현대사회에서 식품의 섭취는 맛과 영양소 공급과 더불어 건강증진과 질병 예방에 초점이 맞춰지고 있어 건강기능식품에 관한 관심과 함께 기능성 식품에 대한 소비가 증가하고 있다(Park 등, 2011; Shin 등, 2014). 유산균은 생균제나 발효식품의 형태로 섭취되어 체내에 유익한 작용을 하는 probiotics로서(Park과 Oh, 2005), 배변 활동(Yoon 등, 2018), 항암 효과(Kim 등, 2020), 면역력 증진(Mcfarland, 2000), 혈중 콜레스테롤 저하 등의 효능이 보고되어 있다(Salminen, 2001). 또한 멸균 처리한 유산균 사균도 생균에 못지않은 다양한 효능을 나타내고 있음이 보고되어 있다(Kang 등, 2020; You 등, 2022). 이러한 유산균에 의한 식재료의 발효는 유산균 개체수의 증가와 더불어 유용한 물질 생성으로 항염증, 항산화 등 건강에 이점을 주어 전통식품 발효 및 유용한 발효소재 개발 방법으로 다양한 연구가 진행되고 있다(Jeong 등, 2019; Ryu 등, 2018). 특히 γ-aminobutyric acid(GABA) 생성능을 지닌 Lactobacillus brevis OPK-3 유산균은 지방 세포 내 지질 축적 개선 효과(Park 등, 2014), 비만 쥐에 대한 지방조직 내 지방생성 감소 및 간 지질 개선 효과(Park 등, 2020)가 확인된 바 있고, ornithine 생성능을 보유한 Weissella koreensis OK1-6 유산균을 첨가한 김치의 항비만 효과(Park 등, 2012)가 보고된 바 있다. 이러한 결과는 Lactobacillus plantarum K-1BR 유산균을 활용한 식품 내 GABA 함량 증진(Kim과 Yoon, 2017)과 Weissella koreensis DB1 유산균을 활용한 ornithine 함량 증진(Moon 등, 2019), 그리고 Lactobacillus rhamnosus HK-9 유산균을 활용한 saponin(ginsenoside)의 저분자화(Choi 등, 2012) 등의 연구 결과와 더불어 유산균을 활용한 기능성 발효식품 및 발효식품소재 개발 가능성을 높이고 있다.

인삼(Panax ginseng)은 재배 시간이 길고, 그 시간 동안 병충해에 노출되어 농약의 사용이 불가피하다는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완할 수 있는 새싹인삼(Sprout Panax ginseng)은 스마트 팜 환경에서 비교적 짧은 시간 내 재배가 가능하며, 뿌리와 줄기, 잎을 모두 섭취할 수 있는 특징이 있어 최근 널리 활용되고 있다(Lee 등, 2019). 새싹인삼에는 saponin, polyphenol, alkaloid 등의 함량이 높아(Park, 1996) 항암 활성, 고혈압 예방(Cheon 등, 2014), 항산화 활성(Lee 등, 2019) 등 다양한 효능이 있는 것으로 밝혀져 있다. 또한 새싹인삼의 활용도를 높이고자 새싹인삼을 첨가한 카스텔라(Kim 등, 2016), 새싹인삼을 첨가한 수산가공품의 제조(Jung, 2018) 등 다양한 활용과 관련된 연구가 보고되어 있다.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 동물실험에 대한 윤리적인 문제를 해결할 수 있고(Oh 등, 2013), 유전자의 구성이 인간 유전자와 60% 이상 유사하여(Bargmann, 1998) 에너지 대사 증후군 및 수명연장 등 다방면에서 실험모델로 이용되고 있다(Kampkötter 등, 2008).

본 연구에서는 GABA 생성능을 보유한 Lactobacillus brevis OPK-3와 ornithine 생성능을 보유한 Weissella koreensis OK1-6, β-glucosidase 활성을 보유한 Weissella confusa JK27에 의한 발효새싹인삼 내 기능성물질(GABA, ornithine, saponin, polyphenol)의 함량을 분석하고, 발효새싹인삼의 에탄올 추출과 유기용매 분획을 실시한 후 예쁜꼬마선충을 대상으로 항산화 및 항노화와 관련된 연구를 진행하였다. 즉, 예쁜꼬마선충 내 항산화 효소인 superoxide dismutase(SOD)와 catalase의 활성 확인, 선충 체내 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS) 발생의 억제 능력 확인, 형질 전환된 CF1553 선충을 이용하여 SOD- 3::GFP(Green fluorescent protein)의 발현 증가 여부 확인, 선충의 수명연장에 미치는 영향 확인, 고온 조건에서의 열 저항성 확인, 선충 체내에서 생성되는 노화색소의 축적량에 미치는 영향 확인 등을 실시하였다. 이와 같은 연구 결과를 토대로 기능성물질이 증가한 발효새싹인삼소재의 개발과 함께 효능에 기반한 활용 가능성을 제시하고자 한다.

