면역이란 외부에서 침입하는 각종 병원균, 바이러스 등으로부터 스스로를 보호하기 위해 인식 후 제거하는 자기방어 체계이다. 인체 면역계는 단핵구, 호중구, 호산구, 호염구 등 백혈구, 대식세포 및 자연살해세포 등의 상호작용에 의해 그 체계가 유지된다(Seo 등, 2022). 인체 면역 반응은 선천 면역(innate immune response)과 적응 면역(adaptive immune response)으로 구별하고, 선천적 면역은 감염에 대한 경험이 없는데도 직접적으로 신속하게 반응하여 1차 방어 역할을 하는 면역 반응으로 비특이적 면역(non-specific immunity)이라고도 한다(Seo 등, 2022). 인체에 광범위하게 분포된 대식세포는 선천 면역에 관여하며, 바이러스 등 외부 항원을 포식하고 면역 조절 인자인 nitric oxide(NO)와 tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β), interleukin-6(IL-6)와 같은 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 생산하여 생체 방어에 중요한 역할을 한다(Heo와 Jung, 2021). 따라서 NO, TNF-α, IL-1β, IL-6 등은 면역증진 효과를 알아보는 중요한 바이오마커로 사용되고 있고, 이들 물질을 증가시킬 수 있는 천연물 및 식이소재 개발에 관한 연구들이 활발하게 진행되고 있다(Heo와 Jung, 2021; Seo 등, 2022).

새싹보리에는 풍부한 비타민과 엽록소, 항산화 성분 등이 함유되어 있어 세포 내 활성산소를 제거하거나 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하고 외부 자극에 대한 면역력을 높이는 데 도움을 주어 면역력 강화 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Seo 등, 2022). 새싹보리 식이섬유인 beta-glucans 등은 유산균의 먹이인 프리바이오틱스(prebiotics)로 이용할 수 있다는 것이 알려져 있다(Lam과 Cheung, 2013).

프로바이오틱스(또는 유산균) 유래 세포막 소포체(membrane vesicle, EV)는 나노입자(nanoparticle) 수준 크기의 포스트바이오틱스 전달체로서 유용한 포스트바이오틱스 성분, 식물 발효 시 식물 기능(지표) 성분 등을 EV 내부에 담아서 장점막하의 상피세포나 하부조직으로 전달한다(Kim 등, 2022). 김치 유산균인 Lactiplantibacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Latilactobacillus curvatus 유래 EV는 면역증진 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Kim 등, 2022; Liu 등, 2018).

고구마껍질에는 inulin, kestose, levanbiose 등 올리고당이 함유되어 있어 프리바이오틱스로 사용될 수 있고(Carlson 등, 2017), 면역증진 효과도 있다(Jeong 등, 2020). 면역증진 효과가 있으면서 유산균의 먹이가 될 수 있는 도라지, 더덕 그리고 고구마껍질 등을 이용한 최적 배합비를 가진 식물혼합물을 개발하는 연구도 보고되었다(Jeong 등, 2020).

새싹보리의 면역증진 효과를 강화하기 위해 면역증진 효과를 가진 식물혼합물 및 유산균 EV를 활용한 연구는 전무하다. 따라서 본 연구에서는 새싹보리와 면역증진 효과가 있으면서 유산균의 먹이가 될 수 있는 올리고당을 함유한 식물혼합 추출물에 면역증진 효과를 가진 EV를 생산하는 유산균을 접종하여 발효시킨 소재의 최적 발효 조건 및 면역증진 효과를 평가하고자 하였다. 본 연구 결과가 새싹보리를 기능성 소재로 활용하는 데 도움이 되길 기대한다.

실험 재료

본 연구에 사용된 새싹보리는 전라북도 고창에서 유기농으로 재배하였다. 약 20 cm로 자란 새싹보리를 수확하여 건조한 후 분쇄하여 121°C, 15분 살균한 뒤 냉각해 발효에 사용하였다. 식물혼합물 추출물 제조에 사용한 도라지(Platycodon grandiflorum)와 더덕(Codonopsis lanceolata)은 전라남도 화순군에서 생산한 것을 구입하여 세척하였고, 고구마는 전라북도 고창군에서 생산한 것으로 세척 후 1~5 mm 두께로 껍질을 벗겼다. 수분을 제거한 후 도라지와 더덕은 슬라이스로 잘랐고, 고구마껍질은 그대로 50°C에서 건조하였다. 건조 후 분쇄한 분말 시료는 본 연구진이 개발한 최적 배합비(Jeong 등, 2019, 2020)를 응용하여 도라지 분말:더덕 분말:고구마껍질 분말을 1:1:3으로 혼합(식물혼합물)하였다. 이들 식물혼합물에 음용수를 시료의 20배 더하여 추출기(TP-1002, Foshan Shunde Litlon Electrical Appliance)로 80°C에서 3시간 추출하였고, 1시간 방치 후 커피 여과지(FINE Coffee filters #4, B.V. Filtropa)로 여과한 후 식물혼합 추출물이라 하였다. 배추는 세척하여 물기를 제거한 후 70% 주정이 든 분무기로 배추 표면에 골고루 뿌린 후 30분간 실온에 방치한 후 물로 씻어 헹군 배추를 분쇄하여 사용하였다.

