피부는 신체를 둘러싸고 있는 가장 넓은 부위로서 자외선, 환경오염 물질 등의 다양한 화학적, 물리적, 환경적인 요인들과 항상 접촉하고 있으며, 이와 같은 여러 외부자극 등으로부터 신체를 방어하고자 체내에서 발생하는 정상적인 대사 작용 등에 의해 지속적인 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 발생한다(Ahn 등, 2021; Choi 등, 2019). ROS는 생활 습관, 스트레스 환경 등의 요인에 의해 생성되며 ROS의 발생 혹은 축적이 지속될 경우, 산화적 스트레스(oxidative stress)를 유발하며 다양한 합병증, 뇌질환, 암 등을 유발해 생체 기능을 저하시킨다(Kim 등, 2017; Seo와 Kim, 2021). 또한 ROS에 의한 산화적 스트레스의 발생은 DNA 분해, collagen과 elastin 분해효소 활성화, melanin 합성 반응 촉진 등 생체 구성 성분의 손상을 야기하고 색소 침착, 탄력 감소, 주름 형성, 염증 등을 초래한다(Han, 2011). 이러한 다양한 자극들로부터 신체를 보호하고자 피부는 면역반응과 관련된 염증반응(inflammatory response)이 빈번하게 발생한다. 이는 미생물 침입, 세균 감염, 조직 손상, 내부 독소 등과 같은 유해한 자극으로부터 손상된 조직을 회복하기 위한 생물학적 신체 보호 반응의 일부이자 필수적인 방어기작을 뜻한다(Dinh, 2022; Wang, 2022). 정상적인 염증반응은 대식세포의 활성 조절로 염증 매개체들에 의해 유지되는데, 대식세포는 그람 음성균의 세포 외막에 있는 내독소로 알려진 lipopolysaccharide(LPS) 등과 같은 다양한 자극들에 노출됨에 따라 면역 세포들이 분비하는 cytokine 등에 의해 염증반응의 전사인자가 활성되고 prostaglandin E₂(PGE₂), nitric oxide(NO)와 같은 전염증 매개체의 생성을 증가시킨다고 알려져 있다(Kim, 2016; Kim, 2022). 그중 NO의 발생은 대식세포로부터 다양한 조직에 존재하는 nitric oxide synthase(NOS)에 의해 L-arginine으로부터 합성되며, 외부 자극 혹은 pro-inflammatory cytokine에 의해 inducible NOS(iNOS)가 자극받을 경우 생성된다. 또 다른 염증 매개 인자인 cyclooxygenase-2(COX-2)는 cytokine 및 LPS와 같은 자극에 의해 대식세포에서 다량 발생되며, 이로 인해 생성된 PGE₂는 염증반응에 크게 관여하고 혈관 생성 유도를 통해 종양을 생성시킨다고 알려져 있다(Lam, 2009).

루모라고사리(Rumohra adiantiformis)는 고사리목에 속하는 고란초과의 한 종류인 양치식물로, ‘leatherleaf fern’, ‘seven-week-fern’ 등의 다양한 명칭으로 불린다(De Souza 등, 2006). 이는 오스트레일리아, 남아프리카 및 일부 인도양 섬에 널리 분포하며, 습한 숲에서 흔히 볼 수 있지만 바위와 암석 사이에서도 자란다고 알려져 있다(Geldenhuys와 van der Merwe, 1988). 고사리(Pteridium)는 양치류의 고사리목, 고사리과에 속하는 여러해살이 식물로, 우리나라 전국 산야에서뿐만 아니라 아시아, 중국, 일본, 인도네시아 등 전 세계적으로 광범위하게 분포되어 있다(Fenwick, 1989; Park 등, 2014). 고사리는 황록색으로 식물 전체에 털이 있으며, 굵은 잎과 긴 잎자루를 특징으로 뿌리는 땅속 깊이 옆으로 뻗어나는 특징을 가진다. 고사리는 많은 석회질과 풍부한 무기질을 함유하고 있어 뼈와 치아를 튼튼하게 하며 신진대사를 촉진시켜 체내의 노폐물을 배출시켜 준다. 또한, 아스파라긴(asparagine), 아스트라갈린(astragalin), 글루타민산(glutaminic acid) 등과 같은 특수성분과 비타민 B₁, 비타민 B₂, 비타민 C, 비타민 D 및 식이섬유를 다량 함유하고 있어 변비 예방과 붓기 제거에 효과적이다(Lee 등, 2010; Sim 등, 2015). 또한 양치식물은 전통적으로 다양한 유형의 질병을 치료하는 데 사용되어져 왔으며(Din 등, 2012), 일반적으로 항균, 피부 상처, 항바이러스, 항암 등의 치료에 이용했다고 알려져 있다(Cho 등, 2020).