균주 배양 및 새싹인삼 발효물 제조

본 연구에 사용된 새싹인삼은 농업회사법인 렛츠팜(주)에서 제공받아 사용하였으며, 발효에 사용된 유산균 Lactobacillus brevis OPK-3, Weissella koreensis OK1-6, Weissella confusa JK27은 우석대학교 식품생명공학과에서 분리하여 보관하고 있는 균주이다. Lactobacillus brevis OPK-3는 GABA 생성능을(Park과 Oh, 2007), Weissella koreensis OK1-6는 ornithine 생성능을(Yu 등, 2009), Weissella confusa JK27은 β-glucosidase 활성을 보유한 유산균이다. 위 3가지 유산균은 각각 MRS broth에 접종하여 30°C에서 48시간 동안 배양하면서 발효에 필요한 균주로 사용하였다. 분쇄한 새싹인삼 10 g에 30% 에탄올 100 mL를 가하고 1%의 sodium L(+)-glutamate monohydrate와 L-arginine monohydrochloride를 첨가하여 고압멸균(121°C, 15 min)하여 에탄올을 제거한 뒤, 밀봉된 상태에서 자연 냉각시켰다. 이후 Lactobacillus brevis OPK-3와 Weissella koreensis OK1-6 유산균을 0.5 g, Weissella confusa JK27 유산균을 4.5 g 접종한 후 30°C에서 72시간 동안 발효하여 실험에 사용하였다.

추출 및 분획

발효가 끝난 새싹인삼은 동결건조하여 분말화하였으며, 분말화된 발효새싹인삼 50 g에 에탄올을 가하여 50°C에서 6시간씩 3회 반복하여 추출하였다. 이후 추출액을 수욕조상에서 감압농축하여 추출농축물(이하 농축물) 7.5 g을 확보하였으며, 농축물 7.5 g을 300 mL의 증류수로 현탁시키고 동량의 n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate, n- butanol의 순서대로 분획하여 여과 후 감압농축하여 각각의 분획농축물(이하분획물)(0.21 g, 0.25 g, 0.24 g, 0.4 g)을 확보하였다. 농축물의 수율은 15.0%, n-hexane 분획물 0.42 %, methylene chloride 분획물 0.5%, ethyl acetate 분획물 0.48%, n-butanol 분획물 0.8%이며 실험에 필요한 농축물과 분획물 시료는 밀봉 및 차광 후 실온에서 보관하여 실험에 필요한 시료로 사용하였다.

발효새싹인삼의 기능성 성분(GABA, ornithine, saponin, polyphenol) 함량 분석

발효새싹인삼 내 GABA와 ornithine 함량을 분석하기 위해 Oh 등(2002)의 분석방법을 사용하였다. 즉, 동결건조된 시료 200 mg에 methanol:chloroform:water(12:5:3) 혼합액 800 μL를 가하여 원심분리(15,000×g, 15 min, 4°C)하였다. GABA와 ornithine을 포함하는 수용액층(상등액)을 회수하고 침전물에 chloroform:water(1:2) 혼합액 600 μL를 가하여 분리된 상등액을 1차 원심분리로부터 얻은 상등액과 혼합하였다. 이후 원심분리(15,000×g, 15 min, 4 °C)를 통해 상등액을 회수하여 동결건조하고 소량의 water에 용해하여 0.45 μm PVDF filter로 여과하여 분석에 사용하였다. GABA와 ornithine의 형광 유도체화를 위해 ACCQ ･Tag^TM Reagant Kit을 사용하였으며, 3.9×150 mm, C₁₈ column으로 유도체를 분리하였다. Mobile phase는 ACCQ ･Tag Eluent A[Waters eluent A:water(1:10, v/v, pH= 5.48)]와 Eluent B(60% acetonitrile)를 분당 1 mL의 유속으로 흘려주었으며(Table 1), GABA와 ornithine 함량은 표준물질을 토대로 작성한 표준검량곡선을 이용하여 산출하였다(Oh 등, 2002). 발효새싹인삼 추출물 및 분획물의 saponin 분석은 vanillin-sulfuric acid 분석법을 응용하여 분석하였다(Kim 등, 2021). 추출물 및 분획물 시료 1 g에 메탄올 50 mL를 가하여 용해시킨 후 시료 100 μL를 시험관에 넣고 얼음물 속에서 8% vanillin-ethanol 용액 300 μL와 72% 황산 용액 4 mL를 가하고 60°C에서 10분간 반응시켜 545 nm에서 흡광도를 측정하였다. 발효새싹인삼 추출물 및 분획물의 polyphenol 함량 측정은 Folin-Ciocalteau colorimetric 방법을 응용하여 실험하였다(Cicco 등, 2009). 추출물 및 분획물 시료 20 mg에 에탄올 10 mL를 가하여 농도별 희석 후 시료로 사용하였으며, 각 시료 100 μL에 Folin- Ciocalteu 용액 100 μL를 첨가한 뒤 2분간 균질화하였다. 이후 0.1 M sodium carbonate를 800 μL 가하여 40°C 수욕상에서 20분 반응시킨 후, 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. Polyphenol 함량은 tannic acid를 표준품으로 사용하여 농도에 따른 일차방정식(y＝0.0022x＋0.0093, R²=0.9981)을 이용하여 총 페놀 함량(mg tannic acid equivalent(TAE)/ g)으로 계산하여 나타내었다.

Table 1

HPLC conditions for GABA and ornithine analysis.

