관절염은 관절의 염증과 변성을 특징으로 하는 만성적인 질환으로, 골관절염(osteoarthritis)과 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)이 대표적이다. 골관절염은 노화에 따른 연골의 퇴화가 주요 원인 중 하나로 간주되며, 부상, 유전적 요인, 비만 등도 관절염의 발생을 촉진할 수 있는 요소이다. 골관절염은 환자의 삶의 질을 저하시키며, 만성적인 통증과 염증으로 일상생활에 부정적인 영향을 미친다. 따라서 관절염의 예방과 치료는 중요한 연구 및 임상적 과제이며, 원인과 기전을 이해하고 보다 효과적인 치료법과 예방 전략을 개발하는 것이 요구된다(Blagojevic 등, 2010; Chen 등, 2017; Cook 등, 2007).

연골은 관절을 보호하고 원활한 움직임을 지원하는 역할을 하므로, 골관절염의 핵심적인 특징인 연골 퇴화 및 손상은 관절의 부분적 또는 전체적인 기능 저하로 이어진다. 따라서 관절 건강을 위해서는 연골세포(chondrocytes)에 의한 연골 항상성 유지가 중요하다. 연골세포는 관절연골에 존재하는 유일한 세포로, 세포외기질(extracellular matrix)의 합성과 분해를 조절하여 연골 항상성을 유지하는 역할을 한다(Akkiraju와 Nohe, 2015; Hwang과 Kim, 2015). 따라서 연골세포의 기능변화와 사멸은 콜라겐, 프로테오글라이칸, 아그리칸 등의 세포외기질의 합성을 감소시켜 연골의 구조가 파괴되는 골관절염의 전형적인 특징을 보이게 한다(Tchetina, 2011).

또한 손상된 연골 주위로 염증성 세포들이 이동하여 염증 반응을 유발하며, 이로 인해 관절 부위에서 염증성사이토카인(pro-inflammatory cytokine), nitric oxide(NO), pros-taglandin E₂(PGE₂) 등의 염증 유발물질들의 분비가 증가한다(Houard 등, 2013). 이러한 염증 반응은 세포외기질을 분해하는 matrix metalloproteinases(MMPs) 활성에 의한 연골조직 분해를 더욱 촉진한다(Klatt 등, 2009; Tchet-verikov 등, 2005). 관절염에서 염증이 발생하면 세포들이 반응성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성하는데, ROS는 산화적 스트레스를 유발하여 연골 파괴를 유발하고 관절 조직에 손상을 입힐 수 있다(Ansari 등, 2020). 또한 과도한 염증 발생은 세포자멸사(apoptosis)를 발생하게 하는데, 노화 및 항상성 유지에 중요하면서도 가장 기본적인 역할을 하는 것으로, 골관절염에서 병리 발생의 주요 인자로 여겨지고 있다(Guo 등, 2021). 따라서 골관절염 경구용 약제는 세포외기질 분해효소나 염증물질 발생을 억제하는 치료제로서 비스테로이드 항염증 약물(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)이 일반적인 약물 치료이다. 그러나 NSAIDs는 위장관계 부작용을 초래하므로, 부작용 및 독성 위험도가 낮고 기능성 식품에 대한 수요가 증가하는 관점에서 최근에는 천연 식물 추출물 등을 활용한 치료법도 주목받고 있다(Bannuru 등, 2014; Zhang 등, 2019).

부작용이 적은 다양한 천연물 연구 중에서도 아보카도･대두불검화물(avocado and soybean unsaponifiables, ASU)은 골관절염의 통증 감소 효과에 관해 임상 연구를 통해 입증되어 관심이 증가하였다. ASU는 아보카도와 대두 기름을 비누화시키는 과정에서 반응하지 않고 생성되는 불검화물로, 주로 1:2의 비율로 제조된다(Głuszko와 Stasiek, 2016; Lequesne 등, 2002). ASU의 연골조직 형성하는 효능은 두 추출물의 개별 효능보다 혼합물이 더 강력한 상호작용 효과를 나타낸다고 보고되었다. ASU가 골관절염의 병태생리에 미치는 영향에 대해, tissue inhibitor of matrix metal-loproteinase(TIMP)의 증가로 MMPs의 활성을 억제하고 염증물질의 발생을 억제하여 세포외기질의 분해를 억제한다고 밝혀졌다(Al-Afify 등, 2018; Henrotin 등, 1998; Goudarzi 등, 2017). 임상 연구를 통해 ASU를 투여한 골관절염 환자를 관찰한 결과, NSAIDs 의존도가 감소하였으며 관절염 진행률이 낮아졌음을 보여줬다(Głuszko와 Stasiek, 2016). 선행연구들은 염증 및 MMPs 관련 인자를 확인하였으나 세포자멸사 기전 관련 실험은 미흡한 실정이며, 세포 및 분자적인 수준에서 ASU 효능의 구체적인 기전과 중요 분자요소를 확인하기 위해 추가 연구가 요구된다. 따라서 본 연구에서는 약효가 있으면서 부작용이 적은 ASU의 골관절염 예방 및 억제 효능의 치료법으로 활용을 위해 연골생성 및 염증 관련 작용기전들을 밝히고자 primary chondrocyte와 동물모델을 이용하여 연구를 수행하였다.

