Ex) Article Title, Author, Keywords
Online ISSN 2288-5978
Ex) Article Title, Author, Keywords
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2023; 52(5): 492-498
Published online May 31, 2023 https://doi.org/10.3746/jkfn.2023.52.5.492
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
Hee-Young Hwang1 , Mee-Jeoung Kim1, Hye-Mi Shim1, and Woo-Sik Jeong2
1Gyeongsangbuk-do Government Public Institute of Health & Environment
2School of Food Science and Biotechnology, Food and Bio-Industry Research Institute, Kyungpook National University
Correspondence to:Woo-Sik Jeong, School of Food Science and Biotechnology, Kyungpook National University, 80, Daehak-ro, Buk-gu, Daegu 41566, Korea, E-mail: wsjeong@knu.ac.kr
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
This study aims to verify the accuracy of the UPLC-MS method for analyzing Δ-9-tetrahydrocannabinol (THC) and cannabidiol (CBD) levels. The contents were investigated in hemp seeds, hemp seed oil, and processed foods containing hemp seeds in South Korea. Our results confirmed that the method was appropriate with high selectivity, reproducibility, linearity, and recovery for both THC (94.1∼108.3%) and CBD (84.9∼109.0%). It was determined that 13 out of the 16 tested products were within the suitable range of THC and CBD levels. However, three out of nine hemp seed oil products exceeded the standards for these compounds, indicating the need for continuous monitoring. The results of our study verify and conclude the reliability of LC-MS/MS as a method for determining THC and CBD concentrations in hemp seeds and hemp seed oil.
Keywords: THC, CBD, UPLC-MS, hemp seed oil, method validation
대마(
대마는 향정신성 칸나비노이드로 인해 유럽에서는 Δ-9-tetrahydrocannabinol(THC) 함량이 0.2% 이하인 일부 제품만 산업 품종으로 재배가 허용되고 있으며, 산업용 대마 품종은 THC 함량이 낮고 cannabidiol(CBD)의 함량이 높은 것이 특징이다(Tura 등, 2023). 대마는 100가지 이상의 phytocannabinoid를 생산하며, 향정신성 및 비향정신성 2가지로 분류된다(Pisciottano 등, 2021). 대표적으로 cannabidiolic acid, tetrahydrocannabinolic acid가 있으며, 대부분 탈카르복실화되어 CBD, THC로 자연계에 존재한다(Hammami 등, 2021). 또한 CBD는 향정신성 효과를 나타내지 않고 진통제, 항염증제, 메스꺼움 억제, 항관절염제, 불안 완화, 면역 조절에 효과가 있으며, THC는 향정신적 작용을 나타내는 특징으로 인해 미국, 독일, 스위스, 벨기에, 캐나다, 호주, 뉴질랜드, 한국에서 헴프씨드와 헴프씨유에 대해 THC의 기준규격을 정하고 있다(Pannico 등, 2022). 따라서 THC와 CBD는 산업용 대마씨 및 대마씨유의 주요 바이오마커이며(Analakkattillam 등, 2022), THC를 비롯한 칸나비노이드 화합물은 꽃의 포엽에 위치한 모용에서 대부분 생산되나 씨앗과 같은 일부에도 소량의 칸나비노이드 화합물이 포함될 수 있어 관리가 필요하다(Alonso-Esteban 등, 2022).
대마에서 칸나비노이드 화합물을 정량 분석하는 방법은 액체크로마토그래피 질량분석기(high performance liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS) 및 기체크로마토그래피 질량분석기(gas chromatography mass spectrometry, GC-MS)를 활용하는 방법이 일반적으로 사용되고 있다(Jang 등, 2020; Petrović 등, 2015; Pisciottano 등, 2021). 국내에서는 식품의약품안전처 고시(식품의 기준 및 규격)에 따라 2015년(식품의약품안전처 고시 제2015-4호) 대마씨앗 및 대마씨유에 대해 THC 기준 및 GC-MS를 이용한 시험법이 처음으로 신설되었고, 그 후 2020년 10월(식품의약품안전처 고시 제2020-98호)에 CBD의 기준이 신설되고 실험법이 LC-MS/MS 분석법으로 고시가 개정되었지만, 마약류 관리에 관한 법률에 따라 THC와 CBD가 마약류로 지정이 되어 있어 국내에서 마약류 취급승인 허가를 받아야 분석이 가능하기 때문에 관련된 보고는 매우 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 국내에서 유통되고 있는 헴프씨드 및 헴프씨유, 헴프씨드가 첨가된 가공식품의 THC와 CBD 함량을 조사하고, LC-MS/MS를 활용한 THC와 CBD 분석법의 유효성을 평가하기 위해 선택성, 직선성, 검출한계, 정량한계, 회수율, 반복실험의 재현성을 확인하였다.
실험재료 및 시약
본 실험에 사용한 시료는 2021~2022년 경상북도 보건환경연구원에 의뢰된 제품을 대상으로 실험을 진행하였다. 헴프씨드 및 헴프씨유, 헴프씨드 함유 가공품은 모두 국내산 제품이었으며, 헴프씨드 4건, 헴프씨유 9건, 헴프씨드 함유 가공품 3건이었다. 표준품인 THC와 CBD는 Sigma-Aldrich 제품을 사용하였으며, 시약 및 이동상(0.1% formic acid in water, 0.1% formic acid in acetonitrile)은 MERCK의 LC-MS 등급을 사용하였다.
표준용액 제조
THC 및 CBD 표준원액(1,000 mg/L)을 메탄올로 10 mg/L 농도로 희석한 후 각각의 무처리 시료 추출물이 90% 이상 함유되도록 1~500 μg/L 농도로 희석하였다. 무처리 시료 추출물은 오일 매트릭스로 올리브유와 카놀라유를 사용하였고, 헴프씨드 및 가공식품은 콩분말을 사용하였다. 표준품 희석에 사용한 무처리 시료 추출물은 시료와 동일하게 전처리하여 사용하였다. 시료 정량에 사용한 표준용액은 헴프씨드와 가공식품이 콩분말, 헴프씨유는 올리브유를 무처리 시료 추출물로 하여 실험에 사용하였다.
