도라지(Platycodon grandiflorum A. DC.)는 초롱꽃과에 속하는 다년생 초본의 식물이며(Kim, 2001), 도라지의 뿌리 부분은 당질과 섬유소가 풍부하고 Ca, K, Mg, Na, Fe, Zn 등이 많이 함유된 알칼리성 식품으로 우리나라에서 주로 약용과 식용으로 사용되고 있다(Ahn 등, 2005). 우리나라 한방에서는 3년근 이상을 껍질을 벗기고 말려 만든 길경(Platycodi radix)이라는 약재로 사용된다(Kim, 2001; Kim 등, 2007). 한방에서 길경은 거담, 진해, 편도선염, 감기, 기침, 천식, 폐결핵에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Moon 등, 2003).

도라지 뿌리 부분에는 다량의 사포닌이 함유되어 있는데, 이들 사포닌은 도라지의 특이 성분으로 platycodin A, C, D와 polygalacin D, spinasterol, spinasterol glucoside 등의 성분이 알려져 있다(Konishi 등, 1978; Li 등, 2010; Tada 등, 1975). 이 중 도라지의 platycodin D의 효능과 관련한 동물실험에서 항염증 효과(Kim 등, 2001), 간 손상 억제 효과(Lee와 Jeong, 2002), 항암 활성 효과(Kim 등, 2005), 혈당강하 및 콜레스테롤 저하 효과(Zhao 등, 2006), 항비만 효과(Lee 등, 2010) 등이 보고되었다. 도라지 뿌리와 관련한 생리활성 연구로는 고지방식이 흰쥐 간의 중성지방 저하 효과(Noh와 Kim, 1984), 혈청과 간의 지방질 개선 효과(Byun과 Seo, 2001), 암세포 접착저해 및 면역력 증강(Kim 등, 1998), 간독성에 대한 보호 효과(Choi 등, 2002), 혈당강하작용 및 콜레스테롤 대사의 개선작용(Seo 등 2004), 흑도라지의 항산화 및 항균 활성 연구(Lee 등, 2013b), 발효도라지의 호흡기질환 세균의 항균 활성 연구(Lee 등, 2016) 및 홍도라지 추출물의 마우스 비장세포 항염증 효과(Park 등, 2019) 등 다양한 생리활성이 보고되었다. 이러한 이유로 도라지 뿌리의 약리작용과 생리활성을 이용한 다양한 도라지 제품개발에 관한 연구가 수행되었다. 도라지를 활용한 제품과 관련한 연구로는 도라지 요구르트(Lee 등, 1998), 도라지 차(Lee 등, 2000), 도라지 캔디(Lee 등, 2001), 도라지 설기떡(Hwang과 Kim, 2007), 도라지 양갱(Park 등, 2009), 도라지 식혜(Jeong과 Yu, 2013), 도라지 쿠키(Jeong 등, 2013), 도라지 막걸리(Lee 등, 2018), 도라지 스펀지케이크(Hwang과 Kim, 2019), 도라지 식초(Gil 등, 2020) 및 도라지 젤리(Kim과 Youn, 2020) 등이 있다. 또한 도라지의 효능 및 품질 등과 관련한 다양한 가공처리법에 관한 연구로는 도라지의 쓴맛성분 저감을 위한 연구(Chang 등, 2015), 온도에 따른 도라지와 더덕의 이화학적 조성과 항산화적 특성 연구(Hwang 등, 2011), 증자와 발효 처리에 의한 도라지의 품질 특성 비교(Kim 등, 2015), 도라지 뿌리의 사포닌과 유리당 함량에 미치는 건조온도의 영향 연구(Lee와 Cho, 2014), 숙성온도와 시간에 따른 도라지의 이화학적 특성과 항산화 활성 연구(Lee 등, 2013a) 및 도라지의 사포닌과 무기질 함량에 미치는 건조 온도의 영향 연구(Lee 등, 2014) 등이 있다.

우리나라는 경제발전과 더불어 서구화된 식생활, 운동부족, 스트레스 및 환경오염 등에서 기인하는 각종 성인병 등으로 인하여 저칼로리 및 건강기능식품에 관한 관심의 증가와 함께 특히 효능을 갖는 식물성 식품에 관한 많은 연구가 수행되고 있다(Lee, 2020). 그러나 앞서 조사된 도라지 뿌리와 관련한 연구들은 약리적인 효능, 가공 및 제품화 등의 연구에 치중되어 있는바 도라지를 가공식품과 기능식품으로 활용하기 위하여 주로 전처리로 사용되고 있는 열수 추출에 관한 연구가 부족한 것으로 파악된다. 따라서 본 연구에서는 도라지 뿌리를 활용한 다양한 가공식품과 응용 제품화 관련 연구를 위하여 반응표면분석법을 활용하여 도라지 뿌리의 유용성분을 중심으로 도라지의 열수 최적 추출조건을 조사하였다.

