동물의 피부, 눈, 모발, 뼈, 내이, 뇌, 심장 등에 분포된 물질로 피부색을 결정하는 멜라닌은 자외선과 같은 외부 유해인자들로부터 피부를 보호하는 역할을 한다(Alaluf 등, 2002; D’Mello 등, 2016). 하지만 이러한 멜라닌이 과잉 생산되어 피부에 축적되면 주근깨, 기미, 피부 반점 등을 유발하여 피부암 및 세포사멸과 같은 질병으로 이어질 수 있다(Yoon 등, 2013). 멜라닌 생성은 멜라노좀에서 tyrosine tyrosinase, melanocyte stimulating hormone(MSH), 비타민 D3, prostaglandin, interferon, histarnine 등 인자들로 인해 생성하는 것으로 알려져 있다. α-MSH는 뇌하수체의 중엽에 분비되는 호르몬으로 멜라닌 합성 과정에서 중요한 역할을 하며 melanocyte에서 발현하는 막수용체 melanocortin 1 receptor와 결합하여 adenylyl cyclase를 활성화한다. 이에 세포 내 cAMP 신호를 증폭시키고 protein kinase A를 활성화하여 세포 내 cAMP response element binding protein의 활성화를 유도한 후 microphthalmia-associated transcription factor(MITF)의 발현을 증가시킨다. MITF는 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 전사조절 인자로 알려져 있으며, 전사조절을 촉진하는 역할을 하여 멜라닌 합성 과정에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Bentley 등, 1994; Kim 등, 2011). Tyrosinase는 구리를 함유한 당단백질로 생체 내의 tyrosine을 L-3,4-dihydroxy phenylalanine(DOPA)으로, DOPA를 DOPA quinone으로 산화시키는 효소이다. TRP-1은 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid(DHICA)를 적색의 indol-5,6-quinone-carboxylic acid로 산화시키고 tyrosinase 활성을 조절한다고 알려져 있다. TRP-2는 DOPA chrome을 DHICA로 전환하며 멜라닌 세포를 이루는 갈색 계열인 eumelanin과 붉은 계열인 pheomelanin을 형성한다(Ko 등, 2015; Moon 등, 2013). 이에 피부 미백소재 개발에 있어 MITF와 전사조절인자인 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 활성을 저해하는 실험은 일차평가법으로 유용하게 인정되고 있다(Curto 등, 1999). 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하여 미백화장품의 원료로 사용되는 kojic acid는 가려움이나 피부에 홍반, 알레르기 등 부작용이 발견되면서 안전성 문제가 대두되고 있다(Yoon 등, 2013). 이를 대처하기 위해 피부 노화 방지 및 멜라닌 생성억제로 미백효과가 있는 안전하고 친환경적인 천연 소재의 기능성 물질에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다(Choi 등, 2016; Choung 등, 2013; Jeong 등, 2018; Yoon 등, 2013). Artemisia속 식물은 항암, 항산화, 항비만, 항고혈압, 항염증 및 항바이러스 작용 등과 같은 생리활성 기능이 보고되어 있으나 갯제비쑥 효능 성분에 관한 연구는 미비하므로 본 연구 개발을 통해 갯제비쑥이 새로운 효능 성분의 보고가 될 수 있을 것으로 예상된다(Kim, 2015; Park, 2015; Yoon 등, 2006). 또한 현재 동물실험을 거치지 않고 동물성 원료 대신 자연 유래 친환경 성분만을 사용하는 비건 화장품이 주목받고 있다. 갯제비쑥(Artemisia littoricola)은 피자식물문, 목련강, 국화과, 쑥속에 속하는 여러해살이풀로 대한민국의 청정해역인 울릉도와 독도의 해안가에서 주로 발견된다. 갯제비쑥이 울릉도와 독도에 다량으로 서식하지만, 이 시료의 생리활성에 관한 연구는 전혀 보고되지 않았다. 이러한 갯제비쑥은 채집 및 재배를 통해서 원료에 대한 대량 확보가 가능할 것으로 예상된다. 본 연구에서는 갯제비쑥의 미백화장품 원료의 기능성을 확인하고자 하였다.

갯제비쑥 시료 추출 및 분획

본 연구에 사용한 갯제비쑥은 울릉도에서 채집하였으며, 한국해양대학교에서 제공받아 사용하였다. 음지에서 건조한 갯제비쑥을 methylene chloride(CH₂Cl₂)에 침지시켜 실온에서 24시간 방치한 후 여과하였다. 남은 잔사에 다시 CH2Cl2를 가하고 동일한 방법을 반복하여 용매 추출액을 얻은 후 추출액을 40°C 수욕상에서 회전 진공증발기로 농축하여 추출물을 획득하였다. 남은 잔사에 메탄올(MeOH)을 침지한 후 용매 분획을 실시하여 분획물을 획득하였다.

