최근 국내외로 증가하는 가공식품의 섭취량은 당류 섭취량과의 연관성으로 비만 및 성인병에 대한 건강상의 문제로 지속해서 제기되고 있으며, 이에 대한 설탕을 대체할 수 있는 천연 감미료의 연구 필요성이 증가하고 있다(Hwang 등, 2016; Na 등, 2012). 스테비아(Stevia rebaudiana Bertoni)는 국화과 식물로서 브라질 국경지방에 인접한 도시의 북동부 고산지대에 자생하는 식물로 알려져 있다. 스테비아는 감미 성분을 가진 스테비오사이드(stevioside)를 함유하는데, 이 성분은 감미도가 설탕의 200배 이상의 단맛을 가지고 있으나 비발암성과 칼로리가 없는 감미료로 당을 대체하는 목적으로 널리 사용되고 있다(Kim 등, 1997; Kim 등, 2007). Jentzer 등(2015)은 스테비아 식물의 주요한 특징으로 단맛을 함유하는 물질이라고 언급하였고, 단맛에 관여하는 화학물질은 ent-kaurene diterpenoid glycoside 계열의 물질로 대표적인 물질은 앞서 언급한 스테비오사이드(잎의 건조 중량 대비 4~13%)라고 발표하였다. 스테비오사이드 다음으로 높은 비율을 차지하는 물질은 rebaudioside A(잎의 건조 중량 대비 2~4%)가 있으며, 이는 설탕 기준 300~450배의 단맛을 낸다고 발표하였다. 그 외의 감미 물질로 dulcoside A, rebaudioside B와 C가 있다고 전해진다. 특히 rebaudioside A는 스테비오사이드보다 쓴맛이 약하다는 장점이 있어 식품과 음료 산업에서 선호도가 높은 것으로도 알려져 있다(Jentzer 등, 2015). 통상적으로 스테비아는 감미 성분에 대한 활용 목적으로 이용되어 왔으나 최근 들어 건강 기능적 효능에 관한 연구도 보고되고 있는데, 항비만 효능 및 간 기능에도 효과적이라고 알려져 있다(Park 등, 2006; Park 등, 2010). 식품 소재로서 스테비아 잎의 감미 성분인 스테비오사이드는 100°C 이상의 고열에서 1시간 정도 가열하여도 pH와 단맛이 유지되는 특성으로 인해 차가운 식품뿐 아니라 뜨거운 가공식품에도 널리 활용되고 있으며, 공식적으로 섭취량에 제한이 없는 안전성이 보장된 천연 감미료이다(Choi 등, 2014; Hwang 등, 2019).

국제식품첨가물공전위원회[The Joint FAO/WHO Expert Committee in Food Additives(JECFA)]는 오랜 기간(51^st, 63^rd, 68^th, 69^th, 73^th, 82^th, 84^th, 87^th) 동안 효소처리스테비아에 대한 회의를 진행하고 있다. 지난 2020년 91st 회의에서 추가적인 실험법 및 효소처리스테비아의 정보를 제시하였다(JECFA, 2021). JECFA에서 제시하는 분석법은 amino column(NH₂ analytical column)과 acetonitrile을 용매로 한 분석을 통해 6종의 효소처리스테비아(stevioside, rebaudioside A, rebaudioside C, rebaudioside F, rubusoside, steviolbioside)에 대한 chromatographic data를 제시하였다(JECFA, 2021).

현재 식품첨가물공전에서 제시하는 효소처리스테비아의 정성 및 정량법의 경우 혼합 유기용매(diazomethane과 ether)를 통한 유도체 후 gas chromatography를 통한 분석을 제시하고 있다. 하지만 유도체 반응을 위해 사용되는 diazomethane의 경우 높은 위험성(폭발성)으로 인해서 국내의 사용이 제한되고 있다. 이에 식품첨가물공전에 대한 개선시험법이 요구되고 있다(Ministry of Food and Drug Safety, 2021). 본 연구는 high performance liquid chromatography(HPLC)를 활용한 13종의 효소처리스테비아의 정량 및 정성분석에 대한 개선시험법을 제시하고, 공인시험법으로의 적용을 위한 method validation을 통해 그 타당성을 제시하고자 한다. 추가로 개선시험법을 통해 시중에 유통되는 상업용 효소처리스테비아의 분포와 함량 또한 보고하고자 한다.