실험 재료

본 연구에 사용된 도라지는 경북 안동에서 재배된 3년근 도라지의 뿌리 부분을 농업회사법인 (주)들산초에서 제공받아 전처리 후 실험에 사용하였다. 실험에 사용한 도라지의 일반성분은 도라지 100 g(wet weight basis) 중 수분 74.70 ±3.13%, 탄수화물 22.99±1.98%, 조단백 0.95±0.13%, 조지방 0.33±0.09%, 조회분 1.03±0.31%인 것을 사용하였다.

도라지의 전처리

도라지를 세척한 뒤 껍질을 벗기고 두께 0.5 cm, 길이 5 cm가 되도록 절단하여 50°C dry oven에서 19시간 건조한 것을 분쇄기(HMF-3910SS, Hanil Electronic)로 분쇄하여 추출시험에 사용하였다.

도라지 추출조건 최적화

전처리한 도라지의 추출은 환류냉각관을 부착한 추출장치를 이용하여 추출하였다. 도라지의 추출조건 최적화 분석은 반응표면 실험계획법(response surface methodology) (Myers 등, 2016)으로 추출에 영향을 미칠 수 있는 조건인 용매비, 추출온도, 추출시간을 각 독립변수(Table 1)로 하고 추출수율, 당 함량, 조사포닌 함량 및 platycodin D 함량 등을 반응변수로 설정하였다. 그에 따른 중심합성계획법(Wanasundara와 Shahidi, 1996)으로 코드화된 19구의 설정된 조건으로 조사하고(Table 2), 반응표면 회귀분석을 위해서는 statistical analysis system(SAS) program(SAS Institute, 2007)을 사용하였으며 변수들의 특성과 그에 상응하는 최적 추출조건은 예측된 모델식을 바탕으로 Mathematica program(Wolfram Research, 2014)을 이용하여 4차원 반응표면으로 나타내었다.

Table 1 . Levels of extraction conditions in experimental design.

Variables	Symbols	Coded variables
		−2	−1	0	1	2
Solvent to sample ratio (mL/g)	X1	10	15	20	25	30
Temperature (°C)	X2	70	75	80	85	90
Time (h)	X3	1.00	2	3	4	5

Table 2 . Central composite design for the optimization of extraction condition.

Exp. No.	Extraction condition
	Solvent to sample ratio (mL/g)	Temperature (°C)	Time (h)
1	25(1)	85(1)	4(1)
2	25(1)	85(1)	2(−1)
3	25(1)	75(−1)	4(1)
4	25(1)	75(−1)	2(−1)
5	15(−1)	85(1)	4(1)
6	15(−1)	85(1)	2(−1)
7	15(−1)	75(−1)	4(1)
8	15(−1)	75(−1)	2(−1)
9	20(0)	80(0)	3(0)
10	20(0)	80(0)	3(0)
11	20(0)	80(0)	3(0)
12	20(0)	80(0)	3(0)
13	20(0)	80(0)	3(0)
14	30(2)	80(0)	3(0)
15	10(−2)	80(0)	3(0)
16	20(0)	90(2)	3(0)
17	20(0)	70(−2)	3(0)
18	20(0)	80(0)	5(2)
19	20(0)	80(0)	1(−2)

추출수율

도라지 추출액의 추출수율은 항량을 구한 수기에 추출물을 취하여 수기를 105°C에 건조시킨 후 그 항량된 무게를 측정하여 추출물 조제에 사용된 건물량에 대한 백분율로써 추출수율을 나타내었다.

총당 및 환원당 함량 분석

추출물의 총당 함량은 phenol-sulfuric acid법(Saha와 Brewer, 1994)으로 측정하였다. 즉, 추출시료 용액 1 mL에 5%(v/v) 페놀 용액 1 mL와 95% 황산 5 mL를 가하여 발열시킨 후 30분 동안 상온에서 방치하였으며, 분광광도계(UVmini-1240, Shimadzu)를 이용하여 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출물의 환원당은 dinitrosalicylic acid (DNS)법(Miller, 1959)에 의해 측정하였다. 즉, 추출 시료액 0.5 mL에 DNS액 0.5 mL를 혼합한 뒤 끓는 물에서 5분 동안 반응시킨 후 방랭한 것을 분광광도계를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총당 및 환원당 함량은 glucose(Sigma-aldrich Co.)를 표준물질로 사용하여 검량선을 작성한 후 시료의 함량을 환산하였다.

