출물이 혈소판에 응집반응과 혈소판 내부의 Ca²⁺ 농도, thromboxane A₂(TXA₂)의 생성 그리고 혈소판 막의 인테그린 αIIb/β3에 미치는 영향을 분석하였다.

재료

갈색거저리는 충청북도농업기술원 곤충 종자 보급센터에서 분양받았다. 거저리는 3일간 절식 후 세척 과정을 거쳐 건조하였고, 이후 70% 에탄올로 추출한 뒤 농축 및 동결건조하였다. Lactate dehydrogenase(LDH) cytotoxicity assay kit과 thromboxane A₂ assay kit, thapsigargin은 Cayman Chemical 사로부터 구입하였다. 그 밖의 시약들은 Sigma Aldrich에서 구입하였고, Fibrinogen Alexa Fluor 488-conjugate는 Invitrogen Molecular Probes에서 구입하였다. Western blotting 용 antibody들과 lysis buffer는 Cell Signaling에서 구입하였고, polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane과 enhanced chemiluminesence solu-tion(ECL)은 GE Healthcare에서 구입하였다.

세척 혈소판 준비

Human platelet-rich plasma(PRP)를 한국 적십자 혈액원으로부터 제공받았다. 농축혈소판을 1,300×g에서 10분간 원심분리하여 platelet pellets를 분리한 뒤 이것을 washing buffer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 0.36 mM NaH₂PO₄, 5.5 mM glucose, 1 mM EDTA, pH 6.5)로 두 번 세척하고, 이후 suspension buf-fer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 0.36 mM NaH₂PO₄, 0.49 mM MgCl2, 5.5 mM glucose, 0.25% gelatin, pH 6.9)로 재구성하여 최종 10⁸/mL 농도가 되게 하였다. 이 실험은 The Korea National Institute for Bio-ethics Policy Public Institutional Review Board의 승인을 받아 수행되었다(P01-201812-31-007).

혈소판응집반응 측정

세척 혈소판(2.10⁸/mL)에 다양한 농도의 갈색거저리 추출물(TME, 75~200 μg/mL)을 첨가하여 37°C에서 3분간 전처리한 후, 2.5 μg/mL 콜라겐으로 응집을 유도하여 aggregometer로 5분간 측정하였고, 응집능은 빛 투과도의 증가 값을 변환하여 산출하였다. Suspension buffer를 투과도 0%의 기준값으로 사용하였고, TME는 dimethyl sulf-oxide에 녹여 0.1%의 최종농도로 사용하였다.

세포독성 평가

세척 혈소판(2.10⁸/mL)에 다양한 농도의 TME(75~200 μg/mL)를 첨가하여 37°C에서 5분간 전처리한 후, 12,000×g로 15분간 원심분리하여 세포 debris를 제거한 상층을 LDH cytotoxicity assay kit으로 측정하였다. 0.1% Triton X-100으로 혈소판을 완전히 용해한 값은 양성대조군으로 100%로 기준을 정하고 TME의 값을 %로 제시하였다.

세포내 Ca²⁺ 동원 측정

세척 혈소판(2.10⁸/mL)에 5 μM의 Fura 2-AM을 처리하고 37°C에서 60분간 전처리하였다. 그 후 1,300×g에서 10분간 원심분리하고 suspending buffer에 다시 부유하여 Ca²⁺ 동원(Ca²⁺ mobilization) 측정용 혈소판을 제조하였다. 세척 혈소판에 다양한 농도의 TME(75~200 μg/mL)를 첨가하여 37°C에서 3분간 전처리한 후, 2.5 μg/mL 콜라겐으로 응집을 유도하고 5분간 반응시켰다. 형광 파장은 excitation 340 nm, emission 510 nm에서 분석되었으며, Grynkiewicz 등(1985)의 방법을 사용하여 spectrofluoro-meter로 측정하였다.

TXA₂ 분석

세척 혈소판(2.10⁸/mL)에 다양한 농도의 TME(75~200 μg/mL)를 첨가하여 37°C에서 3분간 전처리한 후, 2.5 μg/mL 콜라겐으로 응집을 유도하고 5분간 반응시켰다. 이후 indomethacin을 첨가하여 반응을 종료하고 상층액을 분리하여 ELISA reader로 측정하였다.

Fibronectin adhesion 분석

세척 혈소판(2.10⁸/mL)에 다양한 농도의 TME(75~200 μg/mL)를 첨가하여 fibronectin adhesion kit well에 넣고 37°C에서 3분간 전처리한 후, 2.5 μg/mL 콜라겐으로 반응을 유도하였다. 30분간 배양 후 PBS로 세척하고 cell staining solution으로 염색한 뒤 well에 남아있는 점착된 혈소판을 용해하여 ELISA reader로 분석하였다.