Model	Waters 2690 (SIL-20AC)
Column	3.9×150 mm AccQ･TagTM (Nova-PakTM C18, Waters) column
Mobile phase	Eluent A＝Waters eluent A:water (1:10) (v/v), pH=5.48
	Eluent B＝60% acetonitrile
Flow rate	1.0 mL/min
Gradient(Mobile phase B)	0∼2 min(0→5%), 2∼8 min(5→7.5%), 8∼23 min(7.5→8%), 23∼24.5 min(8→11%), 24.5∼25.5 min(11→19.5%), 25.5∼44 min(19.5→20.26%), 44∼49 min(20.26→28%), 49∼50 min(28→60%), 50∼53 min(60→60%), 53∼55 min(B 60→4%), 55∼60 min(4→4%)
Temperature	37°C
Detector	Waters 747 scanning fluorescence detector
Injection volume	10 μL

DPPH 라디칼 및 ABTS 라디칼 소거 활성 측정

발효새싹인삼 분획물 시료를 에탄올을 용매로 농도별로 제조하여 96-well plate에 50 μL를 가하고 0.2 mM의 1,1- diphenyl-2-picrylhrazyl(DPPH) 에탄올 용액 200 μL를 가하였다. 이후 실온의 암소에서 30분간 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며 대조 약물로 L-ascorbic acid를 사용하였다(Yoshida 등, 1989). 발효새싹인삼 분획물 시료에 대한 ABTS 라디칼 소거 활성 측정은 ABTS(7.4 mM) 용액과 K₂S₂O₈(2.6 mM) 용액을 동량 혼합하여 실온의 암소에서 24시간 반응시켜 라디칼을 유도한 후 흡광도 값이 0.7±0.03이 되도록 phosphate buffer saline(pH 7.4)으로 희석하여 사용하였다. 농도별 시료 10 μL와 ABTS 용액 190 μL를 가하여 실온의 암소에서 10분간 반응시켜 732 nm에서 흡광도를 측정하였다(Re 등, 1999).

예쁜꼬마선충의 배양

예쁜꼬마선충(C. elegans)은 Escherichia coli(OP50)가 도말된 nematode growth medium(NGM) agar plate 상에서 배양하였다(20°C). 선충의 알을 회수하기 위해 M9 buffer로 표피를 세척한 선충에게 bleaching solution(NaClO, 5 M KOH) 용액을 가하여 알을 회수하였다. 시료는 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 용매로 하여 멸균된 NGM plate(50°C)에 stock solution 상태로 첨가되었으며, 최종 DMSO 농도는 0.1%(v/v)를 유지하였다(Brenner, 1974).

선충 체내의 항산화 효소(SOD, catalase) 활성 측정

농도별(250, 500 μg/mL)로 제조한 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물 시료를 plate에 넣고 성장 단계를 동일시한 선충을 배양하였다. 성체가 된 지 2일째의 선충에게 M9 buffer를 가하여 세척 후 분쇄하여 항산화 효소 활성 측정에 사용하였다. 이때 사용한 homogenization buffer의 조성은 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.5이다. SOD의 활성은 10 mM phosphate buffer(pH 8.0)를 용매로 한 반응혼합물(1.6 mM xanthine과 0.48 mM NBT) 0.49 mL를 제조하고 농도별 시료 10 μL와 혼합하여 5분간 pre-incubation 시켰다. 이후 0.05 U/mL xanthine oxidase 100 μL를 가하고 37°C에서 20분간 incubation 한 후 69 mM의 SDS를 270 μL 가하여 반응을 멈춘 뒤 570 nm에서 흡광도를 측정하였다(Thuong 등, 2007). Catalase의 활성은 25 mM H₂O₂에 농도별 시료 50 μL를 가하여 3분간 반응시켜 240 nm에서 흡광도를 측정하였다(Aebi, 1984).

선충 세포 내 ROS 분석

발효새싹인삼 methylene chloride 분획물 시료를 처리한 선충 내 ROS의 분석은 2′,7′-dichlorodihydro-fluorescein-diacetate(H₂DCF-DA)를 사용하여 측정하였다. 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물 시료(250, 500 μg/ mL)가 첨가된 plate에서 배양된 성장 단계가 동일한 4일째의 선충을 100 μM juglone이 포함된 M9 buffer에 넣어 2시간 반응시킨 뒤 50 μL의 M9 buffer가 담긴 96-well plate에 옮겨 넣었다. 이후 50 μM의 H₂DCF-DA를 50 μL 가한 뒤 excitation 485 nm, emission 535 nm에서 형광 강도를 측정하였다(Kim 등, 2015).

SOD-3::GFP 발현량 측정 및 노화색소(lipofuscin) 축적량 평가

형질전환 된 SOD-3::GFP를 포함한 GFP-fused transgenic strain CF1553 선충의 GFP 발현율과 N2 선충 체내에 축적되며 자가 형광을 띄는 노화색소인 lipofuscin의 축적량을 측정하기 위해 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물(250, 500 μg/mL)이 첨가된 plate에서 배양하였다. 각각 성체가 된 후 3일째(SOD-3::GFP)와 8일째(lipofuscin)의 선충을 M9 buffer로 세척하여 표피의 불순물을 제거한 뒤 4% sodium azide로 마취시킨 후 형광실체 현미경(Olympus)으로 발현을 관찰하였다. 발현 강도를 정량하고 분석하기 위하여 현미경을 이용하여 사진을 촬영하였으며, 분석에 필요한 software는 ImageJ(NIH)를 사용하였다(Qi 등, 2021).

수명연장 효능평가 및 열 스트레스 저항성 평가

선충의 수명연장을 평가하기 위해 NGM plate로부터 알을 따로 분리 배양하여 성장 단계를 일치시킨 후 발효새싹인삼 추출물 및 분획물을 첨가한 plate에 선충을 옮겨 배양하여 생존여부를 확인하였다. 정확한 측정과 NGM plate의 오염을 예방하기 위해 1일 간격으로 새로운 NGM plate로 선충을 옮겨주었으며 7일째 이후에는 2일 간격으로 새로운 NGM plate로 옮겨주었다(Lithgow 등, 1995). 선충의 열 스트레스에 의한 저항성을 평가하기 위해 성장 단계를 일치시킨 선충을 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물(250, 500 μg/mL)이 첨가된 plate에 배양하여 성체가 된 지 4일째의 선충을 사용하였다. 25마리의 선충을 깨끗한 NGM plate로 옮기고 선충에게는 고온 조건인 36°C에서 배양하면서 매시간 선충의 생존율을 측정하였다. 선충의 사망은 platinum wire의 끝으로 조심스럽게 자극하였을 때 반응이 없는 경우를 사망상태로 간주하였다(Horikawa와 Sakamoto, 2009).