조사포닌 함량 측정

추출물의 조사포닌 함량은 n-부탄올 추출법(Shibata 등, 1965)을 변형하여 측정하였다. 즉, 열수 추출시료 30 mL에 diethyl ether 30 mL로 2회 반복 추출하여 지용성 성분을 제거한 후, 수포화 부탄올 30 mL를 가하여 3회 반복 추출한 후, 미리 항량된 농축 플라스크에 회수하여 감압 농축하고 105°C에서 건조, 항량하여 조사포닌 함량을 구하였다.

Platycodin D 함량 분석

Platycodin D 함량 분석은 Park 등(2000)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 추출물의 조사포닌 함량을 구한 건조 시료를 70% 에탄올 30 mL에 재용해하여 50°C 항온수조에서 2시간 동안 진탕하고, 이를 원심분리(1,957×g, 15분)하여 상등액을 회수하였다. 이 추출조작을 총 2회 반복한 후, 회전증발농축기(N-1100, EYELA)로 감압 농축하여 HPLC용 증류수 10 mL에 녹이고 이를 0.45 μm membrane filter로 여과한 후 HPLC(2695 Alliance HPLC, Waters)로 분석하였다. HPLC 분석조건으로 컬럼은 Jupiter Proteo 90Å C₁₈ column(250×4.6 mm, 4 μm Phenomenex)을 사용하였으며 컬럼온도 35°C, 이동상으로는 acetonitrile(A)과 deionized water(B)를 사용하였다. 이동상의 비율(A:B)은 18:82(0 min)에서 18:82(22 min), 30:70(32 min), 50: 50(60 min)으로 순차적으로 변화시켰고, 유속은 1.0 mL/ min으로 70분 동안 photo diode array detector 203 nm에서 측정하였다. 표준물질은 platycodin D(Sigma-Aldrich Co.) 1 mg을 증류수 1 mL에 녹여 표준액을 조제하고 100, 50, 25 μg/mL 농도로 표준 검량선을 작성하여 추출시료의 platycodin D 농도를 환산하였다.

최적 추출조건의 예측 및 실증 시험

모든 반응변수는 회귀분석(regression analysis)과 분산분석(ANOVA)을 수행하였고, 이로부터 얻은 이차 회귀식을 통하여 반응모델의 적합성을 검증하였다. 추출조건별 도라지의 최적 추출조건 예측은 모든 반응변수의 4차원 반응표면을 superimposing 했을 때 중복되는 부분의 범위에서 최적 추출처리조건을 설정하였다. 또한 예측된 범위에서 임의의 점을 설정하여 회귀식에 대입한 후 그 예측된 값들에 대하여 동일조건에서 실제 실험을 통하여 얻은 실험치를 비교하고 SAS program의 Student’s one sample t-test로 P< 0.05 수준에서 유의성을 검증하였다. 이때 신뢰구간 95%에서 P>0.05이면 귀무가설(null hypothesis)을 채택하여 실측값과 이론값의 유의적 차이가 없는 것으로, P<0.05이면 귀무가설을 기각하고 대립가설(alternative hypothesis)을 채택하여 유의적인 차이가 있는 것으로 판단하였다.

추출수율

도라지 추출물의 추출수율은 25.70~52.47%의 범위로 나타났으며(Table 3), 이를 바탕으로 한 추출수율에 대한 회귀식은 Table 4와 같다. 추출수율에 대한 회귀식의 R² 값은 0.9664로 높은 신뢰도를 보였으며, P-value는 1% 이내 유의수준을 보였다(Table 4). 추출조건에 대한 영향에서 용매비, 추출온도 및 추출시간 모두 1% 이내 유의수준을 보였다(Table 5). 한편 lack of fit(적합결여검정) 값은 model의 적합도를 검정하는 통계량으로 P-value가 0.05보다 작을 때 회귀모델의 적합성에 문제가 있으며, 이보다 클 때 회귀모델이 적합하다고 판단하는 통곗값이다(SAS Institute, 2007). 추출수율에 대한 lack of fit의 P-value는 0.0870으로 나타나 회귀모델이 적합한 것으로 나타났다(Table 6). 추출조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 최대점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 추출수율의 최댓값은 51.58%고 이때의 추출조건은 용매비가 10.92 mL/g, 추출온도가 81.96°C, 추출시간이 3.74시간으로 나타났다(Table 7). 이들 추출수율 값에 대한 4차원 반응표면은 Fig. 1과 같다. Chae 등(2018)은 열수 추출로서 3년근 도라지의 추출수율이 21.20%, 7년근 도라지 추출수율이 26.10%였다고 보고하여 본 연구의 일부 결괏값과 유사하였다. 또한, Shon 등(2001)은 4년근 도라지와 24년근 도라지 물 추출물의 수율이 22%와 19%였다고 보고하여 본 연구의 추출수율보다 다소 낮은 것으로 나타났다. 이는 추출에 사용되는 시료의 처리상태, 추출용매의 종류, 용매비, 추출온도 및 추출시간 등 다양한 추출조건에 따라 추출수율에 차이가 나는 것으로 판단된다.

