우유는 단백질, 지방 및 탄수화물과 같은 필수적인 영양분 외에도 다양한 비타민, 무기질 등을 많이 함유하고 있어 건강 및 영양에 중요한 식품이다(Chon 등, 2019; Kwak 등, 2006). 칼슘 일일 권장량은 우유 및 유제품을 섭취하지 않으면 충족하기 어려우며, 우유의 나트륨 함량은 낮으나 치즈 및 일부 유제품은 소금이 첨가되어 나트륨의 주요 공급원이 될 수 있다(Šnirc 등, 2020). 대표 유제품인 요구르트는 프로바이오틱스뿐만 아니라 단백질, 미네랄 및 비타민 등 다양한 영양소를 쉽게 섭취할 수 있으며, 비만, 알레르기, 장 염증, 심혈관 질환 등의 질병 치료에 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다(Chang 등, 2022). 최근 5년간 국내 유제품 소비량은 계속 증가하는 추세이며, 1인당 연간 유제품 소비량 중 흰 우유가 25% 이상으로 가장 많은 양상이다(Han 등, 2020). 이처럼 우유 및 유제품은 영양적으로 우수한 이점을 갖고 있고 인체에 중요한 식품으로 다양한 연구가 수행되었지만, 국내에서 유통 및 소비되는 우유 및 유제품의 판토텐산 및 피리독신 함량에 관한 연구는 극히 제한적이다(Holick 등, 1992; Kazmi 등, 2007; Kwak 등, 2006; Tanner 등, 1988).

한편, 비타민 B5라고 알려진 판토텐산은 지방산 대사에 관여하는 필수 영양소로 중추신경계의 발달, 스테로이드 분비, 항체 합성, 피부 및 모발 건강에 중요한 역할을 하지만, 인체에서 합성되지 않기 때문에 식품 및 보충제를 통해서 섭취해야 한다(Zeng 등, 2021). 또한, 판토텐산은 성인 기준 하루 약 5 mg을 섭취할 것을 권장하고 있으며, 결핍 시 기억상실, 피로, 피부염 및 관절염을 포함한 다양한 증상을 유발할 수 있다(Sanvictores와 Chauhan, 2021; Zeng 등, 2021).

피리독신(비타민 B6)은 인체에 필요한 조효소의 전구체로 dopamine, serotonin, glycine, glutamate 및 γ-aminobutyric acid와 같은 신경전달물질 합성, 단백질, 탄수화물, 지질 및 아미노산 대사에 중요한 역할을 수행하며, 결핍 시 빈혈, 신경 손상, 발작, 우울증, 피부염 및 구강염을 유발할 수 있다(Abosamak과 Gupta, 2022; Musafili 등, 2021; Rabinowitz와 Snell, 1947; Snell, 1953; Zhang 등, 2020).

이처럼 판토텐산 및 피리독신은 인체에 매우 중요한 역할을 하고 국민의 식생활 개선과 건강증진을 위해 다양한 식품군에 함유된 정량적 정보는 매우 중요하나, 우유 및 유제품의 판토텐산 및 피리독신 함량정보는 극히 제한적인 실정이다. 따라서 본 연구에서는 국내에서 유통 및 소비되는 우유 및 유제품을 대상으로 판토텐산 및 피리독신 함량을 정량적으로 평가하여 그 정보를 제공하고자 하였다.

실험재료

본 연구에 사용된 우유 및 유제품은 국가표준식품성분표 발간을 위해 농촌진흥청 국립농업과학원에서 제공받았으며, 8종의 우유 및 18종의 유제품(분유 3종, 아이스크림 2종, 연유 2종, 요구르트 9종 및 치즈 2종)을 분석시료로 사용하였다.

본 연구에 사용된 초순수 증류수 및 acetonitrile은 J.T. Baker Co.에서 구매했으며, acetic acid는 대정화금에서 구매하여 사용하였다. 또한, potassium phosphate monobasic 및 sodium acetate와 본 분석에 사용된 표준시약인 판토텐산 및 피리독신은 Sigma-Aldrich Co.에서 구매하여 사용하였다.

추출 및 전처리

우유 및 유제품에 함유된 판토텐산 및 피리독신의 추출 방법은 Kim 등(2014)의 추출법을 사용하였다.