실험 재료

본 연구에 사용된 상업용 효소처리스테비아는 국내 인터넷 마켓을 통해 제조사별로 100%로 표기된 제품 10종을 구입하였다. 구입 후 품질 차이에 의한 실험 오차를 줄이고자 –20°C 이하의 냉동보관을 유지하였다. 또한 수분 유입을 줄이고자 밀봉하여 공기 및 수분으로 인한 품질 저하를 막은 후 연구에 사용하였다. 표준품 13종의 경우 rebaudioside A, B, C, D, F, dulcoside A, stevioside, rubusoside, steviolbioside는 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.에서 구입하였고, rebaudioside O는 Chromadex, rebaudioside M, N, E는 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다.

시험 분석법 타당성 검토

효소처리스테비아 분석법 검증은 AOAC(2002) 분석법 검증 가이드라인에 준하여 진행하였다. 직선성 확인을 위해 13종의 효소처리스테비아 표준품을 각각의 stock solution으로 제조하여 직선성 및 상대표준편차(relative standard deviation, %RSD)를 확인하였다(steviobioside: 0.006~0.012 mg/mL, rebaudioside B: 0.007~0.056 mg/mL, rubusoside: 0.008~0.062 mg/mL, dulcoside A: 0.008~0.062 mg/mL, stevioside: 0.008~0.062 mg/mL, rebaudioside C: 0.008~0.062 mg/mL, rebaudioside F: 0.008~0.062 mg/mL, rebaudioside A: 0.008~0.062 mg/mL, rebaudioside E: 0.006~0.046 mg/mL, rebaudioside D: 0.001~0.006 mg/mL, rebaudioside M: 0.001~0.009 mg/mL, rebaudioside N: 0.012~0.093 mg/mL, rebaudioside O: 0.015~0.123 mg/mL). 타당성 검토를 위해 검출한계(limit of detection; LOD)와 정량한계(limit of quantitation; LOQ)를 확인하였다. 정밀성의 경우 일내(intra-day precision)와 일간(inter-day precision)을 통해 진행하였다.

상업 제품의 효소처리스테비아 함량

상업 제품에 함유된 효소처리스테비아의 함량을 검토하기 위하여 absorption chromatography와 HPLC법을 사용하였다. 먼저 dextrin을 제거하기 위해 open column을 사용했으며, 충진제는 Sigma Amberlite XAD 7 HP resin(Sigma-Aldrich)을 사용하였다. 지름 2.5 cm와 길이 60 cm 크기의 컬럼에 200 mL의 수용성 충진제를 주입하고 washing을 위해 증류수를 분당 3 mL의 속도로 흘려주면서 총 400 mL의 증류수를 주입하였다. 샘플 주입은 4 g의 샘플을 100 mL의 증류수에 용해한 후 컬럼에 주입하면서 분당 3 mL의 속도로 elution을 진행하였다. 샘플 주입 완료 후 1,000 mL의 증류수를 동일한 속도(3 mL/min)로 흘려주어 dextrin을 용출시켰다. Dextrin을 제거한 후 70% 에탄올 1,000 mL를 다시 컬럼에 동일한 속도(3 mL/min)로 흘려주어 효소처리스테비아를 용출시켰다. 용출된 효소처리스테비아는 회전진공농축기(BUCHI R-3, BUCHI Korea)를 통해 수분을 완전히 제거한 후 HPLC를 통해 개별 효소처리스테비아를 분석하였다(JECFA, 2021).

개별 효소처리스테비아 분석을 위해 JECFA(2021)에서 제시한 방법을 수정하여 HPLC를 사용하였고, 범용성을 위해 UV 검출기를 사용하였다. 또한 13종의 용이한 분석을 위해 동시분석법을 통해 단일 분석에서 13종의 모든 효소처리스테비아를 분석하였다. 세부적인 HPLC 분석 조건은 Table 1에 나타내었다.

Table 1 . HPLC operating condition for enzymatically modified stevia analysis.