Table 3 . Experimental data on yield, total sugar, reducing sugar contents, crude saponin, and platycodin D of bell flower root extract under different extraction condition based on central composite design by response surface analysis.

Exp. No.	Yield (%)	Total sugar contents (mg/mL)	Reducing sugar contents (mg/mL)	Crude saponin (%)	Platycodin D (mg/mL)
1	39.78±1.45	9.39±0.04	5.94±0.08	0.18±0.01	0.28±0.02
2	35.99±0.69	8.69±0.06	5.75±0.04	0.16±0.01	0.35±0.03
3	29.28±1.87	8.40±0.02	5.72±0.21	0.16±0.05	0.32±0.01
4	25.70±1.41	8.07±0.04	5.64±0.11	0.15±0.03	0.32±0.04
5	47.85±3.61	14.19±0.02	6.84±0.04	0.23±0.08	0.29±0.01
6	42.70±1.69	12.17±0.06	6.41±0.11	0.20±0.03	0.29±0.02
7	40.50±2.76	13.43±0.02	6.55±0.03	0.21±0.01	0.49±0.05
8	35.50±1.33	11.56±0.02	6.32±0.07	0.19±0.02	0.49±0.02
9	42.30±2.20	13.43±0.02	6.22±0.03	0.19±0.02	0.27±0.03
10	41.18±1.65	13.52±0.04	6.20±0.03	0.19±0.03	0.31±0.01
11	42.84±3.28	13.67±0.06	6.21±0.07	0.18±0.02	0.35±0.03
12	43.98±2.59	13.40±0.09	6.30±0.10	0.19±0.01	0.33±0.04
13	43.82±1.75	13.72±0.06	6.20±0.16	0.19±0.06	0.26±0.01
14	26.08±1.12	8.17±0.02	5.48±0.10	0.14±0.02	0.27±0.02
15	52.47±4.97	14.56±0.06	7.15±0.16	0.26±0.03	0.30±0.03
16	39.40±1.57	13.80±0.06	6.35±0.04	0.19±0.03	0.27±0.01
17	26.86±1.28	12.69±0.06	6.04±0.07	0.17±0.01	0.38±0.05
18	42.46±3.82	13.74±0.02	6.21±0.09	0.21±0.04	0.44±0.04
19	30.92±1.16	7.63±0.04	6.03±0.07	0.15±0.01	0.33±0.02

All values are mean±SD (n=3)..

Table 4 . Polynomial equations calculated by RSM program for extraction conditions of bell flower root.

Response	Second order polynomials	R2	Significance
Yield	Y＝−622.363750－1.869128X1＋16.038736X2＋12.806081X3－0.038141X12＋0.031200X1X2－0.099591X22－0.069500X1X3＋0.009000X2X3－1.599764X32	0.9664	<0.0001
Total sugar contents	Y＝14.127500－0.201291X1－0.000662X2－0.679527X3＋0.002414X12－0.001900X1X2＋0.000013514X22－0.0415005X1X3＋0.040000X2X3－0.217162X32	0.9479	<0.0001
Reducing sugar contents	Y＝3.706875－0.057686X1＋0.083132X2－0.152416X3＋0.000670X12－0.000250X1X2－0.000530X22－0.009750X1X3＋0.007750X2X3－0.031993X32	0.9817	<0.0001
Crude saponin	Y＝−0.282500－0.008291X1＋0.013588X2－0.004527X3＋0.000114X12＋0X1X2－0.000086486X22－0.000500X1X3＋0.000500X2X3－0.002162X32	0.9707	<0.0001
Platycodin D	Y＝783.512162－13.747176X1－17.156115X2＋3.837466X3－0.005808X12＋0.201000X1X2－0.094042X22－0.178000X1X3－0.185000X2X3＋2.276047X32	0.7313	0.0759

Table 5 . Regression analysis for extraction conditions of bell flower root.

