비만은 유전, 식습관, 환경적 요인으로 인해 흔하게 발병하는 장애이며, 주로 에너지 섭취량과 소비량 비율이 불균형하여 체내 지방이 과도하게 축적된 상태를 말한다(Go 등, 2020; Jeon, 2012). 세계적으로 비만의 발병률은 점차 증가하고 있으며, 고지혈증, 심혈관 질환, 고혈압, 당뇨, 지방간, 동맥경화 등의 유발과 밀접한 관련이 있으므로 이를 억제하기 위한 노력이 필요하다(Abdul Rahman 등, 2017; Kim과 Kim, 2021; Rahman 등, 2017).

비만의 주된 특징으로는 지방세포 수와 크기가 증가하는 것인데, 지방전구세포에서 성숙한 지방세포로의 분화 과정은 지방의 생성과 연관이 있다(Chen 등, 2017). 3T3-L1 세포는 지방생성 관련 연구에 널리 사용되는 지방전구세포로 지방세포와 관련된 전사인자와 호르몬에 의해 중성지방을 축적한다(Lee 등, 2017). 3T3-L1 세포는 지방세포 유도 복합체인 인슐린, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)이 포함된 MDI 배지에 배양하면 지방세포로 분화가 유도되며 이와 관련된 유전자들의 발현을 동반한다(Choi 등, 2016).

지방세포의 분화가 시작되는 동안 sterol regulatory element-binding protein 1c(SREBP-1c) 및 cytidine-cytidine-adenosine-adenosine-thymidine/enhancer-binding protein(C/EBP) 계열에 속하는 단백질 발현이 증가한다. C/EBP 계열인 C/EBPβ와 δ는 dexamethasone과 IBMX에 의해 활성화되고, 그 후 지방 발생에 주요 조절 인자인 C/EBPα와 peroxisome-proliferation activated receptor gamma(PPARγ)가 지방생성을 증가시켜 지방세포로의 분화와 성숙을 유도한다(Li 등, 2017; Zhang 등, 2019). PPARγ는 핵 호르몬 수용체 중 하나로 지방의 생성뿐만 아니라 인슐린 민감도를 증가시키고, 성숙한 지방세포에서 지방산 흡수와 중성지방의 축적을 유도한다(Kim 등, 2015; White와 Stephens, 2010). C/EBPα는 PPARγ와 함께 분화 초기에 발현되며 PPARγ의 표적 유전자로는 adipocyte fatty acid binding protein 2(aP2), lipoprotein lipase가 있으며, 이외 fatty acid synthase(FAS)와 leptin 등의 발현을 조절한다(Han 등, 2017; Williams 등, 2020).

Leptin과 aP2는 분화 마지막 단계에서 지방 조직 특이적 유전자의 발현을 조절하는데, 분화 후 FAS, acetyl-CoA carboxylase(ACC), hormone-sensitive lipase와 같은 효소를 합성하여 지질 대사를 조절한다(Baldini 등, 2021; Park 등, 2016). 따라서 지방전구세포 분화의 억제는 지방 조직의 질량을 감소시켜 비만 발생률을 억제할 것이며, 비만과 관련된 질환을 예방 및 치료하는 데 유용할 것이다(Meriga 등, 2017; Xu 등, 2015).

문모초(Veronica peregrina L.)는 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려진 개불알풀속(Veronica)에 속하며(Salehi 등, 2019; Xue 등, 2019), 아시아와 유럽 지역에 널리 분포하는 식물로 논밭 근처와 냇가에서 주로 자란다. 문모초는 민간요법에서 병약형 궤양이나 출혈, 이질성 설사 등의 치료에 사용되었으며, 대식세포 매개 염증 질환에 대한 치료에 유용하다고 알려져 있다(Khan 등, 2015). 몇몇 선행 연구에서 문모초 추출물 또는 구성 성분들이 항산화 및 항암 활성을 가지는 것으로 보고된 바 있지만(Kim 등, 2022; Kwak 등, 2009), 비만 억제와 연관된 연구는 이루어진 바 없다. 따라서 본 연구에서는 3T3-L1 세포 모델에서 문모초 에탄올 추출물(ethanol extract of V. peregrina L.; EEVP)의 항비만 활성에 관한 효능을 확인하고자 하였다.