In vitro tyrosinase 저해 시험

96-well plate 각 well에 0.1 M phosphate buffer saline(PBS, pH 6.5)을 110 μL 분주하고, 갯제비쑥 추출물과 분획물을 10, 20, 30, 40, 50 μg/mL 각각의 농도로 희석한 후 10 μL씩 분주한 후, mushroom tyrosinase 용액(1,900 units/mL)을 10 μL씩 순서대로 분주하였다. 이후 분주 완료한 well에 1.5 mM tyrosine을 20 μL씩 분주하여 37°C에서 15분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 490 nm 범위에서 흡광도를 측정하였다(Ministry of Food and Drug Safety, 2020).

L-DOPA oxidation 저해 시험

96-well plate 각 well에 pH 7.0인 0.1 M PBS 170 μL를 분주하고, 10% dimethyl sulfoxide(DMSO)를 이용하여 갯제비쑥 추출물과 분획물을 10, 20, 30, 40, 50 μg/mL 각각의 농도로 희석하고 10 μL씩 분주한 후 mushroom tyrosinase 용액(1,900 units/mL)을 10 μL씩 분주하였다. 이후 분주 완료한 각 well에 10 mM L-DOPA를 10 μL 분주하여 37°C에서 10분간 반응시킨 후 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군 및 양성 대조군은 pH 7.0인 0.1 M PBS와 10 μM kojic acid를 사용하였다(Ministry of Food and Drug Safety, 2020).

B16F10 murine melanoma 세포 배양

B16F10 murine melanoma cell은 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. 세포 배양은 10% fetal bovine serum(Welgene)과 1% L-glutamine penicillin streptomycin solution(Welgene)의 비율로 혼합한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(Welgene) 배양액을 사용하였으며, 5% CO², 37°C의 조건에서 세포를 배양하였다.

세포독성 평가

세포독성 평가는 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetra-zolium bromide(MTT) assay를 통해 진행하였다. B16F10 세포를 96-well cell plate에 1×10⁵ cell/well의 밀도로 24시간 동안 배양한 후 갯제비쑥 추출물 및 분획물을 각각의 농도로 처리하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이후 MTT를 100 μL씩 처리하여 동일조건에서 3시간 동안 배양하였으며, 배양 후 formazan 결정은 DMSO(Cellconic)로 10분간 용해 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 외 유출 멜라닌 함량 측정

세포 외 유출 멜라닌 함량 측정은 6-well cell plate에 세포를 1×10⁵ cell/well씩 분주한 뒤 24시간 동안 배양하였다. 100 nM α-MSH와 갯제비쑥 추출물 및 분획물을 각각의 농도로 처리하여 72시간 동안 배양한 후 각 well에서 배양 상층액을 회수하여 96-well plate 각 well에 50 μL씩 분주하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 표준품(Sigma)을 사용하여 표준 검량선을 확인하고 각 시료의 멜라닌 함량을 산출하였다(Ministry of Food and Drug Safety, 2020).

세포 내 멜라닌 함량 측정

세포 내 유출 멜라닌 함량 측정은 6-well cell plate에 세포를 1×10⁵ cell/well씩 분주한 뒤 24시간 동안 배양하였다. 100 nM α-MSH와 갯제비쑥 추출물 및 분획물을 각각의 농도로 처리하여 72시간 동안 배양한 후 세포 내 pellet으로 세포 내 멜라닌 함량을 측정하였다. Pellet에 DMSO가 1% 비율로 첨가된 1 N NaOH 200 μL를 분주하였다. 80~90°C에서 멜라닌을 용해하여 96-well plate에 50 μL씩 분주하고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다(Ministry of Food and Drug Safety, 2020).

역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)

B16F10 세포에 갯제비쑥 추출물과 분획물을 처리한 후 세포의 total RNA 추출은 RNeasy mini kit(Qiagen)을 사용하였으며, 추출된 RNA는 reverse transcription system kit(Promega)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 실험에 사용된 kit은 제조사의 매뉴얼을 기반으로 사용하였다. 합성된 cDNA에 각각의 멜라닌 생성조절 인자인 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 primer를 사용했고, internal control로 β-actin을 사용하였다. T100 Thermal Cycler(Bio-Rad) denaturation 하고, 60°C에서 45초 동안 annealing, 72°C에서 5분 동안 extension 한 다음 4°C에서 종결하였으며 ethidium bromide(AMRESCO) 용액에 담아 20분 염색한 후 이미지 분석 장치(Davinch-Chemi Imager^TM, CAS-400SM, WakoCo)로 mRNA 발현을 확인하였다.