LC-MS/MS 분석법 유효성 확인
식품의약품안전처 ‘식품의약품 분야 시험검사기관 품질관리를 위한 시험검사기관 유효성 확인 및 검증 안내서(MFDS, 2021)’에 기초하여 시험방법의 유효성을 확인하기 위해 선택성(selectivity), 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ), 회수율(recovery), 반복실험의 재현성(relative standard deviation, RSD)을 측정하였다. 선택성은 간섭물질의 피크와 겹치지 않고 크로마토그램의 baseline이 일정하게 유지되면서 분석하는 대상물질이 정확히 검출되는지 확인하였다. 직선성은 분석대상물질의 농도에 대해 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 것을 검증하는 것으로(Kwon 등, 2022), 1~500 μg/L 농도로 각각의 매트릭스에 대해 THC와 CBD의 검량선을 작성하여 R2를 통해 확인하였다. 검출한계 및 정량한계는 시료 중에 존재하는 분석대상물질의 검출 가능한 최소량 또는 최저농도를 뜻하며 직선성을 통해 산출된 검량선 결과에서 산출된 기울기(slope)와 표준편차를 통해 계산하였다(Kwon 등, 2022). 회수율은 500 μg/L(검출농도 25 μg/L) 농도의 THC와 CBD 표준물질을 올리브유, 카놀라유, 콩분말에 첨가(spiking)하여 3회 반복 실험했으며, 첨가한 농도에 대해 결괏값을 나누어 %로 나타내었다. 반복실험의 재현성은 동일한 농도를 5회 반복 측정하여 RSD%로 나타내었다.
THC 및 CBD 함량
THC 및 CBD 함량은 ‘식품공전(제 8. 일반시험법, 9. 식품 중 유해물질 시험법, 9.17 테트라하이드로칸나비놀 및 칸나비디올시험법)’에 따라 실험하였다. 시료 1 g에 메탄올 20 mL를 가하고 10분간 진탕한 후 10분간 초음파 추출하였다. 추출 후 4,000×g에서 10분간 원심분리하고 상등액을 멤브레인 필터(PTFE, 0.2 μm)로 여과하여 LC-MS/MS로 분석하였다. 기기분석은 삼중사중극자 질량분석기(XEVO TQ-S, Waters Co.)와 결합한 초고성능 액체크로마토그래피(ultra high performance liquid chromatography, UHPLC) 장비를 사용하여 분석하였다. 컬럼은 BEH C18(100 mm×3 mm, 5 µm, Waters Co.), 샘플 주입량 5 μL, 컬럼 오븐 40°C, 유속 0.4 mL/min으로 설정하였다. 이동상은 0.1% formic acid in H2O(A), 0.1% formic acid in acetonitrile(B)을 사용했으며, 0.0~0.5분 A 70%; 0.5~2.5분 A 30%; 2.5~10분 A 30%; 10~10.1분 A 70%; 10.1~11.0분 A 70%로 유지하였다. 질량분석기 조건은 electrospray ionization 소스를 positive mode에서 분석했으며, desolvation temperature (350°C), desolvation gas(800 L/h), cone gas(150 L/h), ion source temperature(150°C), capillary voltage(3 kV)로 설정하였다. Multiple reaction monitoring(MRM) 모드로 선구이온/생성이온으로 정량한 후 Masslynx 소프트웨어를 사용하여 THC와 CBD를 정량하였다. MRM 조건은 Table 1에 나타내었다.
Table 1 . Multiple reaction monitoring conditions for selected Δ-9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol in ESI positive mode
Compounds | Precursor ion (m/z) | Product ion (m/z) | Cone (V) | Collision (V) |
---|---|---|---|---|
Δ-9-Tetrahydrocannabinol | 315.05 | 193.02 | 30 | 25 |
259.02 | 30 | 20 | ||
Cannabidiol | 315 | 193.02 | 30 | 25 |
259.02 | 30 | 20 |
ESI: electrospray ionization.
LC-MS/MS 분석법 유효성 검증
실험방법의 선택성은 THC와 CBD 표준물질이 peak 및 MRM 분석조건에서 baseline이 일정하게 유지되고 정성이온과 정량이온이 간섭물질의 방해 없이 정확히 분리되는지 확인했으며, 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 각각의 매트릭스에서 THC와 CBD의 정량이온 및 정성이온 peak가 정확히 분리되는 것으로 나타났다. 매트릭스에 따른 THC 및 CBD의 직선성은 1, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 µg/L 농도 범위로 측정했으며, 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 올리브유, 카놀라유, 콩분말 3가지 매트릭스 모두 R2값이 0.99 이상으로 저농도에서 고농도 범위까지 직선성이 우수한 것으로 나타났다. 시험방법의 정확도를 평가하기 위한 회수율을 측정한 결과는 Table 2와 같으며, 500 µg/L(검출농도 25 µg/L) 농도의 THC와 CBD 표준물질을 올리브유, 카놀라유, 콩분말 매트릭스에 각각 첨가하여 3회 반복 실험하여 평균 회수율을 측정하였다. 올리브유의 회수율은 THC 및 CBD가 각각 97.3% 및 102.5%였으며, 카놀라유가 108.3%(THC), 84.9%(CBD), 콩분말이 94.1%(THC), 109%(CBD)로 매트릭스에 따라 회수율의 차이가 있었으나 3가지 매트릭스 모두 식품의약품안전처 시험방법 유효성 확인 검증 안내서의 기준에 적합한 것으로 확인되었다. 이러한 회수율 차이는 질량분석기 시스템에서 분석물질과 매트릭스 성분 사이의 이온 경쟁으로 인해 복잡한 식품 매트릭스에서 이온 억제 현상이 발생하기 때문이며(Furey 등, 2013), 따라서 질량분석기 적용 시 매트릭스에 따른 이온 억제 현상을 억제하기 위한 적절한 전처리 및 분석방법의 선택이 고려되어야 한다. 실험법의 정밀성을 확인하기 위한 LOD 및 LOQ, RSD를 측정한 결과는 Table 3과 같다. THC의 LOD는 1.62~1.79 µg/L, LOQ는 4.90~5.44 µg/L 범위였으며, CBD의 경우 LOD와 LOQ가 각각 0.76~1.43 µg/L, 2.54~4.75 µg/L로 확인되었다. RSD를 측정한 결과에서는 THC 1.56~2.33%, CBD 1.03~2.10%로 실험의 반복성이 있음을 확인하였다.