유산균 배양과 유산균 접종을 위한 새싹보리 시료 준비 및 발효

Lactiplantibacillus plantarum KCTC3104(Lp), Leuconostoc mesenteroides KCTC3530(Lm), Latilactobacillus curvatus KCTC3767(Lc) 그리고 Latilactobacillus sakei KCTC3603(Ls) 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다. 유산균 접종을 위한 시료는 50 mL 코니칼 튜브(conical tube)에 Lp, Lm, Lc, Ls를 접종하기 위해 Table 1과 같이 준비하였다.

Table 1

Composition of barley sprout mixtures.

Samples	Ingredient
	Barley sprout powder (g)	Plant mixture extract (mL)	Water (mL)	Crushed kimchi cabbage (g)	Lp	Lm	Lc	Ls
F1-Con	7	35
F1-Lp	7	35			104 CFU/g
F1-Lm	7	35				104 CFU/g
F1-Lc	7	35					104 CFU/g
F1-Ls	7	35						104 CFU/g
F2-Con	7		35
F2-Lp	7		35		104 CFU/g
F2-Lm	7		35			104 CFU/g
F2-Lc	7		35				104 CFU/g
F2-Ls	7		35					104 CFU/g
F3-Con	7	35		5
F3-Lp	7	35		5	104 CFU/g
F3-Lm	7	35		5		104 CFU/g
F3-Lc	7	35		5			104 CFU/g
F3-Ls	7	35		5				104 CFU/g
F4-Con	7		35	5
F4-Lp	7		35	5	104 CFU/g
F4-Lm	7		35	5		104 CFU/g
F4-Lc	7		35	5			104 CFU/g
F4-Ls	7		35	5				104 CFU/g
F5-Con	7	35
F5-Lp＋Lm	7	35			104 CFU/g	104 CFU/g
F5-Lp＋Lc	7	35			104 CFU/g		104 CFU/g
F5-Lm＋Lc	7	35				104 CFU/g	104 CFU/g
F5-Lp＋Lm＋Lc	7	35			104 CFU/g	104 CFU/g	104 CFU/g
F6-Con	7		35
F6-Lp＋Lm	7		35		104 CFU/g	104 CFU/g
F6-Lp＋Lc	7		35		104 CFU/g		104 CFU/g
F6-Lm＋Lc	7		35			104 CFU/g	104 CFU/g
F6-Lp＋Lm＋Lc	7		35		104 CFU/g	104 CFU/g	104 CFU/g

Con: control, Lp: Lactiplantibacillus plantarum, Lm: Leuconostoc mesenteroides, Lc: Latilactobacillus curvatus, Ls: Latilactobacillus sakei..

Plant mixture: Platycodon grandiflorum:Codonopsis lanceolata:sweet potato peel＝1:1:3..

F(fermented)1 시료 준비를 위해 새싹보리 분말 7 g에 식물혼합 추출물 35 mL를 넣어 혼합한 후 Lp, Lm, Lc, Ls를 각각 접종하였다(F1-Lp, F1-Lm, F1-Lc, F1-Ls). F2 시료는 새싹보리 분말 7 g에 식물혼합 추출물 대신 음용수 35 mL를 넣어 혼합한 후 Lp, Lm, Lc, Ls를 각각 접종하였다(F2-Lp, F2-Lm, F2-Lc, F2-Ls).

F3 시료는 새싹보리 분말 7 g과 분쇄한 생배추 5 g에 식물혼합 추출물 35 mL를 넣어 혼합한 후 Lp, Lm, Lc, Ls를 각각 접종하였다(F3-Lp, F3-Lm, F3-Lc, F3-Ls). F4 시료는 새싹보리 분말 7 g과 분쇄한 생배추 5 g에 식물혼합 추출물 대신 음용수 35 mL를 넣어 혼합한 후 Lp, Lm, Lc, Ls를 각각 접종하였다(F4-Lp, F4-Lm, F4-Lc, F4-Ls).

F5 시료는 새싹보리 분말 7 g에 식물혼합 추출물 35 mL를 넣어 혼합한 후 F5-Lp+Lm은 Lp와 Lm을 각각 접종, F5-Lp+Lc는 Lp와 Lc를 각각 접종, F5-Lm+Lc는 Lm과 Lc를 각각 접종, F5-Lp+Lm+Lc는 Lp, Lm과 Lc를 각각 접종하였다. F6 시료는 새싹보리 분말 7 g에 음용수 35 mL를 넣어 혼합한 후 F6-Lp+Lm은 Lp와 Lm을 각각 접종, F6-Lp+Lc는 Lp와 Lc를 각각 접종, F6-Lm+Lc는 Lm과 Lc를 각각 접종, F6-Lp+Lm+Lc는 Lp, Lm과 Lc를 각각 접종하였다. 각각의 시료는 3개씩 준비하였다. 발효전 시료는 vortex mixer(VM-10, WiseMix)로 1분간 혼합하였다. 모든 시료에 접종한 유산균의 최종 수 10⁴ colony forming units(CFU)/g이었다. 유산균을 접종한 시료는 37°C에서 3일간 배양하였다. 접종 전의 모든 실험 시료는 유산균이 검출되지 않았다(데이터 미제시).

새싹보리 발효물의 유산균 수 측정과 세포에 처리할 시료 준비

유산균을 접종하여 3일간 배양한 새싹보리 발효물의 유산균 수를 측정하였다. 유산균 수 측정은 Lactobacilli MRS agar plate(BD Difco^TM)를 사용했으며, 37°C에서 48시간 배양 후 형성된 colony 수를 반복 계수하여 평균값을 구해 CFU/g으로 표시하였다.

