대두(Glycine max L.)는 전 세계에서 재배되는 고단백, 고지질의 영양 식품이며, 우리나라에서는 오랫동안 식생활에서 쌀 다음으로 중요한 부분을 차지하여 쌀, 보리 등 곡류를 주식으로 하는 우리나라 식사 패턴에서 단백질과 지방의 공급원으로 중요한 역할을 해왔다(Kim 등, 2003; Medic 등, 2014). 대두의 단백질은 식물성 단백질로 건조 중량의 35%는 glycinin과 β-conglycinin으로 구성되어 있어 동물성 단백질의 대체재 및 영양 공급원으로 이용되고 있다(Sanjukta와 Rai, 2016). 또한 대두의 단백질은 high density lipoprotein(HDL) 콜레스테롤의 감소 없이 low density lipoprotein(LDL) 콜레스테롤, 총콜레스테롤 및 중성지방을 감소시키는 효과가 있어 심혈관계 건강 증진에 도움을 주고 동맥경화 진행을 늦추는 것으로 알려져 있으며, 필수 아미노산의 적절한 공급을 통해 근육량을 보존시키는 것으로 알려져 있다(Kim, 2018). 특히 대두로부터 분리, 농축하여 단백질의 함량이 90% 이상 되도록 제조한 분리대두단백은 수화력이 뛰어나고 생산 비용이 적어 식품의 증량제, 증점제, 환자용 유동식, 우유 단백질 대체품 등 다양한 범위에서 사용되고 있다(Jo 등, 2014).

이러한 대두의 구성 아미노산 중에서도 branched-chain amino acid(BCAA)는 필수 아미노산인 leucine, isoleucine과 valine을 뜻하며 다양한 생체 기능을 가지는 것으로 알려져 있다(Fernstrom 등, 2005). BCAA는 근육 세포의 대사를 촉진하고(Lundholm 등, 1987) 운동 전후에 근육의 손상을 줄여주고 근육의 합성을 증가시키는 데 효과를 보이는 것으로 알려져 있으며(Shimomura 등, 2004), 인슐린 신호전달, 지질대사 등에 중요한 조절인자로 작용한다(Yao 등, 2016). 또한 BCAA는 간에서 대사 작용을 하는 일반적인 아미노산과 달리 근육에서 산화되면서 대사 매개 물질로 사용되어 에너지로 이용되고 운동효과보조물(ergogenic aids)의 역할을 할 수 있는 것으로 알려져 있으며(So 등, 2006), 이에 따른 BCAA 섭취가 운동 능력을 높여 준다는 연구 결과가 보고되어 있다(Kim 등, 2011; Lee 등, 2002).

이러한 기능으로 단백질 제품 시장에서도 BCAA를 기반으로 하는 제품군이 출시되고 있으며, 국내에서는 수요 대상의 범위가 전문 운동선수에서 일반인 및 노년층으로 확대되면서 2011년 350억에서 2015년 710억으로 크게 성장하였다. 단백질 제품의 소재로는 크게 대두단백과 유청단백이 있으며, 대두단백은 소화력이 높고 혈청콜레스테롤 수준을 감소시키는 생리학적 기능이 우수하여 다양하게 이용되고 있다(He 등, 2020; Kim, 2008; Singh 등, 2008). 또한 유청단백은 용해성, 유화작용 등의 높은 기능적 특성과 BCAA 함유량이 높아 다양한 제품에 이용되고 있다(Jiang 등, 2018; Kim, 2016; Yang 등, 2014). 그러나 높은 동물성 단백질의 섭취량은 심혈관질환 사망률과의 관계가 보고되어 있으며(Gurr 등, 1989), 동물성 단백질의 섭취량 일부를 식물성 단백질로 대체하였을 때 사망률이 유의미하게 낮아졌다(Song 등, 2016). 이러한 결과 외에 환경보호를 위해서도 식물성 식품에 관한 관심이 증가하며 관련 연구 또한 진행되고 있다. 이를 통해 대두단백을 사용한 근육 관련 운동보조제의 시장은 계속 성장할 것으로 예상된다(Sung과 Choi, 2018; Yu 등, 2021).

기존에 BCAA 고함유 쌀 단백질 가수 분해물의 제조 방법에 관한 연구가 수행되었으나 대부분 상업용 균주를 이용하였으며, 유산균을 이용한 BCAA 강화 단백질 보조제의 연구가 미흡하였다. 따라서 본 연구에서는 대두단백에 Bacillus amyloliquefaciens(NY124)에서 얻은 조효소를 처리하여 BCAA 함량이 증가한 대두분말 가수분해물을 제조하고자 하였으며, 유리 아미노산 조성과 단백질의 특성 변화를 알기 위해 high performance liquid chromatography(HPLC), sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) analysis, scanning electron microscope(SEM), fourier transform infrared spectroscopy(FTIR)와 전자혀 분석을 조사하였다. 또한 식물성 단백질과 동물성 단백질을 혼합하여 기능성과 물리적 특성에서 최적의 배합조건을 찾고자 대두분말과 대두분말 가수분해물, 유청단백질의 배합비를 달리해 물리적 특성과 제형 안정성이 우수한 단백질 보조제를 제조하여 대두분말 가수분해물을 첨가한 단백질 보조제의 산업화 가능성과 제품개발에 도움이 되고자 하였다.