샘플 정보

본 연구에 사용한 ASU는 스테롤이 350 mg/g, 토코페롤이 80 mg/g 함유된 HSBio에서 제조된 제품이다. 이 제품은아보카도 지방산과 대두 지방산을 염화칼륨을 사용하여 비누화를 시켰으며, 이후 에틸을 사용하여 추출, 수산화나트륨을 이용한 분리 및 농축 절차를 거쳐 각 아보카도 추출물과 대두 추출물을 1:2 비율로 혼합하였다.

세포배양 및 처리

실험을 위한 연골세포는 다음과 같은 과정으로 rat에서 primary culture를 통해 얻었다. 4~6주령 무게 약 180~200 g 정도의 male Sprague-Dawley rat을 희생시킨 후, 관절연골을 2~3 mm 정도 크기로 채취하였고 채취한 연골조직은 0.1% EDTA-CDMF(calcium magnesium free, Sigma-Aldrich) 용액에 30분씩 2회 넣어 배양시켰다(37°C, 5% CO₂). 0.25% trypsin으로 1시간 배양(37°C, 5% CO₂)시킨 후, 2 mg/mL collagenase type I(Sigma)을 처리하여 교반기에 12시간 배양시켰다. 세포 부유액을 100 μm pore size cell strainer(BD Falcon)에 여과한 후 원심분리하여 세포를 분리하였다. 얻어진 연골세포는 10% fetal bovine serum(Hyclone), 1% penicillin-streptomycin(Hyclone), 1% L-glutamine(Hyclone) 그리고 0.1% gentamicin sul-fate(Lonza)가 포함된 Dulbecco’s modified essential me-dium(Hyclone)에 배양하여 본 실험에 사용하였다.

세포독성 및 세포보호 효과

연골세포를 96-well plate에 분주하여 12시간 동안 안정화한 후, 각 샘플을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 3-(4,5-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Sigma-Aldrich) 시약을 500 μg/mL 처리하여 2시간 배양한 후 배지와 MTT 시약을 제거하고, di-methyl sulfoxide 시약 200 μL를 가하여 560 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 확인하였다. 또한 H₂O₂ 200 μM을 처리한 연골세포에 ASU를 농도별로 처리하여 세포보호 효과를 MTT 시약을 이용하여 세포 생존율을 확인하였다.

골관절염 유발 동물모델 및 샘플 투여

본 연구는 경희대학교 동물실험윤리위원회의 승인(KHGASP-22-357)을 받아 진행하였다. 골관절염 유발에 사용된 동물은 (주)새론바이오에서 250 g 내외의 생후 5주 된 male SD rat을 공급받아 사용하였다. 명암은 12시간(light/dark cycle), 온도는 23±2°C, 상대습도는 50±5%인 조건에서 1주 동안 적응기를 거쳐 실험에 이용하였다. 적응 기간에 AIN93G 식이와 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 체중을 측정하여 평균 체중에 가까운 개체를 무작위 법으로 8마리씩 normal control(NC), control[C; mono-sodium iodoacetate(MIA) 주사 대조군], positive control[PC; MIA 주사와 methyl sulfonyl methane(MSM) 300 mg/kg b.w. 투여한 양성대조군], ASU15(MIA 주사와 ASU 15 mg/kg b.w. 투여군), ASU30(MIA 주사와 ASU 30 mg/kg b.w. 투여군), ASU60(MIA 주사와 ASU 60 mg/kg b.w. 투여군), ASU100(MIA 주사와 ASU 100 mg/kg b.w. 투여군)으로 나누었다. 골관절염 유발을 위하여 이소플루란을 이용해 마취시킨 rat의 무릎 주변을 제모하고 골관절염 유발 물질인 MIA(Sigma-Aldrich)를 1 mL 주사기로 양쪽 무릎 관절강 내에 50 μL(60 mg/mL)씩 주사하였다. 관절염 유발 4주 후에 모든 동물을 희생시킨 후 분석하였다.

