비만은 대사장애와 인지기능 저하의 위험 요인으로(Rosengren 등, 2005; Whitmer 등, 2005, 2008), 식생활 패턴의 서구화와 영양소의 과잉섭취 형태로 변화되면서(Kim 등, 2009), 비정상적이거나 과도한 지방이 축적되어 고혈압, 제2형 당뇨병, 심혈관계 질환, 정신 장애 등의 다양한 만성 질환을 유발하는 원인으로 알려져 있다(Kim과 Popkin, 2006; Scott 등, 2008). 과잉섭취된 영양소는 체내 지방세포의 크기와 수를 증가시키고, 지방 생성에 의하여 축적되어 비만이 발생하게 된다(Bae 등, 2013). 지방의 합성과 분해 및 축적은 식욕 및 염증과 관련된 adiponectin, letpin 등(Gil 등, 2008; Goldfine과 Kahn, 2003; Oben 등, 2008)과 에너지 대사와 관련된 AMP-activated protein kinase(AMPK), glucagon-like peptide-1(GLP-1) 등(Kim, 2021; Minokoshi 등, 2002; Woods 등, 2017), 그리고 지방과 관련 세포 분화, 지방합성, 산화 및 분해와 관련된 peroxisome proliferator activated receptor(PPAR), hormone sensitive lipase(HSL), acetyl CoA carboxylase(ACC) 등(Berger 등, 2002; Holm, 2003; Kahn 등, 2005)의 다양한 인자들의 상호작용으로 조절된다. 지속적인 에너지 과잉섭취는 이러한 인자들을 과도하게 활성 및 억제시켜 비만을 유도하게 되고, 이러한 인자들을 개선 시 최종적으로 비만을 억제할 수 있게 된다.

비만으로 인해 발생하는 다양한 복합 질환은 사망률의 증가와 밀접하게 연관되어 있어(Romero 등, 2006; Zimmet 등, 2005), 공중 보건학상 중대한 문제일 뿐만 아니라 개인과 국가에 막대한 경제적 부담을 주고 있어 매우 심각한 상황이다. 식이 조절과 규칙적인 운동 모두 비만 예방에 효과적으로 알려져 있으나, 개인의 건강에 관한 관심이 증대되는 데 반하여 시간 제약과 신체적 제약 등 다양한 이유로 규칙적인 운동 요법에 참여하지 못하는 사람들이 많아지고 있는 실정이다(Barros 등, 2019; Jeong 등, 2018; Noble 등, 2014). 효과적으로 비만을 예방 및 치료하기 위해 약물을 통하는 경우가 많아지고 있으나, 이는 수면장애, 우울감, 이상감각 등의 심각한 부작용을 일으키고 있으며, 이러한 문제점을 개선하고자 천연물을 이용한 비만 예방 및 개선효과가 있는 기능성 식품에 관한 다양한 연구가 진행되고 있다(Ahn 등, 2007; Montan 등, 2019).

두충(Eucommia ulomides Oliver)과 우슬(Achyranthes japonica Nakia)은 전통적으로 한국, 일본, 중국 등 아시아에서 전통 의약 및 식용으로 사용되고 있는 소재이다(Kim 등, 2020; Marcone 등, 2003; Wang 등, 2008). 두충의 주요 성분은 pinoresinol diglucoside, chologenic acid 등이 있으며(Li 등, 2019), 인슐린 저항성 개선(Jin 등, 2010), 항염증 및 골관절염 개선(Xie 등, 2015) 등의 효과가 보고되고 있다. 우슬의 주요 성분은 20-hydroxyecdysone, saponins 등이 있으며(He 등, 2017), 항산화(Park 등, 2013), 항균(Jung 등, 2007) 등의 효과가 보고되고 있다. 본 연구에 사용한 두충 추출물과 우슬 추출물의 복합물(KGC08EA)은 이전 실험(Lee 등, 2022)에서 노령 마우스 부고환 지방조직 감소 효능을 확인한 바 있으며, 이 연구에서는 비만 마우스에서 체지방 개선 효과에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