Table 2 . Accuracy of LC-MS/MS analysis for Δ-9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol in each matrix (%)
Compounds | Matrix | ||
---|---|---|---|
Olive oil | Canola oil | Soybean | |
Δ-9-Tetrahydrocannabinol | 97.3±0.9 | 108.3±2.0 | 94.1±0.1 |
Cannabidiol | 102.5±3.9 | 84.9±2.7 | 109.0±2.6 |
Table 3 . Limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), and relative standard deviation (RSD) of Δ-9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol in each matrix by LC-MS/MS
Compounds | Matrix | ||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Olive oil | Canola oil | Soybean | |||||||
LOD (µg/L) | LOQ (µg/L) | RSD (%) | LOD (µg/L) | LOQ (µg/L) | RSD (%) | LOD (µg/L) | LOQ (µg/L) | RSD (%) | |
Δ-9-Tetrahydrocannabinol | 1.79 | 5.44 | 2.33 | 1.62 | 4.9 | 1.56 | 1.71 | 5.17 | 1.93 |
Cannabidiol | 0.76 | 2.54 | 1.03 | 1.33 | 4.42 | 1.78 | 1.43 | 4.75 | 2.1 |
국내 유통 중인 헴프씨드 및 헴프씨유, 헴프씨드 함유 가공품의 THC와 CBD 함량
국내에서 대마씨는 껍질(포엽과 외종피)이 완전히 제거된 씨앗만 식품원료로 사용이 가능하다. THC와 CBD 기준규격은 대마씨에서 5 mg/kg(THC), 10 mg/kg(CBD) 이하이며, 대마씨유의 경우 10 mg/kg(THC), 20 mg/kg(CBD) 이하로 규정되어 있다. 외국의 대마씨 및 대마씨유에 대한 THC 기준은 EU(European Commission, 2022)의 경우 국내와 마찬가지로 껍질을 제거한 대마 씨앗만 식용으로 섭취 가능하며, 대마씨 3.0 mg/kg 이하, 대마씨유에서 7.5 mg/kg 이하로 THC를 관리하고 있다. 미국의 경우 2018년 12월 FDA(U.S. Food and Drug Administration, 2018)에서 껍질을 벗긴 대마씨앗 및 오일, 대마씨앗 단백질에 대해 Generally Recognized as Safe로 인정하였다. 대마 및 관련 제품에서 칸나비노이드 분석은 GC-FID, GC-MS HPLC-UV 등으로 가능하며, LC를 통한 분석은 유도체화 과정이 필요하지 않다는 장점이 있다(Christinat 등, 2020). 다수의 연구에서 칸나비노이드 화합물을 정성 및 정량 분석하기 위해 연구가 진행되었으며, Pisciottano 등(2021)의 연구에서는 이탈리아에서 판매되는 식품, 음료, 사료의 칸나비노이드 화합물을 메탄올 및 클로로포름으로 추출한 후 LC-MS/MS로 분석하였다. 질량분석을 위한 선구이온과 생성이온 같은 MRM 조건은 본 연구와 동일하였다. Analakkattillam 등(2022)은 HPLC 및 UV 검출기를 이용하여 분석법 개발 및 밸리데이션을 진행하였다. Jang 등(2020)은 국내에서 판매되는 종자 및 대마씨 오일의 THC, CBD, CBN 함량을 조사하기 위해 메탄올로 추출한 후 GC/MS로 분석하였다. 국내에서 재배되는 대마는 Cannabis Sativa subsp. sativa 재래종과 1997년 네덜란드 저마약형 품종인 IH3 품종을 국내종과 교잡한 청삼종이 주로 재배되고 있다. 또한 국내에서 유통 및 판매되는 대마 관련 제품은 대부분이 대마씨앗 및 대마씨유의 형태로 유통 및 판매가 되고 있다(Sohn 등, 2021). 본 연구에서는 국내에서 유통되는 헴프씨드 4종, 헴프씨유 9종, 헴프씨드가 함유된 가공식품 3종을 대상으로 THC와 CBD 함량을 조사하였다(Table 4). 헴프씨드의 THC 함량은 0.0~4.2 mg/kg 범위로 제품마다 함량의 차이가 있는 것으로 나타났다. CBD 또한 0.0~2.1 mg/kg 범위로 제품에 따라 함량의 차이가 있었다. 대마의 칸나비노이드 함량은 품종을 비롯하여 생물학적 및 비생물학적 요인에 영향을 받을 수 있다고 보고되고 있다(Glivar 등, 2020). 헴프씨유의 THC 및 CBD 함량은 각각 0.4~22.5 mg/kg, 0.0~31.7 mg/kg 범위로 매우 다양했으며, 헴프씨드와 다르게 9개의 제품 중 3개의 제품이 부적합으로 판정되었고, THC 부적합이 2건, THC 및 CBD 모두 기준규격을 초과한 제품이 1건이었다. 이전 연구에서 Tura 등(2023)은 이탈리아에서 판매되는 대마씨유 13건에 대해 THC 및 CBD를 분석하였으며, THC 및 CBD의 함량이 각각 불검출~5.29 mg/kg, 불검출~22.2 mg/kg으로 보고하였다. Jang 등(2020)은 국내에서 유통되는 국내산을 포함한 수입산 헴프씨드 및 헴프씨유의 THC를 분석한 결과에서 국내산 헴프씨드의 THC 함량이 평균 3.46 mg/kg으로 호주 및 중국산 헴프씨드보다는 낮고 캐나다산 헴프씨드보다는 함량이 높다고 하였다. 헴프씨유의 경우는 평균 19.73 mg/kg으로 캐나다, 오스트리아, 영국산 헴프씨유보다 함량이 높다고 보고하였다. 헴프씨드 함유 가공식품은 총 3건이었으며, 가공식품 #1은 헴프씨드 단백질 분말이었고 가공식품 #2는 국내산 헴프씨드가 함유된 효소식품 유형의 가공식품으로 음료 등에 첨가하여 섭취하는 식품이었다. 가공식품 #3은 건강기능식품으로 고시형 원료에 헴프씨드가 함유된 형태였다. 가공식품의 THC 및 CBD 함량은 가공식품 #1이 각각 1.7 mg/kg, 3.1 mg/kg이었고, 가공식품 #2~3은 THC와 CBD가 검출되지 않은 것으로 확인되었다. 대마의 칸나비노이드 화합물은 대부분 껍질에 존재하고 있으며, 헴프씨유에서 THC 및 CBD가 기준규격 이상으로 검출되는 것은 씨앗 수확 시 꽃차례 및 잎의 포엽에 존재하는 THC가 씨앗 접촉으로 오염이 되어 오일 착유 시 함량이 높아질 수 있으며(Tura 등, 2023), 착유 전 씨앗의 껍질이 다량 포함되어도 THC 함량이 높아질 수 있다. 따라서 씨앗으로부터 헴프씨유 착유 전 씨앗의 외종피를 충분히 제거하는 것이 필수적이다.