Micro-CT 촬영을 통한 골 상태 측정

실험 종료 후 실험군별 rat의 골구조 변화를 측정하기 위해 three-dimensional micro-CT 촬영을 시행하였다. 동물을 희생시켜 관절 부위 뼈를 적출하여 formaldehyde(Jun-sei)에 고정시킨 후 high resolution micro-CT(Skyscan 1172)로 촬영하였다. 골 부피(bone volume, BV), 골 표면적(bone surface area), 조직 전체 부피(total tissue vol-ume, TV)를 바탕으로 골의 부피와 조직 전체 부피의 비율(BV/TV), 치밀골의 두께(trabecular thickness) 등 분석 결과를 바탕으로 관절염 유발에 따른 SD rat의 골지표를 분석하였다.

PGE₂, NO 및 cytokine 분비량 측정

세포 배양액과 관절염 유발 실험동물의 혈액을 원심분리하여 serum을 얻어 R&D Systems의 prostaglandin E2 assay kit, rat IL-1β, TNF-α, IL-6 duoset ELISA kit을 이용하여 R&D Systems의 protocol을 따라서 실험하였으며, ELISA reader(Bio-Rad)를 이용하여 655 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 Abcam의 nitric oxide assay kit을 이용하여 Abcam의 protocol을 따라서 실험하였고, ELISA reader(Bio-Rad)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Western blotting

세포와 연골조직을 protease inhibitor 첨가된 lysis buf-fer를 넣어 조직을 균질화하여 ice에 두어 일정 시간 유지 후 단백질을 분리하였다. 단백질 정량은 bovine serum al-bumin과 Bio-Rad protein assay dye reagent concen-trate(Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 정량하였다. So-dium dodecyl sulfate-poly-acrylamide gel(10%)을 이용하여 각 샘플당 10 μL씩 loading 하여 전기영동으로 분리한 후 nitrocellulose membrane으로 단백질을 전이하였다. 그 후 TBST buffer에 용해한 5% skim milk(TBS containing 0.5% Tween 20)로 1시간 동안 blocking을 하였고, 1차 항체 JNK, p-JNK, c-Fos, p-c-Fos, c-Jun, p-c-Jun, FADD, Bax, caspase 8, cleaved caspase 8, caspase 3, cleaved caspase 3, IκBα, p-IκBα, β-actin(Cell Signaling Technology)을 4°C, 18시간 반응시켰다. Membrane을 horseradish peroxidase가 중합된 2차 항체(Cell Signal-ing Technology)에 60분간 반응시켰고, enhanced chemi-luminescent(Amersham Pharmacia Biotech)를 이용해 발색한 후 Easy photo를 사용하여 촬영하였다. 촬영된 west-ern blot band 이미지들은 Image J Software(NIH)를 사용하여 band의 밀도를 측정하였다.

Real-time polymerase chain reaction(PCR)

세포와 연골조직을 RNasy Mini kit(QIAGEN)을 이용하여 RNA를 추출한 뒤 iScript™ cDNA Synthesis kit(Bio-Rad)을 이용하여 cDNA로 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용한 실시간 정량 PCR (Bio-Rad)을 실시하였다. 유전자 증폭 반응에 사용할 각각의 primer 염기서열은 Table 1에 나타내었다. 95°C에서 10분 동안 hot start 한 후 95°C에서 15초, 57°C에서 15초, 72°C에서 30초간 40 cycling으로 PCR 분석을 시행하였다. 모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 실시하였다. 결과의 분석은 Bio-Rad에서 제공하는 CFX Maestro™ Analysis Software로 분석하였다.

Table 1

Primer sequences used in real-time PCR quantification of mRNA.

Gene	Primer sequences
Aggrecan (R)	F: 5′‒GAA GTG TCC AAA CCA A‒3′
	R: 5′‒CGT TCC ATT CAC CCC TCT CA‒3′
Collagen type Ⅰ (R)	F: 5′‒GAG CGG AGA GTA CTG GAT CGA‒3′
	R: 5′‒CTG ACC TGT CTC CAT GTT GCA‒3′
Collagen type Ⅱ (R)	F: 5′‒GCA ACA GCA GGT TCA CGT ACA‒3′
	R: 5′‒TCG GTA CTC GAT GAT GGT CTT G‒3′
TIMP-1 (R)	F: 5′‒AAG GGC TAC CAG AGC GAT CA‒3′
	R: 5′‒ATC GAG ACC CCA AGG TAT TGC‒3′
TIMP-3 (R)	F: 5′‒GAC CGA CAT GCT TC CAA TTT C‒3′
	R: 5′‒GCT GCA GTA GCC ACC CTT CT‒3′
MMP-3 (R)	F: 5′‒GAG TGT GGA TTC TGC CAT TGA G‒3′
	R: 5′‒TTA CAG CCT CTC CTT CAG AGA‒3′
MMP-13 (R)	F: 5′‒TGA TGG GCC TTC TGG TCT TCT‒3′
	R: 5′‒CCC CGC CAA GGT TTG G‒3′
GAPDH (R)	F: 5′‒TGG CCT CCA AGG AGT AAG AAA C‒3′
	R: 5′‒CAG CAA CTG AGG GCC TCT CT‒3′

TIMP: tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, MMP: matrix metalloproteinases, GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase..