현재까지 고사리목에 속하는 여러 종류의 고사리들에 관한 선행연구는 Kim(2003), Oh 등(1994)의 전자공여능, ABTS 라디칼 소거능 등의 항산화 효능을 중심으로 한 생리활성 연구가 진행되었으며, 같은 고사리목에 속하는 루모라고사리에 관한 연구는 아직 부족한 실정이다. 본 연구에서는 루모라고사리의 생리활성 검증을 통해 천연 소재로서의 활용 가능성을 검토하고자 한다.

재료 및 시료 추출

본 연구에 사용한 루모라고사리는 제주도에서 채취한 것을 더자연처럼(원산지: 한국)에서 구입하여 사용하였다. 시료는 깨끗이 세척하고 60°C에서 15시간 이상 열풍건조한 뒤 파쇄하여 사용하였다. 루모라고사리 열수 추출을 위해 시료에 10배량(w/v)의 증류수를 가하여 100°C에서 3시간 환류 냉각 추출을 거쳐 실온에서 24시간 침지시켰다. 이후 1차 여과로 부직포를 사용하여 침전물을 상등액과 분리하였으며, 이와 같은 과정을 총 3회 반복 추출하였다. 에탄올 추출은 시료에 10배량(w/v)의 70% 에탄올을 가하여 24시간 교반 추출을 진행하였으며, 침전물과 상등액을 부직포를 사용하여 1차 분리를 거친 뒤 이와 같은 과정을 3회 반복하였다. 루모라고사리 열수 추출물(RUD) 및 70% 에탄올 추출물(RUE)의 상등액은 진공펌프와 여과지(Whatman No. 4, No. 2, No. 5)를 사용하여 2차 여과를 하였으며, rotary vacuum evaporator를 사용하여 추출에 사용된 용매를 감압 농축하여 제거하였다. 농축된 추출물은 동결건조를 통해 분말 형태의 추출물을 얻었으며, -20°C에 보관하며 본 실험의 시료로 사용하였다. 항산화 활성 측정 시 RUD는 열수, RUE는 70% 에탄올로 용해하여 제조하였으며, 세포실험에서는 Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)을 용매로 하여 농도별로 희석해 실험에 사용하였다.

시약 및 기기

항산화 측정을 위해 사용한 ascorbic acid, tannic acid, folin-ciocalteu reagent, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2′-azino-bis(3–ethylbenzothia-zoline–6-sulfonic acid)(ABTS)는 Sigma Chemical Co.에서 구매하였고, Na₂CO₃(sodium carbonate), K₂S₂O₈(potassium peroxodisulfate)은 Kanto Chemical Co.에서 구입하여 사용하였다. 세포 실험에 필요한 DMEM, fetal bovin serum(FBS), penicillin/streptomycin, protease & phosphatase single-use inhibitor cocktail 100×는 Thermo Scientific Hyclone^TM에서 구입하여 사용하였으며, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), dimethyl sulfoxide(DMSO)와 LPS, Griess reagent, RIPA buffer 등은 Sigma Chemical Co.에서 구입하여 사용하였다. 단백질 발현 측정 실험에 사용된 iNOS, COX-2, β-actin 및 anti-mouse는 Santa Cruz Biotechnology Inc.에서 구입하였으며, mRNA 발현 측정 실험에 사용된 iNOS, COX-2 및 glyceraldehyde-3-phsphate dehydrogenase(GAPDH)는 Bionics에서 구입하여 사용하였다.

실험에 사용된 기기는 vortex(SI-0256, Scientific Industries Inc.), rotary vacuum evaporator(CCA-1111, EYELA), centrifuge(MF-300, Hanil Scientific Inc.), micro refrigerated centrifuge(Smart-R17, Hanil Scientific Inc.), microplate reader(SPECTROstar Nano, BMG LABTECH), nano drop(Q5000, Quawell Technology Inc.), imaging system(ChemiDoc^TM MP Imaging System, Bio-Rad)을 사용하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법(Singleton 등, 1999)을 변형하여 실험을 진행하였다. 추출물을 증류수에 희석하여 2 mL를 제조한 다음 50% Folin reagent 2 mL를 첨가한 후 실온에서 3분간 반응시켰다. 이후 10% Na₂CO₃ 2 mL를 혼합하여 암실 상태의 상온에서 1시간 동안 반응시켜 700 nm의 흡광도에서 측정하였다. 총 폴리페놀 함량의 표준물질로는 tannic acid를 사용하여 농도 10~100 μg/mL가 되도록 표준곡선을 작성한 후 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하였으며, 100 g당 mg의 함량으로 나타내었다.