Table 4 . Content of Δ-9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol in hemp seeds, hemp seed oil and hemp-processed foods (mg/kg)
Samples | Δ-9-Tetrahydro-cannabinol | Cannabidiol | |
---|---|---|---|
Hemp seed | Seed #1 | 0.01) | 0.2 |
Seed #2 | 4.2 | 0 | |
Seed #3 | 1.2 | 2.1 | |
Seed #4 | 0.4 | 0.4 | |
Hemp seed oil | Oil #1 | 9.1 | 17.5 |
Oil #2 | 18.1±0.62) | 31.7±0.7 | |
Oil #3 | 4.4 | 5.6 | |
Oil #4 | 11.5±0.6 | 0 | |
Oil #5 | 22.5±0.9 | 16.3 | |
Oil #6 | 0.4 | 1.5 | |
Oil #7 | 7.6 | 5.9 | |
Oil #8 | 2.3 | 4.2 | |
Oil #9 | 6.2 | 2.3 | |
Hemp-processed | Processed #1 | 1.7 | 3.1 |
Processed #2 | ND3) | ND | |
Processed #3 | ND | ND |
1)Rounding to the last digit after the decimal point zero.
2)Samples above the regulation are the result of three repetitions.
3)Not detected.
본 연구에서는 식품공전에 고시된 시험법에 기초하여 LC-MS/MS를 활용한 THC와 CBD 분석법의 유효성을 검증하고 국내에서 유통 및 판매 중인 헴프씨드, 헴프씨유, 헴프씨드 함유 가공식품의 THC와 CBD 함량을 조사하였다. 본 실험에 사용한 분석법의 선택성, 직선성, 회수율을 통한 정확성, 반복실험의 재현성 모두 실험법이 적합한 것을 확인하였다. 또한 유효성을 확인한 분석법으로 국내 판매되는 헴프씨드, 헴프씨유, 헴프씨드 함유 가공식품의 THC 및 CBD를 분석한 결과에서는 헴프씨드가 4건 모두 기준규격에 적합하였고, 헴프씨유는 9건 중 3건이 부적합으로 확인되어 지속해서 관리가 필요할 것으로 사료된다. 헴프씨드 함유 가공식품은 3건 중 2건에서 THC와 CBD가 검출되지 않은 것으로 나타났다. 결론적으로 국내에서 제조 및 유통되는 헴프씨드 및 헴프씨유의 품질관리가 지속해서 수행되어야 할 것으로 판단된다.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2023; 52(5): 492-498
Published online May 31, 2023 https://doi.org/10.3746/jkfn.2023.52.5.492
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
황희영1․김미정1․심혜미1․정우식2
1경상북도 보건환경연구원
2경북대학교 식품공학부, 식품생물산업연구소
Hee-Young Hwang1 , Mee-Jeoung Kim1, Hye-Mi Shim1, and Woo-Sik Jeong2
1Gyeongsangbuk-do Government Public Institute of Health & Environment
2School of Food Science and Biotechnology, Food and Bio-Industry Research Institute, Kyungpook National University
Correspondence to:Woo-Sik Jeong, School of Food Science and Biotechnology, Kyungpook National University, 80, Daehak-ro, Buk-gu, Daegu 41566, Korea, E-mail: wsjeong@knu.ac.kr
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
This study aims to verify the accuracy of the UPLC-MS method for analyzing Δ-9-tetrahydrocannabinol (THC) and cannabidiol (CBD) levels. The contents were investigated in hemp seeds, hemp seed oil, and processed foods containing hemp seeds in South Korea. Our results confirmed that the method was appropriate with high selectivity, reproducibility, linearity, and recovery for both THC (94.1∼108.3%) and CBD (84.9∼109.0%). It was determined that 13 out of the 16 tested products were within the suitable range of THC and CBD levels. However, three out of nine hemp seed oil products exceeded the standards for these compounds, indicating the need for continuous monitoring. The results of our study verify and conclude the reliability of LC-MS/MS as a method for determining THC and CBD concentrations in hemp seeds and hemp seed oil.