통계처리

실험 결과는 SPSS 22.0 software(IBM)를 이용하여 분석하였으며, 모든 측정 항목의 결과는 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다. 실험군 간 평균 차이를 one-way ANOVA로 확인한 후 그룹 간의 통계적 유의성을 Duncan’s multiple range test를 이용하여 검증하였으며 5% 이내에서 통계적 유의성을 부여하였다(P<0.05).

H₂O₂ 처리한 연골세포에서 ASU의 보호 효과 및 세포외기질 합성 효과

세포 실험에서 염증 반응을 재현할 때 주로 쓰이는 H₂O₂는 미토콘드리아에서 발생하는 대사산물이지만 과도하게 발행하게 되면 산화적 스트레스를 야기하는 물질이다(Mathy-Hartert 등, 2003). 연골세포에 대한 ASU의 독성을 보이는지 확인하기 위해 다양한 농도에서 세포 생존율을 확인하였고 모든 농도에서 세포독성을 보이지 않았음을 확인하였다(Fig. 1A). 세포사멸을 유도하기 위해 H₂O₂ 처리한 연골세포에서 ASU 처리가 세포 생존율에 영향을 미치는지 확인하였다. 그 결과 ASU의 200 μg/mL와 400 μg/mL 농도에서 시험대조군과 비교하여 유의적으로 생존율이 증가하였음을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 1B). 따라서 본 실험 결과를 통해 ASU가 세포사멸이 유도된 연골세포의 회복 및 보호 효과를 지녔음을 알 수 있다.

Fig 1. The effect of avocado and soybean unsaponifiables (ASU) on cell viability (A) and H₂O₂-induced damage (B)　in the primary chondrocytes. NC: no treatment, C: H₂O₂ 200 μM treatment, ASU100: H₂O₂ 200 μM and ASU 100 μg/mL treatment, ASU200: H₂O₂ 200 μM and ASU 200 μg/mL treatment, ASU400: H₂O₂ 200 μM and ASU 400 μg/mL treatment. Values are presented as mean±SD. Different letters (a-d) indicate a significant difference with P<0.05, as determined using Duncan’s multiple range test.

ASU 처리가 연골세포에서 연골생성에 영향을 미치는지 확인하기 위해 세포외기질의 합성과 분해에 영향을 미치는 인자들을 확인하였다. 아그리칸은 연골에서 세포외기질의 섬유소 사이의 공간을 채우는 주요성분이다. 1형 콜라겐(collagen typeⅠ)은 연골세포뿐만 아니라 일반적으로 인체 세포에서 가장 많이 분포하고 있으며, 2형 콜라겐(collagen type Ⅱ)은 연골에 분포하고 있는 콜라겐의 약 85~90%를 차지하고 있는 주요 연골생성 인자이다(Akkiraju와 Nohe, 2015; Troeberg와 Nagase, 2012). 따라서 아그리칸, 1형 콜라겐, 2형 콜라겐은 연골조직의 상태를 결정하는 주요 인자이므로 ASU 처리에 의한 발현의 변화를 관찰하였다. H₂O₂ 처리에 의해 연골세포의 아그리칸, 1형 콜라겐, 2형 콜라겐 모두 발현이 유의적으로 감소하였음을 확인하여 세포외기질의 합성이 억제되었음을 확인하였다. 하지만 양성대조군에서 사용한 아세틸 살리실산(acetylsalicylic acid, 관절질환에서 사용되는 의약품)과 ASU 처리는 아그리칸, 1형 콜라겐, 2형 콜라겐 발현을 시험대조군과 비교하여 유의적으로 증가시켰다(P<0.05)(Fig. 2A~C).

Fig 2. The effect of avocado and soybean unsaponifiables (ASU) on H₂O₂-induced changes in the mRNA expression of aggrecan (A), collagen type Ⅰ (B), collagen type Ⅱ (C), tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP)-1 (D), TIMP-3 (E), matrix metalloproteinases (MMP)-3 (F), MMP-13 (G), and protein expression of smad3 phosphorylation, MMP-3, and MMP-13 (H) in the primary chondrocytes. NC: no treatment, C: H₂O₂ 200 μM treatment, PC: H₂O₂ 200 μM and acetylsalicylic acid 10 μM/mL treatment, ASU100: H₂O₂ 200 μM and ASU 100 μg/mL treatment, ASU200: H₂O₂ 200 μM and ASU 200 μg/mL treatment, ASU400: H₂O₂ 200 μM and ASU 400 μg/mL treatment. Values are presented as mean±SD. Different letters (a-e) indicate a significant difference with P<0.05, as determined using Duncan’s multiple range test.