실험재료

본 연구에서 사용된 국내산 두충과 우슬은 경일약업사에서 구입하였다. 두충과 우슬은 각각 30% 주정으로 2회 추출하여 Whatman No.1으로 여과 후 Rotavapor R-220 pro(Buchi)로 진공상태에서 감압농축을 하였고 SD Pilot 2010(Ein system)으로 분무건조 하였으며, 두충의 수율은 11.0%, 우슬의 수율은 45%로 확인되었다. 두충과 우슬 추출분말을 3:1의 비율로 혼합하여 두충과 우슬 추출복합물(KGC08EA)을 제조하여 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 모든 증류수는 Milli-Q 시스템(Millipore)으로 정제하였으며, 모든 시약은 보증된 시약 등급으로 HPLC 등급의 아세토니트릴 및 메탄올은 Merck에서 구입하였다. 지표성분 함량 측정을 위한 표준품 pinoresinol diglucoside(순도 98.9%)와 20-hydroxyecdysone(순도 98.0%)은 각각 크로마덱스와 어벤션에서 구입하였다.

두충과 우슬 추출복합물의 HPLC 분석

두충과 우슬 추출복합물(E. ulmoides:A. japonica＝3:1, KGC08EA)의 지표성분 pinoresinol diglucoside와 20-hydroxyecdysone은 HPLC 시스템을 사용하여 정량분석 하였다. 두충과 우슬 추출복합물(200 mg)을 칭량하여 부피 플라스크에 넣은 후 70% aq. MeOH(40 mL)을 첨가하여 60분간 초음파 추출을 진행하였다. 추출 용액은 원심분리기를 이용하여 분리하였으며 0.2 μm 필터(PVDF, Whatman)로 여과하여 분석용 시료로 사용하였다. Pinoresinol diglucoside는 HPLC 시스템(Waters)에서 Supelco Discovery C18 컬럼(5.0 μm, 4.6×250 mm)을 사용하여 컬럼 온도 25°C로 유지하며 분석하였고 230 nm 파장에서 검출하였다. 이동상은 유속 1.0 mL/min으로 아세토니트릴(용매 A)과 0.05% 인산염 완충 수용액(용매 B)을 이용하여 총 40분 동안 분석하였다[분석 용매 조건; 0~5분(5% A), 20분(20% A), 30분(30% A), 35분(95% A), 35~36분(95% A), 36~40분(5% A)]. 20-Hydroxyecdyson의 분석은 동일한 시스템과 컬럼을 사용하였다. 이동상은 유속 1.0 mL/min으로 아세토니트릴(용매 A)과 0.1% 인산염 완충 수용액(용매 B)을 이용하여 총 60분 동안 분석하였다[분석 용매 조건; 0~45분(13% A), 50분(95% A), 50~56분(95% A), 57분(13% A), 57~60분(13% A)].

실험동물

동물실험은 한국인삼공사 동물실험 윤리위원회의 심의 및 승인을 거쳐 수행되었다(승인번호: KGC-2022-058). (주)새론바이오로부터 공급받은 5주령의 수컷 C57BL/6J 마우스 56마리를 입수하여 1주간 동물사육실 환경에 적응시켰다. 체중을 바탕으로 군당 8마리씩 분리 후 실험에 사용하였다. 동물사육실 온도는 22±2°C, 상대습도 50±10%, 환기횟수 10~15회/시간, 조명시간 12시간(오전 8시~오후 8시), 조도 250~300 Lux로 유지하였다. 실험기간 동안 KGC08EA 및 양성대조군(positive control; Coleus forskohlii)은 1일 1회 일정한 시간에 경구투여하였고, 식이와 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 1주일에 한 번씩 일정한 시간에 체중을 측정하였다. 실험군의 정보는 Table 1에 나타내었다.

Table 1

Experimental design of animal (n=8).

Group1)	Experiment	Mouse species
NC	AIN93G	C57BL/6J
C	High fat diet
PC	High fat diet＋Coleus forskohlii 100 mg/kg b.w.
EA100	High fat diet＋KGC08EA 100 mg/kg b.w
EA200	High fat diet＋KGC08EA 200 mg/kg b.w
EA400	High fat diet＋KGC08EA 400 mg/kg b.w
EA800	High fat diet＋KGC08EA 800 mg/kg b.w

¹⁾NC: Normal control, C: Control, PC: Coleus forskohlii, EA: KGC08EA (Eucommia ulmoides:Achyranthes japonica＝3:1)..