실험재료

본 연구에 사용된 대두분말은 2021년에 (주)오순도순에서 구입하여 사용하였고, Amino Acid Standards and Reagents는 Agilent Technologies Co.에서 구입하였으며, 단백질 보조제 제조에 들어가는 식품 원료들은 ES 식품원료에서 구입하였다.

균주 배양 및 대두분말 가수분해물 제조

본 연구에 사용된 B. amyloliquefaciens(NY124, KCTC14294BP)는 간장에서 선발된 균주로, 한국생명공학연구원에 등록된 전남대 특허 균주이며, 아미노산 함량과 BCAA 생성능이 우수하여 본 실험에 사용하였다(Nam 등, 2022). B. amyloliquefaciens(NY124) 균주를 식용배지 TSB(대두분말 2%, sucrose 0.25%, sodium chloride 0.5 %, casein peptone 1.7%, disodium phosphate, pH 7)에 24시간 동안 37°C, 100 rpm에서 배양하였다. 균주 배양액은 8,000×g, 4°C에서 30분간 원심분리하여 상등액은 온도 -121°C, 진공압력 5 mTorr의 조건에서 24시간 동결건조(lyophilizer, Mareuda) 후 분말화하여 조효소로 사용하였다. 대두분말 가수분해물(SPH)은 대두분말(SP) 1 g/10 mL(w/v)에 조효소 분말을 5% 수준으로 첨가한 후 18~24시간 37°C에서 80~100 rpm으로 반응 후 100°C, 10분 처리하여 효소를 실활시켜 온도 -121°C, 진공압력 5 mTorr의 조건에서 24시간 동결건조 후 분말화하여 사용하였다.

유리 아미노산 분석(HPLC)

SP와 SPH의 유리 아미노산 조성은 각 시료 0.1 g에 증류수 10 mL를 첨가하여 100°C에서 10분 추출 후 10,000×g, 4°C에서 10분 원심분리하여 상등액을 희석하고 filter(0.2 μm)로 여과하여 분석 시료로 HPLC(Agilent 1216 infinity LC, Agilent Technologies)를 사용하여 분석하였다. 컬럼은 Advance Bio AAA(4.6×100 mm, 27 μm, Agilent Technologies)를 사용하였고, 유속은 0.8 mL/min, 컬럼 온도는 40°C에서 분석하여 338 nm에서 검출하였다. 이동상은 10 mM Na₂HPO₄, 10 mM Na₂BPO₇ buffer(pH 8.2)를 A 용매로, acetonitrile:methanol:distilled water(45:45: 10, v/v/v)를 B 용매로 하여 gradient 하고 분석하였다. 용매 구배는 A 98%, B 2%로 시작하여 13.4분에 A 43%, B 57%, 13.5분부터 15.7분까지 A 0%, B 100%, 15.8분부터 18분까지 A 98%, B 2%로 하였다. 표준품은 Agilent의 amino acid standard를 사용하였고 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 mM로 희석하여 검량선을 작성한 후 유리 아미노산을 정량하였다. 본 연구에서 제조한 단백질 보조제의 유리 아미노산 분석 또한 위 방법과 동일하게 하여 분석하였다.

SDS-PAGE

SP와 SPH의 단백질 분자량의 분포를 SDS-PAGE를 실시하여 확인하였다. 표준 단백질은 bovine serum albumin(BSA) 단백질을 사용하였으며, Bio-Rad(BCA) 단백질 kit(Sigma Aldrich Co.)을 사용해 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료를 BCA kit으로 정량된 단백질을 10~50 mg/mL로 만든 후 5배 농도의 SDS-loading buffer(0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, 10% β-mercaptoethanol)를 첨가해 비연속 SDS-PAGE gel(12~14% resolving 4% stacking)에 단백질을 크기별로 분리하여 전기영동 후 gel을 coomassie blue staining solution(Bio-Rad)으로 염색해 단백질 분자량의 분포를 분석하였다(Laemmli, 1970).

SEM과 FTIR 분석

SEM(GEMINI SEM electron microscope, Zeiss)으로 SP와 SPH의 구조변화를 측정하였다. 사진은 2,000배 배율로 조사되었다.

SP와 SPH는 FTIR spectrophotometer(PerkinElmer, Inc.)에서 4,000~450 cm-1의 파장에서 측정하여 화학적 작용기의 변화를 분석하였다. 실험 자료는 origin 8.0 software(Originlab Corporation)를 이용해 수집하여 분석하였다.