RAW264.7 대식세포에 처리할 시료를 확보하기 위해 발효가 완료된 시료는 원심분리(4,000×g, 15 min)하여 상층액을 얻은 후 동결건조하였다. 동결건조 시료는 Table 1의 시료 라벨인 F1 대신 Fig. 1~5의 시료 라벨인 FD(freeze drying)1로 표시, 즉 F1-Lm은 Lm을 접종한 새싹보리 발효물이고 이들 발효물의 상층액을 동결건조한 시료는 FD1-Lm으로 표시하여 구별하였다.

Fig 1. The effect of fermented barley sprout on the cell viability of RAW264.7 macrophages. The samples represent the fermented products of barley sprout mixture shown in Table 1. The viability was measured by MTT assay. The RAW264.7 cells were treated with the sample or LPS for 24 h. The values are expressed as mean±SD (n=3). NS: Not significant from each other, as determined by Duncan’s multiple range test.

Fig 2. Effect of fermented barley sprout on the production of NO in RAW264.7 macrophages. The samples represent the fermented products of barley sprout mixture shown in Table 1. The values are expressed as mean±SD (n=3). Means with different letters (a-o) significantly differ from each other (P<0.05), as determined by Duncan’s multiple range test.

Fig 3. Effect of fermented barley sprout on the production of TNF-α in RAW264.7 macrophages. The samples represent the fermented products of barley sprout mixture shown in Table 1. The values are expressed as mean±SD (n=3). Means with different letters (a-o) significantly differ from each other (P<0.05), as determined by Duncan’s multiple range test.

Fig 4. Effect of fermented barley sprout on the production of IL-1β in RAW264.7 macrophages. The samples represent the fermented products of barley sprout mixture shown in Table 1. The values are expressed as mean±SD (n=3). Means with different letters (a-m) significantly differ from each other (P<0.05), as determined by Duncan’s multiple range test.

Fig 5. Effect of fermented barley sprout on the production of IL-6 in RAW264.7 macrophages. The samples represent the fermented products of barley sprout mixture shown in Table 1. The values are expressed as mean±SD (n=3). Means with different letters (a-s) significantly differ from each other (P<0.05), as determined by Duncan’s multiple range test.

세포주 배양

마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. RAW264.7 세포는 10% 비활성화 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS; WelGene Co.) 용액 및 1% penicillin과 streptomycin(PEST; WelGene Co.) 용액을 함유한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (WelGene Co.) 배지를 이용하여 37°C, 5% CO₂가 공급되는 배양기(Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였다.

RAW264.7 대식세포의 생존율, NO 생성량 및 사이토카인 생성량 측정

세포 생존율을 알아보기 위해 RAW264.7 세포를 1×10⁴ cells/well로 96-well plate에 분주하여 24시간 배양한 후 FBS가 함유되지 않은 serum-free medium(SFM)으로 교체한 다음 2시간 더 배양하였다. Table 1에 제시한 새싹보리 혼합물 조성물을 발효한 후 상층액을 동결건조한 시료를 세포 생존율을 알아보기 위해서 각 시료당 100~1,000 μg/mL 농도로 준비하여 세포에 처리하였고 24시간 더 배양하였다. 세포 생존율은 Jeong 등(2019)이 사용한 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheylterazolium bromide(MTT; Sigma-Aldrich Co.) 환원 방법을 이용하여 측정하였다. 면역증진 효과를 알아보기 위한 양성대조군으로 lipopolysaccharide(LPS; 0.05 μg/mL, Sigma-Aldrich Co.)를 시료 대신 처리하였다.

시료 또는 LPS 처리 24시간 후 5 mg/mL MTT 용액과 SFM 배지를 1:10의 비율로 섞은 배지와 교체하였다. 37°C, 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 4시간 방치 후 MTT를 환원시켜 생성된 formazan을 남기고 배지는 조심스럽게 제거하였다. 빛을 차단한 실온에서 30분간 방치하여 남아 있는 배지를 제거한 다음 dimethyl sulfoxide(DMSO; Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 용해한 시료를, DMSO를 blank로 하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(%)은 시료 처리군의 흡광도를 대조군의 흡광도로 나누어 100을 곱한 값이다.

NO 및 사이토카인 생성량 측정을 위해 RAW264.7 세포를 5×10⁵ cells/well로 24-well plate에 분주하여 48시간 배양한 후 SFM 배지로 교체한 후 2시간 동안 더 배양하였다. 다양한 농도의 시료를 18시간 처리하였다.

RAW264.7 세포로부터 생성된 NO의 양은 세포배양액 0.5 mL에 동량의 Griess 시약(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid와 1% α-naphtylamide in H₂O) 0.5 mL를 넣고 혼합하여 빛을 차단한 후 10분간 실온에서 방치한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrate로 표준 곡선을 작성하여 NO 함량을 산출하였다.

세포배양액 중 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 측정은 ELISA kit(eBioscience Inc.)을 이용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 측정하였다.

통계처리

모든 분석 수치는 평균(mean)±표준편차(standard deviation)로 표시하였다. 수집된 결과는 SPSS(statistical package for the social science) version 18.0 프로그램(SPSS Inc.)을 이용하여 분석하였다. 각 처리군의 평균 차이를 비교하기 위해 one-way AVOVA로 유의성을 확인한 후 Duncan’s multiple range test를 이용하여 사후 검증했으며, P<0.05 수준에서 유의성 여부를 검증하였다.

