알코올은 예로부터 사회적으로 사용하던 중독성 약물이자 기호성 식품이다(Lee와 Shin, 2009). 현대인들의 사회적 관계 형성과 스트레스 해소를 위해 많이 사용되고 있지만(Han 등, 2017), 섭취자에게 메스꺼움, 구토, 무기력, 두통과 같은 급성 알코올성 숙취를 유발하고 심각한 경우에는 췌장염, 심근경색과 같은 만성 알코올성 질병을 초래한다(Lee 등, 2009).

사람이 섭취한 알코올은 간에 존재하는 효소인 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase, ADH)를 거쳐 아세트알데히드로 산화되고, 다시 아세트알데히드탈수소효소(acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)라는 효소에 의해 아세테이트로 산화되며, 최종적으로는 이산화탄소와 물로 완전히 분해된다(Eriksson 등, 2001). 이 중 아세트알데히드는 독성 물질로 알코올이 체내로 들어와 ADH에 의해 아세트알데히드로 전환되면 알코올 홍조 반응, 심박수 증가, 알코올에 의한 구강건조 및 두통 등의 숙취 증상으로 나타나게 된다(Eriksson, 2001). 많은 사람은 음주 후 숙취 해소를 위해 시중에서 판매 중인 숙취 해소 제품을 구매하는데, 많은 제품은 고문헌 유래의 혼합추출물 또는 생리활성물질을 첨가한 형태를 띠고 있다(Jeon 등, 2002; Park 등, 2006). 많은 숙취 해소 제품은 ADH 활성에 초점이 맞춰져 있지만, 체내에서 숙취 증상을 일으키는 것은 아세트알데히드의 독성에 기인한다는 많은 연구 결과가 있는 만큼(Penning 등, 2010) ADH 뿐만 아니라 ALDH 촉진 및 혈중 아세트알데히드도 감소시키는 것이 바람직한 숙취 해소 방향이라고 볼 수 있다(Cha 등, 2009).

국민건강보험공단(2015) 보고서에 따르면 음주로 인한 사회경제적 손실 비용은 연간 9조 4,524억 원에 달하며 매년 증가하는 추세를 보인다(Lee 등, 2015). 이러한 이유로 숙취 해소 제품에 대한 기업과 소비자들의 관심도가 증가하면서 식품의약품안전처에서는 효능에 대한 과학적 근거를 포함하는 숙취 해소 제품에 대해서 허가하는 방향으로 가이드라인을 마련하고 있다.

마늘은 한국의 전통 식재료로서 향신료 및 조미료로 많이 사용되어 왔는데, 마늘에 함유된 다량의 유기황화합물이 강한 향과 마늘 특유의 맵고 알싸한 맛을 유발한다(Lee 등, 2007). 최근 연구를 통해 마늘이 함유한 유기황화합물이 가진 효능 덕분에 단순 식품을 뛰어넘어 건강기능식품 및 의약품의 원료로 주목받고 있다(Choi 등, 2007). 마늘은 항콜레스테롤(Jung 등, 2015), 항산화(Chung과 Kim, 2008), 심장병(Rahman과 Lowe, 2006) 및 혈압 강하(Park 등, 2016)등에 대한 효능이 알려져 있으며, 마늘을 가열하거나 알칼리화 시 생성되는 cycloalliin이 효능 물질로서 다양한 연구가 진행되었다(Agarwal 등, 1977; Peng과 Liu, 2016). 자사에서는 마늘 발효 시 알코올 유발 세포독성 완화(Jung 등, 2013), 비알코올성 지방간 개선 효과(Lee 등, 2014) 및 혈관 건강(Kwon 등, 2017) 등 다양한 연구를 진행하였다.