Keywords: THC, CBD, UPLC-MS, hemp seed oil, method validation
대마(
대마는 향정신성 칸나비노이드로 인해 유럽에서는 Δ-9-tetrahydrocannabinol(THC) 함량이 0.2% 이하인 일부 제품만 산업 품종으로 재배가 허용되고 있으며, 산업용 대마 품종은 THC 함량이 낮고 cannabidiol(CBD)의 함량이 높은 것이 특징이다(Tura 등, 2023). 대마는 100가지 이상의 phytocannabinoid를 생산하며, 향정신성 및 비향정신성 2가지로 분류된다(Pisciottano 등, 2021). 대표적으로 cannabidiolic acid, tetrahydrocannabinolic acid가 있으며, 대부분 탈카르복실화되어 CBD, THC로 자연계에 존재한다(Hammami 등, 2021). 또한 CBD는 향정신성 효과를 나타내지 않고 진통제, 항염증제, 메스꺼움 억제, 항관절염제, 불안 완화, 면역 조절에 효과가 있으며, THC는 향정신적 작용을 나타내는 특징으로 인해 미국, 독일, 스위스, 벨기에, 캐나다, 호주, 뉴질랜드, 한국에서 헴프씨드와 헴프씨유에 대해 THC의 기준규격을 정하고 있다(Pannico 등, 2022). 따라서 THC와 CBD는 산업용 대마씨 및 대마씨유의 주요 바이오마커이며(Analakkattillam 등, 2022), THC를 비롯한 칸나비노이드 화합물은 꽃의 포엽에 위치한 모용에서 대부분 생산되나 씨앗과 같은 일부에도 소량의 칸나비노이드 화합물이 포함될 수 있어 관리가 필요하다(Alonso-Esteban 등, 2022).
대마에서 칸나비노이드 화합물을 정량 분석하는 방법은 액체크로마토그래피 질량분석기(high performance liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS) 및 기체크로마토그래피 질량분석기(gas chromatography mass spectrometry, GC-MS)를 활용하는 방법이 일반적으로 사용되고 있다(Jang 등, 2020; Petrović 등, 2015; Pisciottano 등, 2021). 국내에서는 식품의약품안전처 고시(식품의 기준 및 규격)에 따라 2015년(식품의약품안전처 고시 제2015-4호) 대마씨앗 및 대마씨유에 대해 THC 기준 및 GC-MS를 이용한 시험법이 처음으로 신설되었고, 그 후 2020년 10월(식품의약품안전처 고시 제2020-98호)에 CBD의 기준이 신설되고 실험법이 LC-MS/MS 분석법으로 고시가 개정되었지만, 마약류 관리에 관한 법률에 따라 THC와 CBD가 마약류로 지정이 되어 있어 국내에서 마약류 취급승인 허가를 받아야 분석이 가능하기 때문에 관련된 보고는 매우 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 국내에서 유통되고 있는 헴프씨드 및 헴프씨유, 헴프씨드가 첨가된 가공식품의 THC와 CBD 함량을 조사하고, LC-MS/MS를 활용한 THC와 CBD 분석법의 유효성을 평가하기 위해 선택성, 직선성, 검출한계, 정량한계, 회수율, 반복실험의 재현성을 확인하였다.
실험재료 및 시약
본 실험에 사용한 시료는 2021~2022년 경상북도 보건환경연구원에 의뢰된 제품을 대상으로 실험을 진행하였다. 헴프씨드 및 헴프씨유, 헴프씨드 함유 가공품은 모두 국내산 제품이었으며, 헴프씨드 4건, 헴프씨유 9건, 헴프씨드 함유 가공품 3건이었다. 표준품인 THC와 CBD는 Sigma-Aldrich 제품을 사용하였으며, 시약 및 이동상(0.1% formic acid in water, 0.1% formic acid in acetonitrile)은 MERCK의 LC-MS 등급을 사용하였다.
표준용액 제조
THC 및 CBD 표준원액(1,000 mg/L)을 메탄올로 10 mg/L 농도로 희석한 후 각각의 무처리 시료 추출물이 90% 이상 함유되도록 1~500 μg/L 농도로 희석하였다. 무처리 시료 추출물은 오일 매트릭스로 올리브유와 카놀라유를 사용하였고, 헴프씨드 및 가공식품은 콩분말을 사용하였다. 표준품 희석에 사용한 무처리 시료 추출물은 시료와 동일하게 전처리하여 사용하였다. 시료 정량에 사용한 표준용액은 헴프씨드와 가공식품이 콩분말, 헴프씨유는 올리브유를 무처리 시료 추출물로 하여 실험에 사용하였다.
LC-MS/MS 분석법 유효성 확인
식품의약품안전처 ‘식품의약품 분야 시험검사기관 품질관리를 위한 시험검사기관 유효성 확인 및 검증 안내서(MFDS, 2021)’에 기초하여 시험방법의 유효성을 확인하기 위해 선택성(selectivity), 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ), 회수율(recovery), 반복실험의 재현성(relative standard deviation, RSD)을 측정하였다. 선택성은 간섭물질의 피크와 겹치지 않고 크로마토그램의 baseline이 일정하게 유지되면서 분석하는 대상물질이 정확히 검출되는지 확인하였다. 직선성은 분석대상물질의 농도에 대해 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 것을 검증하는 것으로(Kwon 등, 2022), 1~500 μg/L 농도로 각각의 매트릭스에 대해 THC와 CBD의 검량선을 작성하여 R2를 통해 확인하였다. 검출한계 및 정량한계는 시료 중에 존재하는 분석대상물질의 검출 가능한 최소량 또는 최저농도를 뜻하며 직선성을 통해 산출된 검량선 결과에서 산출된 기울기(slope)와 표준편차를 통해 계산하였다(Kwon 등, 2022). 회수율은 500 μg/L(검출농도 25 μg/L) 농도의 THC와 CBD 표준물질을 올리브유, 카놀라유, 콩분말에 첨가(spiking)하여 3회 반복 실험했으며, 첨가한 농도에 대해 결괏값을 나누어 %로 나타내었다. 반복실험의 재현성은 동일한 농도를 5회 반복 측정하여 RSD%로 나타내었다.