Description	Enzymatically modified stevia
Column	Zorbax NH2 (250×4.6 mm, 5 µm)
Column temp.	40°C
Detector	UV (210 nm)
Mobile phase	A: acetonitrile
	B: distilled water
Gradient condition	0 min: A 80%＋B 20%
	0 to 2 min: A 80%＋B 20%
	2 to 90 min: A 50%＋B 50%
Flow rate	0.5 mL/min
Injection volume	20 µL
Run time	90 min
Post time	10 min

통계처리

본 연구의 실험 결과는 3 반복을 통해 평균값과 표준편차로 나타내었다. 각 실험값은 각기 다른 세 기관의 교차검증을 통해 실험값의 재현성과 반복성을 검토하였다(Ministry of Food and Drug Safety, 2015).

시험 분석법 타당성 검토

HPLC법을 이용하여 13종의 효소처리스테비아의 분석을 진행하였으며, 크로마토그램은 Fig. 1에 나타내었고 각각의 효소처리스테비아의 분리 및 동정 결과는 Table 2에 나타내었다. 13종의 elution 순서는 steviobioside, rebaudioside B, rubusoside, dulcoside A, stevioside, rebaudioside C, rebaudioside F, rebaudioside A, rebaudioside E, rebaudioside D, rebaudioside M, rebaudioside N, rebaudioside O의 순서로 확인되었다. 머무름시간의 경우 가장 먼저 용출된 steviolbioside가 대략 6.63분 전후로 나타났으며, 마지막으로 rebaudioside O가 대략 38.21분 전후로 확인되었다. Rebaudioside A를 기준으로 한 상대머무름시간(relative retention time)은 0.32에서 1.85 범위에서 확인되었다. 효소처리스테비아의 HPLC를 이용한 분리 연구를 보면, Bililign 등(2014)의 연구에서 비교할 수 있다. 9종의 효소처리스테비아 표준품을 ODS-AQ 컬럼을 통해 역상크로마토그래피 분석을 진행하였고, rebaudioside D를 시작으로 rebaudioside A, stevioside, rebaudioside F, rebaudioside C, rebaudioside A, rubusoside, rebaudioside B, steviobioside, steviol 순서로 분리 및 동정하였다. 해당 연구에서 저자들은 rebaudioside A와 stevioside의 분리를 매우 중요한 요소로 지적하였다. 상대머무름시간의 경우 rebaudioside A(1.00)를 기준으로 0.83(rebaudioside D)에서 1.38(steviolbioside)까지의 범위를 보고하였다(Bililign 등, 2014).

Table 2 . Typical and relative retention times of 13 enzymatically modified stevia standards.

Compounds	Typical retention time (min)	Relative retention time to rebaudioside A
Steviobioside	6.63	0.32
Rebaudioside B	6.86	0.33
Rubusoside	10.76	0.52
Dulcoside A	13.57	0.66
Stevioside	16.06	0.78
Rebaudioside C	17.68	0.86
Rebaudioside F	18.49	0.89
Rebaudioside A1)	20.66	1.00
Rebaudioside E	24.27	1.17
Rebaudioside D	28.31	1.37
Rebaudioside M	28.91	1.4
Rebaudioside N	32.63	1.58
Rebaudioside O	38.21	1.85

¹⁾Based on the rebaudioside A as 1.0 for relative retention time..

Fig 1. Typical chromatogram of 13 enzymatically modified stevia standards.

13종의 효소처리스테비아 표준품 분석 중 직선성(linearity)은 Table 3에 나타내었다. 직선성(R²)의 경우 0.9928(rebaudioside M)에서 0.9997(rubusoside)까지의 범위가 확인되어 높은 직선성을 가진다고 판단되었다. 상대표준편차인 %RSD의 경우 0.02%(rubusoside)에서 0.64%(rebaudioside M)의 범위가 확인되었다. 상대표준편차는 주로 20% 이내의 범위에서 편차가 타당하다고 알려져 해당 값의 범위는 분석법에 대해서 타당성을 가지는 범위에 존재한다고 확인하였다. 식품의약품안전처의 밸리데이션 가이드라인에서는 시험방법에서 정하는 모든 범위에 관해 규정한 농도 범위에서 최소 5개 이상의 표준액을 조제하여 실험을 진행하고 그에 대한 직선성이 확인되어야 한다고 제시하고 있으며, 이에 관한 결과를 본 연구에서 제시하는 것으로 판단된다(Ministry of Food and Drug Safety, 2015).