통계분석

통계 자료의 값은 평균값±표준오차(mean±SEM)로 표시하였으며, 그룹 간에 대한 통계적 유의성 검정은 Student’s t-test를 이용하여 분석하였다. 선충의 연속적인 생존도는 log-rank test 분석 방법을 이용하였으며, P값은 P<0.05, P<0.01, P<0.001일 때 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

발효새싹인삼의 기능성 성분 함량 분석

GABA는 억제성 신경전달 물질로 혈류개선 및 뇌의 대사촉진, 뇌 기억증진 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(Bown과 Shelp, 1997), GABA 생성능을 지닌 유산균이 알코올 투여 흰쥐의 지방대사 및 간 기능을 개선시킨 결과가 나타난 바 있다(Bae 등, 2009). 본 연구에 사용한 Lactobacillus brevis OPK-3는 GABA 생성능을 지닌 김치 유래의 유산균으로(Park과 Oh, 2007), 김치의 발효과정 중에 김치 내 GABA 함유량을 증진시키는 것으로 확인되었다(Oh 등, 2008). Lactobacillus brevis OPK-3 유산균에 의해 발효된 새싹인삼 내 GABA의 함량을 분석한 결과 418.8 mg/ 100 g으로 분석되었으며, 발효되지 않은 새싹인삼 내 GABA는 128.5 mg/100 g이었다(Table 2).

Table 2

GABA and ornithine levels in fermented and non-fermented sprout ginseng.

	Fermented sprout ginseng (mg/100 g)	Non-sprout ginseng (mg/100 g)
GABA	418.8	128.5
Ornithine	2,471.5	－

Hwang 등(2017)의 발효시키지 않은 삼 전초의 GABA 함량(260.60 mg/100 g)과 L. brevis로 발효시킨 삼 전초의 GABA 함량(309.56 mg/100 g)을 비교하였을 때보다 본 연구에서 발효시킨 새싹인삼의 GABA 함량이 더 증가하였음을 확인할 수 있다. 이는 각 유산균의 GABA 생성능과 발효재료 및 조건 등에 기인한 것으로 판단된다. 숙취해소와 운동능력 향상에 효과가 있는 것으로 알려진 ornithine은 조개류와 와인, 치즈 등 발효식품에서 검출되며 기능성 식품 소재로 관심이 증대되고 있는 물질이다(Uchisawa 등, 2004). 또한 ornithine 함량이 증진된 김치는 일반 김치에 비하여 고지방 식이로 유도된 비만 쥐에 대한 항비만 효과가 유의적으로 우수하다는 결과가 나타난 바 있다(Park 등, 2012). Ornithine 생성능을 보유한 Weissella koreensis OK1-6(Yu 등, 2009) 유산균에 의해 발효된 새싹인삼 내 ornithine의 함량을 분석한 결과 2,472 mg/100 g으로 분석되었으며, 발효되지 않은 새싹인삼 내 ornithine은 검출되지 않았다(Table 2). 이는 발효를 위해서 첨가한 ornithine의 전구물질인 L-arginine이 유산균이 분비한 효소에 의해 ornithine으로 전환된 것으로 판단된다. W. koreensis OK1-6는 김치 발효과정 중에도 다량의 ornithine을 생성하여 김치의 기능성을 높이는 것으로 알려져 발효소재 개발에 활용 가능성이 높은 것으로 알려진 바 있다(Park 등, 2012; Yu 등, 2009). Saponin은 인삼, 더덕, 도라지 등에 다량 함유되어 있으며 항암, 항염증, 자궁 수축 등의 효능을 가지고 있다(Lee 등, 2004). Weissella confusa JK27 유산균 발효에 의한 새싹인삼 내 총 saponin은 29.1 g/100 g으로 분석되었으며(Table 3), saponin의 분해에 의한 ginsenosides의 패턴변화가 확인되었다(Fig. 1). 예를 들면 발효 직전에 비하여 발효 후에 ginsenoside F2와 compound K 증가가 관찰되었다. Compound K는 인삼 사포닌의 주된 고분자 ginsenoside Rb1의 마지막 발효 대사산물로 여겨지고 있으며, 흡수율과 생리적 활성이 고분자 ginsenosides에 비하여 우수한 것으로 알려져 있다(Yi 등, 2012). Choi 등(2012)에 따르면 L. casei 균주에 의해 발효된 동외품 인삼(파삼)의 고분자 진세노사이드가 저분자 진세노사이드(Rh2)로의 전환이 확인되었다고 보고한 바 있으며, Yi 등(2012)에 따르면 L. brevis THK-D57 유산균에 의해 ginsenoside Rb1의 compound K로의 전환이 확인되었음을 보고한 바 있어 유산균에 의한 인삼 고분자 사포닌의 생물학적 전환이 증명되고 있다. Flavonoids, anthocyanins, tannins 등을 총칭하는 polyphenol 화합물은 항균, 항암, 항산화 작용 등 다양한 생리활성 기능을 갖는 성분으로 식물계에 널리 분포되어 있다(Lu와 Foo, 2000; Urquiaga와 Leighton, 2000). 발효새싹인삼 추출물 및 분획물의 polyphenol 함량 측정 결과 에탄올 추출물 43.04 μg TAE/mL, n-hexane 분획물 114.55 μg TAE/mL, methylene chloride 분획물 123.18 μg TAE/mL, ethyl acetate 분획물 44.32 μg TAE/mL, n-butanol 분획물 22.64 μg TAE/mL로 측정되었다(Table 4). 이들 결과를 종합하면 유산균에 의해 발효된 새싹인삼은 GABA와 ornithine을 발효 이전의 새싹인삼보다 고함유하고 있고, 고분자의 ginsenosides는 분해 후 저분자의 compound K 등으로 전환되어 기능성 식품개발, 프리미엄 사료개발 등 다양한 방면에 활용 가치가 있을 것으로 생각된다.