전자혀 분석

SP와 SPH의 맛은 electronic tongue(Astree, Alpha MOS)을 사용하여 측정하였다. 각 시료 0.1 g에 증류수 10 mL를 첨가하여 100°C에서 10분 추출 후 10,000×g, 4°C에서 10분 원심분리하여 상등액을 여과(Whatman No. 6, Whatman International Ltd.) 후 5배 희석하여 25 mL를 유리용기에 담아 자동시료 측정기를 이용해 분석하였다. 전자혀는 7가지 센서를 가진 모듈(Sensor array #5, Alpha MOS)을 사용하였다. 7가지 센서 중 SPS와 GPS 센서는 보정 센서값의 지표로 사용하였다. SRS(신맛, 떫은맛, 쓴맛), STS(짠맛, 매운맛, 금속맛), UMS(감칠맛, 짠맛, 떫은맛), SWS(단맛, 신맛), BRS(쓴맛, 떫은맛) 센서를 사용하였다. 신맛, 쓴맛, 단맛, 짠맛, 감칠맛을 각각 citric acid, epigallocatechine gallate, sucrose, NaCl, monosodium glutamate를 농도별로 희석해 표준곡선으로 표시하여 principle component analysis plots(PCA plot)로 도출하였다. 시료의 측정은 5회 반복하여 120초간 분석하였다. 시료 간 오염을 방지하기 위해 단일 시료의 분석 후에는 센서 세척 과정을 거쳤다. 통계 처리에는 Alpha MOS에서 제공된 소프트웨어(Alpha soft 14.1 version)를 사용하였다.

BCAA 고함유 단백질 보조제 제조

단백질 원료에 따른 단백질 보조제는 유청단백질(WPI), SP, SPH를 각각 67% 첨가하였고, SPH의 첨가량에 따른 단백질 보조제는 WPI 33%에 SPH를 각각 34%, 25%, 17%, 9%, 0%씩 다른 비율로 첨가하였다. 단백질 보조제는 요구르트 농축분말 20%, 프락토올리고당 10%, 자일리톨과 수크랄로스 혼합분말 3%를 95% 주정을 사용하여 배합하였다(Table 1). 배합 후 30 mesh로 균질화한 후 55°C 오븐에서 1시간 건조하였다. 건조된 분말을 다시 30 mesh 체로 여과하여 과립화를 잡은 후 분말 상태로 제조하였다.

Table 1 . Manufacture of protein formulas using various protein sources.

Compositions (%)	1st protein formulas			2nd protein formulas
	A	B	C	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	Ⅴ
Soybean powder	0.00	67.00	0.00	0.00	9.00	17.00	25.00	34.00
Soybean powder hydrolysate1)	0.00	0.00	67.00	34.00	25.00	17.00	9.00	0.00
Whey protein isolate	67.00	0.00	0.00	33.00	33.00	33.00	33.00	33.00
Yogurt powder	20.00			20.00
Fructooligosaccharide	10.00			10.00
Xylitol, sucralose	3.00			3.00
Total	100.00			100.00

¹⁾Soybean powder hydrolysate by NY124. 5% of crude enzyme powder was added to 1 g/10 mL (w/v) of soybean powder. After reacting at 37°C for 18 to 24 h, it was lyophilized and powdered for use..

단백질 보조제 물리적 특성

단백질 보조제의 pH, 산도, 당도, 색도는 시료 1 g을 10 mL 증류수에 용해하여 실험에 사용하였다. pH는 pH meter(Ion S220, Mettler Toledo)로 측정하였다. 산도는 1% phenolphthalein 50 µL를 첨가하고 0.1 N NaOH를 첨가 시 적색을 나타내는 시점에 소비된 NaOH 양(mL)을 구연산을 기준으로 환산하여 백분율로 표시하였다. 당도는 디지털당도계(Pocket refractometer PAL-1, ATAGO Co., Ltd.)를 이용하여 측정하였다. 색도는 시료 1 mL를 표준 백색 L=86.31, a=-0.45, b=0.79로 교정한 색차계(NS800 Spectrophotometer, 3nh)를 이용하여 L(lightness), a(redness), b(yellowness) 및 ΔE(color difference)를 측정하였다.

단백질 보조제의 제형 안정성

제형 안정도를 조사하기 위해 단백질 보조제의 용해도(solubility), 흐름성(flowability), 수분 흡수력(water holding capacity), 지방 흡수력(oil holding capacity), 팽윤력(swelling capacity)을 조사하였다.

용해도는 시료 0.5 g에 증류수 10 mL를 첨가한 후 상온에서 vortex를 이용하여 약 30초간 혼합하고 혼합물을 25°C에서 24시간 동안 정치시켰다. 그 후 원심분리기를 이용해 4,000×g에서 10분간 원심분리 후 상등액을 제거하여 침전물의 건조 무게를 측정한 뒤 다음 식에 따라 용해도를 구하였다.

$$Solubility\left(\%\right)＝\{1－(W_{dry}/W_{sample})\}\times 100$$

흐름성은 시료 10 g을 취하여 입구 지름 75 mm, 출구 지름 12 mm인 깔때기를 통해 80 mm 아래에 위치한 평판한 유리 바닥에 부어 생기는 원뿔 모양의 높이를 지름으로 나눠 측정하였다.