Response	F-Ratio
	Solvent ratio (mL/g)	Temperature (°C)	Time (h)
Yield	33.55***	24.60***	10.67***
Total sugar contents	36.63***	1.96	2.62
Reducing sugar contents	109.40***	5.36**	6.72***
Crude saponin	56.67***	3.95**	13.64***
Platycodin D	3.26*	5.45**	1.58

^*Significant at 10% level; ^**significant at 5% level; ^***significant at 1% level..

Table 6 . Analysis of variance for response of dependent variables.

Responses	Sources	DF1)	Sum of squares	Means squares	F-value	P-value
Yield	Model	9	997.581169	110.842352	28.73	<0.0001
	Linear	3	821.58455	273.861516	70.98	<0.0001
	Quadratic	3	170.147169	56.715723	14.7	0.0008
	Cross-product	3	5.84945	1.94981666	0.51	0.6882
	Residual	9.00	34.725926	3.858436	－	－
	Lack of fit	5.00	29.420006	5.884001	4.44	0.087
	Pure error	4	5.30592	1.32648	－	－
	Total	18	1,032.31	－	－	－
Total sugar contents	Model	9	65.506091	7.27845455	18.2	<0.0001
	Linear	3	63.332025	21.110675	52.8	<0.0001
	Quadratic	3	1.491566	0.49718866	1.24	0.3502
	Cross-product	3	0.6825	0.2275	0.57	0.6493
	Residual	9	3.598572	0.399841	－	－
	Lack of fit	5	2.520052	0.50401	1.87	0.2821
	Pure error	4	1.07852	0.26963	－	－
	Total	18	69.104663	－	－	－
Reducing sugar contents	Model	9	2.856818	0.317424	53.55	<0.0001
	Linear	3	2.782569	0.927523	156.47	<0.0001
	Quadratic	3	0.042912	0.014304	2.41	0.134
	Cross-product	3	0.031338	0.010446	1.76	0.2241
	Residual	9	0.05335	0.005928	－	－
	Lack of fit	5	0.04623	0.00178	5.19	0.0678
	Pure error	4	0.00712	0.005928	－	－
	Total	18	2.910168	－	－	－
Crude saponin	Model	9	0.014795	0.00164388	33.08	<0.0001
	Linear	3	0.01415	0.00471666	694.9	<0.0001
	Quadratic	3	0.000545	0.00181666	3.65	0.0569
	Cross-product	3	0.0001	0.00003333	0.67	0.5911
	Residual	9	0.000447	0.0000497	－	－
	Lack of fit	5	0.000367	0.00007345	3.67	0.1158
	Pure error	4	0.00008	0.00002	－	－
	Total	18	0.015242	－	－	－
Platycodin D	Model	9	699.978632	77.7754035	3.51	0.0377
	Linear	3	350.32115	116.773716	5.27	0.0226
	Quadratic	3	134.470682	44.8235606	2.02	0.1813
	Cross-product	3	215.1868	71.7289333	3.24	0.1747
	Residual	9	199.421642	22.15796	－	－
	Lack of fit	5	145.495762	2.16	2.16	0.238
	Pure error	4	53.92588	13.48147	－	－
	Total	18	899.400274	－	－	－

¹⁾DF: Degree of freedom..

Table 7 . Predicted levels of optimum extraction conditions for the maximum responses of bell flower root by the ridge analysis.

Response	Predicted response					Morphology
	Response	Solvent ratio (mL/g)	Temperature (°C)	Time (h)	Result
Yield	Min Max	25.56 10.92	71.99 81.96	2.55 3.74	20.25 51.58	maximum
Total sugar contents	Min Max	29.71 10.69	77.88 82.52	3.23 3.53	7.53 15.59	saddle point
Reducing sugar contents	Min Max	29.54 10.63	77.88 82.52	77.36 82.02	5.45 7.15	saddle point
Crude saponin	Min Max	27.23 10.79	77.43 81.59	1.72 3.71	0.14 0.26	saddle point
Platycodin D	Min Max	13.66 14.42	77.73 62.63	2.93 3.76	0.19 0.53	saddle point

Fig 1. Response surface for yield in bell flower root extraction at constant values (yield: 40－45－50%) according to temperature, time and solvent ratio.