세포외기질의 분해는 단백질 가수분해 효소(proteolytic enzymes)에 의해 연골질 퇴화에 가장 핵심적인 역할을 하며 그중 가장 대표적인 것이 MMPs이다. 골관절염 발병 시 MMPs 증가로 인해 연골을 구성하는 콜라겐 등의 세포외기질 단백질을 분해시켜 골관절염을 악화시키는 것으로 알려져 있다. MMPs의 억제에 관여하는 것이 TIMPs로, 결과적으로 연골생성에 긍정적인 영향을 미치는 인자이다(Tche-tina, 2011; Tchetverikov 등, 2005). 본 연구에서 ASU 처리에 의한 TIMPs와 MMPs의 발현에 미치는 영향을 관찰하였다. H₂O₂ 처리에 의해 연골세포의 TIMP-1와 TIMP-3 발현이 유의적으로 감소하였고 MMP-3, MMP-13의 발현은 유의적으로 증가하였음을 확인하였다. 하지만 양성대조군과 ASU를 처리한 군에서는 TIMP-1와 TIMP-3 발현이 시험대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였고, MMP3와 MMP13의 발현은 시험대조군과 비교하여 유의적으로 감소하였음을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 2D~G). 또한 1형 콜라겐의 전사를 자극하는 전사인자인 Smad3의 인산화를 확인한 결과(Fig. 2H)에서, ASU를 처리한 군에서 시험대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였음을 확인하였다. 따라서 이러한 결과를 통해 ASU 처리가 연골세포를 보호하고 연골합성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

LPS 처리한 연골세포에서 ASU의 항염 효과

세포실험에서 염증 반응을 재현할 때 LPS 역시 많이 사용하는데, LPS는 세포벽의 구성성분 중의 하나지만 세포를 자극하여 염증 매개 인자들을 발현시키는 대표적인 물질로 알려져 있다(Kwon, 2016; Mathy-Hartert 등, 2003). 사이토카인은 세포에서 분비되는 수용성 단백질로 특정 신호물질에 의해 발현되며, 효소와는 구별되게 주변 세포에 의해 영향을 받고 작용하는 범위도 인접한 세포들로 국한되는 특징을 가지고 있다. 관절염에 있어서 전염증성사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6)은 연골에서 세포외기질의 이화작용에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 이러한 전염증성사이토카인과 염증 반응의 매개체인 PGE₂와 NO는 MMPs의 발현을 유도하며, 염증반응을 가속화시켜 조직의 손상을 유발하는 역할을 하게 된다(Chow와 Chin, 2020; Wang 등, 2016; Zhang 등, 2016). 본 연구에서 LPS 처리에 의한 염증 유발을 유도한 연골세포에서 ASU 처리에 의한 항염 효능을 확인하였다. LPS를 처리한 연골세포에서는 TNF-α, IL-1β, IL-6, PGE₂, NO의 생산이 처리하지 않은 연골세포와 비교하여 유의적으로 모두 증가하였음을 확인하여, 염증 유발이 정상적으로 진행되었음을 확인하였다. 반면 ASU 200 μg/mL와 400 μg/mL를 처리한 세포에서는 TNF-α, IL-1β, IL-6, PGE₂, NO의 분비가 시험대조군과 비교하여 유의적으로 모두 감소하였음을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 3A~E).

Fig 3. The effect of avocado and soybean unsaponifiables (ASU) on lipopolysaccharide (LPS)-induced secretion of inflammatory mediators, tumor necrosis factor-alpha (TNF)-α (A), interleukin (IL)-1β (B), IL-6 (C), prostaglandin E₂ (PGE₂) (D), nitric oxide (E), and inflammatory pathway activation (F) in the primary chondrocytes. NC: no treatment, C: LPS 50 μg/mL treatment, PC: LPS 50 μg/mL and acetylsalicylic acid 10 μM/mL treatment, ASU100: LPS 50 μg/mL and ASU 100 μg/mL treatment, ASU200: LPS 50 μg/mL and ASU 200 μg/mL treatment, ASU400: LPS 50 μg/mL and ASU 400 μg/mL treatment. Values are presented as mean±SD. Different letters (a-e) indicate a significant difference with P<0.05, as determined using Duncan’s multiple range test.

