피부는 표피, 진피, 피하지방층의 세 개의 층으로 이루어져 있다. 표피는 얇은 바깥쪽 층으로 거칠고 납작한 세포들이 벽돌처럼 쌓여있고, 진피는 안쪽의 두꺼운 층으로 주로 섬유아세포(fibroblast)가 존재하고 엘라스틴, 콜라겐, 피브로넥틴 등이 주요 구조 단백질로 이루어진 세포외기질로 구성되어 피부의 탄력과 주름 생성에 관여한다(Kim 등, 2007; Shon 등, 2016). 피부는 인체의 가장 바깥층에 노출된 장기로, 외부의 여러 자극으로부터 신체를 보호하는 방어막 역할을 하지만, 다양한 자극에 쉽게 공격받아 피부 노화가 일어나기도 한다(Fisher 등, 2002; Lee, 2006). 피부 노화는 일반적으로 크게 내인성 노화와 외인성 노화로 구분되는데, 내인성 노화는 시간의 흐름에 따른 생리적 노화로 불린다. 외인성 노화는 습도, 온도, 바람, 공해, 담배 연기, 자외선(ultraviolet, UV) 등에 의해 발생하는데 특히 자외선에 의한 광노화가 대표적 요인이다(Krutmann 등, 2017; Saliou 등, 1999; Tanveer 등, 2023). 자외선은 파장에 따라 UVA(320~400 nm), UVB(280~320 nm), UVC(200~280 nm)로 구분되며 이중 UVC는 대부분 오존층에서 흡수되어 피부에 거의 영향을 주지 않는다. UVA는 피부 세포의 DNA에 직접적인 손상을 주지 못하지만, UVB는 직접적으로 피부 세포의 DNA에 손상을 주어 피부암, 피부 노화를 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한 UVB는 간접적으로 피부 세포에 활성산소종(reactive oxygen specisis, ROS)의 생성이 증가하여 matrix metalloproteinases(MMPs)와 같은 콜라겐 분해효소의 활성을 촉진하고 콜라겐의 합성을 억제하여 피부의 구조적 치밀도와 탄력이 약화하여 피부 주름을 생성한다(Amaro-Ortiz 등, 2014; Mojeski 등, 2020; Mostafa 등, 2022).

Transforming growth factor-β(TGF-β)는 세포의 성장, 분화 및 조직 형성을 조절하는 단백질로, 피부에서 염증을 조절하고 콜라겐 및 엘라스틴 같은 피부 성분의 생성을 조절한다(Mauviel, 2009). 콜라겐은 다양한 형태로 인체 내에 존재하는데, 피부에서는 특히 collagen type 1이 가장 풍부하게 존재하며 피부의 탄력과 구조를 유지하는 데 중요한 역할을 한다. Procollagen C-endopeptidase enhancer(PCOLCE)는 프로콜라겐 분해 과정에서 작용하는 효소를 활성화하는 역할을 하는 유전자로, 프로콜라겐을 콜라겐으로 변화시키는 과정을 도와 피부의 콜라겐 생성에 관여한다. 그러나 UVB는 피부 내 TGF-β 및 PCOLCE의 활성을 감소시켜 콜라겐 생성을 억제하여 탄력과 재생 능력이 저하되어 피부 노화나 손상을 야기하게 된다(Cho 등, 2008; Quan 등, 2002). 또한 UVB에 의해 생성된 ROS는 MMPs의 활성화뿐만 아니라 세포 내 apoptosis를 활성화하여 피부 손상을 촉진한다(Mojeski 등, 2020).