Fig 1. TLC analysis of ginsenoside pattern in Weissella confusa JK27 fermented sprout ginseng according to fermentation time. The CK refers to compound K. The arrow indicates the position of compound K.

Table 3

Saponin levels in fermented and fractionated sprout ginseng.

Saponin level (g/100 g)	FSG	n-Hex	MC	EA	n-BuOH
	29.1	5.6	9.8	8.9	7.4

FSG, fermented sprout ginseng; n-Hex, n-hexane fraction; MC, methylene chloride fraction; EA, ethyl acetate fraction; n-BuOH, n-butanol fraction..

Table 4

Total polyphenol content of fermented sprout ginseng extract and fractions.

Extract and fraction	Total polyphenol (μg TAE/mL)1)
Ethanol extract	43.04
n-Hexane fraction	114.55
Methylene chloride fraction	123.18
Ethyl acetate fraction	44.32
n-Butanol fraction	22.64

¹⁾Total polyphenol content analyzed as tannic acid equivalent (TAE) μg/mL of extract and fraction..

DPPH 라디칼 및 ABTS 라디칼 소거 활성 측정

DPPH 라디칼은 517 nm에서 최대 흡광도를 갖는 비교적 안정화된 라디칼로서 천연물의 항산화 활성을 평가하는 데 널리 사용되며(Moreno 등, 2000), 본 연구에서는 라디칼 소거 활성이 50%가 되는 농도인 IC₅₀값으로 표기하였다. 발효새싹인삼 분획물에 대한 DPPH 라디칼 소거 활성은 Fig. 2의 결과로부터 산출되었으며, 에탄올 추출물 IC₅₀값 14.11 mg/mL, n-hexane 분획물 IC₅₀값 3.29 mg/mL, methylene chloride 분획물 IC₅₀값 0.40 mg/mL, ethyl acetate 분획물 IC₅₀값 3.19 mg/mL, n-butanol 분획물 IC₅₀값 19.81 mg/ mL로 methylene chloride 분획물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 농도 의존적으로 가장 우수하게 측정되었다. ABTS 라디칼 소거 활성은 ABTS와 potassium persulfate로 인해 생성된 라디칼이 항산화 활성에 의해 제거되어 탈색되는 원리를 이용하는 방법으로 DPPH 라디칼 소거 활성과 더불어 널리 이용되는 항산화 측정 방법이다(Re 등, 1999). ABTS 라디칼 소거 활성은 Fig. 3의 결과로부터 산출되었으며, 에탄올 추출물 IC₅₀ value 1.41 mg/mL, n-hexane 분획물 IC₅₀ value 37.17 mg/mL, methylene chloride 분획물 IC₅₀ value 0.15 mg/mL, ethyl acetate 분획물 IC₅₀ value 0.15 mg/mL, n-butanol 분획물 IC₅₀ value 1.69 mg/mL로 methylene chloride 분획물의 ABTS 라디칼 소거 활성이 농도 의존적으로 증가하여 다른 분획물에 비해 우수한 소거 활성을 나타내었다. 본 연구에서 DPPH 라디칼 소거 활성과 ABTS 라디칼 소거 활성 모두 methylene chloride 분획물이 가장 우수하게 평가되었지만 ABTS 라디칼 소거 활성이 DPPH 라디칼 소거 활성보다 높은 활성을 나타내었다. 그러한 이유는 ABTS 라디칼 소거 활성 측정법이 친수성 시료와 소수성 시료의 라디칼을 모두 소거할 수 있기에 DPPH 라디칼 소거 활성보다 우수하게 측정되었다고 판단된다(Arnao 등, 2001). 또한 methylene chloride 분획의 라디칼 소거 활성이 가장 우수하게 측정되었는데 이러한 이유는 saponin 및 polyphenol 함량에 일부 기인한 것으로 판단된다. Jang (2018)의 보고에 따르면 맥문동 methylene chloride 분획의 폴리페놀 함량이 메탄올 추출물과 ethyl acetate 분획물보다 상대적으로 더 높았으며, DPPH 라디칼 소거 활성 또한 methylene chloride 분획에서 가장 우수하게 측정된 바 있다. Kim 등(2022)이 보고한 바에 따르면 새싹인삼의 DPPH 라디칼 소거능이 잎/줄기의 IC₅₀값이 0.82 mg/mL, 뿌리의 IC₅₀값이 0.70 mg/mL, 새싹인삼 전체의 IC₅₀값이 0.78 mg/ mL로 보고한 바 있으며, Lee 등(2020b)에 따르면 토양재배 인삼의 DPPH 라디칼 소거능에 대한 IC₅₀값은 16.63 mg/mL, 수경재배 인삼의 IC₅₀값은 20.35 mg/mL, 잎/줄기의 IC₅₀값은 6.47 mg/mL로 보고하였다. 이상의 결과로부터 본 연구에서 진행한 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물의 라디칼 소거능이 상대적으로 우수함을 확인할 수 있는바, 이는 발효새싹인삼에 존재하는 생리활성 물질인 saponin과 polyphenol 화합물이 항산화 활성에 어느 정도 기여하였음을 추측할 수 있으며, 각 분획 내 특정 성분과 항산화 활성과의 구체적인 상관관계에 관한 추가적인 연구가 필요하다.