염증 유발물질 생성의 주요 경로는 세포 내에 신호전달을 통해 인산화된 NF-κB의 전사인자로써의 활성이다. NF-κB 단백 이합체는 inhibitor κB(IκB)와 결합하여 세포질 내에서 비활성화 상태로 존재하며, IκB의 인산화에 ubiquiti-nation이 일어나면 인산화된 NF-κB는 분리되어 핵 내로 이동하여 염증 유발물질의 합성을 유발하는 전사를 유도한다(Chow와 Chin, 2020; Roman-Blas와 Jimenez, 2006). 본 연구에서는 LPS를 처리한 연골세포에서 NF-κB p65와 IκB의 인산화, 그리고 PGE₂ 합성에 관여하는 효소인 cy-clooxygenase-2(COX-2)의 단백질 발현이 모두 증가하였음을 확인하였다. 하지만 ASU를 처리한 세포에서는 NF-κB p65와 IκB의 인산화, COX-2의 단백질 발현이 시험대조군과 비교하여 모두 유의적으로 감소하였음을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 3F). 따라서 ASU가 연골세포의 염증 증상을 완화시켜 골관절염의 예방 및 치료 효능을 지니는 소재로써 활용 가치를 확인하였다.

LPS 처리한 연골세포에서 ASU의 세포사멸 억제 효과

골관절염의 연골세포는 정상관절의 연골세포와 비교하여 더 높은 비율의 세포사멸을 보이며, 연골세포의 세포사멸은 주로 염증성 신호로 시작된다. 연골세포의 세포사멸은 손상된 연골 조직을 제어하고 염증 반응을 제한하기 위한 반응으로 작용할 수 있으나, 비정상적으로 과도한 세포사멸은 세포외기질의 감소를 유발하여 연골 손상을 더 악화시킨다(Hwang과 Kim, 2015). 본 연구에서는 LPS 처리로 유도된 연골세포의 세포사멸에서 ASU의 효과를 확인하였다. LPS 처리된 연골세포에서 세포사멸과 관련된 JNK, c-Fos, c-Jun의 인산화와 FADD/caspase8/Bax/caspase3 경로가 활성화되었음을 확인하였다. LPS 처리한 연골세포에 ASU를 처리하였을 때, JNK, c-Fos, c-Jun의 인산화와 FADD/caspase8/Bax/caspase3 경로가 유의적으로 감소하였음을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 4). 따라서 이러한 결과를 통해 ASU 보충이 연골세포의 세포사멸을 억제함으로써 골관절염의 발병을 예방할 수 있음을 알 수 있다. 추가로 MIA로 유도한 퇴행성 골관절염 동물모델에서 효능을 확인하여 검증을 진행하였다.

Fig 4. The effect of avocado and soybean unsaponifiables (ASU) on lipopolysaccharide (LPS)-induced apoptosis pathway activation in the primary chondrocytes. NC: no treatment, C: LPS 50 μg/mL treatment, PC: LPS 50 μg/mL and acetylsalicylic acid 10 μM/mL treatment, ASU100: LPS 50 μg/mL and ASU 100 μg/mL treatment, ASU200: LPS 50 μg/mL and ASU 200 μg/mL treatment, ASU400: LPS 50 μg/mL and ASU 400 μg/mL treatment. Values are presented as mean±SD. Different letters (a-e) indicate a significant difference with P<0.05, as determined using Duncan’s multiple range test.

MIA로 유도한 골관절염 동물모델에서 ASU의 관절 보호 효과MIA를 동물의 관절연골에 주입하면 세포사멸로 인한 골관절염 발병이 유도되므로 골관절염 유발 동물모델로 적합한 모델이다(Pitcher 등, 2016). Micro-CT 사진으로 골관절염 유발에 따른 뼈조직을 살펴보면 정상군에서는 관절과 뼈조직의 손상이 없이 치밀한 골구조를 보이고 있으나, MIA로 골관절염을 유발한 군에서는 골 전체의 밀도가 감소하여 골조직의 손상이 심각하게 일어났음을 확인할 수 있다. 이러한 뼈조직의 손상은 ASU 섭취에 따라 감소하였음을 형태학적으로 확인할 수 있었다(Fig. 5A).

Fig 5. The effect of avocado and soybean unsaponifiables (ASU) on morphological change (A), bone mineral density (BMD) (B), bone volume/total tissue volume (C), trabecular number (D), trabecular thickness (E), and trabecular separation (F) of rats with monosodium iodoacetate (MIA)-induced osteoarthritis using micro-CT. NC: Normal control, C: MIA injected control group, PC: MIA injected group supplemented with methyl sulfonyl methane 300 mg/kg b.w., ASU15: MIA injected group supplemented with ASU 15 mg/kg b.w., ASU30: MIA injected group supplemented with ASU 30 mg/kg b.w., ASU60: MIA injected group supplemented with ASU 60 mg/kg b.w., ASU100: MIA injected group supplemented with ASU 100 mg/kg b.w.. Values are presented as mean±SD. Different letters (a-d) indicate a significant difference with P<0.05, as determined using Duncan’s multiple range test.