문모초 에탄올 추출물 제조

실험에 사용된 문모초는 충청남도 공주시 신풍면 탑정호 부근에서 인식 가능한 형질 개체를 직접 채집하였다. 채집된 문모초의 지상부 부분을 실온에서 건조 파쇄했으며, 본 표본은 국립낙동강생물자원관 수장고에 보관하였다. 문모초 지상부 에탄올 추출물(EEVP)을 얻기 위해 건조 시료 무게의 30배에 달하는 70% 에탄올로 1시간 동안 초음파 추출 후 실온에서 24시간 방치하였다. 추출물을 여과지(Whatman No. 3 filter pater, Whatman International Ltd.)로 여과한 후 회전식 증발기(rotary evaporator, Tokyo Rikakikai Co.)를 이용하여 용매를 제거하였다. 여과된 추출물은 동결건조를 거쳐 건조중량 대비 9.7%의 분말 시료를 얻었다. EEVP는 dimethyl sulfoxide에 25 mg/mL의 농도로 녹였으며 -20°C에서 보관하였다.

3T3-L1 세포의 배양

본 실험에 사용된 3T3-L1 지방전구세포(mouse fibroblast 3T3-L1 preadipocytes)는 American Type Culture Collection에서 분양받았다. 3T3-L1 세포의 배양에는 90% Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, WELGENE Inc.), 10% bovine calf serum 그리고 1% penicillin 및 streptomycin(Gibco-BRL)이 혼합된 배지를 사용했으며, 5% CO2, 37°C 조건의 incubator에서 배양하였다. 배양 상태에 따라 세포가 증식되는 정도가 과도할 경우 세포가 손상되는 현상을 해소하기 위해 성장 배지를 38시간마다 교환하고 적정 세포 수를 유지하면서 실험을 진행하였다.

세포 생존율 측정

EEVP 처리에 따른 3T3-L1 세포의 생존율을 확인하기 위해 세포 배양용 6-well plate에 적정 수의 세포를 분주한 후 다양한 농도의 EEVP를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 그 후 0.5 mg/mL의 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide 용액(MTT, Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 각 well 당 2 mL씩 분주하여 빛을 차단한 다음 CO2 incubator에서 2시간 동안 반응시켰다. 이어서 MTT가 포함된 배지를 제거하고 dimethyl sulfoxide를 적당량 첨가하여 각 well에 생성된 formazin을 모두 녹였다. 이어서 96-well plate에 200 μL씩 옮겨 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) reader(Molecular Devices)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3T3-L1 지방전구세포의 분화 유도

3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 분화하기 위해 세포를 6-well plate에 성장 배지를 이용하여 confluent 상태까지 배양한 후, 90% DMEM, 10% fetal bovine serum과 1% penicillin 및 streptomycin을 혼합한 배지에서 2일간 추가 배양하였다. 지방세포로의 분화는 선행 방법에 준하여(Han 등, 2017) MDI 배지(10 μg/mL insulin, 0.1 μM, dexamethasone 및 0.5 mM IBMX, Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하였고, 이를 다양한 농도의 EEVP와 함께 처리하여 2일간 배양하였다. 2일마다 10 μg/mL insulin이 포함된 분화 배지와 EEVP를 교환해주었으며, 8일 동안 분화를 유도한 3T3-L1 세포의 형태 변화는 위상차 현미경(phase contrast microscope, Carl Zeiss)을 이용하여 관찰하였다.