Fig 2. DPPH free radical scavenging effects of the ethanol extract, and its fractions from the fermented sprout ginseng. Vit.C, vitamin C; EtOH, ethyl alcohol; n-Hex, n-hexane; MC, methylene chloride; EA, ethyl acetate; n-BuOH, n-butanol.

Fig 3. ABTS radical scavenging effects of the ethanol extract, and its fractions from the fermented sprout ginseng. Vit.C, vitamin C; EtOH, ethyl alcohol; n-Hex, n-hexane; MC, methylene chloride; EA, ethyl acetate; n-BuOH, n-butanol.

선충 체내의 항산화 효소 활성 측정

SOD는 superoxide anion radical(･O2^-)과 반응하여 H₂O₂를 생성하는 효소로, 체내에서 활성산소 장애에 대한 방어작용을 하는 항산화 효소이다(Greenstock, 1993; Pryor, 1986). 발효새싹인삼 methylene chloride 시료를 농도별로 제조하여 성장 단계를 동일시한 선충을 배양하고 xanthine을 기질로 xanthine oxidase의 효소반응 과정 중에서 생성되는 superoxide anion을 활용하여 SOD의 활성을 측정하였다. Fig. 4A와 같이 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물 투여군에서 SOD의 활성이 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다. 250 μg/mL 투여군은 대조군에 비해 SOD의 활성을 24.44% 증가시켰으며, 500 μg/mL 투여군은 SOD의 활성을 41.70% 증가시켰다. Catalase는 H₂O₂를 산소와 물로 변환시켜 세포 내 라디칼을 소거하며(Bobek, 1999), H₂O₂의 독성에 의한 중독에 내성이 강한 항산화 효소이다(Erzurum 등, 1993). Catalase의 활성은 Fig. 4B와 같이 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물 250 μg/mL 투여군이 대조군에 비해 활성을 18.65% 증가시켰으며, 500 μg/ mL 투여군은 활성을 44.38% 증가시켰다. 따라서 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물은 예쁜꼬마선충 내 SOD와 catalase의 활성을 증가시켜 산화적 손상으로부터 방어기전에 도움을 주는 것으로 확인되었다. 다른 유사 연구에서도 새싹인삼 혹은 발효인삼 추출액의 투여가 SOD 유사 활성 혹은 catalase 활성을 증가시키는 것으로 보고된 바 있다. 예를 들면 Lee 등(2020a)은 새싹인삼 추출물의 농도가 증가할수록 SOD 유사 활성이 증가하여 1,000 μg/mL 농도에서 최대 48.95%의 활성을 나타내었다고 보고한 바 있다. 또한 Ko 등(2004)이 보고한 바에 따르면 방사선이 조사된 쥐에게 백삼과 발효인삼 추출액을 처리할 경우 catalase의 활성이 유의성 있게 증가하였다고 보고하였다.

Fig 4. Effects of fermented sprout ginseng methylene chloride fraction on SOD and catalase activities of wild N2 nematodes. (A) SOD activity was expressed by a percentage of the scavenge amount of control. (B) Catalase activity was calculated from the concentration of residual H₂O₂ measured by a spectrophotometric method. Differences compared to the control were considered significant at ^**P<0.01, ^***P<0.001 by one-way ANOVA.

선충 세포 내 ROS 감소 효과 분석

ROS는 체내의 항산화 효소의 활성을 저하시켜 세포의 손상을 유발하여 각종 질병에 관여하는 것으로 보고되어 있다(Moloney와 Cotter, 2018). 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물의 예쁜꼬마선충 세포 내 ROS의 감소 효능을 평가하기 위해 ROS를 유발한 선충과 H₂DCF-DA를 반응시켜 형광의 감소 폭을 관찰하였다. H₂DCF-DA는 활성산소에 의해 산화되면서 dichlorofluorescenin을 생성하여 녹색의 형광을 발하게 되어 세포 내 활성산소 생성에 관한 연구에 널리 이용되고 있다(Afri 등, 2004). ROS로 인한 120분까지의 형광 감소의 폭은 대조군과 비교하였을 때 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물 250 μg/mL 투여군에서는 약 14.68%, 500 μg/mL 투여군에서는 약 18.50% 감소시켰다(Flg. 5). Hong 등(2021)은 인삼 추출물을 n-butanol로 분획하였을 때 n-butanol 분획물이 추출물에 비해 C2C12세포 내 ROS의 발생량을 유의적으로 감소시켰다고 보고한 바 있으며, Shin 등(2017)은 된장에서 분리된 Saccharomyces servazzii, GB-07균에 의해 발효된 발효인삼이 RAW 264.7 세포 내 ROS의 생성을 억제하였다고 보고한 바 있다. 따라서 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물은 예쁜꼬마선충 내 ROS의 축적을 감소시켜 세포의 손상 및 염증 생성 예방 등에 도움을 줄 것으로 판단된다.