Clot retraction 측정

인체 PRP(500 μL)를 polyethylene tube로 옮긴 후 다양한 농도의 TME(75~200 μg/mL)를 첨가하여 37°C에서 10분간 전처리한 후, 0.05 U/mL thrombin으로 자극하여 20분간 반응시켰다. Y27632는 αIIb/β3의 특이적인 억제제로 사용되었다.

Western blot을 이용한 인산화 분석

세척 혈소판(2.10⁸/mL)에 다양한 농도의 TME(75~200 μg/mL)를 첨가하여 37°C에서 3분간 전처리한 후, 2.5 μg/mL 콜라겐으로 응집을 유도하고 5분간 반응시켰다. 그 후 동량의 lysis buffer를 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 혈소판 lysate는 BCA protein assay kit을 사용하여 단백질을 정량하였고 동량의 단백질을 분석에 사용하였다. 전기영동은 8~10% SDS-PAGE를 사용하였고 PVDF membrane에 단백질을 transfer 하여 ECL 시약으로 발색하였다. 혈소판은 핵이 없는 세포로 agonist 자극에 의해 새로운 단백질이 합성되지 않는다. 따라서 total form이 아닌 β-actin을기준으로 phosphorylation ratio를 표기하였다.

통계분석

측정된 모든 실험 결과는 mean±standard deviation으로 처리하여 analysis of variance로 분석하였다. 그룹 간의 평균에 유의적인 차이가 있을 경우, Newman-Keuls meth-od로 비교하여 각 그룹 간 표기하였다. P<0.05일 때 유의적인 의미가 있는 것으로 판단하였다.

혈소판 응집과 세포독성에 미치는 효과

혈소판에 콜라겐을 첨가하여 응집을 유도하였을 때 혈소판은 최대로 응집되어 86.0±1.8%의 응집률을 보였지만, 다양한 농도의 TME(75~200 μg/mL)를 첨가하였을 때 농도 의존적으로 강하게 응집이 억제되는 결과를 나타냈다(Fig. 1A). 이후 thrombin과 U46619를 agonist로 혈소판응집반응을 수행한 결과 농도 의존적인 억제 활성을 나타냈다(Fig. 1B, C). 갈색거저리 추출물의 세포독성을 평가하기 위하여 LDH leakage를 수행하였다. 인체 혈소판에 TME(75~200 μg/mL)를 처리하여 LDH leakage를 분석한 결과 TME는 세포 독성결과에서 유의성을 나타내지 않았다(Fig. 1D).

Fig 1. TME’s effect on platelet aggregation. (A) TME’s effect on collagen-induced human platelet aggregation. (B) TME’s effect on thrombin-induced human platelet aggregation. (C) TME’s effect on U46619-induced human platelet aggregation. (D) TME’s effect on cytotoxicity. Platelet aggregation and cytotoxicity were carried out as described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). *P<0.05, **P<0.01 versus each agonists-stimulated human platelets. NS, not significant. TME: Tenebrio molitor extract.

세포 내 Ca²⁺ 조절과 Ca²⁺ 조절 관련 인산화 단백질에 미치는 효과

세포 내부 Ca²⁺의 분비([Ca²⁺]_i)는 혈소판 활성에 필수적이기 때문에 TME가 세포 내부 Ca²⁺ 동원에 미치는 영향을 확인하였다. Fig. 2A의 결과를 보면 [Ca²⁺]_i의 수준은 in-tact cell에서 105.5±0.5 nM이었던 [Ca²⁺]_i이 콜라겐에 의해 822.5±5.8 nM로 강하게 증가하였고, TME(75~200 μM)는 농도 의존적인 억제 활성을 보였다. 이밖에도 serotonin 방출시험에서 TME(75~200 μM)의 억제 활성을 확인하였다(Fig. 2B). 세포 내 Ca²⁺의 분비는 ER membrane에 존재하는 inositol-1,4,5-triphosphate receptor type I(IP₃R)의 인산화에 의해 억제되는 것으로 알려져 있다(Varga-Szabo 등, 2009). 따라서 TME가 I(IP₃R)의 인산화에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 Fig. 2C에서 확인되는 바와 같이, TME는 농도 의존적인 인산화의 증가를 나타냈다.

Fig 2. TME’s effect on [Ca²⁺]_i mobilization, serotonin release and IP3R phosphorylation. (A) Effect of TME’s effect on collagen-induced [Ca²⁺]_i mobilization. (B) TME’s effect on collagen-induced serotonin release. (C) TME’s effect on collagen-induced IP₃R phosphorylation. All experiments were performed as described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). *P<0.05, **P<0.01 versus the collagen-stimulated human platelets. TME: Tenebrio molitor extract.