전자공여능 측정

전자공여능(electron donating abilities)은 Blois의 방법(1958)을 변형하여 측정하였다. 농도별 추출물 30 μL와 DPPH를 180 μL씩 넣고 혼합한 후 15분간 방치한 다음 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

ABTS cation 라디칼 소거 활성 측정

ABTS 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 ABTS cation decolorization assay 방법(Re 등, 1999)을 변형하여 측정하였다. 7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 혼합하여 ABTS⁺ 형성을 위해 실온에서 15~18시간 반응시켰으며, 에탄올로 희석하여 사용하였다. 농도별 시료 100 μL에 희석한 ABTS 용액 100 μL를 1:1 첨가하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포주 및 세포 배양

본 실험에 사용된 세포주는 한국세포주은행에서 구입하였으며, mouse macrophage-like cell line인 RAW 264.7을 사용하였다. 세포 배양은 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin(100 U/mL)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37°C, 5% CO₂ incubator에서 세포의 성장 속도에 따라 계대 배양을 진행하였다.

MTT assay에 의한 세포 생존율 측정

세포 생존율 측정은 Carmichael 등의 방법(1987)에 따라 측정하였다. RAW 264.7 세포를 96-well plate에 1×10⁴ cells/well이 되도록 100 μL씩 분주하였고, 이후 시료를 농도별(5, 10, 50, 100, 500, 1,000 μg/mL)로 조제하여 첨가한 뒤 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 이후 2.5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액을 40 μL씩 가하여 3~4시간 배양한 뒤 상층액을 제거하고, 보라색으로 생성된 비수용성인 formazan을 각 well당 DMSO 100 μL씩 첨가하여 10분간 용해시켰다. Microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 생존율 측정은 시료를 첨가하지 않은 무첨가군을 대조군으로 하여 첨가군의 흡광도를 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

LPS에 의해 유도된 NO 생성 억제 활성 측정

RAW 264.7 세포주로부터 생성된 NO의 양은 Green 등의 방법(1982)에 따라 측정하였다. 6-well plate에 RAW 264.7 세포를 3×10⁵ cells/well이 되도록 분주하였으며 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 자극제인 LPS를 무처리군을 제외한 각 well에 10 μg/mL이 되도록 처리하여 염증을 유도하고, 2시간 이후 추출물을 농도별(50, 100, 500 μg/mL)로 처리하여 18시간 배양하였다. 96-well plate에 세포배양액 100 μL와 Griess reagent 100 μL 동량을 혼합하여 10분간 상온 반응을 거친 뒤 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, NaNO₂(sodium nitrite)로 표준곡선을 작성하였다. NO 억제 활성 측정은 무첨가군과 첨가군을 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

Total RNA 분리 및 cDNA 합성

RAW 264.7 세포를 100 mm tissue culture dish에 1×10⁶ cells/well로 cell seeding 하여 24시간 동안 배양하였다. RAW 264.7 세포는 LPS를 10 μg/mL가 되도록 처리하였으며, 2시간 뒤 농도별로 시료를 처리하여 18~24시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 PBS로 2번 세척한 뒤, RNA 분리를 위하여 TRIzol reagent를 각 well당 1 mL씩 분주하여 세포를 lysis 해주었다. Chloroform 200 μL를 분주하고 10~15회 흔들어 섞어준 뒤, 층 분리가 일어나면 micro refrigerated centrifuge를 이용하여 4°C, 13,200×g 조건에서 20분 원심분리하였다. 이후 iso-propanol 500 μL와 상층액을 섞어준 후 동일 조건으로 다시 원심분리하였다. Pellet을 제외한 상층액을 제거하고 RNase 효소의 불활성화를 위해 diethyl pyrocarbonate(DEPC) water로 희석한 75% 에탄올로 세척하였다. 액체를 모두 제거해 준 뒤 DEPC water 50 μL를 분주하여 녹인 후 nano drop을 통해 total RNA 양을 측정하였다. Oligo(dT) 15 primer(500 μg/mL) 1 μL, 추출된 RNA 2 μg을 섞어준 뒤 nuclease free water(NW)로 10 μL를 맞추고 75°C에서 5분, 4°C에서 5분 반응시켜 주었다. 5× reaction buffer, PCR nucleotide mix, MgCl₂, reverse transcriptase, RNasin inhibitor, NW를 첨가하여 25°C에서 5분, 42°C에서 60분, 70°C에서 15분, 4°C에서 10분 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)

mRNA 발현을 통한 항염증 활성을 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 사용하여 RT-PCR로 측정하였다. COX-2는 premix에 합성한 cDNA와 primer(sense, anti-sense)를 충분히 섞어준 뒤 실험을 진행하였고, iNOS 및 GAPDH는 PCR tube에 5× Green Go Taq flexi buffer, MgCl₂, PCR nucleotide mix(10 mM), primer(sense, anti-sense), Go Taq DNA polymerase, NW 및 합성한 cDNA를 첨가하여 PCR을 측정하였다. 사용한 primer sequences는