새싹보리 유산균 발효물의 유산균 수

본 연구에서는 새싹보리에 면역증진 효과를 증가시키고자 첫째, 배양 중에 면역증진 효과가 있는 세포밖 소포체(EV)를 생산하는 유산균인 Lactiplantibacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides 그리고 Latilactobacillus curvatus(Kim 등, 2022)를 이용하여 새싹보리를 발효하는 방법을 선택하였다. 더하여 대표적인 김치 유산균인 Latilactobacillus sakei 균주도 발효에 사용하였다. 새싹보리 발효물에는 이들 유산균의 EV가 포함되어 있어 면역증진 효과가 새싹보리 단독보다 더 뛰어나리라는 것을 예측할 수 있다. 둘째, 면역증진 효과가 있으면서 유산균의 먹이가 될 수 있는 프리바이오틱스로 활용할 수 있는 고구마껍질을 주원료로 한 식물혼합물(도라지:더덕:고구마껍질＝1:1:3)의 물 추출물(Jeong 등, 2020)을 이용하여 발효에 도움을 주고 면역증진 효과를 강화하였다. 셋째, 접종한 유산균이 김치 유산균이라 발효의 조건을 향상시키고 접종하지 않은 다른 배추 유래 유산균이 새싹보리 발효물의 면역증진 효과에 미치는 영향을 알아보기 위해 배추를 갈아 넣었다. 김치 유산균은 배추와 마늘에서 유래되고, 배추에서 유래한 미생물에 의해 발효된 김치에서는 Leuconostoc gelidum 등 ‘Leuconostoc’ 균주, Weissella koreensis 등 ‘Weissella’ 균주, Latilactobacillus sakei 등 ‘Lactobacillus’ 균주가 우세한 군집을 이룬다(Song 등, 2020). 넷째, 유산균 1종류(Lp, Lm, Lc, Ls), 2종류(Lp+Lm, Lp+Lc, Lm+Lc) 그리고 3종류(Lp+Lm+Lc) 접종 시 발효에 미치는 영향 및 발효된 새싹보리의 면역증진 효과를 알아보았다.

본 연구에서 개발된 새싹보리 발효물은 낮은 수율 등으로 식물혼합물의 물 추출물로 개발하지 못하는 저렴한 분말 제품 개발 등 다양한 제품 개발이 가능한 면역증진 기능성 소재로 활용할 수 있다고 생각된다. 따라서 먼저 발효 정도를 알아보기 위해 발효된 시료의 유산균 수를 측정하였다.

Table 1 조성물을 37°C에서 3일간 발효시킨 후 유산균 수를 측정한 결과는 Table 2와 같다. 10⁹ CFU/g 이상 유산균 수를 가진 시료는 F1-Lm(2.25×10⁹ CFU/g), F2-Lm(1.14×10⁹ CFU/g), F3-Lm(1.03×10⁹ CFU/g), F5-Lp+Lm+Lc(1.36×10⁹ CFU/g), F5-Lp+Lc(1.02×10⁹ CFU/g), F6-Lp+Lm+Lc(1.40×10⁹ CFU/g) 그리고 F6-Lp+Lc(1.01×10⁹ CFU/g)였고, 7종류 시료 외는 유산균 수가 10⁹ CFU/g 이하였다. F4-Lm 시료의 유산균 수는 0.72×10⁹ CFU/g으로 유산균 수가 10⁹ CFU/g보다는 적지만 전체 시료의 발효 경향을 비교했을 때 발효가 효과적이었다는 것을 알 수 있었다. 즉, Lm 접종 단독 시료(F1-Lm, F2-Lm, F3-Lm, F4-Lm) 및 Lm과 함께 Lp와 Lc를 동시에 접종한 시료(F5-Lp+Lm+Lc, F5-Lp+Lm+Lc)에서 발효가 효과적이었다. Lm은 새싹보리 발효에 적합한 유산균이라는 것을 알 수 있었다.

Table 2

Number of lactic acid bacteria in fermented barley sprout by lactic acid bacteria.

Samples	(×108 CFU/g)	(×109 CFU/g)
F1-Con	0.00±0.01n	0.00±0.00n
F1-Lp	1.11±0.10lm	0.11±0.01lm
F1-Lm	22.46±0.64a	2.25±0.06a
F1-Lc	8.60±0.45e	0.86±0.04e
F1-Ls	9.76±0.26d	0.98±0.03d
F2-Con	0.00±0.00n	0.00±0.00n
F2-Lp	3.72±0.27i	0.37±0.03i
F2-Lm	11.40±0.46c	1.14±0.05c
F2-Lc	3.28±0.12i	0.33±0.01i
F2-Ls	5.80±0.12h	0.58±0.01h
F3-Con	0.19±0.08n	0.02±0.01n
F3-Lp	3.71±0.13i	0.37±0.01i
F3-Lm	10.30±0.52d	1.03±0.05d
F3-Lc	8.60±0.92e	0.86±0.09e
F3-Ls	6.60±0.39g	0.66±0.04gh
F4-Con	0.15±0.06n	0.02±0.01n
F4-Lp	0.37±0.05mn	0.04±0.01mn
F4-Lm	7.24±0.97fg	0.72±0.10fg
F4-Lc	1.92±0.20kl	0.19±0.02kl
F4-Ls	2.31±0.11jk	0.23±0.02jk
F5-Con	0.00±0.00n	0.00±0.00n
F5-Lp＋Lm	1.76±0.08kl	0.18±0.01kl
F5-Lp＋Lc	10.20±0.84d	1.02±0.08d
F5-Lm＋Lc	7.50±0.76f	0.75±0.08f
F5-Lp＋Lm＋Lc	13.60±0.64b	1.36±0.06b
F6-Con	0.00±0.00n	0.00±0.00n
F6-Lp＋Lm	0.38±0.07mn	0.04±0.01mn
F6-Lp＋Lc	10.10±1.06d	1.01±0.11d
F6-Lm＋Lc	3.05±0.44ij	0.31±0.04ij
F6-Lp＋Lm＋Lc	14.00±1.12b	1.40±0.11b

Con: control, Lp: Lactiplantibacillus plantarum, Lm: Leuconostoc mesenteroides, Lc: Latilactobacillus curvatus, Ls: Latilactobacillus sakei..