TXA₂의 생성과 조절 관련 인산화 단백질에 미치는 효과

TXA₂는 혈소판에서 합성되어 분비되는 물질로 혈소판의 응집반응과 동시에 외부로 방출되어 인접한 혈소판의 ago-nist로 작용하는 물질이다. TXA₂의 합성은 세포막 불포화지방산인 아라키돈산으로부터 시작되며 세포 내부의 효소인 cyclooxygenase-1과 TXA₂의 합성효소에 의해 생성되는 eicosanoid다. TXA₂의 합성과 관련된 신호전달 분자로는 cytosolic phospholipase A₂(cPLA₂)와 p38이 잘 알려져 있다(Kramer 등, 1996; McNicol과 Shibou, 1998). Agonist의 자극에 의해 혈소판의 inside-out signaling이 활성화되면 혈중에 증가한 Ca²⁺은 cPLA₂에 결합하고 cPLA₂는 세포질에서 세포막으로 이동한다. 이후 p38에 의해서 cPLA₂는 인산화되어 인지질을 가수분해하여 아라키돈산을 세포질로 유리시킨다. 따라서 갈색거저리 추출물이 TXA₂의 생산과 관련 신호전달 분자에 미치는 영향을 확인하였다. Fig. 3A에서 볼 수 있듯이 TME(75~200 μg/mL)는 TXA₂의 생성을 억제하였고, 관련된 신호전달 분자의 인산화를 억제하였다(Fig. 3B).

Fig 3. TME’s effect on TXA2 production, cPLA₂, p38 phosphorylation. (A) TME’s effect on collagen-induced TXA2 generation. (B) TME’s effect on collagen-induced cPLA₂, p38 phosphorylation. All experiments were performed as described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). *P<0.05, **P<0.01 versus the agonists-stimulated human platelets. TME: Tenebrio molitor extract.

혈소판의 점착에 미치는 효과

혈소판 막에 존재하는 αIIb/β3는 fibrinogen 이외에도 점착 단백질인 fibronectin과 작용할 수 있다. 이러한 작용은 혈소판이 초기 혈관 손상 부위에 점착하는 과정에 필수적이다. 콜라겐으로 자극한 인체 혈소판은 fibronectin이 도포된 well에 점착하지만, TME(75~200 μg/mL)가 처리된 well에서는 점착 반응이 농도 의존적으로 억제되었다(Fig. 4A).

Fig 4. TME’s effect on fibronectin adhesion and clot retraction. (A) TME’s effect on collagen-induced fibronectin adhesion. (B) TME’s effect on thrombin-induced clot retraction. All experiments were performed as described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). *P<0.05, **P<0.01 versus the collagen-stimulated human platelets.

이전 결과에서 혈소판 인테그린 αIIb/β3를 억제한 거저리 추출물은 혈소판 점착 반응에서도 유사한 억제 활성을 나타냈다.

혈병 수축에 미치는 효과

활성화된 혈소판은 αIIb/β3를 매개로 인접한 혈소판들과 그물구조를 형성하게 되어 지혈 마개를 형성하게 되고 이후 수축작용을 통해 지혈 부위를 단단하게 막아준다. TME(75~200 μg/mL)는 세포 내 Ca²⁺ 동원과 αIIb/β3의 활성을 억제하였기 때문에, thrombin을 사용한 clot 형성 수축에 미치는 영향을 확인하기 위하여 clot retraction test를 수행하였다. 그 결과 갈색거저리 추출물은 농도 의존적으로 clot retraction 반응을 억제하는 효과를 나타내었다(Fig. 4B).