THC 및 CBD 함량
THC 및 CBD 함량은 ‘식품공전(제 8. 일반시험법, 9. 식품 중 유해물질 시험법, 9.17 테트라하이드로칸나비놀 및 칸나비디올시험법)’에 따라 실험하였다. 시료 1 g에 메탄올 20 mL를 가하고 10분간 진탕한 후 10분간 초음파 추출하였다. 추출 후 4,000×g에서 10분간 원심분리하고 상등액을 멤브레인 필터(PTFE, 0.2 μm)로 여과하여 LC-MS/MS로 분석하였다. 기기분석은 삼중사중극자 질량분석기(XEVO TQ-S, Waters Co.)와 결합한 초고성능 액체크로마토그래피(ultra high performance liquid chromatography, UHPLC) 장비를 사용하여 분석하였다. 컬럼은 BEH C18(100 mm×3 mm, 5 µm, Waters Co.), 샘플 주입량 5 μL, 컬럼 오븐 40°C, 유속 0.4 mL/min으로 설정하였다. 이동상은 0.1% formic acid in H2O(A), 0.1% formic acid in acetonitrile(B)을 사용했으며, 0.0~0.5분 A 70%; 0.5~2.5분 A 30%; 2.5~10분 A 30%; 10~10.1분 A 70%; 10.1~11.0분 A 70%로 유지하였다. 질량분석기 조건은 electrospray ionization 소스를 positive mode에서 분석했으며, desolvation temperature (350°C), desolvation gas(800 L/h), cone gas(150 L/h), ion source temperature(150°C), capillary voltage(3 kV)로 설정하였다. Multiple reaction monitoring(MRM) 모드로 선구이온/생성이온으로 정량한 후 Masslynx 소프트웨어를 사용하여 THC와 CBD를 정량하였다. MRM 조건은 Table 1에 나타내었다.
Table 1 . Multiple reaction monitoring conditions for selected Δ-9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol in ESI positive mode.
Compounds | Precursor ion (m/z) | Product ion (m/z) | Cone (V) | Collision (V) |
---|---|---|---|---|
Δ-9-Tetrahydrocannabinol | 315.05 | 193.02 | 30 | 25 |
259.02 | 30 | 20 | ||
Cannabidiol | 315 | 193.02 | 30 | 25 |
259.02 | 30 | 20 |
ESI: electrospray ionization..
LC-MS/MS 분석법 유효성 검증
실험방법의 선택성은 THC와 CBD 표준물질이 peak 및 MRM 분석조건에서 baseline이 일정하게 유지되고 정성이온과 정량이온이 간섭물질의 방해 없이 정확히 분리되는지 확인했으며, 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 각각의 매트릭스에서 THC와 CBD의 정량이온 및 정성이온 peak가 정확히 분리되는 것으로 나타났다. 매트릭스에 따른 THC 및 CBD의 직선성은 1, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 µg/L 농도 범위로 측정했으며, 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 올리브유, 카놀라유, 콩분말 3가지 매트릭스 모두 R2값이 0.99 이상으로 저농도에서 고농도 범위까지 직선성이 우수한 것으로 나타났다. 시험방법의 정확도를 평가하기 위한 회수율을 측정한 결과는 Table 2와 같으며, 500 µg/L(검출농도 25 µg/L) 농도의 THC와 CBD 표준물질을 올리브유, 카놀라유, 콩분말 매트릭스에 각각 첨가하여 3회 반복 실험하여 평균 회수율을 측정하였다. 올리브유의 회수율은 THC 및 CBD가 각각 97.3% 및 102.5%였으며, 카놀라유가 108.3%(THC), 84.9%(CBD), 콩분말이 94.1%(THC), 109%(CBD)로 매트릭스에 따라 회수율의 차이가 있었으나 3가지 매트릭스 모두 식품의약품안전처 시험방법 유효성 확인 검증 안내서의 기준에 적합한 것으로 확인되었다. 이러한 회수율 차이는 질량분석기 시스템에서 분석물질과 매트릭스 성분 사이의 이온 경쟁으로 인해 복잡한 식품 매트릭스에서 이온 억제 현상이 발생하기 때문이며(Furey 등, 2013), 따라서 질량분석기 적용 시 매트릭스에 따른 이온 억제 현상을 억제하기 위한 적절한 전처리 및 분석방법의 선택이 고려되어야 한다. 실험법의 정밀성을 확인하기 위한 LOD 및 LOQ, RSD를 측정한 결과는 Table 3과 같다. THC의 LOD는 1.62~1.79 µg/L, LOQ는 4.90~5.44 µg/L 범위였으며, CBD의 경우 LOD와 LOQ가 각각 0.76~1.43 µg/L, 2.54~4.75 µg/L로 확인되었다. RSD를 측정한 결과에서는 THC 1.56~2.33%, CBD 1.03~2.10%로 실험의 반복성이 있음을 확인하였다.
Table 2 . Accuracy of LC-MS/MS analysis for Δ-9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol in each matrix (%).
Compounds | Matrix | ||
---|---|---|---|
Olive oil | Canola oil | Soybean | |
Δ-9-Tetrahydrocannabinol | 97.3±0.9 | 108.3±2.0 | 94.1±0.1 |
Cannabidiol | 102.5±3.9 | 84.9±2.7 | 109.0±2.6 |
Table 3 . Limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), and relative standard deviation (RSD) of Δ-9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol in each matrix by LC-MS/MS.