총당 함량

추출물의 총당 함량을 측정한 결과, 시험구에서 7.63~ 14.56 mg/mL의 범위로 나타났으며(Table 3), 이를 바탕으로 한 총당 함량에 대한 회귀식은 Table 4와 같다. 총당에 대한 회귀식의 R² 값은 0.9479로 높은 신뢰도를 보였으며, P-value는 1% 이내 유의수준을 보였다(Table 4). 추출조건에 대한 영향에서 총당의 경우 용매비가 1% 이내 유의수준을 보여 추출온도와 추출시간보다 용매비가 더 영향을 미치는 것으로 확인된다(Table 5). 추출물의 총당 함량에 대한 lack of fit의 P-value가 0.2821로 나타나 회귀모델이 적합한 것으로 나타났다(Table 6). 추출조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 안장점으로 나타났다. 최적점을 산출한 결과 총당의 최댓값은 15.59 mg/mL고 이때의 추출조건은 용매비가 10.69 mL/g, 추출온도가 82.52 °C, 추출시간이 3.53시간으로 나타났다(Table 7). 이들 총당 함량에 대한 4차원 반응표면은 Fig. 2와 같다. Hwang 등(2011)은 열처리한 도라지의 유리당을 측정한 결과 fructose와 sucrose가 검출되었고 함량은 0.7~4.562%로 보고하여 본 실험의 추출물 시험구의 함량과 유사하였다. 한편, Kim과 Youn(2020)은 증숙 처리 도라지의 총당 함량을 0.478~0.514 g/g으로 보고하여 본 실험의 총당 함량보다 상당히 높은 결괏값을 보였는데, 이는 원료 도라지를 증숙 처리한 후 건조시킨 시료를 건조물 기준으로 나타낸 결과로 시료 처리의 차이에서 오는 결과라 판단된다.

Fig 2. Response surface for total sugar contents in bell flower root extraction at constant values (total sugar contents: 8－11－14 mg/mL) according to temperature, time and solvent ratio.

환원당 함량

추출물의 환원당 함량은 5.48~7.15 mg/mL의 범위로 나타났으며(Table 3), 이를 바탕으로 한 회귀식은 Table 4와 같다. 환원당에 대한 회귀식의 R² 값은 0.9817로 높은 신뢰도를 보였으며, P-value는 1% 이내 유의수준을 보였다(Table 4). 환원당에 대한 추출조건의 영향에서 용매비와 추출시간이 1% 이내의 유의수준을 보이는 것으로 확인되며, 추출온도는 5% 이내 유의수준을 보여 용매비와 추출시간이 더 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다(Table 5). 추출물의 환원당 함량에 대한 lack of fit의 P-value는 0.0678로 나타나 회귀모델 적합성이 적절한 것으로 나타났다(Table 6). 추출조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점은 안장점이었으며, 최적점을 산출한 결과 환원당의 최댓값은 7.15 mg/mL이고 이때의 추출조건은 용매비가 10.63 mL/g, 추출온도가 82.02°C, 추출시간이 3.57시간으로 나타났다(Table 7). 이들 환원당 값에 대한 4차원 반응표면은 Fig. 3과 같다. Hwang 등(2011)은 fructose 함량이 건조온도에 따라 0.7~3.98%라 보고하여 처리온도에 따라 본 연구 결과와 비슷한 함량 범위이거나 다소 높은 결괏값을 보였다. Kang 등(2017)은 일반도라지와 으뜸도라지의 환원당 함량이 각각 3.09% 및 2.82%라 보고하였고 Kim과 Youn (2020)은 증숙 처리 도라지의 환원당 함량이 0.125~0.186 g/g으로 총당과 마찬가지로 상당히 고함량의 결괏값을 보였는데 이는 가열, 가압 처리에 의해 비환원당이 분해되어 단당류와 올리고당이 생성된 결과라고 보고하였다. 또한 Lee와 Cho(2014)는 환원당인 glucose 함량이 건조온도에 따라 195.9~362 mg%라 보고하였다. 본 연구와 이들 연구를 비교한 결과 도라지는 열처리 등 시료의 처리에 따라 당 조성의 변화가 나타나 총당과 환원당 함량에도 영향을 주는 것으로 추정된다.

Fig 3. Response surface for reducing sugar contents in bell flower root extraction at constant values (reducing sugar contents: 5.5－6.0－6.5 mg/mL) according to temperature, time and solvent ratio.