Dual energy X-ray absorptiometry(DXA) 분석

실험동물의 체성분은 DXA 스캐너(iNSiGHT VET DXA, Osteosys)를 사용하여 측정하였다. 체성분 측정을 위해 실험동물을 isoflurane(Piramal Critical Care)으로 마취한 상태에서 촬영용 플레이트에 엎드린 자세로 다리와 꼬리를 최대한 편 후 cone beam X-ray(저에너지 60 kV/0.8 mA에서 고에너지 80 kV/0.8 mA 범위)를 사용하여 평면 패널 검출기(flat panel dectector)에서 고해상도 이미지파일 확보 후 iNSiGHT software(Vesrion 1.0.6, Osteosys)를 활용하여 분석하였다.

조직 및 혈청 처리

실험동물을 isoflurane으로 마취한 상태에서 체성분 측정 후 심장채혈을 통해 혈액을 채취하였으며, 채취한 혈액은 1,300×g에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈액 채취 후 복부를 절개하여 간, 신장, 신장주위 지방, 부고환 지방을 적출하여 무게를 측정하였고, 실험에 사용될 간 조직과 부고환 지방조직은 무게측정 후 -80°C deep freezer에 보관 후 실험에 사용하였다.

혈중 아디포넥틴 및 렙틴 농도 분석

분리한 혈청의 아디포넥틴 농도는 Mouse APD/Acrp30(adiponectin) ELISA kit(Elabscience)을 이용하여 실험 protocol에 따라 분석하였다. 렙틴 농도는 Mouse LEP(leptin) ELISA kit(Elabscience)을 이용하여 실험 protocol에 따라 분석하였다.

혈중 생화학 분석

혈청을 생화학 자동분석기(HITACHI-7180, HITACHI)를 이용하여 공복혈당, 혈중의 지질 지표인 total cholesterol, triglycerides, high density lipoprotein-cholesterol(HDL-C)과 low density lipoprotein-cholesterol(LDL-C), 간 기능 지표인 alanine aminotransferase(ALT)와 aspartate aminotransferase(AST) 및 신장 기능 지표인 blood urea nitrogen(BUN)과 creatinine(CREA)을 측정하였다.

간조직, 지방조직의 체내 대사 단백질 분석

간 및 지방조직의 에너지 대사 관련 단백질을 분석하기 위하여 간 및 부고환 지방조직을 균질기로 균질화하고, TAE buffer를 처리하여 원심분리 후 상등액인 단백질 추출물을 획득하였다. Bio-Rad protein assay dye(Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 단백질을 정량하였다. 확보한 간 조직 균질액은 Mouse phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase(p-AMPK) ELISA kit(Mybiosource), Mouse glucagon like peptide-1 receptor(GLP-1R) ELISA kit(Mybiosource)을 이용하여 실험 protocol에 따라 분석하였고, 부고환 지방조직 균질액은 PPAR-gamma, Mouse HSL ELISA kit(Mybiosource), Mouse acetyl CoA carboxylase(ACC) ELISA kit(Mybiosource)을 이용하여 실험 protocol에 따라 분석하였다.

통계처리

모든 실험에서 얻어진 결과는 SAS Program version 9.3(SAS Institute)을 이용하여 분석하였고, 모든 측정 항목의 결과는 각 실험군의 평균(mean)±표준편차(standard deviation)로 표시하였다. 실험군 간의 유의적 차이는 ANOVA, Student’s t-test, Tukey’s multiple comparison test를 실시하여 유의성 P<0.05 수준에서 검정하였다.

두충과 우슬 추출복합물(KGC08EA)의 지표성분 HPLC 분석

KGC08EA는 두충과 우슬을 각 30% 주정으로 추출 농축하여 분말화한 후 3:1의 비율로 혼합한 추출복합물이다. 두충과 우슬 추출복합물의 지표성분은 분석 조건에 따라 HPLC 정량분석을 실시하였으며 pinoresinol diglucoside(18.40 mg/g)와 20-hydroxyecdysone(0.41 mg/g)을 표준물질과 함께 정량하여 Fig. 1과 Fig. 2에 나타내었다.