특히 마늘 발효 시 S-allyl cysteine, cycloalliin 등의 함량이 가장 우수했던 Lactobacillus plantarum으로 발효한 유산균발효마늘추출분말(Choi 등, 2014)은 간 건강 기능성 개별인정형(제2016-16호) 원료로 인정받았다. 하지만 간 건강 기능성은 포괄적인 기능성이기 때문에 이는 반드시 숙취 해소에 도움을 준다고 볼 수 없다.

따라서 본 연구는 유산균발효마늘추출분말을 에탄올을 급여한 Sprague Dawley(SD) rat에 경구투여하여 혈중 에탄올, 아세트알데히드 농도를 측정하고 간 조직 내 ADH 및 ALDH의 활성을 통해 유산균발효마늘추출분말이 숙취개선 소재로 효과가 있는지 평가하고자 실시하였다.

유산균발효마늘추출분말 시료 제조

실험에 사용된 유산균발효마늘추출분말은 경북 의성에서 생산한 국내산 마늘을 구입하여 다음과 같이 제조하였다. 마늘 3 kg과 상수 6 L를 발효탱크(MJS U3, Marubishi)에 넣고 105~110°C에서 2시간 열수 추출 후 37°C로 냉각하였다. 이후 L. plantarum 종균배양액 200 mL를 접종하여 24~36시간 배양하였다. 배양 종료 후 121°C에서 1시간 동안 열처리 후 50°C로 냉각하여 숙성하였다. 이후 여과, 농축, 혼합, 건조 공정을 거쳐 유산균발효마늘추출분말 1 kg을 제조하였다.

실험동물 검역 및 순화

동물은 생후 6주령의 SD rat을 오리엔트바이오에서 구입하였다. (주)디티앤씨알오의 동물 사육실에서 일정한 조건(온도: 19~25°C, 상대습도: 30~70%, 환기: 10~15회/시간, 조명주기: 12시간/일, 조도: 150~300 Lux 이상)에서 사육했으며 고형 사료를 자유 급여하였다. 입수 시 동물의 수를 확인하고 일반 증상 관찰 및 체중 측정을 했으며 매일 1회 일반 증상을 관찰하였다. 검역 및 순화 기간 종료일에 체중을 측정하고, 일반 증상 및 체중 변화를 바탕으로 동물의 건강 상태 확인 후 이상 증상이 없는 동물을 실험에 사용하였다. 실험동물은 실험물질 투여 18시간 전 절식시켰다. 본 실험은 (주)디티앤씨알오 비임상센터 동물실험윤리위원회의 승인(승인번호: 220145)을 받았으며, 동물윤리에 관한 가이드라인을 준수하여 실험을 수행하였다(Fig. 1).

Fig 1. Experiment scheme of in vivo.

시료 및 에탄올 투여

유산균발효마늘추출분말은 저(50 mg/kg), 중(100 mg/kg), 고(200 mg/kg)농도로 투여 용량을 설정했으며, 투여액량은 10 mL/kg으로 하였다. Blank군 및 음성대조군은 부형제를 동일한 액량으로 투여했으며, 각 실험물질은 단회 경구투여하였다. 실험물질 투여 30분 후, 음성대조군 및 실험물질 투여군에 30%(v/v) 에탄올 10 mL/kg을 경구투여하여 숙취를 유발했다. 각 실험군의 개체 수는 8마리로 설정하였다.

혈청 중 에탄올 농도 변화 측정

실험물질 투여 전 blank군의 경정맥에서 0시간 샘플을 채혈했으며, 30% 에탄올을 투여한 음성대조군 및 실험물질 투여군의 경정맥에서 에탄올 투여 후 1, 3, 5시간마다 채혈하였다. 채취한 혈액은 SST tube에 넣어 상온에서 848×g로 15분 동안 원심분리하여 혈청으로 분리하고, 바로 에탄올과 아세트알데히드 측정 실험에 사용하였다. 혈청 중 에탄올 농도는 ethanol assay kit(cat No. K-ETOH, Megazyme)을 사용하였다. 실험은 kit protocol을 바탕으로 진행하였다.