판토텐산의 경우, 균질화된 우유 및 유제품 시료 1~5 g을 정확하게 칭량한 후 초순수 증류수 20 mL를 가하고 40°C의 조건에서 10분간 초음파 추출기(JAC 4020, KODO Technical Research Co., Ltd.)를 이용하여 추출한 뒤 3% acetic acid 2 mL를 첨가하여 다시 같은 조건으로 10분간 초음파 추출하였다. 그 후 초순수 증류수를 이용하여 40 mL로 정용하고 21,124×g로 10분간 원심분리(1730MR, Gyrozen)한 후 상등액을 다시 0.45 μm 실린지 필터(polyvinylidene difluoride filter media, Whatman Inc.)를 이용하여 여과하고, high-performance liquid chromatography(HPLC) 분석용 샘플로 사용하였다.

피리독신은 균질화된 시료 1~5 g을 정확하게 칭량하고 50 mM sodium acetate 용액(pH 4.5) 25 mL를 가하여 30분간 40°C 조건으로 초음파 추출한 후 초순수 증류수 15 mL를 첨가하여 21,124×g로 10분간 원심분리했으며, 상등액을 다시 0.45 μm 실린지 필터로 여과한 후 HPLC 분석에 이용하였다.

HPLC 분석조건

Kim 등(2014)의 분석법을 이용하여 우유 및 유제품에 함유된 수용성 비타민 판토텐산 및 피리독신을 분석하였다. 즉, 판토텐산은 Agilent사의 HPLC/DAD(HPLC/diode array detector)법을, 피리독신은 HPLC/FLD(HPLC/fluorescence detector)법을 이용하여 isocratic elution으로 분석했으며, 자세한 분석조건은 Table 1에 나타내었다.

Table 1 . HPLC operating conditions for pantothenic acid and pyridoxine analysis.

Pantothenic acid	Instrument	HPLC (Agilent 1200 series)
	Column	YMC-Pack ODS AM (250 mm×4.6 mm, 5 μm)
	Column temp.	30°C
	Detector	Diode array detector (200 nm)
	Injection volume	20 μL
	Flow rate	1.0 mL/min
	Isocratic elution	50 mM potassium phosphate monobasic (pH 3.5):acetonitrile＝95:5 (v/v)
Pyridoxine	Instrument	HPLC (Agilent 1260 infinity series)
	Column	YMC-Pack Pro C18 Rs (250 mm×4.6 mm, 5 μm)
	Column temp.	30°C
	Detector	Fluorescence detector (Ex＝290 nm, Em＝396 nm)
	Injection volume	20 μL
	Flow rate	1.0 mL/min
	Isocratic elution	20 mM sodium acetate (3% acetonitrile, pH 3.6)

판토텐산 및 피리독신의 함량평가

우유 및 유제품에 함유된 판토텐산 및 피리독신 함량을 평가하기 위해 표준용액을 1,000 ppm으로 조제했으며, 이를 여러 농도로 희석하여 HPLC 분석 후 표준 검량선을 작성하였다. 각 우유 및 유제품 시료의 HPLC peak area를 표준 검량선에 대입하여 계산한 후 다음 식에 적용하여 평가하였다(Jang 등, 2022).

$$비타민B의함량\left(mg/100g\right)=\frac{S\times a\times b}{검체채취량\left(g\right)}\times \frac{100}{1,000}$$

S: 시험용액에 함유된 비타민 B의 농도(μg/mL)

a: 시험용액의 전체 용량(mL)

b: 시험용액의 희석배수

분석법의 선택성, 직선성 및 분석 감도 검증

표준용액과 각 시료 추출물의 크로마토그램으로 HPLC peak의 분리 양상을 확인하여 판토텐산 및 피리독신 분석법의 선택성을 검토하였고, HPLC 분석법의 직선성을 평가하기 위해 각 성분의 표준 검량선을 작성했으며, 표준 검량선의 농도는 판토텐산의 경우 0.05~20 mg/L, 피리독신은 0.01~10 mg/L로 설정하여 표준 검량선을 작성하고 R²값(결정계수)을 이용하여 직선성을 확인하였다. 또한, 각 표준용액 peak의 이론단수(N; number of theoretical plate), 이론단 높이(HEPT; height equivalent to theoretical plate) 및 peak 대칭성(S; peak symmetry)을 확인하였다. 또한, 분석 감도를 평가하기 위해 분석법의 검출한계(limit of detection, LOD) 및 정량한계(limit of quantification, LOQ)를 검토했으며, HPLC peak의 signal/noise의 비가 3:1이 될 때의 농도를 LOD, 10:1이 될 때의 농도를 LOQ로 설정하였다(Barth, 2018; Dolan, 2015; Jeon 등, 2022).

