세계당뇨병연맹(International Diabetes Federation)은 2021년 20~79세 전 세계 인구의 5억 3,700만 명이 당뇨병 환자이며, 2045년에는 7억 8,300만 명으로 증가할 것으로 예측하였다(Sun 등, 2022). 우리나라도 30세 이상 성인의 14%와 65세 이상 노인인구의 28%가 당뇨병 환자로 보고되었다(Jung 등, 2021). 최근 제2형 당뇨병은 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 감염 환자의 상태를 더욱 악화시키는 위험 요인으로 보고되었으며(Nassar 등, 2021), 이는 호중구 탈과립, 보체활성화의 손상, 기도의 포도당 농도 증가로 인한 바이러스 복제 증가, 과도한 전염증 사이토카인 분비, 바이러스 제거력 감소 등에 의한 것으로 제안되었다(Chatterjee 등, 2020).

식용곤충은 단백가가 높고 필수아미노산, 불포화지방산 및 무기질의 좋은 급원일 뿐만 아니라 일반 동물사육에 비해 경제적이며 낮은 온실가스 배출이라는 친환경적 장점 때문에 최근 몇 년 동안 지속 가능한 대체 동물성 단백질로의 활용에 많은 관심과 연구가 이어져 오고 있다(Finke, 2002; Ghaly와 Alkoaik, 2009; Oonincx와 de Boer, 2012). 양식 곤충들이 아시아, 아프리카 및 남아메리카 등지에서 이미 소비되고 있는데(van Huis 등, 2013), 특히 밀웜(갈색거저리 유충)은 사육과 관리가 용이하여 사람의 중요한 단백질 급원으로 각광받고 있다(Ghaly와 Alkoaik, 2009; Morales-Ramos 등, 2012). 또한 밀웜의 항비만, 항골다공증, 항암, 항산화, 항염증 등의 활성이 보고되었다(Zielińska 등, 2017). 이와 같이 유충 치료는 중세부터 실시되어 왔으며 아시아, 유럽 및 오스트리아에서 전통적 치료제로 사용되어 왔다(Cherniack, 2010). 최근에는 몇몇 식용곤충 유래 펩티드들(bioactive peptides, BAP)의 항당뇨와 항비만 효과에 관한 연구들이 이어지고 있다(Lacroix 등, 2019; Matheswaran 등, 2020). 밀웜 단백질의 몇몇 효소적 가수분해 BAP가 dipeptidyl peptidase-IV(DPP-IV) 저해 활성을 보여 혈당조절의 기능성 식품소재로 제안되었다(Lacroix 등, 2019; Rivero-Pino 등, 2021). DPP-IV는 혈당조절을 하는 장분비 호르몬인 인크레틴의 불활성에 관여하는 효소로, 이 저해제는 제2형 당뇨병 치료제로 사용되고 있다(Deacon과 Lebovitz, 2016). 또한 밀웜의 BAP들은 알파-글루코시다제를 저해하여 식후 혈당 상승을 억제하는 효과가 있다(Lacroix 등, 2019; Rivero-Pino 등, 2021). 본 연구진의 선행연구에서 밀웜 발효추출물이 비발효추출물에 비하여 유리아미노산과 필수아미노산 함량이 높아짐을 확인하였다(Ham 등, 2021). Sim 등(2020)도 갈색거저리 분말을 발효하였을 때 비발효물에 비하여 오로틴산(orotic acid)으로 유도한 지방간을 효과적으로 개선한 것으로 보고하였다. 선행연구에서도 밀웜 발효추출물이 알코올성과 비알코올성 지방간을 개선하는 데 효과적이었다(Choi 등, 2020; Ham 등, 2021). 그러나 밀웜 발효추출물의 항당뇨 효과에 관한 연구는 이루어져 있지 않다.

따라서 본 연구에서는 제2형 당뇨 동물모델인 db/db 마우스에 밀웜 발효추출물을 급여한 후 혈당과 간조직의 대사 관련 유전자들을 분석하였다.