Western blot 분석

각 시료의 미백 효능을 확인하기 위해 MITF, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2(Cell Signaling Technology Inc.)의 단백질 발현량을 western blot으로 측정하였다. α-MSH 처리한 B16F10 세포에 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양한 후 PBS로 세척하여 cell scraper로 회수한 다음 RIPA buffer(Sigma)를 이용하여 단백질을 분리하였다. 용해한 세포는 30분 동안 ice에 방치 후 4°C, 15,700×g 조건에서 15분 동안 원심분리하여 수득된 단백질의 농도는 BCA protein assay kit(Thermo Scientific)을 통해 정량하였다. 동량의 단백질(15~25 μg)을 SDS-PAGE법으로 전기영동 하여 분리한 후 Nitrocellulose blotting membrane(Amersham Protran Biotech)에 transfer 했으며, 5% skim milk로 1시간 동안 blocking 하였다. 이후 1×TBS-T buffer로 세척하였다. 1차 항체는 1×TBS-T에 희석하여 4°C에서 overnight 반응시키고, 이후 1×TBS-T로 세척한 뒤 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 단백질은 ECL solution을 사용하여 이미지 분석 장치(Davinch-Chemi Imager^TM, CAS-400SM)를 사용하여 결과를 확인하였다.

통계처리

모든 실험은 3회 이상 실시하여 얻은 결과를 평균±표준편차(n=3)로 나타내어 SPSS+/Win12.0(Statistical Package for Social Science, version 21, IBM)으로 분석하였다. 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 진행하였으며, P<0.05 수준으로 Duncan’s multiple range test를 통해 사후검증을 확인하였다.

추출물의 in vitro tyrosinase 저해 효과

인체 내의 멜라닌 생합성 경로에서 tyrosinase는 중요한 초기 속도결정단계에 관여한다. Tyrosinase의 저해는 이후 멜라닌 생성을 저해하는 결과로 이어진다(Koo 등, 2020). 갯제비쑥 추출물이 tyrosinase 활성 저해에 미치는 효과를 알아보기 위해 추출물을 각각의 농도 10, 20, 30, 40, 50 μg/mL로 처리하고, 기질을 tyrosine으로 하여 반응시킨 후 tyrosinase 저해 활성을 확인하였다(Fig. 1). 그 결과, 갯제비쑥 추출물의 tyrosinase 저해 활성이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였으며 갯제비쑥 추출물 50 μg/mL에서 약 26.6%까지 저해되는 것으로 확인하였다. 양성 대조군인 kojic acid 10 μM(1.4 μg/mL)에서는 약 35.4%의 저해 활성이 나타났다. 염생식물인 갯까치수염 추출물의 미백 활성에 관한 연구에서는 50 μg/mL 농도에서 24.7% 감소하는 것으로 보고된 바 있다(Jo, 2022).

Fig 1. Effect of crude extract from A. littoricola on tyrosinase inhibition (A) and L-DOPA oxidation inhibition (B). Kojic acid, a tyrosinase inhibitor, was used a positive control. Means with different letters (a-f) are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test. KA: kojic acid 10 μM.

추출물의 L-DOPA oxidation 저해 효과

DOPA는 멜라닌을 생성하는 기관인 멜라노좀 내에 존재하는 tyrosine이 반응하여 생성되는 물질로 멜라닌 합성 과정의 속도결정단계를 촉매하는 역할을 한다. Tyrosinase의 DOPA 산화반응의 활성을 저해시키면 이후 멜라닌 생성을 저해시키는 결과로 이어진다(Koo 등, 2020; Lee, 2011). 갯제비쑥 추출물이 L-DOPA에 미치는 효과를 알아보기 위해 추출물 10, 20, 30, 40, 50 μg/mL의 농도로 각각 처리하여 L-DOPA oxidation 저해 효과를 확인하였다(Fig. 1). 그 결과 L-DOPA의 활성이 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인할 수 있었으며, 갯제비쑥 추출물 50 μg/mL에서 약 40.8%까지 저해하였다. 양성 대조군인 kojic acid 10 μM에서는 약 49.4%까지 저해되는 것을 확인하였다. 염생식물인 갯질경이가 B16F10 세포에서 멜라닌 합성에 미치는 영향을 조사한 연구에서 갯질경이의 추출물 농도가 증가함에 따라 tyrosinase 활성과 L-DOPA oxidation 저해 시험 결과 농도 의존적으로 억제되었다는 보고가 있다(Lee, 2017). 또한 갯까치수염 추출물의 미백 활성에 관한 연구에서는 50 μg/mL 농도에서 54.5% 감소하는 것으로 보고된 바 있다(Jo, 2022).