혈소판 인테그린 조절 관련 인산화 단백질에 미치는 효과

PI₃K와 Akt는 αIIb/β3 활성화를 촉진하는 잘 알려진 신호 분자다(Guidetti 등, 2015). 최근 연구에서는 glycogen synthase kinase-3(GSK-3)가 혈소판 기능의 음성 조절자로서 역할에 대하여 보고되었지만 세부적인 활성화 기작은 아직 명확하지 않다. 혈소판 내부의 GSK-3에 관해 보고된 바에 따르면 GSK는 Akt의 하류 신호전달 분자로 Akt에 의해 인산화되는 것으로 보고되었다(Moore 등, 2021). GSK- 3은 N-말단 Ser 잔기(Ser²¹에서 GSK-3α, Ser⁹에서 GSK-3β)의 인산화에 의해 억제되는 Ser/Thr kinase이며 phos-phatidylinositol 3-kinase 억제제인 wortmannin과 protein kinase C 억제제인 Ro31-8220에 의해서 GSK-3의 인산화가 감소하는 것으로 보고되었다(Moroi와 Watson, 2015). 본 연구에서는 αIIb/β3 활성화와 관련된 신호 분자(PI₃K, Akt, GSK-3α/β)의 인산화에 대한 갈색거저리 추출물의 영향을 분석하였다. Fig. 5에 나타낸 바와 같이 TME는 PI₃K, Akt 및 GSK-3α/β의 콜라겐 유도 인산화를 강력하게 억제하였다. 따라서 TME가 갖는 강력한 αIIb/β3 억제 활성은 VASP의 인산화와 PI₃K, Akt, GSK-3α/β의 탈인산화를 통해 작용함을 확인하였다. SYK는 72 kDa의 tyrosine kin-ase로, 혈소판 agonist인 ADP, thrombin, 콜라겐에 의해 자극되어 인산화되며 inside-out signaling을 이끌며, 동시에 αIIb/β3 활성화 이후 αIIb/β3 매개로 발생하는 out-side-in signaling에서 직접 인산화되어 작용하는 tyrosine kinase로 보고되었다(Clark 등, 1994a, 1994b; Keely와 Parise, 1996). 따라서 우리는 TME가 SYK의 인산화에 미치는 영향을 평가하였다. Fig. 5에서 볼 수 있듯이 TME는 콜라겐으로 유발된 SYK의 인산화를 농도 의존적으로 억제하였다. 혈소판 인테그린, αIIb/β3를 조절하는 또 다른 인자로는 vasodilator stimulated phosphoprotein(VASP)이 잘 알려져 있다. VASP는 actin filament의 연장과 관계있는 단백질이며, 혈소판의 활성 시 αIIb/β3의 형태변환에 관여한다. VASP는 인체 혈소판에서 Ser¹⁵⁷과 Ser²³⁹, 두 군데 인산화 위치를 가지는 것으로 알려져 있으며, 인산화되었을 때는 αIIb/β3의 활성이 억제된다(Laurent 등, 1999; Sudo 등, 2003). 따라서 콜라겐으로 자극한 인체 혈소판에 TME (75~200 μg/mL)를 처리하여 VASP의 인산화를 분석한 결과, VASP¹⁵⁷과 VASP²³⁹에서 농도 의존적인 인산화의 증가 양상을 보였다(Fig. 5). 인테그린 αIIb/β3의 활성화에 작용하는 초기 inside-out signaling과 αIIb/β3의 활성화 이후 작용하는 outside-in signaling을 모두 확인한 결과 갈색거저리 추출물은 혈소판의 인테그린 αIIb/β3의 불활성화에 강력한 효과를 보였다. 실험 결과들을 통하여 갈색거저리 추출물은 항혈소판 기능성 식품으로서의 가능성을 나타내지만, in vitro 결과만으로는 실제 임상에서 효과를 나타낼지 단언할 수 없다. 따라서 동물에게 갈색거저리 추출물을 식이 한 후 분리한 혈소판에서의 억제 활성 유무 확인과 거저리 추출물의 유효성분 규명, 그리고 유효성분의 혈중 도달 농도에 대한 평가가 필요하다. 이 밖에도 갈색거저리 추출물은 인체 혈소판을 사용한 세포독성 실험에서 독성을 보이지 않았지만 다른 세포주에서 독성이나 부작용을 나타낼 수 있으므로 다양한 세포에서 독성 평가가 필요하다. 천연물의 인체 식이 후 혈중에 도달하는 농도는 pg/mL나 ng/mL로 저농도일 가능성이 높으며 낮은 농도인 만큼 항혈소판 효능을 나타낼지 아니면 과도한 항혈소판 효과로 정상적인 지혈을 지연시킬지에 대한 충분한 검증이 필요하다. 이 부분은 추후 실험을 통하여 규명할 계획이다.

Fig 5. TME’s effect on PI3K/Akt/GSK-3α/β, SYK, and VASP phosphorylation. Western blot was performed as describe in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). *P<0.05 versus the collagen-stimulated human platelets. TME: Tenebrio molitor extract.

본 연구에서는 갈색거저리 추출물(TME)이 혈소판응집반응과 인테그린 αIIb/β3에 미치는 영향을 평가하였고, 이와 관련된 신호전달 분자들을 어떻게 조절하는지 규명하고자 하였다. 그 결과 TME는 콜라겐이 유도한 platelet aggrega-tion을 강력하게 억제하였고, 세포 내부 칼슘 동원과 외부 칼슘 유입과 관련된 I(IP₃R)의 인산화를 억제하고, TXA₂의 합성과 관련된 cPLA₂/p38, 그리고 인테그린의 활성과 관련된 PI₃K/Akt/GSK-3/SYK/VASP의 인산화를 조절한다는 것을 규명하였다. 따라서 TME는 항혈소판 효과가 있는 천연물 자원으로서 치료 및 예방 약물로서 잠재적 가치가 있다고 여겨진다.

이 논문은 2020년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임(No. 2020R1I1A1A01067709).