Oil Red O 염색 및 중성지방 함량의 정량

총 지질을 정량하기 위해 사용된 Oil Red O 염색법은 색소결합법이라 불리며 지질에만 특이하게 결합하게 되므로 lipid droplet의 상태를 파악하기 위해 사용된다. 분화된 3T3-L1 세포에서 lipid droplet의 생성에 미치는 EEVP의 영향을 조사하기 위해 배양이 끝난 세포를 phosphate buffered saline으로 수세한 후 1시간 동안 3.7% formalin으로 고정했다. 이어서 60% isopropanol로 세척하여 Oil Red O 용액(Sigma-Aldrich Chemical Co.)으로 실온에서 20분 동안 염색시키고 3차 증류수로 세척한 후 위상차 현미경으로 관찰하거나, 100% isopropanol을 이용하여 염색된 Oil Red O 용액을 녹이고 96-well plate에 200 μL씩 옮겨 ELISA reader로 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Western blot analysis에 의한 단백질 발현분석

EEVP를 처리하면서 분화시킨 3T3-L1 세포에 적당량의 lysis buffer[25 mM Tris-Cl(pH 7.5), 5 mM ethylenediaminetetra acetic acid, 250 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1% Nonidet-P40 및 5 mM dithiothreitol]를 첨가하여 4°C에서 1시간 동안 용해시킨 후, 30분간 원심분리하여 상층액의 단백질을 분리하였다. Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad Lab.)을 이용하여 단백질 농도를 측정한 후 Laemmli sample buffer(Bio-Rad Lab.)와 혼합했으며, 동량의 단백질 샘플을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분자량에 따라 분리하였다. 이후 분리된 단백질을 polyvinylidene difluoride membrane(Merck Milipore)으로 전이시키고 5% skim milk로 1시간 동안 처리하였다. 각 membrane을 검출하고자 하는 단백질에 대항하는 1차 항체(PPARγ, C/EBPα, C/EBPβ, SREBP-1c, aP2, leptin, AMP-activated protein kinase(AMPK), phospho(p)-AMPK, ACC, p-ACC 및 β-actin, Santa Cruz Biotechnology Inc.)에 2시간 이상 반응시킨 후, 2차 항체(peroxidase-labeled donkey anti-rabbit 또는 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin, Amersham Life Science Corp.)를 1시간 동안 처리하였다. 처리가 끝난 membrane은 암실에서 enhanced chemiluminescence 용액(Amersham Life Science Corp.)에 반응시킨 후 X-ray 필름에 감광시켜 단백질의 발현 정도를 분석하였다. 각 단백질의 발현을 정량적으로 분석하기 위한 밴드의 밀도는 ImageJ^® 소프트웨어(v1.48; National Institutes of Health)를 사용하여 분석하였다.

통계처리

모든 통계 분석은 GraphPad Prism Ver. 5.0(Graphpad Inc.)을 사용하여 실시했으며, 평균±표준편차로 표현하였다. 통계적 유의성의 검정은 P<0.05 수준으로 하였다.

EEVP가 3T3-L1 지방전구세포의 생존율에 미치는 영향

EEVP가 3T3-L1 세포의 생존율에 미치는 영향을 조사하기 위해 3T3-L1 세포에 EEVP를 다양한 농도(0~200 μg/mL)로 72시간 동안 처리한 후 MTT assay를 실시하였다. Fig. 1에 나타낸 바와 같이 대조군과 비교하여 20 μg/mL 처리군부터 세포 생존율이 다소 증가했으며, 80 μg/mL에서 가장 높은 생존율을 보였다. 이후의 농도에서도 대조군과 유사한 생존율을 보여주었고, 이러한 결과는 EEVP가 처리된 3T3-L1 세포에서 200 μg/mL 농도까지 유의적인 세포독성이 유도되지 않았음을 의미하며, 이후의 실험들은 200 μg/mL 이하의 농도 범위에서 실시하였다.

Fig 1. Effect of EEVP on the viability of 3T3-L1 mouse preadipocytes. Cells were treated with indicated concentrations of EEVP for 72 h. Cell viability was determined using the MTT assay. Data were presented as mean±SD. *P<0.05 and **P<0.01 compared to control. EEVP: ethanol extracts of V. peregrina L.