조사포닌 함량

추출물의 조사포닌 함량을 측정한 결과, 19개구의 시료에서 0.14~0.26%의 범위로 나타났으며(Table 3), 이를 바탕으로 한 회귀식은 Table 4와 같다. 조사포닌에 대한 회귀식의 R² 값은 0.9707로 높은 신뢰도를 보였으며, P-value는 1% 이내의 유의수준을 보였다(Table 4). 추출조건에 대한 영향에서는 용매비와 추출시간이 1% 이내의 유의수준을 보이는 것으로 확인되어 영향이 높은 것으로 나타났으며, 추출온도는 5% 이내의 유의수준을 보였다(Table 5). 조사포닌 함량에 대한 lack of fit의 P-value는 0.1158로 나타나 회귀모델이 적합한 것으로 나타났다(Table 6). 추출조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 안장점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 조사포닌의 최댓값은 0.26%이고 이때의 추출조건은 용매비가 10.79 mL/g, 추출온도가 81.59°C, 추출시간이 3.71시간으로 나타났다(Table 7). 이들 조사포닌값에 대한 4차원 반응표면은

Fig. 4와 같다. Chae 등(2018)은 열수 추출에서 3년근과 7년근 도라지의 조사포닌 함량이 각각 4.70 mg% 및 2.81 mg%라 보고하여 본 연구 결과의 범위보다 낮은 결과를 보였으며, Kang 등(2017)은 일반도라지와 으뜸도라지의 조사포닌 함량이 0.88%와 2.01%로 보고하여 본 연구 결과의 범위보다 높은 함량이었다. 또한 Kim 등(2015)은 증숙 전 도라지의 조사포닌 함량이 23.4 g/100 g에서 3회 증숙 후 발효한 도라지 분말의 조사포닌 함량이 47.1 g/100 g으로 증가한 결과로 증숙과 건조공정을 반복하면 조사포닌의 함량이 증가한다고 보고하였다. 또한 Lee(2012)는 흑도라지의 조사포닌이 증숙 전 4.45 g/100 g에서 증숙 후 7.98 g/100 g으로 증가한 결과에 대하여 증숙 작용으로 세포벽과 분자구조가 파괴되어 사포닌 추출효율이 증가하여 사포닌 함량이 증가하는 것으로 보고하였다. 본 연구와 이들 연구 결과로 유추했을 때 가열 처리와 같은 온도변화를 주는 도라지 가공처리 과정을 통하여 총당과 환원당 함량의 결과와 마찬가지로 조사포닌 함량에 영향을 줄 수 있는 것으로 판단된다.

Fig 4. Response surface for crude saponin contents in bell flower root extraction at constant values (crude saponin contents: 0.19－0.22－0.25%) according to temperature, time and solvent ratio.

Platycodin D 함량

추출물의 platycodin D 함량은 0.26~0.49 mg/mL의 범위로 나타났으며(Table 3), 이를 바탕으로 한 회귀식은 Table 4와 같다. Platycodin D 함량에 대한 회귀식의 R² 값은 0.7313이었으며, P-value는 10% 이상의 유의수준을 보여 다른 반응변수 항목에 비하면 유의성이 낮은 것으로 나타났다(Table 4). Platycodin D 함량에 대한 추출조건에서 용매비의 영향이 10% 이내 유의수준을 보였으며, 추출온도가 5% 이내 유의수준을 보이는 것으로 확인되어 추출온도에 더 영향을 받는 것으로 나타났다(Table 5). Platycodin D 함량에 대한 lack of fit의 P-value는 0.2380으로 나타나 역시 회귀모델이 적합한 것으로 나타났다(Table 6). 추출조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 안장점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 platycodin D 함량의 최댓값은 0.53 mg/mL고 이때의 추출조건은 용매비가 14.42 mL/g, 추출온도가 62.63°C, 추출시간이 3.76시간으로 나타났다(Table 7). 이들 platycodin D 함량값에 대한 4차원 반응표면은 Fig. 5와 같고 도라지 추출액의 platycodin D의 HPLC chromatogram은 Fig. 6과 같다. Kim 등(2022)은 효율적인 도라지 추출물 제조를 위한 복합효소를 처리한 조건에서 도라지 열수 추출물의 platycodin D 함량을 0.32 mg/mL로 보고하여 본 연구의 추출물의 측정 범위 내의 일부값과 유사하였다. Lee와 Cho(2014)는 platycodin D가 도라지 건조온도가 높을수록 함량이 낮아지는 경향을 가진다고 보고하였고 Lee 등(2014)은 건조방법에 따라 platycodin D 등 사포닌 종류별 함량이 다르게 나타난다고 보고하였다. Kim과 Youn(2020)은 증숙 처리 도라지의 platycodin D 함량이 증숙 전보다 증숙 횟수가 증가할수록 감소하는 결괏값을 보인다고 보고하였다.

Fig 5. Response surface for platycodin D contents in bell flower root extraction at constant values (platycodin D contents: 0.35－ 0.30－0.25 mg/mL) according to temperature, time and solvent ratio.

Fig 6. HPLC chromatogram of platycodin D standard 25 μg/mL (A) and bell flower root extracts (B).