Micro-CT 촬영 사진 결과를 정확하게 판독하기 위하여 골밀도(bone mineral density), 골부피(bone volume)와 총부피(total volume)의 비율, trabecular bone의 수, tra-becular 두께(thickness)와 간격(separation)을 측정하였다. 골부피, trabecular bone의 수, trabecular 두께는 정상군과 비교하여 관절염 유발 대조군에서 모두 유의적으로 감소하였음을 확인하였으나, 관절염 유발 대조군과 비교하여 MSM(양성대조군)과 ASU 섭취군에서 골밀도를 제외하고 유의적으로 증가했음을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 5B~E). Trabecular 간격은 trabecular 두께와는 반대되는 개념으로 골 그물 구조 사이의 거리를 나타내고, 수치가 높을수록 골 소실이 심한 것을 확인할 수 있다. Trabecular 간격을 확인한 결과에서는 관절염 유발 대조군과 비교하여 MSM과 ASU 섭취군에서 유의적으로 감소하였음을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 5F).

MIA로 유도한 골관절염 동물모델에서 ASU의 세포외기질 합성 효과

MIA로 골관절염을 유발한 군에서는 연골조직의 아그리칸, 1형 콜라겐, 2형 콜라겐의 RNA 발현이 정상군과 비교하여 유의적으로 감소하였음을 확인하였다. 반면 양성대조군과 ASU 100 mg/kg b.w.를 투여한 군에서는 아그리칸, 1형 콜라겐, 2형 콜라겐 RNA 발현이 모두 관절염 유발 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였다(P<0.05)(Fig. 6A~C). 골관절염을 유발한 군에서는 연골조직의 TIMP-1과 TIMP-3의 RNA 발현과 Smad3의 인산화가 유의적으로 감소하였고 MMP-3, MMP-13의 RNA 발현과 단백질 발현은 유의적으로 증가하였음을 확인하였다. 반면 양성대조군과 ASU를 투여한 군에서는 TIMP-1과 TIMP-3의 RNA 발현과 Smad3의 인산화가 관절염 유발 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였고, MMP-3와 MMP-13의 발현은 관절염 유발 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하였음을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 6D~H). 따라서 MIA로 유도한 관절염에서 ASU 처리가 연골조직의 세포외기질 합성 자극에 긍정적인 역할을 할 수 있음을 확인하였다.

Fig 6. The effect of avocado and soybean unsaponifiables (ASU) on mRNA expression of aggrecan (A), collagen type Ⅰ (B), collagen type Ⅱ (C), tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP)-1 (D), TIMP-3 (E), matrix metalloproteinases (MMP)-3 (F), MMP-13 (G), and protein expression of smad3 phosphorylation, MMP-3, and MMP-13 (H) in rats with monosodium iodoacetate (MIA)-induced osteoarthritis. NC: Normal control, C: MIA injected control group, PC: MIA injected group supplemented with methyl sulfonyl methane 300 mg/kg b.w., ASU15: MIA injected group supplemented with ASU 15 mg/kg b.w., ASU30: MIA injected group supplemented with ASU 30 mg/kg b.w., ASU60: MIA injected group supplemented with ASU 60 mg/kg b.w., ASU100: MIA injected group supplemented with ASU 100 mg/kg b.w.. Values are presented as mean±SD. Different letters (a-e) indicate a significant difference with P<0.05, as determined using Duncan’s multiple range test.

Lequesne 등(2002)은 임상 연구를 통해 엉덩이 골관절염 환자에서 ASU의 투약이 관절강 손실의 진행을 유의하게 감소시켰음을 확인하였다. 또한 Kawcak 등(2007)의 연구에서는 말의 연골에 관절염을 유발하고 ASU를 투여한 결과, 관절연골의 침식 및 윤활막 염증이 유의적으로 감소하였음을 보여줬다. 이러한 연구 결과와 본 연구 결과를 통해 ASU 섭취는 관절연골의 손상을 억제하여 골관절염의 발병을 완화할 수 있다고 판단된다.

MIA로 유도한 골관절염 동물모델에서 ASU의 항염 및 세포사멸 억제 효과

MIA로 골관절염을 유발한 군에서는 TNF-α, IL-1β, IL-6, PGE₂, NO의 혈중 농도와 NF-κB p65와 IκB의 인산화, COX-2의 단백질 발현이 정상군과 비교하여 유의적으로 증가하여 염증이 유발되었음을 확인하였다. 하지만 양성대조군과 ASU 투여군에서는 TNF-α, IL-1β, IL-6, PGE₂, NO의 혈중 농도와 NF-κB p65와 IκB의 인산화, COX-2의 단백질 발현이 모두 관절염 유발 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하였다(P<0.05)(Fig. 7). MIA로 골관절염을 유발한 군의 연골세포에서는 JNK, c-Fos, c-Jun의 인산화와 FADD/caspase8/Bax/caspase3 경로가 활성화되었음을 확인하였다. 하지만 양성대조군과 ASU 투여군에서는 JNK, c-Fos, c-Jun의 인산화와 FADD/caspase8/Bax/caspase3 경로의 활성화가 유의적으로 감소하였음을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 8). 이러한 세포사멸을 억제하는 ASU의 효능은 ASU의 항염효능에 따른 염증성 신호 감소로 세포사멸이 억제되었다고 판단된다.