최근 삶의 질과 경제 수준이 향상되고 사회생활 참여도가 높아지면서 건강한 피부를 유지하고자 피부 건강 관련 기능성 화장품 및 식품에 관한 관심이 증가하고 있다. 이에 피부 건강에 안전한 소재에 관한 천연물 연구가 활발히 진행되고 있다(Kim 등, 2023; Lim 등, 2023; Vanella 등, 2023). 배는 배나무과속(Pyrus)에 속하는 낙엽고목 식물로, 한국과 일본이 원산지인 남방형 동양배(Pyrusussuriansis N.)와 중국이 원산지인 북방형 동양배(Pyruspyritolia M.) 그리고 유럽 및 서부아시아가 원산지인 서양배(Pyruscommunis L.) 등으로 분류된다(Min 등, 2013). 예로부터 배잎은 토사곽란, 과실은 연육, 가래, 해열, 기침, 숙취, 배변, 그리고 과피는 부스럼이나 피부질환 등 민간요법으로 사용되어 왔다(Min 등, 2013). 배의 세포벽은 헤미셀룰로오스, 펙틴, 셀룰로오스, 당단백질 그리고 미량의 페놀계 물질로 구성되어 있고 이러한 성분들은 항산화, 항염, 항암, 항고혈압, 항당뇨 등에 효능이 있으며 피부 보습 효과가 있음을 보고한 바 있다(Chio 등, 2004; Fischer와 Bennett, 1991; Kim과 Na, 2002; Na 등, 2003). 이러한 연구에 근거하여 본 연구에서는 배유과 추출물이 UV 조사로 유도된 피부 섬유아세포의 광노화에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

배유과(UPhenon^®)의 제조 방법

UPhenon^®(UP)은 5월경 전라남도 나주에서 수확된 직경 3 cm의 덜 익은 배(Pyrus spp.) 열매로 제조되었다. 설익은 배 열매를 세척, 열수 추출, 여과, 농축 및 분무 건조(20% 덱스트린 첨가)하여 추출 분말을 제조하였다.

HS27 세포배양

HS27 세포는 high-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; Hyclone)에 10% fetal bovine serum (Hyclone), 100 mg/L penicillin-streptomycin(Hyclone), 2 mmol/L L-glutamine(Hyclone), sodium pyruvate(Hyclone)를 포함하여 사용하였으며, 37°C, 5% CO₂에서 배양하였다.

Real-time PCR

HS27 세포를 6-well plate에 5×10⁵ cells/well씩 분주하고 18시간 동안 배양한 뒤 Dulbecco’s phosphate buffered saline(DPBS)으로 세척하고 UV lamp(5 Sankyo Denki G5T5 lamps, Sankyo Denki Co.)를 이용하여 50 mJ/cm² 조사하고 양성대조군인 L-ascorbic acid 100 μg/mL 및 UP를 100, 200, 400 μg/mL 농도로 처리하였다. 24시간 뒤 0.25% trypsin-EDTA로 세포를 수집하고 RNasy mini kit(QIAGEN)을 이용하여 total RNA를 추출한 뒤 iScript^TM cDNA synthesis kit(Bio-Rad)을 이용하여 cDNA로 합성하였다. Transforming growth factor beta receptor 1(TGFβR1), PCOLCE, type Ⅰ collagen(COL1) 등 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용한 실시간 정량 PCR을 실시하였고, 기기는 CFX Connect^TM real-time PCR detection system(Bio-Rad Laboratories Headquarters)을 사용하였다. 유전자 증폭 반응에 사용할 각각의 primer 염기서열은 Table 1에 나타내었다. 95°C에서 10분 동안 hot start 한 후 95°C에서 15초, 57°C에서 15초, 72°C에서 30초간 40 cycling으로 PCR 분석을 시행하였다. 모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 실시하였다. 결과의 분석은 Bio-Rad에서 제공하는 CFX Maestro™ Analysis Software(Bio-Rad Laboratories Inc.)로 분석하였다.

Table 1 . Primer sequences used in RT-PCR quantification of mRNA.

Gene	Primer sequences
TGFβR1	F 5′-TCC CGG CAG ATC AAC GA-3′
	R 5′-ACG CGG TCA CAA ACA TGG T-3′
PCOLCE	F 5′-TCT CCT CCG AAG GGA ATG AAC-3′
	R 5′-CAG CGG TGA CAC TGA GAT CTG-3′
COL1	F 5′-GCC TCG GAG GAA ACT TTG C-3′
	R 5′-TCC GGT TGA TTT CTC ATC ATA GC-3′
GAPDH	F 5′-CCC CAC ACA CAT GCA CTT ACC-3′
	R 5′-TTG CCA AGT TGC CTG TCC TT-3′

TGFβR1: transforming growth factor-β receptor 1, PCOLCE: procollagen C-endopeptidase enhancer, COL1: collagen type Ⅰ, GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase..