최적 추출조건의 예측

도라지의 최적 추출조건을 설정하기 위해 추출물의 각 성분에 대한 4차원 반응표면을 superimposing한 결과(Fig. 7), 조사포닌 함량과 platycodin D 함량의 반응표면이 겹치는 것으로 나타났다. 겹치는 반응표면을 바탕으로 도라지 열수 추출의 최적 조건 범위를 산출한 결과, 용매비 15~20 mL/g, 추출시간 1.5~3.5시간, 추출온도 80~90°C로 나타났다(Table 8).

Table 8 . Superimposed response surface for optimization of platycodin D and crude saponin content as a function of extraction temperature, time, and solvent ratio.

Extraction condition	Range of predicted condition
Solvent ratio (mL/g)	17.5(15∼20)
Temperature (°C)	85(80∼90)
Time (h)	2.5(1.5∼3.5)

Fig 7. Superimposed response surface of crude saponin and platycodin D for optimization of bell flower root extraction.

최적 추출조건의 실증 시험

각 성분의 반응표면을 superimposing 하여 예측된 최적 추출조건인 용매비 17.5 mL/g, 추출시간 2.5시간, 추출온도 85°C에서 실제 추출 및 실험을 수행하고 예측치와 실제 실험치의 비교를 통해 모델의 정확도를 검증한 결과는 Table 9와 같다. 그 결과, 최적 추출조건에서 총당과 환원당은 예측치보다 실험치가 다소 높게 나타났으며, 수율과 조사포닌 및 platycodin D 함량은 예측치보다 실험치가 다소 낮게 나타났다. Student t-test는 t 검정 이후 가설을 수용할지, 기각할지를 결정한다. 가설로서 귀무가설 “두 집단 간의 평균 차이가 없을 것이다”를 수용할지 기각할지 결정한다. 이와 반대되는 것은 대립가설이라 한다. 즉, 유의수준(α)을 0.05라 가정할 때 t 값이 커지면 평균 차이가 있을 가능성이 커져서 기각역에 존재하여 유의확률(P-value)이 0.05보다 작으면 평균 차이가 유의미한 것으로 해석되어 귀무가설을 기각하고, 유의확률이 0.05보다 크면 그 반대로 귀무가설을 채택한다(Mishra 등, 2019). 본 실험의 반응표면 각 항목의 예측값에 대한 실측값으로 one sample t-test를 실시하여 유의성을 검증한 결과, 반응표면의 모든 항목에서 P>0.05로 나타나 귀무가설이 채택되어 이론치와 실측치 사이에 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다.

Table 9 . Comparison between predicted and observed values of response variables within the range of the optimum condition.

	Bell flower root extracts
	Predict value (A)	Experimental value (B)	B/A×100 (%)	P-value2)
Yield (%)	44.29	42.44±2.651)	95.82	0.3501
Total sugar contents (mg/mL)	12.19	12.68±1.89	104.02	0.6973
Reducing sugar contents (mg/mL)	6.41	6.56±0.35	102.34	0.5352
Crude saponin (%)	0.2	0.18±0.07	90	0.6697
Platycodin D (mg/mL)	0.22	0.20±0.06	90.91	0.622

¹⁾Values are mean±SD (n=3)..

²⁾Student’s one sample t-test significance: P>0.05 accept the null hypothesis, P<0.05 reject the null hypothesis, so accept the alternative hypothesis..

도라지 뿌리의 기존 연구는 효능, 가공 및 제품화를 위한 유기용매와 단순 조건에서 열수 추출을 행하였으나, 본 연구는 도라지 각각의 유용성분 활용을 위한 열수 최적 추출조건을 조사하였다. 본 연구에서는 도라지 열수 추출물의 주요 성분 함량 등을 측정하여 반응표면분석법으로 도라지의 최적 추출조건을 설정하였다. 실험계획은 중심합성 계획법으로 실시하여 3가지 독립변수로 용매비, 추출온도 및 추출시간을 설정하고, 종속변수로는 추출물의 추출수율, 총당, 환원당, 조사포닌 및 platycodin D 함량 등을 측정하여 추출조건을 최적화하였다. 조사포닌 함량과 platycodin D 함량의 4차원 반응표면을 superimposing 하여 최적 조건을 설정하였다. 최적 추출조건 각 항목의 예측값에 대한 실측값으로 유의성을 검증한 결과, 이론치와 실측치 사이에 유의적인 차이가 없는 것으로 나타나 본 연구의 최적 추출조건을 통하여 도라지 추출물의 각 성분에 대한 효과적인 추출과 이용이 가능할 것으로 사료된다.

이 논문은 2019학년도 대구대학교 학술연구비(과제번호 2019-0456) 지원에 의한 논문임.