추출물의 세포독성 평가

살아있는 세포의 미트콘드리아 내에서 노란색의 MTT tetrazolium을 청자색의 MTT formazan으로 환원시키는 원리를 이용한 실험으로 formazan의 생성량을 측정하여 세포생존율을 평가하는 방법이다(Kim, 2011; Mosmann, 1983). 갯제비쑥 추출물이 B16F10 murine melanoma 세포의 생존에 미치는 효과를 알아보기 위해 추출물 5, 10, 20, 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 각각 처리하여 MTT assay를 통해 세포독성을 확인하였다(Fig. 2). 시료를 처리하지 않은 군을 대조군으로 설정하여 세포생존율 백분율로 계산하여 나타내었다. 그 결과 갯제비쑥 처리군 중 5, 10, 20, 25, 50 μg/mL에서 모두 90% 이상의 세포생존율을 나타내었다. 이후 실험은 90% 이상의 세포생존율을 보이는 5, 25, 50 μg/mL 추출물 농도로 선정하여 진행하였다.

Fig 2. Effect of crude extract from A. littoricola with different concentrations on viability of B16F10 murine melanoma cells. Cell viability was determined by MTT. Means with different letters (a,b) are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

추출물이 B16F10 세포 외 유출 멜라닌 함량에 미치는 영향

멜라닌은 생합성 tyrosinase 효소를 생성하고 tyrosinase의 작용으로 여러 단계의 합성 과정들을 통해 tyrosine에서 기저층의 멜라닌 세포에서 흑갈색의 색소 입자인 멜라닌이 만들어진다. 미백 효과의 검정을 위해서는 B16F10 murine melanoma 세포에서 멜라닌 생성 저해 효과를 밝히는 것이 중요하다(Kim, 2018). 갯제비쑥 추출물이 세포 수준에서 멜라닌 생성에 미치는 효과를 확인하고자 B16F10 murine melanoma 세포를 배양하여 α-MSH를 처리하여 멜라닌 합성을 유도하였고, 동시에 갯제비쑥 추출물을 처리하여 멜라닌 합성 유도 후 배지 상등액을 회수하여 세포 외 유출된 멜라닌 함량을 측정하였다(Fig. 3). 그 결과 α-MSH 처리에 의해 세포 외 유출 멜라닌 함량이 크게 증가하는 것을 관찰했으며, 갯제비쑥 추출물을 처리했을 때 멜라닌 함량을 5, 25, 50 μg/mL 농도에서 확인한 결과 각각 70.1%, 67.4%, 63.3%로 나타났다. 양성 대조군인 kojic acid 10 μM 농도에서는 34.4%의 멜라닌 함량이 확인되었다.

Fig 3. Effect of crude extract from A. littoricola on extracellular (A) and intracellular (B) melanin content of α-MSH-stimulated B16F10 murine melanoma cells. Cells were treated with or without crude extract from A. littoricola at given concentrations for 72 h. Means with different letters (a-d) are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

추출물이 B16F10 세포 내 멜라닌 함량에 미치는 영향

멜라닌은 피부의 색조를 결정하는 중요한 인자이며 표피 기저층의 melanocyte라고 불리는 색소 세포 내의 멜라노좀에서 생합성된다. 미백 효과의 효능을 확인하기 위해서는 멜라닌 생성이 B16F10 세포 내에서 저해 효과가 있는지 밝히는 것이 중요하다(Kim, 2018). 갯제비쑥 추출물이 세포 수준에서 멜라닌 생성에 미치는 효과를 확인하기 위해 α-MSH로 멜라닌 생성을 유도한 B16F10 세포에 갯제비쑥 추출물을 처리한 후 생성된 세포 내 멜라닌의 함량을 측정함으로써 멜라닌 생성 저해 활성을 평가하였다(Fig. 3). 그 결과 α-MSH 처리에 의해 melanoma 세포 내의 멜라닌 함량이 크게 증가하는 것을 확인하였고, 갯제비쑥 추출물을 처리했을 때 멜라닌 함량을 5, 25, 50 μg/mL 농도에서 확인한 결과 각각 86.2%, 74.3%, 68.9%로 나타났다. 양성 대조군인 kojic acid의 10 μM 농도에서는 66.5%의 함량을 보였으며, 갯제비쑥 추출물 처리군이 양성 대조군만큼 세포 내 멜라닌 생성 저해 활성이 있는 것으로 확인되었다.