수분 흡수력은 시료 0.5 g에 증류수 10 mL를 첨가한 후 상온에서 vortex를 이용하여 약 30초간 혼합 후 혼합물을 25°C에서 24시간 동안 정치시켰다. 그 후 원심분리기를 이용해 4,000×g에서 10분간 원심분리 후 상등액을 제거하여 침전물의 무게를 측정한 뒤 다음 식에 따라 수분 흡수력을 측정하였다.

$$Waterholdingcapacity\left(g/g\right)＝(W_{wet}－W_{dry})/W_{dry}$$

지방 흡수력은 시료 0.5 g에 olive oil 5 mL를 첨가한 후 vortex를 이용하여 약 30초간 혼합한 뒤 4°C에서 1시간 동안 정치시켰다. 그 후 원심분리기를 이용하여 4,000×g에서 10분간 원심분리 후 상등액을 제거하여 침전물의 무게를 측정한 뒤 다음 식에 따라 지방 흡수력을 측정하였다.

$$Oilholdingcapacity\left(g/g\right)＝(W_{pellet}－W_{dry})/W_{dry}$$

팽윤력은 시료 0.5 g에 증류수 10 mL를 첨가한 후 vortex를 이용하여 약 30초간 혼합한 뒤 4°C에서 18시간 동안 정치시켰다. 그 후 시료가 차지하는 부피를 측정하여 다음 식에 따라 팽윤력을 측정하였다.

$$Swellingcapacity\left(mL/g\right)＝(V_{wet}－V_{dry})/W_{dry}$$

통계분석

통계분석은 SPSS(Statistical Package for the Social Science) 통계프로그램(Ver. 26.0, SPSS Inc.)을 이용하여 평균과 표준편차를 산출하였다. 두 집단 간의 유의성 검정은 독립표본 t-검정(two independent samples t-test)을 실시하였고, 세 집단 이상의 유의성 검정은 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 후 P<0.05의 유의수준에서 Duncan 사후 검정하였다.

SP와 SPH의 유리 아미노산, BCAA 성분 비교

SP와 SPH의 유리 아미노산과 BCAA 성분을 HPLC로 분석하였으며 chromatogram과 함량은 Fig. 1에 나타내었다. SPH의 유리 아미노산 함량은 151.25 mg/g으로 SP의 14.08 mg/g에 비해 약 10배 높았다. 아미노산의 함량은 기호성에 영향을 미치는 중요한 요소이고, 식품의 풍미를 예측하는 하나의 중요한 요소가 될 수 있다고 보고되어 있다(Watanabe와 Sato, 1974). SP의 valine, isoleucine, leucine은 각각 1.57, 1.32, 2.81 mg/g으로 BCAA 함량은 5.70 mg/g이었다. 이는 Vangsoe 등(2018)의 연구에서 대두의 BCAA 함량 측정 결과 leucine, valine, isoleucine 순으로 높은 것과 동일한 경향을 나타내었다. SPH의 valine, isoleucine, leucine은 각각 16.54, 10.73, 31.77 mg/g으로, BCAA 함량은 59.04 mg/g으로 SP의 BCAA 함량에 비해 SPH의 BCAA 함량이 약 10배 증가하였다.

Fig 1. HPLC chromatogram profile (A), and contents of free amino acid (B) and branched-chain amino acid (C) of soybean powder (SP) and soybean powder hydrolysate (SPH). The value represents the mean±SD (n=3). *Significant at P<0.05.

SP와 SPH의 특성 조사

SP와 SPH의 SDS-PAGE, SEM, FTIR analysis, 전자혀 분석 비교 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 단백질이 유화성, 기포성, 젤화 등 대부분의 기능적 성질을 잘 수행하기 위해서는 용해도가 높아야 한다. 또한 잘 녹는 단백질이 더 쉽게 식품에 혼합될 수 있으며 용해도가 낮은 단백질은 기능적 성질이 좋지 못하여 식품 소재로써 사용에 제한받는 것으로 알려져 있다(Lee, 1993).

Fig 2. Physicochemical properties of soybean powder (SP) and soybean powder hydrolysate (SPH). Sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis analysis (A), scanning electron microscope control (B), fourier transform infrared spectroscopy spectra (C), and seven sensory values of the electronic tongue (D). CPS, SCS is sensor for standard.

단백질 분해 정도를 조사하기 위해 SDS-PAGE 분석 결과 SP는 70~95 kDa 이하의 크기에서 단백질 밴드가 나타나 고분자 단백질이 남아있는 것에 비해, SPH는 단백질이 43 kDa 이하의 크기에서만 단백질 밴드가 남아있음을 확인하였다. 따라서 SP와 비교했을 때 단백질의 가수분해가 활발하게 일어났음을 확인할 수 있었다. SP와 SPH의 미세구조 변화를 확인하기 위해 SEM을 이용하여 조사한 결과, SP에 비해 SPH의 구조가 붕괴되는 것이 보이고 SPH의 조직에 공극이 다수 생성되어 다공성의 구조를 나타내는 것을 확인하였다. 또한 SPH의 조직이 풍선처럼 부풀어 입자의 표면적이 커지면서 용해가 되기 쉬운 구조를 이루고 있음을 확인하였다.