Plant mixture: Platycodon grandiflorum:Codonopsis lanceolata :sweet potato peel＝1:1:3..

The values are expressed as mean±SD (n=3). Means with different letters (a-n) significantly differ from each other (P<0.05), as determined by Duncan’s multiple range test..

Lm은 Lc와 동시에 접종했을 때는 발효가 효과적이지만(F5-Lm+Lc), Lp와 동시에 접종했을 때는 발효가 효과적이지 않았다(F5-Lp+Lm). Lp는 Lc와 동시에 접종했을 때 발효가 효과적이었다(F5-Lp+Lc).

새싹보리 발효를 위해 Lm을 사용할 경우는 Lm 단독 접종, Lm, Lp 및 Lc 혼합 접종을 하는 것이 발효에 효과적이고 두 종류의 유산균 선택을 고려한다면 Lm과 Lc가 효과적이라는 것을 알 수 있었다. 식물혼합 추출물을 물 대신에 더했을 때 발효가 더 잘 되는 경향이 있었고, 이런 경향은 단독 유산균 접종 시료에서 더 뚜렷하였다(Table 2). 3종의 유산균을 접종한 시료에서는 음용수 대신 식물혼합 추출물 첨가에 의한 유산균 수에 대한 영향은 유의적인 차이가 없었다(Table 2).

유산균을 접종하지 않고 배추를 넣은 대조군 F3-Con과 F4-Con의 유산균 수는 0.19×10⁸ CFU/g과 0.15×10⁸ CFU/g으로 이들 대조군 시료에 유산균이 성장하고 있었고, F3-Con과 F4-Con 간의 유산균 수의 유의적 차이는 없었다(Table 2).

이들 결과를 종합하면 첫째, F1~F4 시료에서 단일 유산균 접종으로 새싹보리 혼합물 발효를 가장 효과적으로 유도하는 유산균은 Lm이라는 것을 알 수 있었다. 둘째, Lm은 새싹보리 분말에 음용수를 넣어 걸쭉하게 만들어 접종하는 것보다 새싹보리 분말에 음용수 대신 식물혼합 추출물을 넣어 걸쭉하게 만들어 Lm을 접종하여 배양하는 것이 더 발효가 효과적인 것을 알 수 있었다. 셋째, 배추를 넣을 경우 배추에서 유래하는 유산균이 있고, 이들 유산균이 새싹보리 혼합물 발효에 접종 유산균과 함께 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. Lm 접종 시료는 배추를 넣을 경우 유산균 총수는 감소하였는데, 이는 배추를 넣은 시료는 배추에서 유래된 ‘Leuconostoc’, ‘Weissella’, ‘Lactobacillus’ 균주(Song 등, 2020)가 접종한 유산균 외에 새싹보리 혼합물 발효에 영향을 미쳤을 것으로 생각된다. 넷째, 2종 이상의 유산균을 동시에 접종할 경우 Lm과 Lc를 동시에 접종하거나 Lm, Lp 그리고 Lc를 동시에 접종했을 때 발효가 효과적이라는 것을 알 수 있었다.

Song 등(2020)의 연구에 따르면 방사선 멸균 처리한 원‧부재료로 김치를 제조하여 발효하면 발효 기간에 류코노스톡 속, 와이셀라 속, 락토바실러스 속, 슈도모나스 속, 엔테로박터 속, 리조비움 속, 클레브시엘라 속 등 미생물 군집을 확인했다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서 배추를 발효하기 위한 시료에 첨가하기 전에 70% 주정으로 배추 표면에 있을 유해균을 제거한 후 물에 씻어 헹구는 공정이 있었지만, 본 연구에 사용된 배추에서 접종하지 않은 유산균이 유래되었을 것으로 생각된다. 새싹보리와 배추를 혼합하여 유산균을 접종하지 않은 시료의 발효물인 F4-Con에서 유산균이 확인되었으나 배추를 넣지 않고 새싹보리만 발효한 시료인 F2-Con에서는 유산균이 확인되지 않았다. 그러나 70% 주정으로 처리한 후 물로 씻어 헹군 배추를 발효하면 발효 기간에 유산균이 얼마큼 생존하는지와 어떤 종류의 유산균이 생존하는지에 관한 연구는 진행되어야 할 것이다.

계속되는 실험에서는 새싹보리 발효물의 면역증진 효과를 알아보기 위해 NO 및 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6) 생성량을 알아보았다.