Table 1과 같다. GAPDH는 96°C에서 2분, 96°C에서 10초, 64°C에서 30초, 72°C에서 1분, 72°C에서 10분(30 cycles), iNOS는 96°C에서 2분, 96°C에서 10초, 62°C에서 30초, 72°C에서 1분, 72°C에서 10분(30 cycles), COX-2는 96°C에서 2분, 94°C에서 10초, 51°C에서 30초, 72°C에서 1분, 72°C에서 10분(35 cycles)으로 합성을 진행하였다. PCR로 합성시킨 뒤 0.005% ethidium bromide(EtBr)를 첨가한 1.5% agarose gel을 100 V에서 20분 전기영동 시켜 ChemiDoc^TM imaging system을 이용하여 각 mRNA 발현을 확인하였다.

Table 1

Sequence of the primers used for RT-PCR.

Gene	Primer	Sequence (5’→3’)
GAPDH	sense	CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT
	anti-sense	AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC
iNOS	sense	ACA GCT CCG GGC ATC GAA GAC C
	anti-sense	ACA ACG TGG AGA AAA CCC CAG GTG
COX-2	sense	GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT
	anti-sense	ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA

Western blot을 통한 단백질 발현 측정

항염증 활성을 단백질 발현으로 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 사용하여 western blot으로 측정하였다. 항염증 관련 인자인 iNOS, COX-2의 활성을 알아보기 위해 RAW 264.7 세포를 100 mm tissue culture dish에 1×10⁶ cells/well로 seeding 한 후, 24시간 동안 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양하여 세포를 안정화하고 부착시켰다. RAW 264.7 세포에는 자극제로 LPS를 무처리군을 제외한 각 well에 10 μg/mL가 되도록 처리하였으며, 2시간 뒤 농도별로 시료를 처리하여 18~24시간 배양하였다. 세포 배양액을 제거하고 PBS를 사용하여 2회 세척한 후, RIPA buffer 10 mL에 protease & phosphatase single-use inhibitor cocktail(100×) 100 μL를 혼합하여 제조한 lysis buffer를 사용하여 세포막을 파괴하고, micro refrigerated centrifuge를 사용하여 4°C, 13,200×g에서 20분간 원심분리하였다. 이후 상등액을 BCA protein assay kit을 이용하여 단백질을 정량하였으며, 20 μL의 단백질을 10% SDS acrylamide gel에서 120 V로 전기영동 하여 분리하였다. 분리된 단백질은 transfer 기기를 이용하여 polyvinylidene fluoride membrane에 옮긴 다음 실온에서 5% skim milk를 tris-buffered saline & Tween 20(TBST)으로 녹여 1시간 동안 blocking 하였다. Primary antibody를 희석하여 4°C에서 overnight 한 다음, TBST를 사용하여 10분 간격으로 3회 세척하였다. 이후 secondary antibody를 첨가하여 실온에서 1시간 30분 반응시켰으며, TBST로 10분 간격 3회 세척하였다. Chemiluminescent HRP substrate(ECL) 용액으로 반응시키고 ChemiDoc^TM imaging system을 이용하여 발현을 확인하였다.

통계 처리

본 연구의 모든 실험 데이터는 동일한 조건으로 3회 반복 측정하였으며, 측정값의 평균치와 표준편차(means±standard deviation)로 표기하였다. 또한 결과의 통계처리는 SPSS Statistics 23을 사용하여 t-test를 통해 유의값을 나타내었으며, 일원분산분석(one-way analysis of variance)을 사용하여 Duncan’s multiple range test에 의해 P<0.05 수준에서 나타내었다.

수율

루모라고사리 원물 30 g에 대한 수율은 Table 2와 같이 나타내었으며, RUD는 21.2%, RUE는 14.34%로 RUE의 수율이 6.86% 더 높았다.

Table 2

Yield of hot water and 70% ethanol extracts from Rumohra adiantiformis.