Fig 1. Representative HPLC chromatogram of pinoresinol diglucoside standard (A) and KGC08EA (B) using the analysis procedure for pinoresinol diglucoside.

Fig 2. Representative HPLC chromatogram of 20-hydroxyecdysone standard (A) and KGC08EA (B) using the analysis procedure for 20-hydroxyecdysone.

실험동물의 체성분 및 장기무게 변화

비만 동물모델에서 KGC08EA 투여에 의한 체성분 및 주요 장기에 미치는 영향을 확인하기 위해 실험동물에 9주간 투여한 후의 DXA 측정 결과, 체중 및 총지방량은 Fig. 3에 나타내었으며, 체중변화, 간, 신장, 부고환 지방, 신장주위지방의 무게를 측정하고 Table 2에 나타내었다. 실험기간의 체중변화는 초기 체중에서는 유의적인 차이가 없었으나 9주 투여 완료 후 무게에서는 정상군인 NC군에 비해 고지방식이(HFD) 섭취 그룹들에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였고, 대조군인 C군에 비하여 EA400군과 EA800군에서는 체중이 유의적으로 감소하였다. KGC08EA를 9주 섭취 후 총지방량, 부고환지방 및 신장주위지방은 NC군에 비해 HFD 섭취한 그룹들에서 유의적으로 증가함을 확인하였다. 총지방량은 대조군인 C군에 비하여 EA400군과 EA800군에서는 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 부고환지방 및 신장주위지방은 대조군인 C군에 비하여 EA800군에서는 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.

Fig 3. Analysis of body composition of a normal C57BL/6J and HFD induced C57BL/6J mice. (A) Representative dual-energy X-ray absorptiometry images, (B) Body weight, (C) Total fat. NC, C57BL/6J mice; C, C57BL/6J mice with high fat diet; PC, C57BL/6J supplemented with HFD and Coleus forskohlii 100 mg/kg b.w.; EA 100, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 100 mg/kg b.w.; EA 200, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 200 mg/kg b.w.; EA 400, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 400 mg/kg b.w.; EA 800, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 800 mg/kg b.w.. Data were expressed as mean±standard deviation. ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001; compared with the control (C group).

Table 2

Weight, liver, kidney, and muscle weight of experimental groups at 9 weeks (n=8).

Group1)	Intial body weight (g)	Final body weight (g)	Liver (% of b.w.)	Kidney (% of b.w.)	Epididymal fat (% of b.w.)	Perirenal fat (% of b.w.)
NC	25.39±1.93	28.99±1.97***	3.03±0.12	1.01±0.14	1.05±0.43***	0.56±0.28***
C	25.37±1.80	45.99±3.67	3.05±0.38	0.82±0.04	5.18±0.43	2.38±0.18
PC	25.31±1.76	41.42±4.09	3.00±0.42	0.93±0.10	5.06±1.03	2.15±0.39
EA100	25.36±1.76	41.85±2.72	2.81±0.18	0.94±0.05	4.81±0.46	2.08±0.29
EA200	25.45±1.75	40.80±5.72	2.85±0.15	0.99±0.14	4.77±1.30	2.08±0.54
EA400	25.39±1.97	39.30±2.48**	2.73±0.12	0.97±0.07	4.64±0.69	2.07±0.45
EA800	25.45±1.76	39.09±2.40**	2.87±0.10	0.97±0.07	3.76±0.71**	1.91±0.47*

¹⁾NC: Normal control, C: Control, PC: Coleus forskohlii, EA: KGC08EA (Eucommia ulmoides:Achyranthes japonica＝3:1)..

Data were expressed as mean±standard deviation. ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001; compared with the control (C group)..