새싹보리 유산균 발효물이 세포 생존율 및 NO 생성에 미치는 영향

새싹보리와 식물혼합 추출물(F1), 새싹보리와 음용수(F2), 새싹보리와 간 배추에 식물혼합 추출물을 더한 것(F3), 새싹보리와 간 배추에 음용수를 더한 것(F4)에 Lp, Lm, Lc, Ls 각각 유산균을 단독 접종했을 때 Lm이 Lp, Lc, Ls를 각각 단독 접종했을 때보다 시료의 유산균 수가 현저하게 높았다. 따라서 세포실험에서는 F1-Lm, F2-Lm, F3-Lm, F4-Lm 시료를 발효하여 원심분리 후 상층액을 동결건조한 시료 FD1-Lm, FD2-Lm, FD3-Lm, FD4-Lm을 사용하였고, 2종 이상 유산균을 동시에 접종한 시료도 Lm이 포함된 F5-Lp+Lm, F5-Lm+Lc, F5-Lp+Lm+Lc, F6-Lp+Lm, F6-Lm+Lc, F6-Lp+Lm+Lc 시료를 발효하여 원심분리 후 상층액을 동결건조한 시료인 FD5-Lp+Lm, FD5-Lm+Lc, FD5-Lp+Lm+Lc, FD6-Lp+Lm, FD6-Lm+Lc, FD6-Lp+Lm+Lc를 사용하였다. 무처리군은 대조군(Con)으로 표시하였고, FD1, FD2, FD3, FD4, FD5, FD6와 조성과 실험 방법은 동일하지만, 유산균을 접종하지 않은 대조군은 FD1-Con, FD2-Con, FD3-Con, FD4-Con, FD5-Con, FD6-Con이라 하였다.

유산균을 접종하지 않은 시료인 대조군의 농도는 500 μg/mL, 2종 이상 유산균을 동시에 접종한 시료의 농도는 500 μg/mL까지, Lm만 접종한 시료는 1,000 μg/mL까지 RAW 264.7 대식세포에 시료를 처리하였다. Lm 접종 새싹보리 유산균 발효 시료는 100, 500, 1,000 μg/mL의 농도를 RAW 264.7 대식세포에 24시간 처리한 결과 100~1,000 μg/mL 처리 농도에서는 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다(Fig. 1). 2종 이상 유산균 접종 새싹보리 유산균 발효 시료도 100과 500 μg/mL 처리 농도에서 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다(Fig. 1). 따라서 Lm 접종 새싹보리 유산균 발효 시료는 농도 1,000 μg/mL까지, 2종 이상 유산균 접종 새싹보리 유산균 발효 시료는 농도 500 μg/mL까지 계속되는 실험에 사용하였다.

새싹보리 유산균 발효물을 RAW264.7 대식세포에 처리했을 때, NO 생성량에 미치는 영향을 알아본 결과는 Fig. 2와 같다. 시료 처리 농도는 FD1-Lm, FD2-Lm, FD4-Lm은 100, 500, 1,000 μg/mL로 하였고, FD3-Lm은 예비실험에서 다른 처리군보다 현저하게 높은 면역증진 효과가 있어 저농도인 10 μg/mL를 추가하여 10, 100, 500 μg/mL 처리 농도를 사용하였다.

FD3-Lm의 10, 100, 500 μg/mL 농도 처리군에서 NO 함량은 1.24, 2.05, 2.27 μg/mL로 다른 처리군과 비교하여 현저하게 높았다(Fig. 2). 1,000 μg/mL 농도 FD1-Lm, FD2-Lm, FD4-Lm 처리군에서 NO 농도는 각각 0.41, 0.53, 0.67 μg/mL였다(Fig. 2). 유산균을 2종 이상 동시에 접종한 후 발효한 새싹보리 유산균 발효물 처리는 새싹보리 Lm 유산균 접종 발효물 처리군과 비교하여 RAW264.7 대식세포에서 NO 생성 증가에 미치는 영향은 적었다. FD1-Lm과 FD2-Lm을 비교한 결과 음용수 대신 면역증진 효과가 알려진 식물혼합물(도라지:더덕:고구마껍질＝1:1:3)의 물 추출물 첨가가 NO 생성량을 증가시키지 못하였으나, 배추를 넣었을 때는 다른 결과를 보여 주었다. 즉, RAW264.7 대식세포에서 새싹보리, 배추, 식물혼합 추출물을 혼합한 시료에 Lm을 접종시켜 발효한 시료 처리군(FD3-Lm 500)은 새싹보리, 배추, 음용수를 혼합한 시료 Lm 접종 발효물 처리군(FD4-Lm 500)보다 NO 생성량이 10.3배 증가하였고, Lm 유산균 접종 없이 새싹보리, 배추, 식물혼합 추출물을 혼합한 발효 시료(FD3-Con 500)보다 4.8배 증가하였다. Lm 유산균을 접종하지 않은 FD3-Con 500 μg/mL 농도 처리군에서 NO 함량이 0.47 μg/mL로 NO 함량이 높은 것은 배추에서 유래된 유산균, 이들 유산균에 의한 새싹보리 및 식물혼합물의 발효산물의 영향일 것으로 생각된다.

NO 생성량에 대한 결과에서 새싹보리, 배추, 식물혼합 추출물에 Lm을 접종하여 37°C에서 3일 동안 발효시켰을 때 면역증진 효과가 뛰어난 면역증강 소재가 생산된다는 것을 알 수 있었다. 이들 발효물이 면역증진 효과를 나타내는 이유는 배추에서 유래된 유산균이 관여할 것으로 생각되고, 이것들에 대한 더 깊이 있는 연구가 수행되어야 할 것이다.