추출물이 멜라닌 생성 관련 RNA 발현에 미치는 영향

전사조절인자인 MITF는 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 조절을 촉진하는 역할을 하여 멜라닌 합성 과정에서 중요한 인자로 알려져 있다(Table 1). 멜라닌은 황색과 적색을 띠는 pheomelanin과 검은색과 갈색을 띠는 eumelanin이 있다. Tyrosinase는 이 두 가지의 멜라닌 합성에 필요하며 TRP-1과 TRP-2는 검은색과 갈색을 띠는 eumelanin의 합성에 더 많이 관여한다고 알려져 있다(Imokawa와 Mishima, 1982; Manga, 2006). 갯제비쑥 추출물이 α-MSH의 자극을 통해 유도된 tyrosinase 활성 및 멜라닌 생성이 억제되는 것을 확인한 후 α-MSH로 멜라닌을 유도한 B16F10 murine melanoma 세포에 갯제비쑥을 5, 25, 50 μg/mL로 처리한 후에 멜라닌 합성에 관계된 주요 인자인 MITF와 조절인자인 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2가 mRNA 수준에서의 발현에 미치는 영향을 확인하였다(Fig. 4). 그 결과 α-MSH의 처리에 의해 MITF의 mRNA 발현이 증가하였고, 갯제비쑥 추출물을 처리했을 때 MITF의 발현이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 전사조절인자인 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2는 α-MSH 처리에 의해 mRNA의 발현이 크게 증가했으며, 갯제비쑥 추출물 처리로 인해 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 발현이 농도 의존적으로 감소하였다. 따라서 멜라닌 생성과 관련된 MITF, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2 인자를 mRNA 수준에서 발현을 억제함으로써 갯제비쑥 추출물은 멜라닌 생성을 억제하는 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다.

Table 1 . Gene-specific primers used for the RT-PCR.

Gene	Direction	Sequence
MITF	Forward Reverse	5′-AAC-CGA-CAG-AAG-AAG-CTG-GA-3′ 5′-ACA-AGT-TCC-TGG-CTG-CAC-TT-3′
Tyrosinase	Forward Reverse	5′-TTA-TGC-GAT-GGA-ACA-CCT-GA-3′ 5′-ACT-GGC-AAA-TCC-TTC-CAG-TG-3′
TRP-1	Forward Reverse	5′-AGG-AAT-CTG-GCT-TGG-GAT-TT-3′ 5′-AGA-AGA-CAG-GGG-TGC-TCA-GA-3′
TRP-2	Forward Reverse	5′-AGC-AGA-CGG-AAC-ACT-GGA-CT-3′ 5′-GCA-TCT-GTG-GAA-GGG-TTG-TT-3′
β-Actin	Forward Reverse	5′-CCA-CAG-CTG-AGA-GGG-AAA-TC-3′ 5′-AAG-GAA-GGC-TGG-AAA-AGA-GC-3′

Fig 4. Effect of crude extract from A. littoricola on mRNA (A) and protein (B) expression levels of melanogenesis-related factors in α-MSH-stimulated B16F10 murine melanoma cells. Cell were treated with or without crude extract from A. littoricola at given concentrations for 72 h. Bands were densiometrically quantified, normalized against internal loading control β-actin and given as relative percentage of untreated control group. Means with different letters (a-f) are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

추출물이 멜라닌 생성 관련 단백질 발현에 미치는 영향

MITF는 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2와 같은 멜라닌 합성 과정의 핵심 효소에 대해 전사인자로 작용한다. 미백 관련 인자들은 멜라닌 합성 인자들의 발현 조절을 통해 미백 효능 검증을 할 수 있다. 또한 피부 미백소재 개발에 있어 MITF, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2 활성 저해 실험이 일차평가법으로 유용하게 인정되고 있다(Hwang, 2012; Kim 등, 2014; Kim 등, 2016). mRNA 발현에서의 결과를 확인한 후 단백질 수준에서 MITF는 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2 발현을 알아보기 위해 B16F10 murine melanoma 세포에 갯제비쑥 추출물 5, 25, 50 μg/mL를 농도별로 처리하여 western blot을 통해 단백질의 발현 정도를 관찰하였다(Fig. 4). 그 결과 α-MSH의 처리에 의해 MITF 발현이 증가하였고, 갯제비쑥 추출물을 처리했을 때 MITF의 단백질 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 전사조절인자인 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2는 α-MSH 처리에 의해 단백질의 발현이 크게 증가했으며, 갯제비쑥 추출물 처리로 tyrosinase 및 TRP-2의 단백질 발현이 농도 의존적으로 감소하였다. 또한 TRP-1 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 멜라닌 생성과 관련된 MITF, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2 인자를 단백질 수준에서 발현을 억제함으로써 갯제비쑥 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과를 확인할 수 있었다.