밀웜 발효추출물 제조

밀웜은 (주)명품에서 9주간 사육하고 36~48시간 절식한 것을 구입하였다. 밀웜 발효추출물(fermented mealworm extract; MWF)은 순천바이오헬스케어연구센터에서 제공받았으며, 제조 방법은 다음과 같다. 밀웜은 헥산으로 3회 추출한 후 여과하여 지방을 제거한 후 동결건조하여 사용하였다. 효모(Saccharomyces cerevisiae, KCTC 17299)는 한국세포주은행에서 분양받았으며 발효에 사용된 배지 조성물은 이스트(yeast), 탈지 밀웜 분말, 덱스트로스(1:2:2, w/w)를 혼합하여 제조하였다. 상기 배지 조성물에 효모를 접종하여 32±2°C에서 120 rpm의 조건으로 72시간 동안 진탕 배양하여 발효하였다. 발효 배양액에 70% 주정이 되도록 조제한 후 80°C에서 2시간 동안 추출하고 여과지(Advantec No. 2, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.)를 이용하여 가압 필터한 후 회전진공농축기(Eyela Co., Ltd.)로 농축하고 동결건조하였다.

실험동물 사육

5주령 된 C57BLKS/J-db/db 수컷 마우스는 국내 (주)중앙실험동물을 통해 일본의 SLC로부터 수입하여 사용하였으며, 2주간 사육환경에 적응시킨 뒤 난괴법에 따라 당뇨 대조군(Control)과 MWF군으로 각각 6마리씩 배치하여 6주간 폴리카보네이트 사육상자에 한 마리씩 분리하여 사육하였다. MWF의 경구투여 농도는 선행연구(Choi 등, 2020)에서 효과적이었던 농도를 기준으로 체중 kg당 200 mg씩 존데를 이용하여 매일 일정한 시각에 경구투여하였으며, 대조군은 동일 양의 증류수를 투여하였다.

동물사육실의 환경은 항온(22±2°C), 항습(50±5%), 12시간 간격(08:00~20:00)의 광주기로 일정한 조건을 유지하였고 AIN-76 식이(Research Diets, Inc.)와 식수는 자유롭게 섭취(ad libitum)하도록 하였다. 체중은 매주 일정한 시간에 측정하였으며 식이섭취량은 매일 식이잔량을 측정하여 식이제공량으로부터 뺀 값을 기록하였다. 6주간 사육 후 12시간 동안 절식시킨 다음 CO₂ 가스로 흡입마취시켜 복부 하대정맥(inferior vena cava)으로부터 전혈을 채취한 후 900×g로 15분간 4°C에서 원심분리(Hanil Scientific Inc.)하여 혈청을 분리하였다. 간조직은 적출하여 생리식염수로 헹군 뒤 표면의 수분을 제거하고 액체질소에 급랭시킨 후 -80°C에 보관하였다. 본 실험은 순천대학교 동물실험 윤리위원회에서 심의 및 승인(SCNU IACUC-2021-01)되었으며 사육지침에 따라 수행되었다.

혈당, 내당능 검사 및 혈청의 인슐린 함량 측정

주별 혈당은 매주 6시간 절식 후 꼬리 채혈하여 혈당측정기(G-doctor, Allmedicus)로 측정하였으며, 내당능 검사(glucose tolerance test)는 실험 6주째에 6시간 절식 후 체중 kg당 포도당 용액을 1 g씩 경구투여한 다음 0, 30, 60, 120분에 혈당을 측정하였다. 혈청의 인슐린 농도는 quantitative sandwich enzyme immunoassay kit(Morinaga Institute of Biological Science)을 사용하여 측정하였다.