FTIR spectrum 결과 3가지 peak 범위인 3,500~2,900 cm^-1, 1,700~1,300 cm^-1, 1,200~900 cm^-1로 구성되며, 기존 연구 결과로는 범위별로 3,500~2,900 cm^-1는 OH기 생성을 의미하고 주로 물이나 에탄올 특성들이 나타났다. 1,700~1,300 cm^-1는 주로 페놀화합물의 존재, 증가나 생성을 의미하며 플라보노이드나 페놀류 등의 주요 특성을 대표하였다. 1,200~900 cm^-1는 카보닐기의 확대나 증가를 나타내며 곡선 높이의 증가는 C=O 결합의 증가를 의미하였다. SP에 비해 SPH의 peak 패턴이 3,500~2,900 cm^-1, 1,700~1,300 cm^-1 구간에서 peak가 매우 커졌으며, 이는 OH기의 존재와 페놀화합물의 결합을 통한 aromatic ring의 생성이 증가함을 보이는 결과를 나타내었다.

전자혀 분석은 관능 평점과 높은 상관성을 보여주어, 비교적 신속하고 간단한 전자센서 시스템을 이용하여 관능적 품질 평가로 활용될 수 있다(Jo 등, 2016). BCAA, SP와 SPH의 전자혀 분석 결과, SP에 비해 SPH의 신맛이나 떫은맛의 변화는 미미하나 단맛이 향상되었으며 짠맛과 쓴맛이 증가하였다. 정상적인 식품 풍미의 구성성분이기도 하지만 풍미 저하를 가져오는 중요한 요소가 될 수 있는 쓴맛 펩타이드는 주로 카제인의 분해 산물, 치즈, 효소 처리한 대두 단백질에서 볼 수 있다. 이러한 쓴맛 펩타이드의 주요 구성인자는 glutamic acid, proline, leucine, valine이 있다(Kim 등, 2016). 따라서 SPH가 SP 대비 BCAA인 leucine, valine, isoleucine 함량이 증가하면서 쓴맛 또한 증가한 것으로 사료되었다.

이를 통하여 SPH는 대두분말에서 효소 처리에 의해 단백질이 분해되어 BCAA 아미노산 함량이 증가하였고, 이는 기존 대두분말보다 수용성과 유리 아미노산 함량이 높아져 BCAA를 다량 함유한 단백질 보조제 제조에 적합한 원료인 것으로 사료되었다. 따라서 SPH를 첨가하여 단백질 보조제를 제조하였으며, 단백질 원료로 WPI와 SP를 첨가한 단백질 보조제 또한 제조하여 유리 아미노산 함량과 물리적 특성 및 제형 안정성을 비교하였다.

단백질 원료에 따른 단백질 보조제의 유리 아미노산, BCAA 성분 비교

대조군으로 식물성 단백질을 첨가한 상업용 제품(CP1), 유청단백질을 첨가한 상업용 제품(CP2)과 본 연구에서 WPI, SP, SPH를 첨가하여 제조한 단백질 보조제 A, B, C의 유리 아미노산 성분을 HPLC로 분석하였으며 chromatogram과 함량은 Fig. 3에 나타내었다. A의 유리 아미노산 함량은 376.27 mg/g으로 가장 높았으며, C, CP2, B, CP1의 순서대로 각각 유리 아미노산 함량은 252.79, 147.65, 106.01, 53.03 mg/g으로 SPH를 첨가한 보조제 C가 두 번째로 높았다. BCAA 함량 또한 A가 198.18 mg/g으로 가장 높았으며, 특히 leucine이 98.42 mg/g으로 가장 높았다. 이는 WPI가 BCAA가 풍부하며 특히 leucine을 많이 함유하고 있는 것으로 알려져(Luhovyy 등, 2007) 단백질 보조제 A의 유리 아미노산 함량이 높은 것으로 사료된다. C의 BCAA 함량은 101.77 mg/g으로 B의 32.38 mg/g보다 3.1배 높을 뿐만 아니라 CP1의 70.91 mg/g, CP2의 82.80 mg/g보다 약 1.4, 1.2배 높았다.

Fig 3. HPLC chromatogram profile (A), and contents of free amino acid (B) and branched-chain amino acid (C) of protein formulas using various protein sources. CP1 is commercial product manufactured by using whey protein isolate and CP2 is commercial product manufactured by using soybean protein. A is protein formula that contain 67% of whey protein isolate (WPI), B is protein formula that contain 67% of soybean powder (SP), and C is protein formula that contain 67% of soybean powder hydrolysate (SPH). The value represents the mean±SD (n=3). Means with different letters (a-e) on the same bar are significantly different from each other at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

단백질 원료에 따른 단백질 보조제의 물리적 특성 및 제형 안정성

상업용 제품 CP1, CP2와 단백질 보조제 A, B, C의 물리적 특성인 pH, 산도, 당도, 색도와 제형 안정성인 용해도, 흐름성, 수분 흡수력, 지방 흡수력 및 팽윤력을 비교하여 Table 2에 나타내었다.