분획물의 in vitro tyrosinase 저해 효과

갯제비쑥 분획물이 tyrosinase 저해에 미치는 효과를 알아보기 위해 분획물(H₂O, n-butanol, 85% aq. MeOH, n-hexane)을 10, 20, 30, 40, 50 μg/mL 농도로 각각 처리하고, tyrosine을 기질로 반응시켜 tyrosinase 저해 활성을 확인하였다(Fig. 5). 그 결과, 갯제비쑥 분획물의 tyrosinase 저해 활성이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. H₂O층에서는 12.4%, 14.7%, 18.3%, 21.7%, 24.2%로 n-butanol층에서는 17.1%, 19.5%, 20.7%, 22.0%, 23.9%로, 85% aq. MeOH층에서는 22.8%, 24.9%, 26.3%, 29.0%, 32.4%로, n-hexane층에서는 9.2%, 15.8%, 20.1%, 26.2 %, 30.5%로 tyrosinase 활성이 저해되는 것을 확인하였다. 또한 양성 대조군인 kojic acid 10 μM에서는 약 35.4%로 tyrosinase 활성이 저해되는 것으로 확인되었으며, 효과가 가장 좋은 85% aq. MeOH층에서 양성 대조군인 10 μM kojic acid와 유사한 효과가 나타나는 것을 확인하였다.

Fig 5. Effect of solvent fractions from A. littoricola on tyrosinase inhibition in vitro. Kojic acid, a tyrosinase inhibitor, was used a positive control. Means with different letters (a-o) are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test. KA: kojic acid 10 μM.

분획물의 L-DOPA oxidation 저해 효과

갯제비쑥 분획물이 L-DOPA oxidation에 미치는 효과를 알아보기 위해 분획물(H₂O, n-butanol, 85% aq. MeOH, n-hexane)을 10, 20, 30, 40, 50 μg/mL 농도로 각각 처리하여 L-DOPA oxidation 저해 효과를 확인하였다(Fig. 6). 그 결과 갯제비쑥 분획물의 L-DOPA oxidation 저해 효과가 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. H₂O층에서는 14.2%, 18.6%, 21.9%, 24.9%, 33.7%로, n-butanol층에서는 17.9%, 21.1%, 23.6%, 28.5%, 33.3%로, 85% aq. MeOH층에서는 18.4%, 21.7%, 25.4%, 31.7%, 36.4%로, n-hexane층에서는 18.8%, 19.8%, 24.4%, 30.3%, 32.8%로 L-DOPA oxidation이 저해되는 것으로 확인되었다. 또한 양성 대조군으로 사용한 kojic acid 10 μM에서는 약 49.4%로 L-DOPA oxidation의 활성이 저해되는 것으로 확인하였다.

Fig 6. Effect of solvent fractions from A. littoricola on the oxidation inhibition of L-DOPA. Kojic acid, a tyrosinase inhibitor, was used a positive control. Means with different letters (a-k) are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test. KA: kojic acid 10 μM.

분획물의 세포독성 평가

갯제비쑥 분획물이 B16F10 murine melanoma 세포에서 세포생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 분획물(H₂O, n-butanol, 85% aq. MeOH, n-hexane)을 1, 5, 15, 20, 50, 100 μg/mL 농도로 처리하여 MTT assay를 통해 세포독성을 평가하였다(Fig. 7). 시료를 처리하지 않은 군을 대조군으로 설정하여 세포생존율로 계산하여 나타내었다. 그 결과 H₂O층 50 μg/mL 농도에서 약 94.3% 생존율을 나타내었으며, n-butanol층 50 μg/mL 농도에서 세포생존율이 약 96.8%로 나타났다. 85% aq. MeOH층 20 μg/mL 농도에서 98.6%의 생존율을 확인하였으며 n-hexane은 20 μg/mL에서 97.6%의 생존율을 확인하였다. 이후 실험은 모든 분획물의 90% 이상의 세포생존율을 보이는 1, 5, 20 μg/mL 농도로 선정하여 진행하였다.

Fig 7. Effect of solvent fractions from A. littoricola with different concentrations on viability of B16F10 murine melanoma cells. Cell viability was determined by MTT. Means with different letters (a-c) are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

분획물이 B16F10 세포 외 유출 멜라닌 함량에 미치는 영향

갯제비쑥 분획물(H₂O, n-butanol, 85% aq. MeOH, n-hexane)이 세포 수준에서 멜라닌 생성에 미치는 효과를 확인하고자 B16F10 murine melanoma 세포를 배양하여 α-MSH를 처리하여 멜라닌 합성을 유도하였고 동시에 갯제비쑥 분획물을 1, 5, 20 μg/mL 농도로 처리했으며, 멜라닌 합성 유도 후의 배지 상등액을 회수하여 세포 외 유출된 멜라닌의 함량을 측정함으로써 멜라닌 생성 저해 활성을 평가하였다(Fig. 8). 그 결과 ɑ-MSH 처리에 의해 세포 외 유출 멜라닌 함량이 크게 증가하는 것으로 관찰되었다. 갯제비쑥 분획물을 각각 1, 5, 20 μg/mL 농도로 처리했을 때 멜라닌의 함량이 H₂O층에서 58.1%, 48.6%, 44.5%로, n-butanol에서 51.5%, 47.7%, 41.4%로, 85% aq. MeOH에서 42.9%, 39.2%, 33.2%로, n-hexane에서 51.1%, 40.7%, 35.1%로 감소하는 것을 확인하였다. 양성 대조군인 10 μM kojic acid의 멜라닌 함량은 34.4%로 나타났다. 세포 외 유출 멜라닌 함량이 가장 높은 분획물은 85% aq. MeOH인 것으로 확인하였으며, 또한 양성 대조군인 10 μM kojic acid와 유사한 효과가 있는 것으로 확인하였다.