췌장조직의 형태학적 분석

췌장조직은 10% 포름알데히드 용액에 24시간 고정한 다음 수세하였으며, 60% 에탄올로부터 상승농도로 탈수하고 파라핀에 포매하여 4 μm 두께로 박절하였다. 이후 hematoxylin-eosin(H&E) 염색한 다음 광학현미경(Leica)을 이용하여 200배 배율로 관찰하였다. 또한 췌장의 베타세포에서 인슐린 농도를 관찰하기 위하여 위와 같은 방법으로 조직절편을 제작한 후 avidinbiotin complex 방법으로 베타세포의 인슐린 면역조직화학적 염색을 하여 동일한 방법으로 관찰하였다.

간조직의 글리코겐 함량 측정

글리코겐 함량은 Seifter 등(1950)의 방법을 수정･보완하여 측정하였으며 간조직 1 g과 30% KOH 용액을 균질화한 용액을 100°C에서 30분간 가열한 뒤 에탄올로 침전시키고 증류수에 용해했다. 여기에 안트론(anthrone) 시약을 첨가하여 10분간 100°C에서 반응시킨 후 microplate reader(Versamax, Molecular Devices, LLC)를 이용하여 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후 포도당 표준액을 이용하여 정량하였다.

간조직 중의 RNA 분리 및 real-time PCR 분석

총 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen)으로 추출하여 정제하였으며, 추출된 RNA는 NanoDrop(Thermo Fisher Scientific)으로 정량하였다. 이후 SuperiorScript Ⅲ cDNA synthesis kit(Enzynomics)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. mRNA 발현은 SYBR green PCR kit(Enzynomics)과 CFX96 Touch^TM real-time PCR detection system(Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 이용하여 real-time PCR 분석을 하였다. Threshold cycle(Ct) 값은 형광커브와 역치선이 만나는 cycle 값으로 CFX3.1(Bio-Rad Laboratories)로 분석하였다.

유전자 발현은 각각 동일한 시료의 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(Gapdh) 발현을 측정하여 정량하였으며, 2^-ΔΔCt 방법(Livak과 Schmittgen, 2001)을 사용하여 산출하였다. 본 실험에서 분석한 유전자의 primer sequence는 다음과 같다. Gapdh forward: AAGGTCATCCCAGAGCTGAA, reverse: CTGCTTCACCACCTTCTTGA; glucose transporter 2(Glut2) forward: TCACTGCTGTACTGAGTTCCTTCC, reverse: CTGGTGTTGTGTATGCTGGTGTG; glycogen synthase 2(Gys2) forward: GCTGAGAGGGATCGGCTAAATA, reverse: GGGCAGCTCATTTTCTTGTG.

통계처리

실험 결과는 SPSS(version 26.0, SPSS Inc.)를 이용하여 통계학적으로 분석하였으며 결괏값은 평균±표준오차로 나타내었다. 각 군 간 평균치의 통계적 유의성 검정은 P<0.05 수준에서 Student’s t-test를 실시하였다.

MWF 보충이 db/db 마우스의 공복 혈당 및 내당능 변화에 미치는 영향

제2형 당뇨병 환자에서 공복혈당의 상승은 말초동맥질환 발생과 연관이 있으며 심혈관계 사망률과 양의 상관관계가 있다(Jang과 Jung, 2022). 이와 같이 공복혈당은 당뇨병 발병과 합병증에 밀접한 관련이 있으므로 당뇨병 치료 시 중요한 지표로 활용된다. 본 실험에 사용된 제2형 당뇨병 동물모델인 db/db 마우스는 렙틴 수용체의 변이로 인해 식욕이 조절되지 않아 비만이 유도되고 인슐린 저항성, 고인슐린혈증 등으로 혈당이 점차 높아지는 특성이 있어서 제2형 당뇨병 연구에 보편적으로 사용된다(Lee 등, 2021). 따라서 본 실험에서는 db/db 마우스를 이용하여 MWF가 공복 혈당에 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과 실험 5주째부터 MWF군의 공복혈당이 대조군에 비해 유의적으로 낮았으며 실험종료인 6주에는 14% 감소하였다(Fig. 1). Kim 등(2019)의 결과에서도 밀웜 열수추출물이 db/db 당뇨 마우스의 혈당 개선에 효과를 보여 본 결과와 일치하였다.