혈청 중 아세트알데히드 농도 변화 측정

혈청 중 아세트알데히드 농도 측정은 acetaldehyde assay kit(cat No. K-ACHYD, Megazyme)을 사용했으며, 에탄올 농도 측정 방법과 같은 방법으로 에탄올 투여 후 실험동물의 경정맥에서 1, 3, 5시간마다 채혈한 혈액 샘플을 원심분리하여 혈청만을 사용하였다. 실험은 kit protocol을 바탕으로 진행하였다.

ADH 효소 활성 측정

실험종료 후 실험동물을 이산화탄소로 희생시켜 간을 적출하였다. 액체질소로 간을 얼린 후 분석 시까지 -80°C deep freezer에 보관하였다. 간 조직 내 ADH 효소의 활성은 alcohol dehydrogenase activity colorimetric assay kit(cat. No. K787-100, BioVision)을 사용하였다. NADH 표준물질을 ADH buffer에 1/10로 희석하여 1 mM의 농도로 제조하였다. 96-well plate에 시료와 NADH 표준물질을 50 μL씩 분주하고 ADH buffer 82 μL, developer 8 μL 및 기질 10 μL를 혼합하여 제조한 reaction mix를 100 μL씩 넣어주었다. 이후 37°C에서 3분 간격으로 2시간 동안 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

ALDH 효소 활성 측정

ALDH 효소의 활성은 aldehyde dehydrogenase activity colorimetric assay kit(cat No. K731-100, BioVision)을 사용했으며 분석 방법은 ADH 효소 활성 측정과 유사하게 진행하였다. ALDH positive control은 20%(v/v) glycerol이 포함된 buffer에 용해하였다. 96-well plate에 시료 50 μL와 NADH 표준물질을 50 μL씩 분주하고 ALDH buffer 43 μL, ALDH 기질 혼합물 2 μL 및 아세트알데히드 5 μL를 혼합한 reaction mix를 50 μL 넣어주었다. 이후 37°C에서 3분 간격으로 1시간 동안 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

통계처리

실험에서 얻어진 모든 결과는 SPSS(version 27.0, IBM Corp.)를 사용하여 통계해석을 수행하였다. Blank 및 각 실험군은 결과에 대한 유의성 검정을 위해 independent t-test를 실시하였다(P<0.05).

혈중 에탄올 농도 변화

Fig. 2는 유산균발효마늘추출분말을 급여한 동물에게서 에탄올 투여 후 혈중 에탄올 농도의 변화를 확인한 결과이다. 실험 결과, 음성대조군의 혈중 에탄올 농도는 30% 에탄올 급여 1시간 후 150±60 mg/dL를 나타냈으며, 3시간 후 194±68 mg/dL, 5시간 후 99±9 mg/dL를 나타내어 3시간까지 혈중 에탄올 농도가 증가하다 이후 감소하는 경향을 나타내었다. 실험동물에 저농도 실험물질을 투여 시 에탄올 급여 1시간 후 150±74 mg/dL의 혈중 에탄올 농도를 보였다. 투여 3시간, 5시간 후 200±48 mg/dL, 107±25 mg/dL의 에탄올 혈중 농도를 나타내었다. 이 결과는 음성대조군과 같은 경향성을 보이는 결과로 3시간까지 농도가 증가했다가 이후 감소하는 결과를 보여주었다. 중용량 투여군은 1, 3, 5시간 후 혈중 에탄올 농도가 137±82 mg/dL, 191±63 mg/dL 및 111±43 mg/dL로 확인되었으며 고용량 투여군은 각 관찰 시간에 대해 141±97 mg/dL, 201±41 mg/dL 및 120±20 mg/dL로 앞서 언급한 음성대조군과 같은 경향성을 보였다. 실험물질 투여군의 결과에서 음성대조군에 비해 특별한 유의적인 차이를 보여주지 않아 유산균발효마늘추출분말은 각 농도에서 혈중 에탄올 농도 변화에 영향을 미치지 못하였다.