Fig 8. Effect of solvent fractions from A. littoricola on intracellular melanin content of B16F10 murine melanoma cells. Cells were treated with or without solvent fractions from A. littoricola at given concentrations for 72 h. Means with different letters (a-h) are significantly different (P&#60;0.05) by Duncan’s multiple range test. KA: kojic acid 10 μM.

분획물의 B16F10 세포 내 멜라닌 함량에 미치는 영향

갯제비쑥 분획물(H₂O, n-butanol, 85% aq. MeOH, n-hexane)이 세포 수준에서 멜라닌 생성에 미치는 효과를 확인하기 위해 α-MSH로 멜라닌 생성을 유도한 B16F10 세포에 갯제비쑥 분획물을 1, 5, 20 μg/mL 농도별로 처리한 후, 생성된 세포 내 멜라닌의 함량을 측정함으로써 멜라닌 생성 저해 활성을 평가하였다(Fig. 9). 그 결과 α-MSH 처리에 의해 melanoma 세포 내의 멜라닌 함량이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 갯제비쑥 분획물을 1, 5, 20 μg/mL 농도별로 처리했을 때 세포 내 멜라닌 함량이 H₂O층에서 95.0%, 92.5%, 86.0%로, n-butanol에서 94.4%, 83.8%, 73.6%로, 85% aq. MeOH에서 82.2%, 75.5%, 67.2%로, n-hexane에서 92.6%, 81.1%, 70.3%로 감소하는 것을 확인하였다. 양성 대조군인 10 μM kojic acid의 멜라닌 함량은 66.5%로 나타났다. 가장 효과가 좋은 85% aq. MeOH 20 μg/mL 농도에서 양성 대조군과 유사한 효과를 가진 것으로 나타났다.

Fig 9. Effect of solvent fractions from A. littoricola on intracellular melanin content of B16F10 murine melanoma cells. Cells were treated with or without solvent fractions from A. littoricola at given concentrations for 72 h. Means with different letters (a-h) are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test. KA: kojic acid 10 μM.

분획물이 멜라닌 생성 관련 RNA 발현에 미치는 영향

갯제비쑥 분획물(H₂O, n-butanol, 85% aq. MeOH, n-hexane)이 tyrosinase 활성 및 멜라닌 생성을 억제하는 것을 확인한 후 ɑ-MSH로 멜라닌을 유도한 B16F10 murine melanoma 세포에 갯제비쑥 분획물 1, 5, 20 μg/mL의 농도로 처리한 후 멜라닌 합성에 관계된 주요 인자인 MITF, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2가 mRNA 수준에서 발현에 미치는 영향을 확인하였다(Fig. 10). 그 결과 ɑ-MSH로 MITF의 mRNA 발현이 증가하였고, 갯제비쑥 분획물의 처리로 MITF의 mRNA 발현이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 전사조절인자인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2는 ɑ-MSH의 처리로 mRNA 발현이 증가하였고, 갯제비쑥 분획물의 처리로 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 mRNA 발현이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 특히 85% aq. MeOH층에서 mRNA의 발현이 저해되는 것으로 나타났다. 따라서 멜라닌 생성과 관련된 MITF, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2 인자를 mRNA 수준에서 발현을 억제함으로써 갯제비쑥 분획물은 멜라닌 생성을 억제하는 효과를 가지는 것으로 확인할 수 있었다.

Fig 10. Effect of solvent fractions from A. littoricola on mRNA expression levels of melanogenesis-related factors in α-MSH-stimulated B16F10 murine melanoma cells. Cells were treated with or without solvent fractions from A. littoricola at given concentrations for 72 h. Bands were densiometrically quantified, normalized against internal loading control β-actin and given as relative percentage of untreated control group. Means with different letters (a-f) are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