Fig 1. Effects of MWF on fasting blood glucose, glucose tolerance test, and AUC in C57BLKS/J-db/db mice. Values are expressed as the means±SE. Values are significantly different between groups according to Student’s t-test. ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001. AUC: area under the curve.

MWF가 내당능 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실험 6주 차에 내당능 검사를 하였다. 내당능은 체내 포도당의 처리능력으로 췌장 베타세포에서 분비되는 인슐린의 분비 및 혈당 상승에 대한 췌장의 민감성을 반영하는 지표이다(Cobelli 등, 2007). 대조군의 경우 포도당 주입 60분 후에 593.66 mg/dL로 최대 혈당수치를 기록하였으며 120분 후에도 533.50 mg/dL로 혈당 감소 속도가 느린 반면, MWF군은 포도당 주입 30분 후에 혈당 최댓값을 나타낸 후 60분에는 대조군의 혈당보다 유의적으로 낮았다(Fig. 1). 내당능 검사 결과를 혈당의 곡선하면적(area under the curve)으로 산출한 결과, MWF는 대조군에 비해 유의적으로 낮아 MWF의 내당능 개선을 확인하였다(Fig. 1). Samsul 등(2020)의 연구에서도 4주간 갈색거저리 분말(체중 kg당 45 mg 또는 90 mg)을 급여한 스위스 웹스터(Swiss Webster) 마우스에서 내당능 장애가 개선되었다. 본 연구에서 MWF는 식이섭취량과 체중에는 영향을 미치지 않으므로(Fig. 2) 체중감량에 의한 혈당조절이 아닌 것으로 판단된다.

Fig 2. Effects of MWF on final body weight, food intake, and serum insulin level in C57BLKS/J-db/db mice. Values are expressed as the means±SE.

MWF 보충이 db/db 마우스의 혈청 인슐린 및 췌장 면역조직학적 변화에 미치는 영향

간과 지방조직을 포함한 조직의 인슐린 저항성과 췌장 베타세포의 인슐린 분비장애는 제2형 당뇨병의 대표적인 특징이다(Omori 등, 2019). 인슐린 저항성이 진행되면 제2형 당뇨병과 관련된 다양한 대사질환 합병증을 유발하기 때문에 혈청의 인슐린 함량 조절은 당뇨병 개선에 필수적인 요인이다(Kwon 등, 2020). 본 실험에서 MWF는 혈청 중의 인슐린 농도에 유의적인 영향을 미치지 않았으나(Fig. 2), 췌장조직의 인슐린 면역화학적 변화에서 MWF군의 인슐린 염색이 대조군보다 더 진하고 크게 나타났다(Fig. 3). 또한 췌장조직의 H&E 염색 결과에서도 대조군에 비해 MWF군에서 췌장 형태가 뚜렷하고 변형이 적은 것으로 보였다(Fig. 3).

Fig 3. Effects of MWF on pancreas insulin immunohistochemistry and H&E staining in C57BLKS/J-db/db mice. Magnification 200×.

제2형 당뇨병 발생 초기에는 인슐린 저항성으로 인해 인슐린 민감성이 낮아지며 이로 인해 체내 항상성 유지를 위해 많은 양의 인슐린이 분비되어 고인슐린혈증이 유도되나(Kim 등, 2022), 고혈당이 지속되면 췌장 랑게르한스섬의 붕괴와 축소가 일어나 베타세포가 손상되면서 인슐린 분비가 감소하는 특징을 보인다(Kim 등, 2012). 따라서 MWF군에서 혈청 인슐린 농도가 증가하지 않았으나 공복혈당과 내당능이 개선된 것으로 미루어, MWF는 췌장의 베타세포 보호와 인슐린 민감성을 개선하는 데 유효한 것으로 사료되어 향후 관련 지표의 연구가 필요하다.