Table 2 . Physicochemical properties and product stability of protein formulas with various protein sources.

Samples	Protein sources of protein formulas
	CP1	CP2	Whey protein isolate (A)	Soybean powder (B)	Soybean powder hydrolysate (C)1)
pH	10.11±0.04a2)	8.45±0.01b	3.02±0.03d	5.96±0.01c	5.99±0.02c
Acidity (%)	0.64±0.00c	2.35±0.22c	11.20±0.68a	4.33±2.13b	4.20±0.16b
Soluble solid (°Brix)	3.77±0.06b	8.63±0.15a	3.93±0.15b	3.77±0.06b	3.88±0.16b
Hunter color values L	75.99±0.02b	83.74±0.01a	83.20±0.02a	75.71±0.01b	61.42±0.35c
a	3.98±0.01b	1.40±0.03c	1.18±0.00c	4.64±0.00ab	5.94±0.56a
b	16.93±0.03b	13.37±0.02c	−7.42±0.06d	22.37±0.03a	25.43±1.99a
ΔE	74.13±0.01d	80.76±0.01a	78.87±0.04b	75.50±0.01c	62.69±0.41e
Solubility (%)	12.7±2.31d	50.70±3.06b	65.30±5.77a	35.30±3.06c	49.30±3.06b
Flowability (arctan°)	28.40±0.74c	19.10±0.13e	26.70±0.39d	40.10±1.10a	36.60±0.66b
Water holding capacity (g/g)	3.60±0.25ab	1.41±0.24c	0.76±0.12d	3.31±0.15b	3.83±0.19a
Oil holding capacity (g/g)	4.11±0.26bc	4.23±0.22b	4.65±0.05a	3.79±0.22cd	3.65±0.08d
Swelling capacity (mL/g)	7.90±0.42a	0.90±0.12d	0.09±0.01e	3.50±0.12c	4.80±0.20b

¹⁾Soybean powder hydrolysate by NY124. The 5% of crude enzyme powder was added to 1 g/10 mL (w/v) of soybean powder. After reacting at 37°C for 18 to 24 h, it was lyophilized and powdered for use..

²⁾The value represents the mean±SD (n=3). Means with different letters (a-e) within the same row are significantly different from each other at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..

WPI가 주 단백질 원료인 A 단백질 보조제는 pH가 3.02, 산도가 11.20%로, B, C의 pH 5.96, 5.99, 산도 4.33, 4.20%에 비해 pH는 낮고 산도는 약 7% 높아 신맛이 강한 것으로 나타났다.

당도는 CP2가 8.63°Brix로 제일 높았고 CP1, A, B, C는 3.77, 3.93, 3.77, 3.88°Brix로 유사하였다. 색도에서 밝기 L값은 CP2가 83.74로 가장 높았으며 C가 61.42로 가장 낮았다.

용해도는 A가 65.30%로 가장 높았으며 C가 49.30%, B가 35.30%로 A, C, B 순으로 높았다. 이는 WPI가 대두단백질보다 용해도가 높으며(Sorgentini 등, 1995), 앞서 SDS-PAGE, SEM 조사 결과 SP보다 SPH가 용해되기 쉬운 구조를 이루고 있기 때문으로 사료되었다. 또한 단백질의 용해도 차이는 단백질 추출 시 단백질 시료와 물의 비율, 추출 시간, 온도 등의 영향을 받는 것으로 보고되어 있다(Kim과 Park, 1995).

입자의 흐름성 정도는 입사각의 크기로 판단하고 있으며, 분말 또는 과립에서 입사각의 크기가 작을수록 입자의 흐름성, 즉 유동성이 좋아 편리성이 높음을 의미한다(Maulny 등, 2005). 상업용 제품과 A가 B와 C에 비해서 입사각의 크기가 작아 흐름성이 높음을 알 수 있었다.

수분 흡수력은 C가 3.83 g/g으로 A의 0.76 g/g에 비해 약 5배 높았다. 반면에 지방 흡수력은 A가 4.65 g/g으로 가장 높았다. 단백질의 수분 흡수력은 단백질 분자의 크기, 모양, 구조적 특성 등 다양한 매개 변수의 영향을 받으며, 지방 흡수력은 지질과 단백질의 상호작용에 관여하는 소수성 등 지질과 단백질의 상호작용에 관여하는 요소로 인해 영향을 받는다(Adiamo 등, 2016). 수분 흡수력과 지방 흡수력은 상반되는 결과가 나타났으며, 이는 Adiamo 등(2016)의 연구와 동일한 결과를 보였다.