분획물이 멜라닌 생성 관련 단백질 발현에 미치는 영향

mRNA 발현에서의 결과를 확인한 후 멜라닌 합성에 관련된 주요 인자들이 단백질 발현이 B16F10 murine melanoma 세포에 미치는 영향을 확인하기 위해 갯제비쑥 분획물(H₂O, n-butanol, 85% aq. MeOH, n-hexane)을 각각 1, 5, 20 μg/mL의 농도로 처리하여 western blot을 이용하여 MITF, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 단백질 수준에서의 발현 정도를 관찰하였다(Fig. 11). 그 결과 ɑ-MSH 처리에 의해 MITF 발현이 증가하였고, 갯제비쑥 분획물을 처리했을 때 MITF의 단백질 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 전사조절인자인 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2는 ɑ-MSH 처리로 단백질의 발현이 크게 증가했으며, 갯제비쑥 분획물 H₂O층과 n-butanol층에서 MITF, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 단백질 발현이 농도 의존적으로 감소하였다. 85% aq. MeOH층과 n-hexane층에서는 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 단백질 발현이 농도 의존적으로 감소하였다. 따라서 멜라닌 생성과 관련된 MITF, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2 인자를 단백질 수준에서 발현을 억제함으로써 갯제비쑥 분획물은 멜라닌 생성을 억제하는 효과를 가지는 것으로 확인할 수 있었다. 또한 갯제비쑥 분획물 85% aq. MeOH 20 μg/mL를 처리했을 때 MITF 발현이 대조군인 kojic acid 10 μM과 유사한 효과가 있음을 확인하였다.

Fig 11. Effect of solvent fractions from A. littoricola on protein expression levels of melanogenesis-related factors in α-MSH-stimulated B16F10 murine melanoma cells. Cells were treated with or without solvent fractions from A. littoricola at given concentrations for 72 h. Bands were densiometrically quantified, normalized against internal loading control β-actin and given as relative percentage of untreated control group. Means with different letters (a-f) are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

본 연구에서는 국화과(Asteraceae) 쑥속(Artemisia)에 속하는 갯제비쑥(Artemisia littoricola) 용매 추출물 및 분획물 단계에서 미백 기능성을 확인하여 천연물 화장품 첨가물의 개발 가능성을 확인하고자 하였다. 갯제비쑥 추출물에 대한 in vitro tyrosinase를 확인한 결과, 추출물의 농도가 증가함에 따라 tyrosinase 저해 활성이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한 L-DOPA oxidation을 측정한 결과, 농도 의존적으로 저해되는 것을 확인하였다. 용매 추출물의 활성을 확인한 후 B16F10 murine melanoma 세포 수준에서의 효과를 확인하였다. 세포의 유출 멜라닌 함량 및 세포 내 멜라닌 함량을 측정한 결과 농도 의존적으로 저해되는 것을 확인하였다. 멜라닌 합성에 주요한 인자들인 MITF, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 mRNA 및 단백질의 발현을 확인하기 위해 RT-PCR 및 western blot을 진행했으며, 그 결과 α-MSH 처리에 의해 멜라닌 생성 관련 인자들의 발현이 증가하였고 갯제비쑥 추출물을 5, 25, 50 μg/mL 농도로 처리했을 때 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 추출물 실험을 한 후 갯제비쑥 분획물(H₂O, n-butanol, 85% aq. MeOH, n-hexane)의 in vitro tyrosinase 활성 저해 시험을 확인한 결과, 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인했으며, 특히 50 μg/mL 85% aq. MeOH이 가장 높은 효과를 나타냈다. 갯제비쑥 분획물로 L-DOPA oxidation 저해 활성을 측정한 결과 또한 50 μg/mL 85% aq. MeOH의 활성이 가장 높게 나타났다. 세포 수준에서 갯제비쑥 분획물이 세포 생존에 미치는 효과를 확인하였다. 세포 외 유출 멜라닌과 세포 내 멜라닌 함량을 측정한 결과, 세포 외 유출 멜라닌 함량은 20 μg/mL H₂O가 멜라닌이 세포 외로 가장 많이 유출되었음을 확인할 수 있었다. 또한 세포 내 멜라닌 함량을 측정한 결과 20 μg/mL 85% aq. MeOH이 가장 낮은 것을 확인할 수 있었다. 멜라닌 합성에 주요한 인자들인 MITF, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 mRNA 및 단백질 발현을 확인하기 위해 RT-PCR 및 western blot을 진행했고, 그 결과 α-MSH 처리에 의해 멜라닌 생성 관련 인자들의 발현이 증가했으며, 갯제비쑥 분획물을 처리했을 때 농도 의존적으로 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 갯제비쑥 추출물과 분획물은 α-MSH 처리로 멜라닌 생성을 유도한 B16F10 세포에서 멜라닌 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 분획물 중 85% aq. MeOH은 MITF를 통한 멜라닌 생성을 제어하여 피부 미백효과를 가지는 천연물 유래 기능성 소재의 개발이 가능할 것으로 기대된다.

이 논문은 2022년도 해양수산부 재원으로 해양수산과학기술진흥원의 지원을 받아 수행된 연구임(20220259, 해안습지식물 갯제비쑥으로부터 피부개선 화장품 소재 개발). 또한, 본 논문은 부산광역시 및 (재)부산인재평생교육진흥원의 BB21플러스 사업으로 지원된 연구임