김치에서 분리한 Leuconostoc 속 유산균의 면역증진 효과를 알아본 연구에서 Leuconostoc mesenteroides DH34의 열처리한 균체산물을 RAW264.7 대식세포에 처리한 결과 Leuconostoc kimchii WK18과 Leuconostoc citreum DH33의 열처리한 균체산물을 처리했을 때보다 NO 농도가 유의적으로 높았고, Leuconostoc mesenteroides DH34 처리군은 면역 효과가 뛰어나다고 알려진 Lactobacillus rhamnosus GG 처리군보다 NO 함량이 더 높았다(Ahn 등, 2012). RAW264.7 대식세포에 김치에서 분리된 Leuconostoc mesenteroides SE24와 Leuconostoc mesenteroides GY7의 열처리한 균체산물 처리는 Leuconostoc mesenteroides DH34의 열처리한 균체산물 처리군보다 현저하게 낮은 NO 생산량을 보여 주었다(Ahn 등, 2012). 따라서 Leuconostoc mesenteroides는 면역증진 효과를 나타내는 유산균이지만 균주명에 따라 면역증진 효과에 차이가 있는 것으로 생각된다.

새싹보리 유산균 발효물이 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6) 생성에 미치는 영향

RAW264.7 대식세포에 새싹보리 유산균 발효물 처리가 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성량에 미치는 영향은 Fig. 3~5와 같다. 양성대조군으로 RAW264.7 대식세포에 LPS 0.05 μg/mL 처리 시 TNF-α, IL-1β 및 IL-6가 다량 분비되었다(Fig. 3~5).

RAW264.7 대식세포에 500과 1,000 μg/mL FD1-Lm, FD2-Lm, FD3-Lm 및 FD4-Lm 처리군은 모두 무처리군인 대조군에 비해 TNF-α 함량이 현저하게 높았고, 500 μg/mL 농도 처리군에서 FD3-Lm(950.8 pg/mL)> FD1-Lm(840.6 pg/mL)> FD4-Lm(746.5 pg/mL)> FD2-Lm(635.4 pg/mL) 순으로 함량이 높았고, 이들 처리군 간의 유의적 차이가 있었다(Fig. 3). 500 μg/mL 농도 처리군에서 TNF-α 함량을 알아본 결과 새싹보리에 식물혼합물을 첨가한 시료에 Lm만 접종한 발효물(FD1-Lm)은 식물혼합물을 더하지 않고 발효한 시료(FD2-Lm)보다 TNF-α 함량이 유의적으로 높았고, 새싹보리에 식물혼합물과 배추를 첨가한 시료의 발효물(FD3-Lm)은 FD1-Lm과 FD2-Lm보다 TNF-α 함량이 유의적으로 높았다(Fig. 3).

식물혼합물의 물 추출물 처리에 의해 RAW264.7 대식세포에서 TNF-α의 함량이 현저하게 증가하였고(Jeong 등, 2019), 식물혼합물을 사용하여 개발된 티백 침출차 추출물의 동결건조 분말도 TNF-α 함량을 현저하게 증가시켰다(Jeong 등, 2020). 이들 식물혼합물을 섭취한 마우스에서 분리한 비장세포 및 비장에서도 TNF-α의 함량이 현저하게 증가하였다(Jeong 등, 2020). Jeong 등(2019, 2020)의 연구에서 사용한 식물혼합물은 도라지 분말:더덕 분말:옥수수수염 분말:고구마껍질 분말을 1:1:0.5:3으로 혼합한 것이고 본 연구에서 사용한 식물혼합물은 옥수수수염 분말을 제외한 도라지 분말:더덕 분말:고구마껍질 분말을 1:1:3으로 혼합한 것이다. Jeong 등(2019, 2020)의 연구에서 사용한 식물혼합물을 사용하여 개발된 티백 침출차 추출물의 동결건조 분말을 100과 500 μg/mL 농도로 RAW 264.7 대식세포에 처리했을 때 TNF-α 생성량은 226.4와 248.3 pg/mL였다. 본 연구에서 FD3-Lm을 100과 500 μg/mL 농도로 RAW264.7 대식세포에 처리했을 때 TNF-α 생성량은 938.5와 950.8 pg/mL로 고구마껍질을 주원료로 한 식물혼합물 추출물보다 더 높았다. 따라서 면역증진 효과를 가진 식물혼합 추출물 첨가는 새싹보리 함유 발효물의 면역증진 효과를 증가시켰을 것으로 생각되지만 FD3-Lm에는 면역증진 효과를 나타내는 다른 물질도 함유되어 있을 것으로 생각된다.

Ahn 등(2012)의 연구 보고에 의하면, RAW264.7 대식세포에서 유산균 균주에 따라 NO와 IL-1β는 생산량의 차이가 현저하였으나, RAW264.7 대식세포에서 Leuconostoc mesenteroides DH34 열처리 균체산물 처리는 Leuconostoc mesenteroides SE24, Leuconostoc mesenteroides GY7, Leuconostoc kimchii WK18 및 Leuconostoc citreum DH33 처리 후 방출되는 TNF-α의 함량과 유의적 차이가 없었다(Ahn 등, 2012). 본 연구에서도 RAW264.7 대식세포에서 NO 함량은 FD3-Lm 처리군이 다른 처리군과 비교하여 현저하게 높았으나, TNF-α의 함량 변화는 처리군 간의 차이가 작았다.