Fig 2. Blood ethanol concentration after ethanol administration. N. Con means negative control group. Rats are given LFGE concentrations of 50 mg/kg (Low), 100 mg/kg (Mid), and 200 mg/kg (High), depending on which level is desired. LFGE means lactobacillus fermented garlic extract powder.

ADH 활성 평가

실험동물로부터 에탄올 투여 5시간 뒤 채혈 종료 후, 동물을 희생시키고 간을 적출하였다. 간 조직을 -80°C deep freezer에서 보관하고 이후 간 조직 내 ADH와 ALDH의 활성을 측정하였다. Fig. 3에서 Blank군의 ADH 활성은 8.0±2.8 mU/mg으로 확인되었으며, 음성대조군의 ADH 활성은 5.4±3.7 mU/mg의 수치를 나타냈다. 두 군 간에 통계학적 유의한 차이는 나타내지 않았다. 저농도의 시료 투여군은 6.5±3.5 mU/mg의 수치를 보여 음성대조군과 유의한 차이를 보이지 않았다. 또한, 중용량의 실험군은 ADH 활성 수치가 7.1±3.6 mU/mg을 나타냈으며, 시료 고농도군은 7.3±2.5 mU/mg의 결과를 보여 음성대조군과 비교하여 통계학적으로 유의하게 증가하는 결과를 도출할 수 없었다. 즉, 유산균발효마늘추출분말은 ADH의 활성을 높이는 데 기여하지 못함으로써 단위 시간당 효소 반응속도가 낮았다. 이에 따라 혈중 에탄올은 ADH 기질에 대해 역가 의존적으로 줄이는 데 한계가 있었다. 즉, 유산균발효마늘추출분말은 ADH를 활성화하지 못하여 에탄올에서 아세트알데히드로 분해되는 과정이 빠르게 이루어지지 않았다. 이러한 이유로 혈중 에탄올 농도는 blank군과 유사한 수준을 나타내었다.

Fig 3. The ADH activity in liver tissue after ethanol administration by LFGE. N. Con means negative control group. Rats are given LFGE concentrations of 50 mg/kg (Low), 100 mg/kg (Mid), and 200 mg/kg (High), depending on which level is desired.

혈중 아세트알데히드 농도 변화

Fig. 4는 혈중 아세트알데히드 농도 변화 측정 결과를 확인하였다. 음성대조군의 혈중 아세트알데히드는 에탄올 투여 1시간 후 6.05±1.13 mg/dL로 급격히 증가했으며, 3시간 후 2.54±0.68 mg/dL, 5시간 후 0.75±0.19 mg/dL를 나타내어 1시간 이후 아세트알데히드의 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

Fig 4. Decreased of acetaldehyde concentration after ethanol administration by LFGE. N. Con means negative control group. Rats are given LFGE concentrations of 50 mg/kg (Low), 100 mg/kg (Mid), and 200 mg/kg (High), depending on which level is desired. Different signs show significant differences among groups by independent t-test. *P<0.05 and **P<0.01 are compared with the negative control group (not treated LFGE).