혈중 아디포넥틴 및 렙틴 변화

비만은 지방조직에서 분비되는 아디포넥틴, 레지스틴, 렙틴 등과 같은 호르몬과 관련이 있으며, 이러한 호르몬은 다양한 조절분자와 함께 에너지 대사와 체중 조절에 중요한 역할을 한다. 호르몬 조절의 불균형은 비만이 발생하는 주요한 위험 요소 중 하나인데, 특히 아디포넥틴의 분비는 감소하고 렙틴의 분비가 증가하면 식욕, 포만감 및 에너지 대사 조절 능력에 영향을 주게 되고 비만화를 가속하게 된다(Sainz 등, 2015). 본 실험에서 KGC08EA 투여가 실험동물의 혈중 아디포넥틴과 렙틴의 수치에 미치는 영향을 확인하기 위하여 9주간 투여 후 측정한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 혈중 아디포넥틴은 정상군인 NC군에 비하여 대조군인 C군에서 유의적으로 감소하는 것을 확인하였고, EA800군에서는 C군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 총지방량, 부고환 지방 및 신장주위지방이 KGC08EA 섭취로 감소한 결과와 같은 경향임을 확인하였다. 반대로 혈중 렙틴은 정상군인 NC군에 비하여 대조군인 C군에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였고, EA400군과 EA800군에서는 C군에 비해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 고지방식이 섭취로 인해 감소한 아디포넥틴은 KGC08EA 섭취 시 증가하고, 고지방식이 섭취로 인해 증가한 렙틴은 KGC08EA 섭취 시 감소하여, 당과 지방대사 및 식욕조절 등의 작용을 통하여 항비만에 도움을 주는 것을 확인하였다(Perez-Perez 등, 2018; Yamauchi 등, 2002).

Fig 4. Effects of KGC08EA on serum adiponectin and leptin level in C57BL/6J and HFD induced C57BL/6J mice. (A) Adiponectin, (B) Leptin. NC, C57BL/6J mice; C, C57BL/6J mice with high fat diet; PC, C57BL/6J supplemented with HFD and Coleus forskohlii 100 mg/kg b.w.; EA 100, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 100 mg/kg b.w.; EA 200, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 200 mg/kg b.w.; EA 400, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 400 mg/kg b.w.; EA 800, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 800 mg/kg b.w.. Data were expressed as mean±standard deviation. ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001; compared with the control (C group).

혈중 lipid profile, 간 기능 및 신장 기능 지표 변화

비만은 당뇨, 고지혈증 등과 같은 합병증의 주요한 원인이므로 KGC08EA의 섭취가 안전성과 밀접한 영향을 가진 혈중 지질 변화의 측정 결과는 Table 3에, 간 기능 및 신장 기능을 확인할 수 있는 지표들을 측정한 결과는 Table 4에 나타내었다. 혈중 지질 중 HDL은 모든 그룹 간 유의적인 변화를 확인하지 못하였으나, 총콜레스테롤은 정상군인 NC군에 비하여 대조군인 C군에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였고, EA800군에서는 C군에 비해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 중성지방은 정상군인 NC군에 비하여 대조군인 C군에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였고, EA400군과 EA800군에서는 C군에 비해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. LDL은 정상군인 NC군에 비하여 대조군인 C군에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였고, EA800군에서는 C군에 비해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 간 기능을 확인할 수 있는 지표는 AST에서는 모든 군 간 유의적인 차이를 확인하지 못하였으나, ALT는 정상군인 NC군에 비하여 대조군인 C군에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였고, EA100군과 EA400군, EA800군에서는 C군에 비해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 신장 기능을 확인할 수 있는 지표인 BUN과 CREA는 모든 군 간 유의적으로 차이가 없음을 확인하였다. 또한 Lee 등(2022)의 선행연구 결과에서 노령 동물모델의 혈중 안전성 지표에 영향을 미치지 않는 점에서 KGC08EA 섭취가 동물에 영향을 미치지 않는 소재임을 확인할 수 있다.

Table 3

Effects of KGC08EA on serum lipid profile in C57BL/6J and HFD induced C57BL/6J mice (n=8).