Sample	Weight (g)	Weight after extraction (g)	Yield (%)
RUD	30	6.53	21.2
RUE	30	4.13	14.3

RUD: Rumohra adiantiformis hot water extract, RUE: Rumohra adiantiformis 70% ethanol extract..

총 폴리페놀 함량 측정

Phenolic 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 식물계의 방어기작 중 하나로 2차 대사산물의 한 종류이다. 플라보노이드, 안토시아닌, 탄닌 등 다양한 페놀성 화합물들이 존재하며 이들은 다양한 분자구조 및 분자량을 지니고, 특히 폴리페놀은 한 분자 내에 2개 이상의 phenolic hydroxyl기를 가진 방향족 화합물로, 항염증, 항암 등의 작용을 하는 항산화성 생리활성 물질로 알려져 있다(Lee 등, 2015; Moon 등, 2004; Na 등, 2004).

RUD 및 RUE의 총 폴리페놀 함량 측정에 관한 결과는 Table 3과 같이 나타내었다. Standard 물질로는 tannic acid를 사용하였으며 추출물 100 g당 함유한 tannic acid 양(tannic acid equivalent,

Table 3

Total polyphenol contents in hot water and 70% ethanol extracts from Rumohra adiantiformis.

Sample	Total polyphenol (mg TAE/100 g)
RUD	137.69±0.99
RUE	470.78±0.67***

RUD: Rumohra adiantiformis hot water extract, RUE: Rumohra adiantiformis 70% ethanol extract. Results of all experiments are mean±SD from triplicate experiments (^***P<0.001)..

TAE)으로 환산하여 표시하였다. RUD는 137.69±0.99 mg TAE/100 g의 함량이 나타났으며, RUE에서는 470.78±0.67 mg TAE/100 g으로 RUD에 비해 RUE의 폴리페놀 함량이 높게 나타났다. 그 이유는 목적 성분에 따라 천연물의 생리활성 검증을 위한 추출 용매 및 방법이 달라지며, 일반적으로 탄수화물, 단백질 등과 같은 고분자물질은 열수 추출 시 다량 추출되어 에탄올로 추출했을 때보다 수율이 높고, 에탄올 및 메탄올 추출 시 극성을 띠고 있는 polyphenol류 등이 다량 추출되어 열수 추출보다 수율이 낮게 나타난다(Kim 등, 2018b). Choi 등(2015)은 폴리페놀 함량이 많은 약용식물 중 한 종류인 줄풀 추출물의 폴리페놀 함량을 측정한 결과 2.83 mg/g의 폴리페놀 함량이 나타남을 확인하였다. 이와 비교하였을 때 RUE는 우수한 폴리페놀 함량을 함유하고 있어 높은 항산화력을 확인할 수 있었다.

전자공여능 측정

산화적 스트레스는 다양한 활성산소의 발생을 증가시키며, 이로 인해 세포 사멸, 피부 노화 등의 다양한 염증반응이 발생하게 된다(Kim 등, 2018a). 이러한 염증반응을 촉진하는 라디칼을 제거하는 항산화제의 효능을 평가하기 위한 방법으로는 자유라디칼을 제거하는 DPPH가 널리 사용되고 있다(Park 등, 2022b). DPPH 라디칼 소거법은 DPPH가 함유한 분자 내 라디칼이 지질산화에 관여하는 자유라디칼과 비공유 결합을 통해 안정한 complex를 만들어 이를 항산화 물질을 함유한 추출물이 라디칼을 소거하면서 보라색을 띠는 DPPH의 색차를 이용하여 전자공여능을 측정하는 방법이다. 이는 페놀 구조와 aromatic amine 화합물에서 주로 사용되는 방법이다(Kim 등, 2005; Lee 등, 2014).

RUD 및 RUE의 전자공여능 측정 결과는 Fig. 1에 나타내었다. RUD 및 RUE의 농도가 증가할수록 전자공여능이 증가하는 것을 확인하였고, RUD 및 RUE는 100 μg/mL에서 각각 86.88%, 78.95%의 높은 활성을 보여주었다. Cho 등(2020)의 발풀고사리 물 추출물은 125 μg/mL에서 70.25%, Kim 등(2020)의 수송나물 추출물은 100 μg/mL에서 28.28%의 활성이 나타났고, Cha 등(2009)의 두릅 순 열수 및 70% 에탄올 추출물은 모두 1,000 μg/mL에서 각각 28.69%와 2.78%의 낮은 활성이 나타났다. 이와 비교하였을 때 RUD 및 RUE의 전자공여능 활성이 다른 추출물에 비해 높은 활성을 가졌음을 확인하여 루모라고사리 추출물은 자유라디칼 소거 효과가 우수하다고 판단된다.