Fig 7. The effect of avocado and soybean unsaponifiables (ASU) on production of inflammatory mediators, tumor necrosis factor-alpha (TNF)-α (A), interleukin (IL)-1β (B), IL-6 (C), prostaglandin E2 (PGE2) (D), nitric oxide (E), and inflammatory pathway activation (F) in rats with monosodium iodoacetate (MIA)-induced osteoarthritis. NC: Normal control, C: MIA injected control group, PC: MIA injected group supplemented with methyl sulfonyl methane 300 mg/kg b.w., ASU15: MIA injected group supplemented with ASU 15 mg/kg b.w., ASU30: MIA injected group supplemented with ASU 30 mg/kg b.w., ASU60: MIA injected group supplemented with ASU 60 mg/kg b.w., ASU100: MIA injected group supplemented with ASU 100 mg/kg b.w.. Values are presented as mean±SD. Different letters (a-e) indicate a significant difference with P<0.05, as determined using Duncan’s multiple range test.

Fig 8. The effect of avocado and soybean unsaponifiables (ASU) on apoptosis pathway activation in rats with monosodium iodoacetate (MIA)-induced osteoarthritis. NC: Normal control, C: MIA injected control group, PC: MIA injected group supplemented with methyl sulfonyl methane 300 mg/kg b.w., ASU15: MIA injected group supplemented with ASU 15 mg/kg b.w., ASU30: MIA injected group supplemented with ASU 30 mg/kg b.w., ASU60: MIA injected group supplemented with ASU 60 mg/kg b.w., ASU100: MIA injected group supplemented with ASU 100 mg/kg b.w.. Values are presented as mean±SD. Different letters (a-e) indicate a significant difference with P<0.05, as determined using Duncan’s multiple range test.

Henrotin 등(1998) 연구에서 ASU가 연골세포에서 IL-6, IL-8, PGE₂의 생산을 감소시켰음을 보여줬으며, Au 등(2007)은 ASU를 처리한 연골세포에서 COX-2와 iNOS 발현 억제와 PGE₂의 생성을 감소시켰음을 확인하였다. 또한 ASU는 단핵구/대식세포에서 TNF-α와 IL-1β 발현을 감소시켰음을 보여주어 항염 효능을 입증하였다. 이러한 결과들은 ASU 처리가 직접적으로 연골세포의 염증 유발을 억제함으로써 골관절염을 완화할 수 있음을 시사한다.

ASU에는 식물성 스테롤 성분인 피토스테롤(phytosterol)이 포함되어 있으며 피토스테롤 중에서도 beta-sitosterol, campesterol, stigmasterol이 포함된 것으로 보고되었다. 이러한 피토스테롤은 혈중콜레스테롤을 감소시키고 항염 및 항산화 효능이 있다고 입증되었다(Demonty 등, 2009; Lippiello 등, 2008; Yoshida와 Niki, 2003). 하지만 아직 골관절염 완화 효능에 영향을 미치는 ASU의 주요성분에 관한 연구가 부족한 상황이다. 따라서 추후 연구를 통해 ASU의 주요성분을 밝히고 임상 연구를 통해 관절염 통증 완화 및 항염 효능을 입증할 필요가 있다.

본 연구에서는 primary culture 된 연골세포 모델과 MIA로 유발한 골관절염 동물모델을 이용하여 ASU의 골관절염 예방 효과를 확인하였다. 연골세포에서 확인한 결과 ASU 처리는 세포보호 효과와 세포외기질의 합성 자극, 염증 유발 억제 효과에 의한 세포사멸을 억제하였음을 보여주었다. 동물모델에서는 micro-CT 촬영을 통한 골 상태를 측정하여 ASU 섭취가 연골손상을 억제하였음을 확인하였다. 또한 동물의 연골조직에서 ASU 섭취에 의한 세포외기질의 합성 자극, 항염 효과, 세포사멸 억제 효과를 확인하여 골관절염 증상을 완화시켰음을 확인하였다. 이러한 효과는 ASU가 직접적으로 연골세포에 영향을 미쳐 긍정적인 효능을 보였음을 알 수 있다. 따라서 ASU는 관절 및 연골 건강 기능성 소재로써 개발가능성이 충분할 것으로 판단된다.