분석법의 정확성 및 재현성 검증

판토텐산 및 피리독신 분석법의 정확성을 검증하기 위해 표준인증물질 SRM-1849a(standard reference material-1849a; Infant/adult nutritional formula)를 3회 추출 및 분석하여 표준인증값과 비교했으며, 성분별 회수율을 검토하였다. 또한, 강화 조제분유를 일내(intra-day) 10회, 일간(inter-day) 15회 반복 추출 및 분석하여 얻은 상대표준편차(RSD%, relative standard deviation%)를 검토하여 재현성을 평가하였다.

통계처리

각 시료의 판토텐산 및 피리독신 함량분석은 3 반복으로 수행되었으며, 기본통계(처리 간 평균, 표준편차 및 상대표준편차)는 Microsoft사의 office 365 excel 프로그램을 이용하였다. 또한, 처리 평균 간 유의성 검정인 Duncan’s multiple range test는 SAS 9.4(Statistical Analysis System, SAS Institute Inc.) 프로그램을 이용하여 수행되었다.

분석법의 선택성, 직선성 및 분석 감도 평가

판토텐산 및 피리독신 분석법의 선택성, 직선성 및 분석 감도를 평가하여 Table 2에 나타내었다. 선택성을 검토하기 위해 표준용액과 우유 및 유제품 시료의 크로마토그램을 비교, 검토하여 분리 양상을 평가했으며(Fig. 1), 판토텐산 및 피리독신 성분이 모두 우수하게 분리되는 것을 확인하였다. 또한, 직선성을 확인하기 위해 표준용액의 농도 대비 HPLC peak area를 통해 표준 검량선을 작성한 결과, 성분별 표준 검량선의 R2값이 모두 0.999 이상으로 높은 직선성을 나타내었다. 분석 감도를 평가하기 위해 판토텐산 및 피리독신의 LOD 및 LOQ를 확인한 결과, 판토텐산의 경우 LOD는 0.043 mg/L, LOQ는 0.18 mg/L였으며, 피리독신의 경우 LOD는 0.011 mg/L, LOQ는 0.04 mg/L로 선행연구와 비교했을 때 충분한 분석 감도임을 확인하였다(Jang 등, 2022; Shin 등, 2021).

Table 2 . Comparison of the sensitivity, selectivity, and linearity of the HPLC method.

Vitamin	Sensitivity		Selectivity			Linearity
	LOD1)	LOQ2)	N3)	HETP4)	S5)	Calibration curve	R2
	(mg/L)
Pantothenic acid	0.043	0.18	10,195	0.0243	0.974	y＝689.57x－5.66	0.999**
Pyridoxine	0.011	0.04	5,819	0.0424	0.966	y＝5,946.97x－0.38	0.999**

¹⁾Limit of detection..

²⁾Limit of quantification..

³⁾Number of theoretical plate..

⁴⁾Height equivalent to theoretical plate..

⁵⁾Peak symmetry..

Fig 1. Representative HPLC chromatograms of pantothenic acid and pyridoxine in milk and dairy product.

분석법의 정확성 및 재현성 평가

판토텐산 및 피리독신 분석법의 정확성 및 재현성을 검토하여 Table 3에 나타내었다. 정확성을 평가하기 위해 SRM-1849a를 반복 추출 및 분석하였고, 판토텐산의 경우 표준인증값은 6.820±0.190 mg/100 g이었으며, 실제 측정값은 6.839±0.054 mg/100 g으로 회수율은 100.28%를 나타내었다. 피리독신의 측정값은 1.330±0.010 mg/100 g으로 표준인증값(1.346±0.093 mg/100 g)과 비교했을 때 98.8%의 회수율을 나타내었다. 또한, 판토텐산 및 피리독신의 반복 간 상대표준편차는 각각 0.790% 및 0.752%로 본 분석에 사용된 추출 및 분석법은 추가적인 개선이 불필요함을 확인하였다. 한편, 강화 조제분유를 일내 및 일간으로 반복 추출 및 분석하여 재현성을 검토한 결과, 성분별 상대표준편차는 모두 3% 이하로 재현성이 매우 우수한 것을 확인하였다.

Table 3 . Results of precision and accuracy test for pantothenic acid and pyridoxine.

Constituent	Precision		Accuracy
	RSD (%)1)		Content (mg/100 g)			Recovery (%)	RSD (%)
	Intra-day (n=10)	Inter-day (n=15)	Material	Reference value	Analysis value
Pantothenic acid	1.308	1.297	SRM-1849a	6.820±0.190	6.839±0.054	100.3	0.79
Pyridoxine	1.97	1.562		1.346±0.093	1.330±0.010	98.8	0.752

¹⁾Relative standard deviation..