Table 3 . Linearities of 13 enzymatically modified stevia standards.

Compounds	Linearity (R2)	%RSD	Slope	Intercept
Steviobioside	0.9971	0.21	3,084.48	2.70
Rebaudioside B	0.9947	0.07	3,915.96	10.30
Rubusoside	0.9997	0.02	12,171.57	17.54
Dulcoside A	0.9989	0.04	6,027.91	21.28
Stevioside	0.9966	0.05	9,927.91	26.20
Rebaudioside C	0.9984	0.20	6,746.51	24.67
Rebaudioside F	0.9993	0.07	6,987.06	21.63
Rebaudioside A	0.9987	0.03	5,518.37	12.74
Rebaudioside E	0.9961	0.29	7,649.11	16.54
Rebaudioside D	0.9996	0.05	81,561.68	14.39
Rebaudioside M	0.9928	0.64	32,761.51	15.17
Rebaudioside N	0.9981	0.08	6,230.60	19.00
Rebaudioside O	0.9958	0.24	4,365.25	16.18

13종의 효소처리스테비아 표준품 분석 중 검출한계와 정량한계를 Table 4에 나타내었다. 검출한계의 경우 0.0001 mg/mL(rebaudioside B)에서 0.0041 mg/mL(rebaudioside A)까지의 범위가 확인되었고, 정량한계의 경우 0.0002 mg/mL(rebaudioside B)에서 0.0124 mg/mL(rebaudioside A)까지의 범위로 나타났다. 문헌에서 제시하는 검출한계란 “검체 중에 존재하는 분석대상물질의 검출 가능한 최소량”을 말하며 반드시 정량 가능할 필요는 없는 범위라고 한다. 또한 정량한계는 “적절한 정밀성과 정확성을 가진 정량값”으로 표현하고 있는 검체 중 분석대상물질의 최소량을 말한다. 정량한계는 주로 분석대상물질을 미량으로 함유하는 검체의 정량시험이나 특히 불순물, 분해생성물 결정에 사용되는 정량시험의 타당성 지표로 사용된다고 알려져 있다(Ministry of Food and Drug Safety, 2015).

Table 4 . Limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) of 13 enzymatically modified stevia standards (mg/mL).

Compounds	LOD	LOQ
Steviobioside	0.0010	0.0031
Rebaudioside B	0.0001	0.0002
Rubusoside	0.0004	0.0011
Dulcoside A	0.0011	0.0034
Stevioside	0.0029	0.0088
Rebaudioside C	0.0002	0.0007
Rebaudioside F	0.0028	0.0086
Rebaudioside A	0.0041	0.0124
Rebaudioside E	0.0020	0.0059
Rebaudioside D	0.0003	0.0009
Rebaudioside M	0.0006	0.0019
Rebaudioside N	0.0022	0.0068
Rebaudioside O	0.0005	0.0017

효소처리스테비아 분석법에 대한 정밀성을 확인하기 위해 repeatability를 위한 intra-day assay와 intermediate precision을 위한 inter-day assay를 측정하여 Table 5에 나타내었다. 정밀성의 확인을 위해 서로 다른 3개의 기관에서 실험을 진행하여 결괏값을 제시하였다. 세 가지 농도(저농도, 중간, 고농도)에 따른 intra-day assay는 95.07%에서 99.70%의 높은 수율을 확인할 수 있었다. 상대표준편차 역시 0.05%에서 1.41%로 확인되었다. Intra-day assay를 통해서 본 실험법에 대한 높은 반복성을 확인하였다. 반복성은 동일 실험실 내에서 동일한 시험자가 동일한 장치와 기구, 동일 시약, 기타 동일 조작 조건에서 균일한 검체로부터 얻은 2가지 이상의 반복 결과를 얻은 측정값이다(Ministry of Food and Drug Safety, 2015). 또한 세 가지 농도(저농도, 중간, 고농도)에 따른 서로 다른 3개의 기관에서 진행한 inter-day assay는 95.10%에서 99.56%의 높은 수율을 확인하였다. 서로 다른 3개의 기관에 대한 상대표준편차 역시 0.01%에서 2.00%로 확인되었다. Inter-day assay를 통해 본 실험법에도 intra-day assay에서 얻은 결과와 같이 높은 실험실 내 정밀성을 확인하였다. 실험실 내 정밀성의 경우 동일 실험실 내에서 다른 실험일, 다른 실험자, 다른 기구 또는 장비를 통해 분석 결과를 확인하는 방법으로써 해당 결과에 대해서는 우수한 정밀성을 확인할 수 있었다(Ministry of Food and Drug Safety, 2015). 앞서 제시된 method validation 지표를 근거로 하여 본 시험법을 통한 13종의 효소처리스테비아의 정량 및 정성 분석에 활용이 가능할 것으로 판단된다.