Compounds | Matrix | ||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Olive oil | Canola oil | Soybean | |||||||
LOD (µg/L) | LOQ (µg/L) | RSD (%) | LOD (µg/L) | LOQ (µg/L) | RSD (%) | LOD (µg/L) | LOQ (µg/L) | RSD (%) | |
Δ-9-Tetrahydrocannabinol | 1.79 | 5.44 | 2.33 | 1.62 | 4.9 | 1.56 | 1.71 | 5.17 | 1.93 |
Cannabidiol | 0.76 | 2.54 | 1.03 | 1.33 | 4.42 | 1.78 | 1.43 | 4.75 | 2.1 |
국내 유통 중인 헴프씨드 및 헴프씨유, 헴프씨드 함유 가공품의 THC와 CBD 함량
국내에서 대마씨는 껍질(포엽과 외종피)이 완전히 제거된 씨앗만 식품원료로 사용이 가능하다. THC와 CBD 기준규격은 대마씨에서 5 mg/kg(THC), 10 mg/kg(CBD) 이하이며, 대마씨유의 경우 10 mg/kg(THC), 20 mg/kg(CBD) 이하로 규정되어 있다. 외국의 대마씨 및 대마씨유에 대한 THC 기준은 EU(European Commission, 2022)의 경우 국내와 마찬가지로 껍질을 제거한 대마 씨앗만 식용으로 섭취 가능하며, 대마씨 3.0 mg/kg 이하, 대마씨유에서 7.5 mg/kg 이하로 THC를 관리하고 있다. 미국의 경우 2018년 12월 FDA(U.S. Food and Drug Administration, 2018)에서 껍질을 벗긴 대마씨앗 및 오일, 대마씨앗 단백질에 대해 Generally Recognized as Safe로 인정하였다. 대마 및 관련 제품에서 칸나비노이드 분석은 GC-FID, GC-MS HPLC-UV 등으로 가능하며, LC를 통한 분석은 유도체화 과정이 필요하지 않다는 장점이 있다(Christinat 등, 2020). 다수의 연구에서 칸나비노이드 화합물을 정성 및 정량 분석하기 위해 연구가 진행되었으며, Pisciottano 등(2021)의 연구에서는 이탈리아에서 판매되는 식품, 음료, 사료의 칸나비노이드 화합물을 메탄올 및 클로로포름으로 추출한 후 LC-MS/MS로 분석하였다. 질량분석을 위한 선구이온과 생성이온 같은 MRM 조건은 본 연구와 동일하였다. Analakkattillam 등(2022)은 HPLC 및 UV 검출기를 이용하여 분석법 개발 및 밸리데이션을 진행하였다. Jang 등(2020)은 국내에서 판매되는 종자 및 대마씨 오일의 THC, CBD, CBN 함량을 조사하기 위해 메탄올로 추출한 후 GC/MS로 분석하였다. 국내에서 재배되는 대마는 Cannabis Sativa subsp. sativa 재래종과 1997년 네덜란드 저마약형 품종인 IH3 품종을 국내종과 교잡한 청삼종이 주로 재배되고 있다. 또한 국내에서 유통 및 판매되는 대마 관련 제품은 대부분이 대마씨앗 및 대마씨유의 형태로 유통 및 판매가 되고 있다(Sohn 등, 2021). 본 연구에서는 국내에서 유통되는 헴프씨드 4종, 헴프씨유 9종, 헴프씨드가 함유된 가공식품 3종을 대상으로 THC와 CBD 함량을 조사하였다(Table 4). 헴프씨드의 THC 함량은 0.0~4.2 mg/kg 범위로 제품마다 함량의 차이가 있는 것으로 나타났다. CBD 또한 0.0~2.1 mg/kg 범위로 제품에 따라 함량의 차이가 있었다. 대마의 칸나비노이드 함량은 품종을 비롯하여 생물학적 및 비생물학적 요인에 영향을 받을 수 있다고 보고되고 있다(Glivar 등, 2020). 헴프씨유의 THC 및 CBD 함량은 각각 0.4~22.5 mg/kg, 0.0~31.7 mg/kg 범위로 매우 다양했으며, 헴프씨드와 다르게 9개의 제품 중 3개의 제품이 부적합으로 판정되었고, THC 부적합이 2건, THC 및 CBD 모두 기준규격을 초과한 제품이 1건이었다. 이전 연구에서 Tura 등(2023)은 이탈리아에서 판매되는 대마씨유 13건에 대해 THC 및 CBD를 분석하였으며, THC 및 CBD의 함량이 각각 불검출~5.29 mg/kg, 불검출~22.2 mg/kg으로 보고하였다. Jang 등(2020)은 국내에서 유통되는 국내산을 포함한 수입산 헴프씨드 및 헴프씨유의 THC를 분석한 결과에서 국내산 헴프씨드의 THC 함량이 평균 3.46 mg/kg으로 호주 및 중국산 헴프씨드보다는 낮고 캐나다산 헴프씨드보다는 함량이 높다고 하였다. 헴프씨유의 경우는 평균 19.73 mg/kg으로 캐나다, 오스트리아, 영국산 헴프씨유보다 함량이 높다고 보고하였다. 헴프씨드 함유 가공식품은 총 3건이었으며, 가공식품 #1은 헴프씨드 단백질 분말이었고 가공식품 #2는 국내산 헴프씨드가 함유된 효소식품 유형의 가공식품으로 음료 등에 첨가하여 섭취하는 식품이었다. 가공식품 #3은 건강기능식품으로 고시형 원료에 헴프씨드가 함유된 형태였다. 가공식품의 THC 및 CBD 함량은 가공식품 #1이 각각 1.7 mg/kg, 3.1 mg/kg이었고, 가공식품 #2~3은 THC와 CBD가 검출되지 않은 것으로 확인되었다. 대마의 칸나비노이드 화합물은 대부분 껍질에 존재하고 있으며, 헴프씨유에서 THC 및 CBD가 기준규격 이상으로 검출되는 것은 씨앗 수확 시 꽃차례 및 잎의 포엽에 존재하는 THC가 씨앗 접촉으로 오염이 되어 오일 착유 시 함량이 높아질 수 있으며(Tura 등, 2023), 착유 전 씨앗의 껍질이 다량 포함되어도 THC 함량이 높아질 수 있다. 따라서 씨앗으로부터 헴프씨유 착유 전 씨앗의 외종피를 충분히 제거하는 것이 필수적이다.