Group1)	TCHO2)	TG3)	HDL-C4)	LDL-C5)
NC	109.63±14.00***	42.00±9.89*	70.75±13.36	6.88±1.89**
C	215.88±40.13	66.88±22.05	72.25±9.24	15.13±5.84
PC	181.00±39.22	52.25±26.82	72.25±6.07	10.38±4.84
EA100	185.63±27.34	47.25±23.30	76.63±5.29	11.63±3.54
EA200	196.14±22.89	46.57±19.17	74.29±7.68	12.57±3.21
EA400	184.50±40.00	41.50±17.98*	72.75±6.94	10.50±5.86
EA800	172.38±31.46*	37.63±19.52*	75.00±6.33	8.00±4.11*

¹⁾NC: Normal control, C: Control, PC: Coleus forskohlii, EA: KGC08EA (Eucommia ulmoides:Achyranthes japonica＝3:1)..

²⁾Total cholesterol. ³⁾Triglycerides. ⁴⁾High density lipoprotein cholesterol. ⁵⁾Low density lipoprotein cholesterol..

Data were expressed as mean±standard deviation. ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001; compared with the control (C group)..

Table 4

Functional indicators of liver and kidney from blood in C57BL/6J and HFD induced C57BL/6J mice (n=8).

Group1)	ALT2)	AST3)	BUN4)	CREA5)
NC	31.13±18.02**	166.25±65.71	28.93±5.08	0.38±0.07
C	91.13±49.27	137.86±37.32	25.34±3.28	0.44±0.05
PC	50.36±21.88	120.25±47.87	28.79±14.98	0.43±0.07
EA100	44.63±20.07*	127.50±64.33	22.96±3.41	0.45±0.05
EA200	46.86±26.60	107.00±11.83	22.73±3.34	0.40±0.06
EA400	39.36±35.18*	124.00±51.74	23.38±3.88	0.41±0.08
EA800	29.36±7.15**	103.63±56.71	22.45±4.27	0.44±0.05

¹⁾NC: Normal control, C: Control, PC: Coleus forskohlii, EA: KGC08EA (Eucommia ulmoides:Achyranthes japonica＝3:1)..

²⁾Alanine aminotransferase. ³⁾Aspartate aminotransferase. ⁴⁾Blood urea nitrogen. ⁵⁾Creatinine..

Data were expressed as mean±standard deviation. ^*P<0.05, ^**P<0.01; compared with the control (C group)..

간 및 지방조직의 체내 대사 단백질 변화

에너지 대사의 핵심 효소인 AMPK는 간, 지방조직, 골격근, 심장, 췌장 및 뇌에서 포도당의 지질 흡수를 조절하는 인자이다(Kahn 등, 2005). 인슐린 저항성을 향상시켜 혈당을 조절하는 인자로 알려진 GLP-1R은 간에 분포하여 중성지방의 대사를 조절하며 지방병변을 개선하는 것으로 알려진 인자이다(Gupta 등, 2010). PPAR-γ는 지방조직, 간, 근육 등 인슐린과 연관된 장기에 분포하며, 지방조직에서 당의 흡수를 증가시키고 지방세포를 분화하는 것으로 알려진 인자이다(Evans 등, 2004). 지방 및 콜레스테롤의 합성에 관여하는 효소 단백질인 ACC는 미토콘드리아 내의 지방산 산화를 조절하는 것으로 알려져 있다(Kahn 등, 2005). HSL은 지방조직 내에서 중성지방을 유리 지방산과 글리세롤로 분해하는 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2006). 본 실험에서는 KG08EA를 섭취한 비만 동물모델에서 적출한 간 조직과 부고환 지방조직을 활용하여 체내 대사와 관련 있는 단백질을 분석하였으며, 간 조직의 결과는 Fig. 5에, 부고환 지방조직의 결과는 Fig. 6에 나타내었다. 간 조직에서 에너지 대사에서 작용하는 p-AMPK와 GLP-1R는 정상군인 NC군에 비하여 C군에서 유의적으로 감소하는 것을 확인하였고, EA800군에서는 C군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 지방조직에서 지방 대사에 작용하는 PPAR-γ는 정상군인 NC군에 비하여 C군에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였고, EA800군에서는 C군에 비해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. ACC는 정상군인 NC군에 비하여 C군에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였고, EA400군과 EA800군에서는 C군에 비해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. HSL은 정상군인 NC군에 비하여 C군에서 유의적으로 감소하는 것을 확인하였고, EA400군과 EA800군에서는 C군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 일반적으로 영양소의 과잉섭취는 체내의 지방 축적 및 세포 비대화로 이어지고 체내의 탄수화물, 단백질 및 지질의 대사 기능에 저항성을 유발하게 되어 이와 관련된 단백질 및 효소에 영향을 주게 되어 결국 비만으로 발전하게 된다. 본 실험 결과를 통해 KGC08EA를 섭취함으로써 포도당과 지질의 에너지 대사 관련 p-AMPK와, 간에서 중성지방의 대사와 관련된 GLP-1R과 지방조직에서 중성지방을 유리 지방산과 글리세롤로 분해하는 HSL은 향상하고, 지방조직의 당 흡수를 통하여 지방세포의 분화를 촉진하는 PPAR-γ와 지방과 콜레스테롤의 합성을 촉진하는 ACC를 억제하므로 최종적으로 체내 총지방량과 체중을 감소시키게 되는 것으로 사료되며, 예상할 수 있는 작용기전을 Fig. 7에 나타내었다.