유산균발효마늘추출분말 저농도 처리군은 1, 3시간대의 관찰 시간에서 5.04±1.00 mg/dL, 1.78±0.27 mg/dL로 음성대조군에 비해 유의적 차이를 보였으며, 5시간 관찰 시간에서는 0.58±0.22 mg/dL로 음성대조군과 유사한 수준의 혈중 아세트알데히드 농도가 관찰되었다. 중용량 투여군은 1, 3, 5시간대에서 3.40±0.86, 1.37±0.49, 0.46±0.23 mg/dL를 나타내어 모든 관찰 시간대에서 음성대조군과의 유의적인 차이를 나타냈으며, 고농도 실험군은 2.03±0.41, 0.77±0.54, 0.55±0.26 mg/dL로 알코올 섭취 후 1, 3시간 후에 통계적으로 유의미한 결과를 나타내었지만, 5시간 후에는 음성대조군과 유사한 수준의 결과를 나타내었다. 또한, 음성대조군 및 저농도 처리군과 동일하게 1시간 이후 혈중 아세트알데히드의 농도가 감소하는 것을 볼 수 있으며 농도가 증가함에 따라 아세트알데히드의 혈중 농도가 더 낮은 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과로 보아 유산균발효마늘추출분말은 ALDH 효소의 활성화를 유도하여 숙취 원인물질인 아세트알데히드를 아세테이트로 분해하는 것으로 사료된다. 술의 주성분인 에탄올은 ADH, cytochrome P450 2E1(CYP2E1) 및 다양한 catalase에 의해 아세트알데히드로 전환되며, 이후 ALDH에 의해 아세테이트로 전환된다(Seitz와 Stickel, 2007). 숙취는 이러한 과정에서 아세트알데히드가 체내에 쌓이고 뇌를 자극하여 발생하므로 빠르게 체내에서 분해하는 것이 가장 이상적인 숙취를 해소하는 방법이다(Hyun 등, 2014). 반면 유전적으로 에탄올 대사가 느려 숙취가 오래 지속되는 사람도 많이 볼 수 있는데, ALDH2*2라는 ALDH의 동형단백질(isoform)은 알코올 섭취 시 아세트알데히드로 전환과 체외로의 배출을 경쟁적으로 저해하여 방해한다(Zhang과 Ren, 2011). 따라서 ALDH2*2 유전자를 보유한 사람은 에탄올의 흡수가 어렵기 때문에 숙취 해소가 가능한 제품의 섭취 등이 도움을 줄 수 있을 것이라 예상된다.

간 조직 내 ALDH의 활성 측정

Fig. 5는 ALDH의 활성을 비교한 결과로 blank군은 0.9±0.3 mU/mg, 음성대조군은 0.5±0.2 mU/mg의 ALDH 활성 결과를 보여주었다. 시료 저용량 투여군의 ALDH 활성은 0.4±0.3 mU/mg, 중농도 시료군은 0.6±0.2 mU/mg으로 측정되었다. 두 군의 결과는 음성대조군과의 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 고농도 시료군의 경우 0.8±0.2 mU/mg으로 ALDH가 활성화된 것을 확인할 수 있었다. 이는 음성대조군과 비교하여 유의적인 증가 결과를 보여주었으며 정상 수치와 유사한 수치를 나타내었다. 위와 같은 결과를 보아, 유산균발효마늘추출분말은 간 조직 내 ADH에 비해 ALDH 효소 친화적으로 활성을 상대적으로 촉진하는 효과를 확인할 수 있다.

Fig 5. The results of ALDH activity in liver tissue in SD rats administrated with ethanol. N. Con means negative control group. Rats are given LFGE concentrations of 50 mg/kg (Low), 100 mg/kg (Mid), and 200 mg/kg (High), depending on which level is desired. Different signs show significant differences among groups by independent t-test. ^†P<0.05 is compared with control group. *P<0.05 is compared with negative control group (not treated LFGE).