Fig 5. Effects of fermented sprout ginseng methylene chloride fraction on the intracellular ROS accumulation of wild-type N2 nematodes. The worms were incubated with 100 μM juglone for 2 hours and then treated with fluorescent H₂DCF-DA to confirm the reaction with sulfuric oxygen. Intracellular ROS accumulation was quantified spectrophotometrically at excitation 485 nm and emission 535 nm. Plates were read every 30 min from 0 min to 120 min. Differences compared to the control were considered significant at ^***P<0.001 by one-way ANOVA.

SOD-3::GFP 발현량 측정 및 노화색소 축적량 평가

발효새싹인삼 methylene chloride 분획물을 처리한 선충 내 산화스트레스에 저항하는 단백질의 발현 여부를 평가하기 위해 SOD-3::GFP를 포함하는 형질전환 된 CF1533 선충을 사용하여 SOD-3::GFP의 발현량을 확인하였다. CF1553 선충은 GFP의 발현율에 따라 분석하고자 하는 시료 중에 산화적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 물질이 함유되어 있음을 확인할 수 있는 모델로 이용되고 있다(Seo 등, 2015). 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물 250 μg/mL 처리군은 대조군에 비해 7.1% 증가한 GFP의 발현율을 나타내었으며, 500 μg/mL 처리군은 14.29% 증가한 SOD-3::GFP의 발현율을 나타내었다(Flg. 6). 따라서 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물은 형질전환된 CF1553 선충 내 SOD- 3::GFP의 발현율을 농도 의존적으로 증가시켜 산화적 스트레스에 대한 저항성을 높여주는 것으로 확인되었다. Lipofuscin은 세포 손상의 마커 중 하나로, lipofuscin의 축적은 ROS의 발생량을 증가시켜 노화를 촉진하는 원인 중 하나로 알려져 있다(Terman 등, 2006). 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물이 선충에게 lipofuscin의 축적에 미치는 영향을 확인한 결과 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물 250 μg/mL 투여군에서 lipofuscin의 축적을 6.72% 감소시켰으며, 500 μg/mL 투여군에서는 lipofuscin의 축적을 7.58% 감소시켰다(Fig. 7). Kim 등(1989)은 인삼 에탄올 추출물을 장기간(31주) 투여한 쥐의 간과 뇌조직에서의 lipofuscin 축적이 감소함을 확인하여 인삼 에탄올 추출물의 지질대사 개선과 항산화 활성을 보고하였다. 따라서 발효새싹인삼 methylene chroride 분획물은 노화의 원인 중 하나인 lipofuscin의 축적을 감소시켜 노화 예방에 일부 도움을 줄 것으로 사료된다.

Fig 6. Effects of methylene chloride fraction of the fermented sprout ginseng on the expression of SOD-3 (CF1553) in transgenic nematodes. (A) Images of SOD-3::GFP expressions of CF1553 nematodes in presence or absence of the methylene chloride fraction of fermented sprout ginseng. (B) The mean GFP-expressing intensity of CF1553 mutants was expressed as mean SEM of values from 90 worms per each experiment. Data are expressed as the mean±standard deviation of three independent experiments (N=3). Differences compared with the control were considered significant at ^*P<0.05 and ^**P<0.01 by one-way ANOVA.

Fig 7. Effects of fermented sprout ginseng methylene chloride fraction on the lipofuscin accumulation in wild-type N2 nematodes. (A) Fluorescence intensity was measured by determining pixel intensity in worm’s intestines using ImageJ software. (B) Image of auto fluorescence within the nematode intestine from lipofuscin accumulation of worms on the 8th adult days. Mean fluorescence intensity of lipofuscin accumulation was expressed as mean±SEM. Differences compared to the control were considered significant at ^*P<0.05 and ^**P<0.01 by one-way ANOVA.

수명연장 효능평가 및 열 스트레스 저항성 평가

발효새싹인삼 추출물과 분획물이 선충의 수명에 미치는 영향을 확인한 결과, n-hexnae 분획물을 제외한 에탄올 추출물은 4.67%, methylene chloride 분획물은 15.24%, ethyl acetate 분획물은 6.61%, n-butanol 분획물은 2.30% 증가한 수명연장 효과를 나타내어 methylene chloride 분획물이 선충의 수명을 유의적으로 증가시켰다. 대조군 선충의 평균 수명은 9.4±0.2일이었으며, 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물을 처리한 선충의 평균 수명은 10.8± 0.2일로 15.24% 증가한 수명연장 효능을 나타내었다(Fig. 8, Table 5). Lee 등(1995)에 따르면 노화 촉진 생쥐에게 백삼과 홍삼추출물을 투여하였을 때 홍삼추출물 투여군이 백삼추출물 투여군과 비교하였을 때 약 17% 증가한 수명연장 효능을 나타내었으며, 최종 생존 10% 평균수명에서는 백삼과 홍삼추출물 투여군이 대조군에 비해 약 4.5% 증가한 수명연장 효능을 나타내었다고 보고하여 백삼과 홍삼의 장기간 급여가 평균수명을 연장한 것으로 사료된다고 보고하였다. 선충의 수명연장은 스트레스와 밀접한 관련이 있으므로 열 스트레스 대한 저항성을 평가하였다(Lithgow 등, 1995; Zhang 등, 2009). 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물의 선충에 대한 열 스트레스 저항성에 미치는 영향을 확인하기 위해 선충에게는 고온 조건인 36°C에서 배양하여 시간대별로 생존율을 관찰한 결과 대조군은 3시간 만에 사망하여 13시간에 모두 사망한 반면, 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물 250, 500 μg/mL 투여군은 4시간째부터 사망하여 각각 15, 16시간까지 생존하였다. 대조군 선충의 평균 생존시간은 7.8±0.6시간으로 측정되었으며, 250 μg/mL 투여군의 평균 생존시간은 9.8±0.6시간으로 22% 증가한 생존율을 나타내었고, 500 μg/mL 투여군의 평균 생존시간은 9.9±0.6시간으로 26.7% 증가한 생존율을 나타내었다(Fig. 9, Table 6). Hong 등(2006)에 따르면 고온 환경에 노출된 흰쥐의 경우 백삼과 홍삼 추출물 투여군의 간 지질과산화가 억제되는 것을 확인하여 인삼의 생체항상성 유지 효과를 보고하였다. 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물은 선충의 수명연장에 도움을 주고 고온에 노출된 선충의 수명을 유의적으로 증가시키는 것으로 확인되었다.