MWF 보충이 db/db 마우스의 간조직 내 글리코겐 합성에 미치는 영향

제2형 당뇨 마우스에서 MWF의 혈당 개선 효과의 기전을 살피기 위하여 간조직의 글리코겐 함량을 측정한 결과 MWF군의 글리코겐 함량이 대조군에 비해 1.4배 유의적으로 높았다(Fig. 4). 간조직의 글리코겐은 체내 포도당의 저장 형태로 포도당 대사의 주요 지표이며 글리코겐 합성 장애는 고혈당증과 당뇨병을 유발한다고 알려져 있다(Kuai 등, 2016). 따라서 당뇨병으로 인하여 높아진 혈당을 정상화하기 위해 글리코겐 합성을 촉진하는 것은 당뇨병 예방 및 치료에 매우 중요하다(Wang 등, 2018). Ros 등(2010)은 간조직의 글리코겐 합성 증가가 당내성을 개선하는 것으로 보고하였다. 이와 같이 MWF는 제2형 당뇨병의 간조직의 글리코겐 함량을 증가시켜 혈당 개선에 기여하는 것으로 판단되므로 관련 유전자 발현을 측정하였다.

Fig 4. Effects of MWF on hepatic glycogen content and gene levels of Glut2 and Gys2 in C57BLKS/J-db/db mice. Values are expressed as the means±SE. Values are significantly different between groups according to Student’s t-test. ^*P<0.05. Glut2: glucose transporter 2, Gys2: glycogen synthase 2.

혈중의 포도당 함량이 높으면 GLUT2 수송체를 통해서 포도당은 간세포로 이동하여 글루코키나아제(glucokinase)에 의해 포도당-6-인산으로 인산화되어 글리코겐으로 전환된다(Yang 등, 2021). 본 연구 결과에서 MWF는 간조직의 Glut2 유전자 발현을 대조군에 비해 3.3배 유의적으로 상향 조절하였으며, 글리코겐 합성에 관여하는 Gys2의 유전자 발현 역시 MWF군에서 대조군에 비하여 각각 4.4배 유의적으로 상향 조절되었다(Fig. 4). GYS2는 글리코겐 합성 최종 단계에서 우리딘 이인산 포도당(uridine diphosphate glucose)에 글리코실기가 결합하는 것을 촉진하여 글리코겐 합성을 유도한다(Soto-Luna 등, 2021). 이와 같이 MWF는 Glut2와 Gys2 유전자 발현을 높여 혈액의 포도당을 간세포로 빠르게 유입하고 글리코겐 합성을 촉진하여 혈당 개선에 기여한 것으로 판단된다.

본 연구에서는 밀웜 발효추출물(MWF)이 당뇨병에 미치는 영향을 확인하기 위하여 db/db 마우스에서 혈당, 췌장의 인슐린 면역조직학적 변화 및 글리코겐 함량과 관련 유전자 발현을 측정하였다. MWF(200 mg/kg/d) 경구 보충 시 5주 차부터 대조군에 비해 유의적으로 혈당이 낮아졌으며, 실험종료 시(6주) 내당능 장애 역시 개선되었다. MWF는 혈청의 인슐린 함량에는 유의적인 영향을 미치지 않았으나 MWF의 췌장 세포 내 랑게르한스섬 크기가 대조군에 비해 크고 뚜렷하였으며 베타세포의 인슐린 함량이 높았다. MWF는 간조직 내 포도당수송에 관여하는 Glut2 유전자와 글리코겐 합성에 관여하는 Gys2 유전자의 발현을 상향 조절하였으며, 이는 MWF군의 간조직 내 글리코겐 함량이 대조군에 비하여 유의적으로 높았음을 뒷받침한다. 이와 같이 MWF는 혈중의 포도당을 간조직으로 이동하여 저장 형태인 글리코겐으로 합성하여 혈당을 낮추는 데 기여하는 것으로 보인다. 따라서 MWF는 당뇨병을 예방하거나 개선하기 위한 식품소재로서의 가능성을 입증하였다.

이 성과는 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No. NRF-2020R1A2C1009008).