Table 5 . Intra-day and inter-day precision of the cross validation by three different institutions.

Institutions	Conc. (mg/mL)	Intra-day		Inter-day
		Recovery (%)	%RSD	Recovery (%)	%RSD
Institution A	Product A	0.5	96.34	1.08	96.37	0.85
		1.0	98.15	0.99	97.52	0.57
		2.0	99.7	0.78	99.56	0.16
	Product B	0.5	98.18	0.24	96.72	2
		1.0	95.25	0.33	95.22	0.17
		2.0	97.28	1.21	97.94	0.71
	Product C	0.5	96.87	0.69	97.41	1.47
		1.0	97.04	0.63	97.14	0.23
		2.0	98.42	1.41	99.51	0.94
Institution B	Product A	0.5	97.31	0.68	97.27	0.32
		1.0	96.43	0.51	96.58	0.17
		2.0	97.58	0.22	97.45	0.13
	Product B	0.5	97.00	0.69	96.48	0.56
		1.0	95.51	0.27	95.71	0.50
		2.0	95.07	0.04	95.1	0.09
	Product C	0.5	97.68	1.15	97.12	0.59
		1.0	95.44	0.31	95.53	0.20
		2.0	95.76	0.25	95.78	0.28
Institution C	Product A	0.5	96.4	0.16	96.39	0.08
		1.0	97.26	0.22	97.23	0.07
		2.0	96.99	0.05	96.98	0.01
	Product B	0.5	96.59	0.19	96.69	0.12
		1.0	97.19	0.22	97.18	0.01
		2.0	96.98	0.06	96.97	0.01
	Product C	0.5	96.79	0.59	97.04	0.33
		1.0	97.06	0.33	96.97	0.12
		2.0	96.97	0.10	97.09	0.16

상업 제품의 효소처리스테비아 함량

상업용으로 시판되는 10종의 효소처리스테비아 제품에 대한 HPLC 분석을 통한 정량 및 정성 분석을 진행하였고, Table 6에 나타내었다. 10종의 샘플에서 최초 분석했던 13종의 효소처리스테비아 중 11종을 확인할 수 있었다. 상업용 제품에서 나타나지 않은 효소처리스테비아는 크로마토그램 상에서 가장 먼저 elution 되었던 steviolbioside와 rebaudioside B로 확인되었다. 상업용 제품에서 가장 다량으로 확인되는 효소처리스테비아의 경우 rebaudioside A, rebaudioside M, rebaudioside N, rebaudioside O이며, 그 외 7종의 효소처리스테비아는 상대적으로 낮은 비율로 분포하였음을 알 수 있었다. 추가로 스테비아 배당체에 대한 다양한 문헌 연구를 볼 수 있는데, Jentzer 등(2015)은 스테비아 배당체의 최적 추출조건에 대한 experimental design을 제시하여 최대 수율을 얻을 수 있는 추출 전처리 조건을 발표하였다. Bililign 등(2014)은 ODS-AQ column과 potassium dihydrogen phosphate buffer와 acetonitrile을 이동상으로 하여 12종의 스테비아 배당체를 분리하였다. Elution 순서는 본 연구에서 제시한 elution 순서와는 역으로 나타남을 제시하였다. Rebaudioside A를 기준(relative retention time: 1.0)으로 볼 때 rebaudioside D(0.80)를 제외한 모든 배당체가 1.0 이후에서 확인되었다. Kolb 등(2001)은 본 연구와 동일한 amino column(NH₂)을 사용하여 70% 에탄올로 추출한 스테비아 배당체 중 stevioside와 rebaudioside A에 대한 정량 및 method validation을 제시하였다. Montoro 등(2013)의 연구에서는 여러 지역에서 수집한 스테비아에서 LC-ESI-MS/MS를 이용하여 6종(stevioside, rebaudioside A, rebaudioside B, steviolbioside, rebaudioside C, steviol)의 steviol glycosides를 분석하였고, 지역별 stevia glycoside의 함량을 다변량분석으로 비교 제시하였다. 국내에서도 개선시험법을 통해 효소처리스테비아 연구가 계속 진행되어야 할 것으로 판단된다.