우유 함유 판토텐산 및 피리독신 함량평가

우유에 함유된 판토텐산 및 피리독신의 함량을 Table 4에 나타내었다. 우유 중에서 판토텐산 함량이 가장 높았던 제품은 저지방 우유(0.296±0.005 mg/100 g)였으며, 우유(0.295±0.006 mg/100 g), 고칼슘우유(0.289±0.003 mg/100 g), 커피우유(0.229±0.005 mg/100 g) 및 산양유(0.218±0.003 mg/100 g) 순으로 높은 함량을 나타내었고, 바나나우유, 초콜릿우유 및 딸기우유에서는 검출되지 않았다. 한편, 피리독신의 경우 고칼슘우유(0.198±0.002 mg/100 g), 커피우유(0.027±0.001 mg/100 g) 및 딸기우유(0.014±0.000 mg/100 g)를 제외한 기타 우유 제품에서는 검출되지 않았다. Woollard 등(2000)은 무지방 우유(skim milk) 분말의 판토텐산 함량을 2.41 mg/100 g으로 보고하여 본 연구의 저지방 우유(0.296±0.005 mg/100 g)와 약 8배의 함량 차이가 있는 것을 확인하였는데, 국가표준식품성분표 제9개정판에 따르면 일반 흰 우유의 수분 함량이 약 90% 수준인 것을 고려했을 때(RDA, 2016), 본 연구 결과와 유사한 수준임을 확인하였다. Scott과 Bishop(1986)은 멸균된 full cream cow’s milk에 함유된 피리독신 함량을 0.39 μg/mL로 보고하였는데, 본 연구에서 검토된 고칼슘우유(0.198±0.002 mg/100 g)보다는 함량이 낮았으나 다른 우유에 비해 높은 함량을 보여 본 연구 결과의 함량 범위 내에 속함을 확인하였다. 한편, United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service(USDA-ARS, 2019b)의 조사에 따르면, 우유에 함유된 판토텐산 함량은 0.362 mg/100 g으로 본 연구에서 검토된 모든 우유보다 함량이 다소 높은 것으로 확인되었으며, 이는 실제 분석에 사용된 제품 혹은 분석 방법의 차이로 인한 것으로 생각된다.

Table 4 . Comparison of pantothenic acid and pyridoxine contents in milk and dairy products.

Kind	Type	Products	Pantothenic acid	Pyridoxine
			Content (mg/100 g)
Milk		Common white	0.295±0.006A2)	ND3)
		Banana	ND	ND
		Chocolate	ND	ND
		Coffee	0.229±0.005B	0.027±0.001B
		Goat’s milk	0.218±0.003C	ND
		High calcium	0.289±0.003A	0.198±0.002A
		Low fat	0.296±0.005A	ND
		Strawberry	ND	0.014±0.000C
Dairy product	Cheese	Cheddar cheese	0.443±0.029d	ND
		Mozzarella cheese	0.076±0.002k	ND
	Condensed milk	Sugar added	0.286±0.002f	ND
		Sugar-free	0.422±0.044d	ND
	Ice cream	Soft vanilla	0.355±0.000e	0.015±0.000d
		Vanilla	0.276±0.003f	ND
	Powdered milk	Infant formula level 1	4.183±0.025c	0.696±0.003c
		Infant formula level 2	4.660±0.024b	0.702±0.000b
		Infant formula level 3	5.252±0.008a	0.826±0.003a
	Yogurt1)	Drink; dietary fiber added	0.145±0.002j	ND
		Drink; low fat; dietary fiber added	0.143±0.004j	ND
		Drink; plain	0.229±0.003g	ND
		Drink; plain apple; dietary fiber added	0.162±0.003ij	0.005±0.000e
		Drink; plain; dietary fiber added	0.206±0.002gh	ND
		Drink; strawberry	0.328±0.001e	ND
		Mango	0.179±0.000hij	0.006±0.000e
		Plain	0.160±0.002ij	ND
		Strawberry	0.190±0.002hi	ND

¹⁾Lactobacillus-rich fermented milk..

²⁾Means with different letters (A-C, a-k) within a column are significantly different by Duncan’s multiple range test at P<0.05..

³⁾ND: not detection..