Fig 1. Electron donating activity of hot water and 70% ethanol extracts from Rumohra adiantiformis. Vit. C: ascorbic acid, RUD: Rumohra adiantiformis hot water extract, RUE: Rumohra adiantiformis 70% ethanol extract. Results of all data were mean±SD of three independent measurement and expressed in different alphabet letters (a-l) by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

ABTS cation 라디칼 소거 활성 측정

ABTS cation 라디칼 소거능은 DPPH와 함께 많이 사용되는 항산화력 측정법 중 하나로 이는 ABTS와 potassium persulfate의 혼합물 반응에 의해 생성된 비교적 안정한 자유라디칼이다. ABTS를 peroxidase와 H₂O₂를 반응시키면 ABTS⁺이 생성되는데, 이때 추출물의 항산화력에 의해서 ABTS⁺ 고유의 색인 청록색이 탈색되어 decolorization 되는 원리를 이용하여 측정하는 방법이다. ABTS 라디칼 소거 반응은 DPPH 라디칼 소거 반응보다 반응속도가 빠르며, 극성 및 비극성 화합물 모두 반응하여 더 높은 소거능이 일어난다고 알려져 있다(Park 등, 2022a; Yoo와 Lee, 2020).

RUD 및 RUE의 ABTS 소거능 측정 결과는 Fig. 2와 같이 나타내었다. 1,000 μg/mL 농도에서 RUD는 99.58%, RUE는 99.73%의 소거능을 보여주었다. 또한 전 농도 구간에서 농도 의존적으로 증가하였으며, 100 μg/mL 농도 이상에서는 대조군인 ascorbic acid와 유사한 소거 활성을 나타내었다. Sim 등(2015)의 남해산 고사리 물 추출물은 1,000 μg/mL에서 38.7%, 에탄올 추출물은 49.71%, Song 등(2021)의 속새 추출물의 열수 및 70% 에탄올 추출물은 1,000 μg/mL에서 각각 77.67%, 77.23%의 소거 활성을 보여주어 루모라고사리 추출물의 ABTS cation 라디칼 소거능은 우수한 활성을 가진 것으로 판단된다.

Fig 2. ABTS cation radical scavenging activity of hot water and 70% ethanol extracts from Rumohra adiantiformis. Vit. C: ascorbic acid, RUD: Rumohra adiantiformis hot water extract, RUE: Rumohra adiantiformis 70% ethanol extract. Results of all data were mean±SD of three independent measurement and expressed in different alphabet letters (a-h) by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

MTT assay에 의한 세포 생존율 측정

추출물의 세포 생존율을 알아보기 위한 방법으로 MTT assay를 이용하였다. MTT assay는 살아있는 세포 내 미토콘드리아에서 탈수소 효소 작용에 의하여 노란색 수용성 기질인 MTT가 보라색의 불용성 formazan으로 환원되는 원리를 이용하여 측정하는 방법이다(Jang, 2015).

Mouse macrophage인 RAW 264.7 세포 생존률에 대한 RUD 및 RUE의 효과를 MTT assay로 측정한 결과는 Fig. 3과 같다. RUD 및 RUE는 500 μg/mL 농도에서 각각 99.54%, 99.07%, 5~500 μg/mL 농도에서는 세포독성이 거의 나타나지 않았음을 확인하였다. 따라서 이후 진행한 세포 실험에서는 독성을 거의 보이지 않은 50, 100, 500 μg/mL 농도 구간을 선택하여 실험을 진행하였다.

Fig 3. Cell viability of hot water and 70% ethanol extracts from Rumohra adiantiformis on RAW 264.7 cells. Con (Control): Extract-free group to RAW 264.7 cells. RUD: Rumohra adiantiformis hot water extract, RUE: Rumohra adiantiformis 70% ethanol extract. After culturing the RAW 264.7 cells (1×10⁴ cells/well) for 24 h, they were treated with 5, 10, 50, 100, 500, 1,000 μg/mL of extracted RUD and RUE for 24 h. Then, it was performed using the MTT assay. Results of all experiments are mean±SD from triplicate experiments (^***P<0.001 vs. control group).

LPS에 의해 유도된 NO 생성 억제 활성 측정

ROS 중 하나이자 염증 유발 과정에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려진 NO는 그람 음성균의 내독소인 LPS 자극에 의해서 RAW 264.7 세포와 같은 대식세포에 작용하여 L-arginine을 통해 NOS에 의해 생성된다. NO의 정상적 발현은 종양 억제, 신경전달물질 운반 역할로 다양한 기능을 가지지만, 과도한 발현은 신체에 염증 유발, 뇌막염, 신경 및 조직 손상, 유전자 변이 등의 유해한 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Im과 Lee, 2012; Moon 등, 2021; Park과 Yang, 2008). 따라서 본 연구에서는 RUD 및 RUE의 NO 생성 억제 활성에 대한 효과를 측정하였다.