팽윤력은 상업용 제품 CP1이 7.90 mL/g으로 가장 높았으며 C가 4.80 mL/g으로 A의 0.09 mL/g에 비해 약 53배 높았다. 팽윤력은 입자의 크기가 작을수록 크고 비슷한 크기에서는 입자 내의 결정성이 클수록 낮다고 보고되어 있다(Wong과 Lelievre, 1982). 이를 통해 유리 아미노산과 BCAA 함량, 물리적 특성 및 제형 안정성을 모두 고려하여 WPI 함량 33%를 기준으로 SPH 함량에 따른 품질특성을 알아보고자 SP와 SPH의 배합비를 달리하여 제조하였다.

SPH 첨가량에 따른 단백질 보조제의 유리 아미노산, BCAA 성분 비교

SPH 첨가량에 따른 단백질 보조제의 유리 아미노산 성분을 HPLC로 분석하였으며 chromatogram과 함량은 Fig. 4에 나타내었다. SPH가 25% 첨가된 Ⅱ의 BCAA가 94.75 mg/g으로 SPH가 첨가되지 않은 Ⅴ의 76.51 mg/g보다 18.24 mg/g 높았으며, SPH 첨가량이 많을수록 BCAA 함량이 높았다. 유리 아미노산 함량은 Ⅰ이 305.12 mg/g으로 가장 높았으며 Ⅴ의 161.38 mg/g보다 143.74 mg/g 높았다. 앞서 HPLC 분석 결과 SPH의 유리 아미노산이 SP보다 높았으며, 따라서 SPH 첨가량이 많을수록 유리 아미노산 함량이 증가하는 것을 알 수 있었다.

Fig 4. HPLC chromatogram profile (A) and contents of free amino acid (B) and branched-chain amino acid (C) of protein formulas using different concentrations of soybean powder hydrolysate (SPH). Each protein formula is consisted of whey protein isolate (33%), combination of soybean powder and soybean powder hydrolysate (34%). The value represents the mean±SD (n=3). Means with different letters (a-e) on the same bar are significantly different from each other at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

SPH 첨가량에 따른 단백질 보조제의 물리적 특성 및 제형 안정성

SPH 첨가량에 따른 단백질 보조제의 물리적 특성인 pH, 산도, 당도, 색도와 제형 안정성인 용해도, 흐름성, 수분 흡수력, 지방 흡수력 및 팽윤력을 비교하여 Table 3에 나타내었다.

Table 3 . Physicochemical properties and product stability of protein formulas with different soybean powder hydrolysate (SPH) content.

Samples	SPH1) content in protein formulas
	Ⅰ (34%)	Ⅱ (25%)	Ⅲ (17%)	Ⅳ (9%)	Ⅴ (0%)
pH	4.24±0.01a2)	4.26±0.02a	4.25±0.02a	4.21±0.02a	4.23±0.02a
Acidity (%)	7.59±0.62bc	7.27±0.22d	7.42±0.23cd	7.89±0.10a	7.63±2.65b
Soluble solid (°Brix)	6.40±0.00c	6.73±0.12ab	6.43±0.06c	6.90±0.00a	6.63±0.15b
Hunter color values L	77.29±0.02e	79.55±0.01d	80.08±0.05c	80.91±0.08b	82.19±0.06a
a	4.13±0.00a	3.53±0.01b	3.43±0.01bc	3.31±0.04c	2.50±0.02d
b	16.83±0.00ab	16.50±0.05c	16.97±0.10a	16.81±0.05b	16.10±0.10d
ΔE	75.37±0.02e	77.44±0.01d	78.06±0.03c	78.82±0.07b	79.88±0.05a
Solubility (%)	54.00±2.00a	52.70±3.06b	49.30±3.06c	44.70±3.06d	38.00±2.00e
Flowability (arctan°)	28.50±0.84d	28.80±1.24c	35.20±0.47b	36.00±1.88a	35.90±0.66a
Water holding capacity (g/g)	2.79±0.33a	2.88±0.29a	2.87±0.05a	2.87±0.03a	2.87±0.32a
Oil holding capacity (g/g)	4.75±0.67a	4.65±0.23a	4.41±0.13b	4.49±0.21b	4.43±0.13b
Swelling capacity (mL/g)	8.00±0.23a	7.40±0.35b	6.70±0.35c	6.20±0.23d	4.80±0.31e

¹⁾Soybean powder hydrolysate by NY124. 5% of crude enzyme powder was added to 1 g/10 mL (w/v) of soybean powder. After reacting at 37°C for 18 to 24 h, it was lyophilized and powdered for use..

²⁾The value represents the mean±SD (n=3). Means with different letters (a-e) within the same row are significantly different from each other at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..

pH는 유의미한 차이가 나지 않았으며(P>0.05), 당도는 Ⅱ가 6.73°Brix로 Ⅴ의 6.63°Brix보다 0.10 높았다. 산도는 Ⅱ가 7.27%로 Ⅴ의 7.63%보다 0.36% 낮았다. 밝기 L값은 SPH 함량이 많아질수록 낮아지는 경향을 나타냈다. 적색도 a값은 SP 함량이 많아질수록 낮아지는 경향을 나타냈다.