RAW264.7 대식세포에 새싹보리 유산균 발효물 처리가 IL-1β 생성에 미치는 영향은 Fig. 4와 같다. FD3-Lm 처리군은 다른 처리군과 비교하여 IL-1β 생성량이 현저하게 높았다. 이는 NO 함량과 비슷한 경향이었고, FD1-Lm 처리군과 FD2-Lm 처리군을 비교해 본 결과 IL-1β 생성량은 유사하여 발효 시 음용수 대신 식물혼합물을 더한 경우 IL-1β 생성량에 영향을 미치지 않았으나, FD3-Lm 처리군과 FD4-Lm 처리군에서는 배추를 넣었을 경우는 음용수 대신 식물혼합물을 더할 때 현저하게 높은 IL-1β 생성량을 보였다. Lm과 함께 다른 유산균을 동시에 접종하여 발효한 시료에서는 Lm만 접종하여 발효시킨 시료보다 IL-1β 생성량이 적거나 유사하였다(Fig. 4).

RAW264.7 대식세포에 새싹보리 유산균 발효물을 처리했을 때 IL-6 생성에 미치는 영향은 Fig. 5와 같다. 같은 농도에서 3-Lm 처리군은 다른 처리군과 비교하여 IL-6 생성량이 현저하게 높았다. 이와 같은 결과는 NO, TNF-α와 IL-1β와 비슷한 경향이었다. FD1-Lm과 FD2-Lm 처리군의 IL-6 생성량을 비교해 본 결과 식물혼합물의 물 추출물을 음용수 대신 더한 후 발효했을 때 IL-6 생성량에 영향을 미치지 않았으나, 그 외의 시료들은 음용수 대신 식물혼합물의 물 추출물을 첨가하여 발효한 시료 처리군에서 IL-6 생성량이 높은 경향을 나타내었다(Fig. 5). IL-6 생성량은 배추를 첨가하지 않은 시료에서는 Lm 단독 처리군보다 Lm과 다른 유산균(Lp, Lc)을 동시에 접종한 새싹보리 유산균 발효물 처리군에서 더 증가하였다(Fig. 5).

유산균의 건강 유익성 중에서 면역 기능 강화 관련 관심이 증가하고 있고, 유산균이 대식세포를 자극하여 활성화되면 탐식작용, TNF-α, IL-1β, IL-6 등과 같은 사이토카인 생산, 항종양 활성 등의 기능으로 숙주로부터 몸을 보호하여 감염 예방에 중요한 역할을 한다는 다수의 보고가 있다(Ahn 등, 2012; Ben-Efraim과 Bonta, 1994). Ahn 등(2012)의 연구에서는 김치로부터 분리된 Leuconostoc strains 열처리한 균체산물이 RAW264.7 대식세포에서 NO, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성을 증가시켜 인체의 면역력을 증강시켜 주는 효과가 뛰어나다고 하였고, Lin 등(2007)의 연구에서도 열처리한 유산균 균체산물이 대식세포를 활성화하여 사이토카인 생성을 유도한다고 하였다. Hur 등(2004)의 연구에서는 김치로부터 분리한 Leuconostoc, Lactiplantibacillus, Bifidobacteria 유산균이 RAW264.7 대식세포에서 NO와 사이토카인(IL-6, TNF-α) 생성을 유도한다고 하였다. Leuconostoc mesenteroides에서 유래한 EV는 RAW 264.7 대식세포에서 NO, TNF-α 및 IL-6 생성을 증가시켰고, 마우스 모델에서는 면역증진 효과가 있었다(Kim 등, 2022). Leuconostoc mesenteroides에서 유래한 EV는 포스트바이오틱스 전달체로서 면역증진 효과를 나타내는 유용한 포스트바이오틱스 성분(Kim 등, 2022), 새싹보리, 식물혼합 추출물, 배추 등에 함유된 기능 성분들인 platycodin D, lobetyolin, chlorogenic acid, caffeic acid, lutonarin, saponarin 등(Kang, 2022; Yoon 등, 2021)이 EV에 담겨 RAW264.7 대식세포에 전달되어 면역증진 효과가 나타날 것으로 생각된다.

본 연구에서도 Leuconostoc mesenteroides, 이들 유산균이 새싹보리, 배추 등을 발효시키면서 생산하는 대사산물들, 이들 유산균 유래 세포막 소포체 등에 의해 RAW264.7 대식세포에서 NO, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성을 증가시켜 면역증진 효과를 나타낼 것으로 생각된다.

본 연구는 RAW264.7 대식세포에서 새싹보리, 식물혼합 추출물 그리고 배추의 혼합물을 이용한 유산균 발효물의 면역 활성 효과에 관한 것이다. 새싹보리 분말, 식물혼합(도라지:더덕:고구마껍질＝1:1:3) 추출물 및 분쇄한 생배추를 혼합한 후 Lm을 접종하여 발효하였다(F3-Lm). F3-Lm의 상층액을 동결건조한 시료인 FD3-Lm을 RAW264.7 대식세포에 처리한 결과 농도 의존적으로 NO, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 수준이 증가하였다. 발효 중 FD4-Lm은 식물혼합 추출물을 제외하고 FD3-Lm과 동일한 조성을 가지고 있고, RAW264.7 대식세포에서 FD4-Lm을 처리한 결과 FD3-Lm의 처리보다 NO, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 수준이 낮았다. Lm만 접종한 시료(FD1-Lm과 FD2-Lm)는 Lp, Lm 및 Lc를 함께 접종하여 발효한 FD5-Lp+Lm+Lc와 FD6-Lp+Lm+Lc보다 높은 면역증진 효과가 있었다. 이와 같은 발견은 FD3-Lm이 면역증진 효과를 가진 기능성 소재로 잠재력을 가지고 있다는 것을 시사하였다.

본 성과물은 중소벤처기업부에서 지원하는 2022년도 산학연 Collabo R&D사업(NO. S3251004)의 연구수행으로 인한 결과물임을 밝힙니다.