유제품 함유 판토텐산 및 피리독신 함량평가1

유제품에 함유된 판토텐산 및 피리독신의 함량을 Table 4에 나타냈으며, 본 연구에 사용된 요구르트는 모두 농후발효유를 사용하였다. 검토된 유제품 중 판토텐산 및 피리독신 모두 유아용 조제 3단계 분유가 각각 5.252±0.008 mg/100 g 및 0.826±0.003 mg/100 g으로 가장 높은 함량을 나타냈으며, 유아용 조제 2단계 분유(4.660±0.024 및 0.702±0.000 mg/100 g), 유아용 조제 1단계 분유(4.183±0.025 및 0.696±0.003 mg/100 g)의 순으로 높은 함량을 나타내었다. 한편, 판토텐산 함량이 가장 낮았던 제품은 모짜렐라 치즈(0.076±0.002 mg/100 g)였으며, 피리독신이 검출된 유제품 중에서 피리독신이 가장 낮은 제품은 플레인 사과맛 요구르트(식이섬유 첨가; 0.005±0.000 mg/100 g)였다. 한편, 유제품의 원료, 제조 방법, 생산연도 및 가공 국가 등 다양한 변이 요인에 의해 본 연구에서 검토된 유제품과 직접적인 비교는 불가능했으나 과거 몇몇 연구자에 의해 수행되었던 결과와 비교했을 때, Hoppner와 Lampi(1990)는 딸기맛 요구르트에 함유된 판토텐산 함량이 0.289±0.039 mg/100 g이라고 보고한 바 있으며, 본 연구에서의 딸기맛 요구르트(0.190±0.002 mg/100 g)보다 다소 높은 함량임을 확인하였다. Scott과 Bishop(1988)의 연구에 따르면 바닐라 아이스크림에 함유된 판토텐산은 0.436 mg/100 g, 피리독신은 0.079 mg/100 g이었는데, 본 연구의 소프트 바닐라 아이스크림(0.355±0.000 mg/100 g 및 0.015±0.000 mg/100 g)보다 다소 높은 함량을 나타내었다. Shahani 등(1962)은 체다치즈에 0.331 mg/100 g 수준의 판토텐산과 0.084 mg/100 g의 피리독신이 함유되어 있다고 보고했는데, 본 연구에서 검토된 체다치즈에는 0.443±0.029 mg/100 g의 판토텐산이 함유되어 있어 더 높은 함량임을 확인하였다. 그러나 본 연구에서 검토된 모든 치즈류에는 피리독신이 검출되지 않아 Shahani 등(1962)의 결과와는 다소 차이를 나타내었다. 한편, Woollard 등(2000)에 의하면 분유에 함유된 판토텐산 함량은 7.20 mg/100 g으로 본 연구에서의 분유보다 약 1.5배 높은 것을 확인할 수 있었는데, 이 선행연구의 결과 또한 가공원료, 제조 방법 및 분석 방법 등 다양한 차이로 인해 본 연구 결과와 함량 차이가 발생했을 것으로 생각된다. 또한, USDA-ARS(2019a)의 조사에 따르면 철분이 강화된 분유의 피리독신 함량은 0.384 mg/100 g으로 본 연구에서의 분유보다 약 2배 낮은 것을 확인했는데, USDA에서 사용한 분유는 철분 강화 분유로 이 또한 원료, 가공 방법, 생산연도 및 가공 국가 등 다양한 변이 요인에 의해 피리독신 함량의 차이가 발생한 것으로 추측된다.

이상으로 본 연구는 국내에서 유통 및 소비되는 우유와 유제품의 판토텐산 및 피리독신 함량을 정량적으로 검토하여 그 정보를 제공했으며, 이 결과는 향후 국민의 식생활 개선과 건강증진에 필요한 기초자료로 사용될 수 있을 것이다.

우유 및 유제품은 단백질, 지방 및 탄수화물과 같은 필수적인 영양분 외에도 다양한 비타민, 무기질 등을 많이 함유하고 있어 건강에 중요한 식품이지만, 국내에서 유통되는 우유 및 유제품의 판토텐산 및 피리독신 함량정보는 극히 제한적이다. 따라서 본 연구에서는 국내에서 유통 및 소비되는 우유 및 유제품의 판토텐산 및 피리독신 함량을 정량적으로 평가하였다. 우유에 함유된 판토텐산 함량 범위는 0.000~0.296 mg/100 g이었으며, 피리독신은 0.000~0.198 mg/100 g이었다. 유제품의 판토텐산 함량은 0.076~5.252 mg/100 g의 범위였으며, 피리독신 함량 범위는 0.000~0.826 mg/100 g이었다. 따라서 본 연구는 국내에서 유통 및 소비되는 우유 및 유제품 함유 판토텐산 및 피리독신의 함량에 대한 정보를 제공하고, 이 연구 결과는 향후 국민의 식생활 개선과 건강증진에 기여할 것으로 생각된다.