Table 4 . Content of Δ-9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol in hemp seeds, hemp seed oil and hemp-processed foods (mg/kg).
Samples | Δ-9-Tetrahydro-cannabinol | Cannabidiol | |
---|---|---|---|
Hemp seed | Seed #1 | 0.01) | 0.2 |
Seed #2 | 4.2 | 0 | |
Seed #3 | 1.2 | 2.1 | |
Seed #4 | 0.4 | 0.4 | |
Hemp seed oil | Oil #1 | 9.1 | 17.5 |
Oil #2 | 18.1±0.62) | 31.7±0.7 | |
Oil #3 | 4.4 | 5.6 | |
Oil #4 | 11.5±0.6 | 0 | |
Oil #5 | 22.5±0.9 | 16.3 | |
Oil #6 | 0.4 | 1.5 | |
Oil #7 | 7.6 | 5.9 | |
Oil #8 | 2.3 | 4.2 | |
Oil #9 | 6.2 | 2.3 | |
Hemp-processed | Processed #1 | 1.7 | 3.1 |
Processed #2 | ND3) | ND | |
Processed #3 | ND | ND |
1)Rounding to the last digit after the decimal point zero..
2)Samples above the regulation are the result of three repetitions..
3)Not detected..
본 연구에서는 식품공전에 고시된 시험법에 기초하여 LC-MS/MS를 활용한 THC와 CBD 분석법의 유효성을 검증하고 국내에서 유통 및 판매 중인 헴프씨드, 헴프씨유, 헴프씨드 함유 가공식품의 THC와 CBD 함량을 조사하였다. 본 실험에 사용한 분석법의 선택성, 직선성, 회수율을 통한 정확성, 반복실험의 재현성 모두 실험법이 적합한 것을 확인하였다. 또한 유효성을 확인한 분석법으로 국내 판매되는 헴프씨드, 헴프씨유, 헴프씨드 함유 가공식품의 THC 및 CBD를 분석한 결과에서는 헴프씨드가 4건 모두 기준규격에 적합하였고, 헴프씨유는 9건 중 3건이 부적합으로 확인되어 지속해서 관리가 필요할 것으로 사료된다. 헴프씨드 함유 가공식품은 3건 중 2건에서 THC와 CBD가 검출되지 않은 것으로 나타났다. 결론적으로 국내에서 제조 및 유통되는 헴프씨드 및 헴프씨유의 품질관리가 지속해서 수행되어야 할 것으로 판단된다.
Table 1 . Multiple reaction monitoring conditions for selected Δ-9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol in ESI positive mode.
Compounds | Precursor ion (m/z) | Product ion (m/z) | Cone (V) | Collision (V) |
---|---|---|---|---|
Δ-9-Tetrahydrocannabinol | 315.05 | 193.02 | 30 | 25 |
259.02 | 30 | 20 | ||
Cannabidiol | 315 | 193.02 | 30 | 25 |
259.02 | 30 | 20 |
ESI: electrospray ionization..
Table 2 . Accuracy of LC-MS/MS analysis for Δ-9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol in each matrix (%).
Compounds | Matrix | ||
---|---|---|---|
Olive oil | Canola oil | Soybean | |
Δ-9-Tetrahydrocannabinol | 97.3±0.9 | 108.3±2.0 | 94.1±0.1 |
Cannabidiol | 102.5±3.9 | 84.9±2.7 | 109.0±2.6 |
Table 3 . Limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), and relative standard deviation (RSD) of Δ-9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol in each matrix by LC-MS/MS.
Compounds | Matrix | ||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Olive oil | Canola oil | Soybean | |||||||
LOD (µg/L) | LOQ (µg/L) | RSD (%) | LOD (µg/L) | LOQ (µg/L) | RSD (%) | LOD (µg/L) | LOQ (µg/L) | RSD (%) | |
Δ-9-Tetrahydrocannabinol | 1.79 | 5.44 | 2.33 | 1.62 | 4.9 | 1.56 | 1.71 | 5.17 | 1.93 |
Cannabidiol | 0.76 | 2.54 | 1.03 | 1.33 | 4.42 | 1.78 | 1.43 | 4.75 | 2.1 |
Table 4 . Content of Δ-9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol in hemp seeds, hemp seed oil and hemp-processed foods (mg/kg).
Samples | Δ-9-Tetrahydro-cannabinol | Cannabidiol | |
---|---|---|---|
Hemp seed | Seed #1 | 0.01) | 0.2 |
Seed #2 | 4.2 | 0 | |
Seed #3 | 1.2 | 2.1 | |
Seed #4 | 0.4 | 0.4 | |
Hemp seed oil | Oil #1 | 9.1 | 17.5 |
Oil #2 | 18.1±0.62) | 31.7±0.7 | |
Oil #3 | 4.4 | 5.6 | |
Oil #4 | 11.5±0.6 | 0 | |
Oil #5 | 22.5±0.9 | 16.3 | |
Oil #6 | 0.4 | 1.5 | |
Oil #7 | 7.6 | 5.9 | |
Oil #8 | 2.3 | 4.2 | |
Oil #9 | 6.2 | 2.3 | |
Hemp-processed | Processed #1 | 1.7 | 3.1 |
Processed #2 | ND3) | ND | |
Processed #3 | ND | ND |
1)Rounding to the last digit after the decimal point zero..
2)Samples above the regulation are the result of three repetitions..
3)Not detected..
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