염증반응을 촉진하는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 RUD 및 RUE를 처리한 후, NO 생성 억제율을 측정한 결과를 Fig. 4와 같이 나타내었다. LPS 무처리군에 비해 LPS 단독처리군은 높은 NO 생성량을 보여주었고, RUD 및 RUE를 각각 농도별(50, 100, 500 μg/mL)로 처리하였을 때 농도 의존적으로 NO 생성 억제능이 증가하는 것을 확인하였다. RUD는 50, 100, 500 μg/mL 각 농도 구간에서 LPS 단독처리군 대비 27.79%, 64.61%, 82.25%의 저해 효과가 나타났고, RUE는 41.26%, 58.96%, 79.23%의 저해 효과를 나타내었다. Kim(2018)의 가시박 에탄올 추출물의 NO 생성량은 100 μg/mL 농도에서 58.27%의 저해율을 보여주었으며, Lee 등(2018)의 긴 병풀꽃 추출물은 500 μg/mL 농도에서 41.2%의 저해율을 나타내어 이와 비교했을 때, 루모라고사리 추출물의 NO 생성 억제 활성이 우수함을 확인하였다.

Fig 4. Inhibitory effect of hot water and 70% ethanol extracts from Rumohra adiantiformis on NO production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. (A) Nitric oxide expression was determined in RAW 264.7 cells treated with RUD, (B) Nitric oxide expression was determined in RAW 264.7 cells treated with RUE. RUD: Rumohra adiantiformis hot water extract, RUE: Rumohra adiantiformis 70% ethanol extract. After culturing RAW 264.7 cells (3×10⁵ cells/well) in 6-well plate for 24 h, and then LPS (10 μg/mL) was treated for 2 h. After that, RUD and RUE were treated by concentration (50, 100, 500 μg/mL). Results of all experiments are mean±SD from triplicate experiments (^***P<0.001 vs. LPS alone treatment group).

RT-PCR을 통한 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현 측정

RT-PCR을 통해 RUD 및 RUE의 염증성 매개 인자인 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현에 미치는 효과 측정 결과를 Fig. 5에 나타내었다. LPS를 처리한 RAW 264.7 세포에 RUD 및 RUE를 농도별(50, 100, 500 μg/mL)로 처리하였으며, mRNA 발현량은 500 μg/mL 농도에서 RUD는 LPS 단독 처리군 대비 각각 86.74%, 32.54%, RUE는 LPS 단독처리군 대비 각각 81.58%, 67.11%의 억제 효과를 나타내었다.

Fig 5. iNOS, COX-2 mRNA expression levels of hot water and 70% ethanol extracts from Rumohra adiantiformis on RAW 264.7 cells. (A) iNOS mRNA expression was determined in RAW 264.7 cells treated with RUD, (B) COX-2 mRNA expression was determined in RAW 264.7 cells treated with RUD, (C) iNOS mRNA expression was determined in RAW 264.7 cells treated with RUE, (D) COX-2 mRNA expression was determined in RAW 264.7 cells treated with RUE. RUD: Rumohra adiantiformis hot water extract, RUE: Rumohra adiantiformis 70% ethanol extract. After culturing RAW 264.7 cells (1×10⁶ cells/well) in 100 mm tissue culture dish for 24 h, and then LPS (10 μg/mL) was treated for 2 h. After that, RUD and RUE were treated by concentration (50, 100, 500 μg/mL). Results of all experiments are mean±SD from triplicate experiments (^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 vs. LPS alone treatment group).

Western blot을 통한 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현 측정

Western blot을 통해 RUD 및 RUE의 염증성 매개 인자인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현을 측정한 결과를 Fig. 6에 나타내었다. House keeping 인자로는 β-actin을 사용하였고, 500 μg/mL 농도에서 RUD의 iNOS, COX-2의 단백질 발현은 LPS 단독처리군 대비 각각 24.21%, 28.7% 억제되었으며, RUE의 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현은 LPS 단독 처리군 대비 각각 79.49%, 15.45% 억제됨을 확인하였다.