Western blot

HS27 세포를 6-well plate에 5×10⁵ cells/well씩 분주하고 18시간 동안 배양한 뒤 DPBS로 세척하고 UV lamp(5 Sankyo Denki G5T5 lamps, Sankyo Denki Co.)를 이용하여 50 mJ/cm² 조사하고 양성대조군인 L-ascorbic acid 100 μg/mL 및 UP를 100, 200, 400 μg/mL 농도로 처리하였다. 24시간 뒤 배지를 제거하고 protease inhibitor가 첨가된 lysis buffer를 넣어 균질화하여 ice에 두어 일정 시간 유지한 후 원심분리(14,000×g, 20분, 4°C)하여 단백질을 분리하였다. 단백질 정량은 BSA와 Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate(Bio-Rad Laboratories Inc.)를 이용하여 Bradford 법(1976)으로 정량하였다. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel(SDS-PAGE, 10%)을 이용하여 각 샘플당 20 μL씩 loading 하여 전기영동으로 분리한 후 nitrocellulose membrane으로 단백질을 전이한 뒤, TBST buffer에 용해시킨 5% skim milk(TBS containing 0.5% Tween 20)로 1시간 동안 blocking을 하고, 1차 항체 c-Jun N-terminal kinase(JNK), c-Fos, c-Jun, MMP’s(1, 3, 9), Smad3, beta-actin(Cell signaling Technology) 상온에서 3시간 반응시킨 뒤 membrane을 HRP가 중합된 2차 항체(Cell Signaling Technology)에 1시간 반응시키고, enhanced chemiluminescent(ECL, Amershampharmacia Biotech)를 이용해 발색한 후 Easy photo를 사용하여 촬영하였다. 촬영된 Western blot band 이미지들은 ImageJ software(NIH)를 사용하여 band의 밀도를 측정하였다.

통계처리

본 실험 결과의 분석은 통계프로그램 Statistical Package for Social Science(SPSS, version 25.0, SPSS Inc.)를 사용하였으며, 각 실험 항목의 측정 결과는 평균±표준편차(mean±SD)로 표시하였다. 그룹 간 평균 차이는 one-way ANOVA로 확인하였고 통계적 유의성은 Duncan’s multiple range test를 실시하여 P<0.05 수준에서 검정하였다.

자외선 조사한 HS27 세포에서 배유과 추출물(UPhenon^®, UP)이 TGFβR1, PCOLCE, COL1A 유전자 발현에 미치는 영향

진피에 존재하는 콜라겐은 80% 이상 COL1이고, 다음으로는 type 3 collagen이다. 콜라겐 유도제인 TGF-β 콜라겐 생성을 증가시키는 콜라겐 분비 자극제로, UV에 의해 TGF-β가 감소하면 콜라겐 섬유 구조의 문제를 야기하고 진피 내 콜라겐 손실이 나타나는 것으로 알려져 있다. PCOLCE는 콜라겐 합성에 관여하는 유전자로 알려져 있다(Cho 등, 2008; Quan 등, 2002).

자외선 조사한 HS27 세포에서 배유과 추출물이 TGFβR1, PCOLCE, COL1A 유전자 발현에 미치는 영향을 측정한 결과는 Fig. 1에 나타내었다. TGFβR1 유전자 발현을 측정한 결과(Fig. 1A), NC군보다 C군에서 유의적으로 감소하여 UVB에 의한 광노화 반응이 일어났음을 확인하였다. 양성대조군(positive control, PC) 및 UP100, UP200, UP400 처리군에서 C군보다 각각 195.30%, 20.65%, 60.66%. 98.22% 증가하였다. UP100을 제외한 PC, UP200, UP400 처리군은 C군과 유의적인 차이가 있음을 확인하였다. PCOLCE 유전자 발현을 측정한 결과(Fig. 1B), NC군보다 C군에서 75.69% 유의적으로 감소하여 UVB에 의한 광노화 반응이 일어났음을 확인하였다. PC군 및 UP100, UP200, UP400 처리군에서 C군보다 각각 234.39%, 0.57%, 22.94%, 127.84% 증가하였다. UP100, UP200을 제외한 PC, UP400 처리군은 C군과 유의적인 차이가 있음을 확인하였다. COL1A 유전자 발현을 측정한 결과(Fig. 1C), NC군보다 C군에서 71.57% 유의적으로 감소하여 UVB에 의한 광노화 반응이 일어났음을 확인하였다. PC군 및 UP100, UP200, UP400 처리군에서 C군보다 각각 188.57%, 15.62%, 32.26%, 112.40% 증가하였다. UP100, UP200을 제외한 PC, UP400 처리군은 C군과 유의적인 차이가 있음을 확인하였다.