Fig 8. Effects of the fractions from fermented sprout ginseng on the lifespan of wild-type N2 nematodes. Worms were grown in the NGM agar plate at 20°C in the absence or presence of fractions. The number of worms used per each lifespan assay experiment was 45∼47 and three independent experiments were repeated (N=3). (A) The mortality of each group was determined by daily counting of surviving and dead animals. (B) The mean lifespan of the N2 worms was calculated from the survival curves. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test. Error bars represent the standard error of mean (SEM). Differences compared to the control were considered significant ^**P<0.01 and ^***P<0.001 by one-way ANOVA.

Fig 9. Effects of methylene chloride-soluble fraction from the fermented sprout ginseng on the thermal stress tolerance of wild-type N2 nematodes. To assess thermal tolerance, worms were incubated at 36°C and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test. All experiments were done in triplicates. Differences compared to the control were considered significant at ^*P<0.05 and ^**P<0.01.

Table 5

Effects of the fractions from the fermented sprout ginseng on the lifespan of wild-type N2.

Fraction	Mean lifespan (day)	Maximum lifespan (day)	Change in mean lifespan	Log-rank test
Control	9.4±0.2	16	－	－
Ethanol	9.9±0.2	16	4.67	－
n-hexane	9.4±0.2	17	－	－
Methylene chloride	10.8±0.2	20	15.2	***P<0.001
Ethyl acetate	10±0.2	18	6.61	**P<0.01
n-butanol	9.6±0.2	18	2.30	－

Mean lifespan presented as mean±SEM data. Change in mean lifespan compared with control group (%). Statistical significance of the difference between survival curves was determined by log-rank test using the Kaplan-Meier survival analysis. Differences compared to the control were considered significant at ^**P<0.01 and ^***P<0.001..

Table 6

Effects of fractions from the fermented sprout ginsengon on the stress tolerance of C. elegans.

Stress condition	Fraction	Mean lifespan (h)	Maximum lifespan (h)	Change in mean lifespan	Log-rank test
36°C	Control	7.8±0.6	13	－	－
	250 μg/mL	9.8±0.6	15	22.0	*P<0.05
	500 μg/mL	9.9±0.6	16	26.7	**P<0.01

Mean lifespan presented as mean±SEM data. Changes in mean lifespan were compared with control group (%). Statistical significance of the difference between survival curves was determined by log-rank test using the Kaplan-Meier survival analysis. Differences compared to the control were considered significant at ^*P<0.05 and ^**P<0.01..

본 연구에서는 유산균 발효를 통한 새싹인삼 내 기능성 성분(GABA, ornithine, saponin, polyphenol)의 함량을 확인한 후 에탄올을 용매로 발효새싹인삼을 추출하고 이어 n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate, n-butanol 순으로 분획하여 항산화 및 항노화 활성을 측정하였다. 유산균에 의해 발효된 새싹인삼은 발효되지 않은 새싹인삼에 비해 GABA와 ornithine의 함량이 증가하였다. 또한 고분자의 ginsenoside는 발효과정 중 compound K 등으로 저분자화되었다. 발효새싹인삼 추출물 및 분획물의 DPPH 라디칼, ABTS 라디칼 소거 활성 측정 결과 methylene chloride 분획물에서 가장 우수한 항산화 활성이 나타남을 확인하였다. 발효새싹인삼 methylene chloride 분획물은 예쁜꼬마선충 내 항산화 효소인 SOD와 catalase의 활성을 농도 의존적으로 증가시켰으며, 선충 체내에 발생하는 ROS의 양을 감소시켰다. 또한 형질전환된 SOD-3::GFP를 포함한 GFP- fused transgenic strain CF1553 선충 체내의 GFP의 발현율을 농도 의존적으로 증가시켜 산화적 스트레스에 대한 저항성을 높여주는 것을 확인하였다. 발효새싹인삼 methylene chlordie 분획물은 예쁜꼬마선충의 수명을 유의적으로 증가시켰으며, 선충에게는 고온 조건인 36°C에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 생존율을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 노화를 촉진하는 lipofuscin의 축적을 농도 의존적으로 감소시켰다. 이와 같은 결과를 종합하였을 때 본 연구에서 개발한 새싹인삼 발효물은 기능성물질인 GABA, ornithine, 저분자의 saponin 등을 함유하고 있고 항산화와 항노화 효능이 우수하여 기능성 식품 및 프리미엄 사료 개발 등 다방면으로 적용이 가능하여 새싹인삼의 활용성을 높일 수 있을 것으로 사료된다.

본 연구는 2022년도 중소벤처기업부의 기술개발사업 지원에 의한 연구임(S3268446).