생마늘과 흑마늘은 제조표준화가 이루어질 수 없거나 제조 기간이 길어 표준화가 어렵지만, 유산균발효마늘은 제조표준화가 이루어진 간 건강 기능성 원료이다. 마늘을 발효하게 되면 생마늘과 다르게 발효 과정을 통해 생성되는 S-allyl cysteine, S-ethyl cysteine, S-methyl cysteine과 같은 유기황화합물로 인해 항산화능이 증가하는 결과가 연구에서 나타났다(Jung 등, 2013). 알코올은 아세트알데히드로 전환되고 다시 아세테이트로 전환되는 과정에서 유리기가 생성된다. 생성된 유리기는 산화스트레스를 유발하여 지질과산화 등 산화적 손상 및 염증을 유발한다. 이러한 염증에 의한 반응이 두통과 같은 숙취 증상인데(Mackus 등, 2020), 항산화능이 높은 발효마늘의 섭취가 숙취 증상을 낮추는 데 효과가 있을 것으로 추측된다. 유산균발효마늘추출분말은 HepG2 세포를 이용하여 CYP2E1(간 손상효소)에 의한 세포독성 및 보호 효과를 확인하였고, DPPH를 이용하여 라디칼 소거 효과를 조사한 결과 DPPH 라디칼 소거능을 증가시켜 높은 항산화능을 나타내었다. 이는 간 손상을 유도하는 CYP2E1 효소 활성을 유산균발효마늘추출분말이 억제해 생존성을 증진시킨 것이며, 간세포의 보호 효과를 나타내었다. 이는 만성적 알코올 섭취로 인한 간세포 손상을 보호한 결과이며, 항산화 효과를 나타낸 것이다(Choi 등, 2014).

자사에서 유산균발효마늘을 이용한 기존 연구는 알코올성 또는 비알코올성으로 지방간을 유도하고 유산균발효마늘을 처리하여 간 보호 효능을 평가하였다(Choi 등, 2014; Lee 등, 2014). 하지만 본 연구는 지방간을 유도하는 것이 아닌 알코올 및 알코올 유래의 독성 물질인 아세트알데히드를 분해하는 효소의 활성을 통해 혈액 내 농도가 감소하는 결과를 바탕으로 숙취 유발물질을 감소시키는 데에 도움을 주는지 확인하고자 하였다. 실험 결과에서 유산균발효마늘은 아세트알데히드 분해효소를 활성화하고 혈중 아세트알데히드의 농도를 감소시키는 결과를 보였다. 이는 알코올에 의해 발생하는 어떠한 질병이 아닌 알코올을 분해하는 대사에 적용한다는 점에서 분명한 차이를 보였다.

본 연구는 유산균발효마늘추출분말의 간 보호 효능을 기반으로 숙취 개선 소재로의 가능성을 확인하기 위해 진행하였다. 효능 평가를 위해 SD rat에 유산균발효마늘추출분말(50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg)을 급여 후 30% 에탄올을 투여하여 숙취를 유발한 후 1, 3, 5시간마다 경정맥에서 채혈하여 혈중 알코올 및 아세트알데히드 농도의 변화를 측정하였고, SD rat을 희생시킨 후 적출한 간에서 조직 내 ADH와 ALDH 효소의 활성도를 측정하였다. 혈중 알코올의 변화를 확인하고자 에탄올을 급여한 쥐에서 채취한 혈액은 원심분리 후 혈청을 사용하였다. 에탄올 투여 후 혈중 알코올의 농도는 1, 3, 5시간마다 채혈하며 음성대조군과의 차이를 확인하였고, 채혈을 종료한 SD rat을 희생시킨 후 간을 적출하여 ADH 활성을 확인하였다. ADH 활성에서 농도 증가에 따른 효소 활성 증가는 보이지 않았다. 이러한 결과로, 혈중 에탄올 농도는 실험군과 blank군에서 채혈 시간 흐름에 대해 유의적인 차이를 보이지 않았다. 반면, 아세트알데히드에서는 혈중 농도 평가에서 혈중 알코올 평가와 같은 채혈 시간에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의미하게 감소하는 경향을 보였다. 또한, ALDH 활성을 측정한 실험에서는 고용량 실험군이 음성대조군과 비교하여 유의적으로 증가한 활성도를 보였다. 따라서 유산균발효마늘추출분말은 알코올로 유발된 아세트알데히드 혈중 농도를 ALDH의 활성 증대를 통해 감소시키는 원리로 숙취 증상을 개선하는 데 효능이 있는 것으로 사료된다.