Fig 1. Effect of young pear (UPhenon^®, UP) on mRNA expression of genes related to collagen synthesis in UV-irradiated HS27 cell. (A) TGFβR1, (B) PCOLCE, and (C) Collagen type Ⅰ. The cells were treated with UV (50 mJ/cm²) except NC and incubate for 24 h with 100 μg/mL of PC (L-ascorbic acid) and various concentrations (100, 200, 400 μg/mL) of UP. mRNA expression of TGFβR1, PCOLCE, and collagen type Ⅰ was analyzed by real-time PCR. The results were expressed in mean±SD values. Significance were indicated using Duncan’s multiple range test at P<0.05.

자외선 조사한 HS27 세포에서 배유과 추출물이 JNK, c-Fos, c-Jun 단백질 인산화에 미치는 영향

자외선은 피부 세포 내 DNA를 손상시켜 세포사멸을 야기한다. 세포사멸은 mitogenactiaged protein kinase(MAPK) signal pathway가 중요하게 작용하는데, MAPK signal pathway는 JNK, p38, extracullular signal-regulated kinase 등 3가지가 매우 특징적이다. Jun과 Fos famaily 단백질로 구성된 AP-1은 MAPK signal pathway에서 가장 많은 영향을 주는 인자로, c-Jun과 c-Fos의 heterodimer 형태로 존재할 때 가장 높은 전사활성을 가지며, 사이토카인, 성장인자, 외부 환경의 자극 등에 의해 c-Jun과 c-Fos 단백질 발현이 증가하고 c-Jun은 JNK와 p38에 의해 인산화되어 활성화된다(Chen 등, 2023; Cho 등, 2023; Zhang과 Liu, 2002).

자외선 조사한 HS27 세포에서 배유과 추출물이 JNK, c-Fos, c-Jun 단백질 인산화에 미치는 영향을 측정한 결과는 Fig. 2에 나타내었다. p-JNK/JNK 단백질 인산화를 측정한 결과(Fig. 2B), NC군보다 C군에서 198.39% 유의적으로 증가하여 UVB에 의한 세포사멸 반응이 일어났음을 확인하였다. PC군 및 UP100, UP200, UP400 처리군에서 C군보다 각각 59.31%, 25.25%, 48.57%, 57.81% 농도 의존적으로 감소하였다. p-c-Fos/c-Fos 단백질 인산화를 측정한 결과(Fig. 2C), NC군보다 C군에서 176.59% 유의적으로 증가하여 UVB에 의한 세포사멸 반응이 일어났음을 확인하였다. PC군 및 UP100, UP200, UP400 처리군에서 C군보다 각각 48.13%, 20.27%, 30.51%, 32.77% 농도 의존적으로 감소하였다. p-c-Jun/c-Jun 단백질 인산화를 측정한 결과(Fig. 2C), NC군보다 C군에서 77.35% 유의적으로 증가하여 UVB에 의한 세포사멸 반응이 일어났음을 확인하였다. PC군 및 UP100, UP200, UP400 처리군에서 C군보다 각각 38.16%, 2.59%, 15.69%, 34.64% 감소하였다. UP100을 제외한 PC, UP400 처리군은 C군과 유의적인 차이가 있음을 확인하였다.

Fig 2. Effect of young pear (UPhenon^®, UP) on protein phosphorylation of p-JNK/JNK, p-c-Fos/c-Fos, and p-c-Jun/c-Jun in UV-irradiated HS27 cell. The cells were treated with UV (50 mJ/cm²) except NC and incubate for 24 h with 100 μg/mL of PC (L-ascorbic acid) and various concentrations (100, 200, 400 μg/mL) of young pear. Protein expression of MAPK8 (JNK), c-Fos, c-Jun was analyzed by western blot. The results were expressed in mean±SD values. Significance were indicated using Duncan’s multiple range test at P<0.05.