수분 흡수력은 통계적으로 유의미한 차이가 없었다(P>0.05). 지방 흡수력은 SPH가 25% 첨가된 Ⅱ가 4.65 g/g으로 Ⅴ의 4.43 g/g보다 0.22 g/g 높았다.

Ⅱ의 팽윤력은 7.40 mL/g으로 Ⅴ의 4.80 mL/g보다 2.60 mL/g 높았으며 용해도는 Ⅱ가 52.70%로 Ⅴ의 38.00%보다 14.70% 높았다. 이는 앞서 SDS-PAGE와 SEM을 통해 조사한 결과 SPH가 SP보다 작은 크기의 단백질로 존재하며 용해가 되기 쉬운 구조를 이루고 있었기 때문에 팽윤력과 용해도가 SPH 첨가량이 많을수록 증가하는 것으로 나타났다. 팽윤력은 포만감과 장 운동성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Baenas 등, 2020). 또한 SPH 첨가량이 많을수록 입사각이 작으며 흐름성이 좋다는 것을 알 수 있었다. 유리 아미노산 함량과 물리적 특성, 제형 안정성을 고려했을 때 보조제 Ⅱ가 우수하여 단백질 보조제에 첨가할 SPH 함량을 25%로 최종 선택하였다.

본 연구를 통해 대두분말 가수분해물을 첨가하여 제조한 단백질 보조제의 표준화 연구에 도움이 될 것으로 판단되었으며, 향후 대두분말 가수분해물은 BCAA 강화 기능성 소재로써 활용이 가능할 것으로 사료된다.

본 연구는 대두분말(SP)의 단백질을 분해하여 BCAA를 다량 함유한 대두분말을 얻기 위하여, 대두분말에 단백질 분해능이 높은 B. amyloliquefaciens(NY124)에서 얻은 조효소를 처리하여 BCAA 함량이 증가한 대두분말 가수분해물(SPH)을 제조하였다. 대두분말의 효소적 가수분해에 따른 유리 아미노산 조성과 단백질의 특성 변화를 알기 위해 HPLC, SDS-PAGE, SEM, FTIR과 전자혀 분석을 조사하였다. SPH의 SDS-PAGE 결과 43 kDa 이하의 크기에서만 단백질 밴드가 남아 SP에 비해 단백질이 분해됨을 확인하였으며, 유리 아미노산 및 BCAA 함량 또한 SP보다 10배 증가하였다. SEM을 통해 구조를 본 결과 SPH는 다공성 구조를 보였으며 조직이 부풀어 표면적이 커짐과 동시에 FTIR 결과 OH기가 생성되어 물에 잘 용해되기 쉬운 구조를 이루고 있었다. 전자혀 분석은 BCAA를 control로 하여 SP와 SPH를 분석한 결과, BCAA는 함량이 증가함에 따라 쓴맛이 증가하였고 SPH는 SP에 비해 단맛이 형성되었다. 이를 통하여 SP보다 BCAA 함량이 증가하고 용해성이 높아진 SPH를 가지고 단백질 보조제를 제조하였고, 단백질 원료에 따른 보조제의 특성을 비교하기 위해 SP와 유청단백질(WPI)로도 제조하여 유리 아미노산 함량과 물리적 특성 및 제형 안정성을 조사하였다. 그 결과 SPH로 제조한 단백질 보조제 C는 SP로 제조한 단백질 보조제 B보다 BCAA가 3.1배 높았으며 이는 상업용 제품보다 BCAA 함량이 높은 양이었다. WPI로 제조한 단백질 보조제 A는 BCAA 함유량이 높았지만 산도가 높아 신맛이 강한 것을 고려하여 WPI 함량 33%를 기준으로 SPH의 함량에 따른 보조제의 품질특성을 알아보고자 SP와 SPH의 배합비를 달리하여 제조하였다. 그 결과 SPH 첨가량이 많을수록 유리 아미노산과 BCAA 함량이 증가하였으며 팽윤력과 용해도 또한 증가하였다. 최종적으로 유리 아미노산 함량과 물리적 특성, 제형 안정성을 고려하여 단백질 보조제에 첨가할 SPH 함량을 25%로 선택하였다. 본 연구 결과를 통하여 SPH를 첨가하여 물리적 특성과 제형 안정성이 우수한 단백질 보조제를 제조함으로써 대두분말 가수분해물이 BCAA 강화 단백질 보조제 소재로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구는 산업통상자원부의 첨단 바이오소재 사업, 천연물 유래 생체적합성 기능성 소재 제품화 및 양산화 지원(과제번호: B0080506000122)과 과학기술정보통신부의 지역산업연계 대학 open-Lab 육성지원 사업(과제번호: S3196163)에서 지원받아 수행된 연구결과입니다.