Table 6 . Contents of enzymatically modified stevia in 10 commercial products (mg/mL).

Products	Rubusoside	Dulcoside A	Stevioside	Rebaudioside C	Rebaudioside F	Rebaudioside A	Rebaudioside E	Rebaudioside D	Rebaudioside M	Rebaudioside N	Rebaudioside O
A	0.01±0.01	0.01±0.01	0.12±0.01	0.05±0.01	0.01±0.01	0.21±0.02	0.02±0.01	0.10±0.01	0.26±0.01	0.24±0.01	0.27±0.01
B	0.02±0.01	0.02±0.01	0.19±0.01	0.04±0.01	0.01±0.01	0.21±0.01	0.01±0.01	0.16±0.01	0.40±0.01	0.21±0.01	0.26±0.01
C	0.01±0.01	0.02±0.01	0.13±0.01	0.05±0.01	0.01±0.01	0.23±0.01	0.02±0.01	0.09±0.01	0.29±0.01	0.24±0.05	0.26±0.05
D	0.01±0.01	0.01±0.01	0.12±0.01	0.05±0.01	0.01±0.01	0.23±0.01	0.02±0.01	0.10±0.01	0.27±0.01	0.27±0.01	0.30±0.01
E	0.01±0.01	0.03±0.01	0.13±0.01	0.05±0.01	0.01±0.01	0.24±0.01	0.01±0.01	0.10±0.01	0.29±0.01	0.26±0.01	0.31±0.01
F	0.01±0.01	0.01±0.01	0.12±0.01	0.05±0.01	0.01±0.01	0.22±0.01	0.02±0.01	0.10±0.01	0.28±0.01	0.27±0.01	0.29±0.01
G	0.08±0.01	0.04±0.01	0.24±0.01	0.10±0.01	0.02±0.01	0.58±0.01	0.02±0.01	0.14±0.01	0.32±0.01	0.39±0.01	0.33±0.01
H	0.01±0.01	0.05±0.01	0.15±0.01	0.07±0.01	0.01±0.01	0.21±0.01	0.02±0.01	0.11±0.01	0.31±0.01	0.24±0.01	0.22±0.01
I	0.01±0.01	0.04±0.01	0.13±0.01	0.08±0.01	0.01±0.01	0.24±0.01	0.02±0.01	0.10±0.01	0.29±0.01	0.26±0.01	0.25±0.01
J	0.02±0.01	0.04±0.01	0.13±0.01	0.06±0.01	0.01±0.01	0.24±0.01	0.02±0.01	0.08±0.01	0.28±0.01	0.29±0.02	0.31±0.01

본 연구는 효소처리스테비아 분석법에 대한 개선시험법을 제시하는 연구로써 기존 JECFA에서 제시한 6종의 효소처리스테비아 분석법을 기본으로 하여 13종의 효소처리스테비아의 동시 분석을 진행하였다. 13종의 효소처리스테비아의 분석은 method validation을 통해 타당성을 제시하였고, 서로 다른 세 곳의 분석 기관에서의 동시 분석을 통해 기관별 오차, 분석일차, 그리고 분석자의 차이에 의해서도 타당한 결과를 얻을 수 있었다. 이에 대한 실험을 통해 상업용 효소처리스테비아 제품의 적용을 진행하여 13종 중 11종의 효소처리스테비아 배당체가 정량 및 정성이 이루어졌다. 이에 본 연구에서 제시된 시험법을 근거로 하여 공인된 효소처리스테비아의 정량 및 정성 연구의 체계화가 가능한 것으로 보인다.

본 연구는 식품의약품안전처(22192식품위017)의 지원으로 수행된 연구로 이에 감사드립니다.