자외선 조사한 HS27세포에서 배유과 추출물이 MMPs(1, 3, 9)와 Smad3 단백질 발현에 미치는 영향

자외선은 표피의 각질 형성세포에서 ROS 생성 및 염증성 사이토카인 분비를 촉진하고 진피 섬유아세포에서 MMPs의 발현을 증가시켜 피부 노화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 특히 진피 세포에서 증가하는 MMPs로는 MMP-1, MMP-3, MMP-9 등이 있다. MMP-1은 콜라겐 타입을 분해하고 MMP-3는 extracellular matrix의 다양한 분자를 분해하며, MMP-9은 젤라틴분해효소로 콜라겐 단편들을 더욱 분해하는 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2018; Vincenti 등, 1996).

자외선 조사한 HS27 세포에서 배유과 추출물이 MMPs(1, 3, 9)와 Smad3 단백질 활성화에 미치는 영향을 측정한 결과는 Fig. 3에 나타내었다. MMP-1 단백질 활성화를 측정한 결과(Fig. 3B), NC군보다 C군에서 198.76% 유의적으로 증가하여 UVB에 의한 광노화 반응이 일어났음을 확인하였다. PC군 및 UP100, UP200, UP400 처리군에서 C군보다 각각 52.38%, 21.08%, 29.36%, 47.20% 유의적으로 감소하였다. MMP-3 단백질 활성화를 측정한 결과(Fig. 3C), NC군보다 C군에서 124.12% 유의적으로 증가하여 UVB에 의한 광노화 반응이 일어났음을 확인하였다. PC군 및 UP100, UP200, UP400 처리군에서 C군보다 각각 32.82%, 12.63%, 12.78%, 23.28% 유의적으로 감소하였다. MMP-9 단백질 활성화를 측정한 결과(Fig. 3D), NC군보다 C군에서 74.49% 유의적으로 증가하여 UVB에 의한 광노화 반응이 일어났음을 확인하였다. PC군 및 UP100, UP200, UP400 처리군에서 C군보다 각각 30.42%, 12.13%, 18.43%, 29.55% 유의적으로 감소하였다. p-Smad3/Smad3 단백질 인산화를 측정한 결과(Fig. 3E), NC군보다 C군에서 51.92% 유의적으로 감소하여 UVB에 의한 광노화 반응이 일어났음을 확인하였다. PC군 및 UP100, UP200, UP400 처리군에서 C군보다 각각 63.82%, 41.18%, 45.32%, 114.77% 유의적으로 증가하였다.

Fig 3. Effect of young pear (UPhenon^®, UP) on protein activation of MMPs (-1, -3, -9), p-Smad3/Smad3 in UV-irradiated HS27 cell. The cells were treated with UV (50 mJ/cm²) except NC and incubate for 24 h with 100 μg/mL of PC (L-ascorbic acid) and various concentrations (100, 200, 400 μg/mL) of young pear. Protein expression of MMP-1, MMP-3, MMP-9, and Smad3 was analyzed by western blot. The results were expressed in mean±SD values. Significance were indicated using Duncan’s multiple range test at P<0.05.

본 연구에서는 배유과 추출물을 이용하여 자외선 조사로 유도된 피부 섬유아세포에서 콜라겐 생성 관련 유전자와 세포사멸 관련 단백질 및 MMPs 단백질 변화를 확인함으로써 광노화 억제 효능을 평가하였다. 자외선을 조사한 HS 세포에서 배유과 추출물의 농도별(100, 200, 400 g/mL) 처리 시 콜라겐 생성 관련 유전자인 TGFβR1, PCOLCE, COL1의 변화를 확인한 결과, 자외선 조사로 감소한 유전자 발현을 유의적으로 증가시킴을 확인하였다. 또한 배유과 추출물의 처리는 세포사멸 관련 단백질인 p-JNK/JNK, p-c-Fos/c-Fos, p-c-Jun/c-Jun의 인산화를 유의적으로 감소시켰으며, MMPs 단백질 활성을 유의적으로 감소시키는 것으로 확인되었다. 이상의 결과를 통하여 배유과 추출물은 자외선 조사에 의한 광노화 발생 시 나타나는 콜라겐 분해 및 세포사멸 등 주름 생성 억제에 긍정적인 효과가 있음을 확인하였고, 자외선 조사에 의한 피부 손상으로부터 피부 건강 유지에 도움을 줄 수 있는 건강기능식품을 개발하기 위한 기초로 활용 가능할 것으로 보인다.