Fig 5. Effects of KGC08EA on protein in liver of C57BL/6J and HFD induced C57BL/6J mice. (A) Phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase (p-AMPK), (B) Glucagon-like peptide 1 receptor (GLP-1R). NC, C57BL/6J mice; C, C57BL/6J mice with high fat diet; PC, C57BL/6J supplemented with HFD and Coleus forskohlii 100 mg/kg b.w.; EA 100, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 100 mg/kg b.w.; EA 200, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 200 mg/kg b.w.; EA 400, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 400 mg/kg b.w.; EA 800, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 800 mg/kg b.w.. Data were expressed as mean±standard deviation. ^*P<0.05, ^**P<0.01; compared with the control (C group).

Fig 6. Effects of KGC08EA on protein in epididymal fat of C57BL/6J and HFD induced C57BL/6J mice. (A) Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-γ), (B) Acetyl-CoA carboxylase (ACC), (C) Hormone-sensitive lipase (HSL). NC, C57BL/6J mice; C, C57BL/6J mice with high fat diet; PC, C57BL/6J supplemented with HFD and Coleus forskohlii 100 mg/kg b.w.; EA 100, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 100 mg/kg b.w.; EA 200, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 200 mg/kg b.w.; EA 400, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 400 mg/kg b.w.; EA 800, C57BL/6J supplemented with HFD and KGC08EA 800 mg/kg b.w.. Data were expressed as mean±standard deviation. ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001; compared with the control (C group).

Fig 7. Expected mechanism of obesity control by KGC08EA. GLP-1R, glucagon-like peptide 1 receptor; p-AMPK, phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase; TG, triglyceride; TCHO, total cholesterol; PPAR-γ, peroxisome proliferator-activated receptor gamma; ACC, acetyl-CoA carboxylase; HSL, hormone-sensitive lipase.

본 연구에서는 두충과 우슬의 추출복합물(KGC08EA)이 체내 에너지대사와 지방대사와의 연관성, 그리고 그에 따른 체지방 변화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 고지방식이로 유도된 비만 동물 모델에서 DXA 측정을 통한 체성분, 혈중 아디포넥틴 및 렙틴, 간 조직의 에너지대사 조절 단백질, 지방조직의 지방대사 조절 단백질의 변화를 살펴보았다. 그 결과 체중 및 총지방량의 감소와 함께 지방의 합성과 분해 및 축적은 식욕 및 염증과 관련된 아디포넥틴 및 렙틴과 에너지 대사와 관련된 p-AMPK 및 GLP-1R, 그리고 지방과 관련 세포 분화, 지방합성, 산화 및 분해와 관련된 PPAR-γ, HSL, ACC의 조절을 통해 항비만 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 KGC08EA는 고지방식이로 유도된 비만동물 모델에서 에너지 대사 조절을 통한 항비만 효과와 함께 간과 신장의 안전성 관련 지표 확인을 통해 안전한 소재임을 확인하였다.