Fig 6. iNOS, COX-2 protein expression levels of hot water and 70% ethanol extracts from Rumohra adiantiformis on RAW 264.7 cells. (A) iNOS protein expression was determined in RAW 264.7 cells treated with RUD, (B) COX-2 protein expression was determined in RAW 264.7 cells treated with RUD, (C) iNOS protein expression was determined in RAW 264.7 cells treated with RUE, (D) COX-2 protein expression was determined in RAW 264.7 cells treated with RUE. RUD: Rumohra adiantiformis hot water extract, RUE: Rumohra adiantiformis 70% ethanol extract. After culturing RAW 264.7 cells (1×10⁶ cells/well) in 100 mm tissue culture dish for 24 h, and then LPS (10 μg/mL) was treated for 2 h. After that, RUD and RUE were treated by concentration (50, 100, 500 μg/mL). Results of all experiments are mean±SD from triplicate experiments (^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 vs. LPS alone treatment group).

그 결과, RUD 및 RUE는 LPS 자극으로 유도되어 생성된 NO의 유의적인 억제율과 비례해, NO 생성의 직접적인 발현 인자인 iNOS의 단백질 및 mRNA 발현 수준까지 우수한 영향을 미치는 것을 확인하였다. 또한, LPS 자극으로 과발현된 COX-2의 단백질 및 mRNA의 발현 억제 효과도 확인하여 두 추출물 모두 항염 효과가 있다고 판단된다. 하지만 루모라고사리 추출물의 염증 억제에 관해 명확한 효과를 규명하기 위해서는 다른 사이토카인 관계에 관한 추가 연구가 필요하다. 따라서 추후 MAPK 등의 signaling pathway와의 관련성 입증 및 기능성 성분 분석을 통해 지표성분 검출과 이에 대한 항염증 활성 검증을 진행하여 구체적인 염증반응에 관해 입증하고자 한다.

본 연구는 루모라고사리의 항산화, 항염증에 대한 생리활성 측정을 통해 천연 소재로써 사용 가능성을 확인하였다. 먼저 RUD 및 RUE의 총 폴리페놀 함량 측정 결과, 각각 137.69±0.99 mg TAE/100 g, 470.78±0.67 mg TAE/100 g으로 RUE에서 더 많은 폴리페놀 함량을 확인하였다. 또한, 항산화 활성 측정을 위해 전자공여능과 ABTS assay로 자유라디칼 및 cation 라디칼을 측정한 결과, 두 실험 모두 농도가 증가할수록 RUD 및 RUE의 소거 활성이 증가하였고, 1,000 μg/mL 농도에서 대조군인 ascorbic acid와 유사한 효과를 보여주어 우수한 항산화 활성을 확인하였다. 항염증 활성을 보기 위해 MTT assay를 사용하여 RAW 264.7 세포에서의 RUD 및 RUE의 세포독성을 측정한 결과, 500 μg/mL 이하의 농도에서 100%에 가까운 생존율을 보여주어 이후 실험은 50, 100, 500 μg/mL 농도 구간에서 진행하였다. 대식세포에서 LPS 자극으로 유도 생성된 NO 생성 저해 효과는 LPS 단독처리군 대비 50, 100, 500 μg/mL의 각 농도에서 RUD는 27.79%, 64.41%, 82.25%, RUE는 41.26%, 58.96%, 79.23%로 두 추출물 모두 농도 의존적으로 우수한 억제 효과를 보여주었다. 이후 RT-PCR을 통해 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현 억제 효과를 확인한 결과, LPS 단독처리군 대비 iNOS, COX-2는 각각 500 μg/mL에서 RUD는 86.74%와 32.54%, RUE는 81.58%와 67.11% 저해 활성을 확인하였다. 또한 항염증 관련 인자인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 억제 효과를 western blot을 통해 확인한 결과, LPS 단독처리군 대비 iNOS와 COX-2의 단백질 발현량은 500 μg/mL에서 RUD는 24.21%와 28.7%, RUE는 79.49%와 15.45%의 억제율을 보여주었다. RUD 및 RUE는 염증 유발 인자인 NO를 생성하는 iNOS의 단백질 및 mRNA 발현의 억제 효과 확인을 통해 NO 저해 활성에도 우수한 영향을 미치는 것으로 판단되며, COX-2의 단백질 및 mRNA 발현 억제 또한 두 추출물 모두 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다. 이를 통해 RUD 및 RUE는 항산화 및 항염증 효과를 가지는 것으로 생각되며, RUD 및 RUE의 효능을 보다 명확히 입증하기 위해서 성분 분석과 추후 항염증에 관여하는 NF-κB 및 MAPK에 대한 결과를 추가 입증한다면 우수한 기능성 소재로써 활용 가능성이 있다고 기대되는 바이다.