EEVP가 lipid droplet 및 중성지방의 생성에 미치는 영향

3T3-L1 지방전구세포의 지방생성 과정에서 나타나는 lipid droplet의 생성에 대한 EEVP의 영향을 알아보기 위해 지방세포로의 분화를 유도하면서 EEVP를 농도별로 처리하고 Oil Red O 염색처리 전과 후로 구분하여 세포 내 lipid droplet의 생성 정도를 관찰하였다. 제시된 Fig. 2의 결과에서 알 수 있듯이 미분화 대조군에서는 lipid droplet이 거의 형성되지 않았으나, 분화 대조군에서는 이의 형성이 활발한 것으로 나타났고, lipid droplet 형성은 EEVP의 처리 농도 의존적으로 억제되었다. 이러한 결과를 정량적으로 비교하기 위해 lipid droplet을 isopropanol로 녹인 후 중성지방의 양을 측정하였다(Fig. 3). Fig. 2의 결과와 잘 일치되게 분화된 지방세포에서 현저하게 증가한 중성지방의 양은 EEVP의 처리 농도 증가에 따라 유의적으로 감소했으며, 최대 농도인 200 μg/mL에서 약 70% 정도의 중성지방 생성 억제 효과가 있는 것으로 나타났다. 이 결과는 EEVP에 의한 lipid droplet의 형성 억제에 따른 것이며, EEVP는 지방전구세포가 지방세포로의 분화를 효율적으로 억제하였음을 의미한다.

Fig 2. Effect of EEVP on lipid accumulation during 3T3-L1 preadipocyte differentiation. Differentiation of 3T3-L1 preadipocytes was induced by the addition of DMI (insulin, dexamethasone, and IBMX) in the presence or absence of EEVP for 8 days. (A) Changes in cell morphology were observed under a phase contrast microscope (magnification, ×200). (B) 3T3-L1 cells cultured under the same conditions were stained with Oil Red O and images of lipid droplets in adipocytes were captured using a phase contrast microscope (magnification, ×200).

Fig 3. Inhibitory effect of EEVP on triglyceride contents in differentiated 3T3-L1 cells. 3T3-L1 preadipocytes were differentiated with differentiation medium in the presence or absence of EEVP for 8 days. To measure intracellular triglyceride contents of 3T3-L1 adipocytes, absorbance was measured at 500 nm with an ELISA reader. ***P<0.001 compared to non-differentiated cells; ^#P<0.05 and ^###P<0.001 compared to differentiated cells.

분화 과정에서 생성된 lipid droplet은 중성지방 및 cholesterol ester를 포함하는 중성 지질 형태로 인지질 단층으로 구성된 세포 내 소기관이다. 잘 알려진 바와 같이 diglyceride acyltransferase 1과 같은 효소에 의한 소포체(endoplasmic reticulum)의 지질 합성은 초기의 lipid droplet 형성을 유도한다(Khor 등, 2013; Welte와 Gould, 2017). Lipid droplet의 지질 저장 기능은 백색지방세포에서 가장 두드러지고 비정상적으로 지질이 축적되는 것이 특징이며, 지질 대사와 매우 밀접하게 관련되어 있어 비만과 연관이 깊다(Fujimoto와 Parton, 2011). 그리고 지방세포에 저장되는 중성지방은 글리세롤 한 분자와 지방산 세 분자가 ester 결합으로 이루어져 있고, 열량, 당질, 지질 등의 섭취량이 많거나 과도한 음주로 인해 중성지방의 농도는 증가한다. 중성지방과 콜레스테롤은 apolipoprotein B를 포함하는 지방단백질에 의해 혈장에서 운반되고 중성지방은 간에서 합성된다(Talayero와 Sacks, 2011; Xu 등, 2018). 지방단백질은 chylomicron, very low density lipoprotein(VLDL), LDL과는 별개로 죽상경화를 촉진한다고 알려져 있으며, 관상 동맥 심장질환의 위험을 증가시키고 고지혈증, 인슐린 저항성, 비만을 유발할 수 있다(Gotto, 1998). 따라서 본 연구의 결과는 EEVP가 관상 동맥 심장질환을 포함한 지방 축적과 연관된 질환의 제어를 위한 기능성 소재로서의 활용 가능성이 높음을 의미한다.

EEVP가 지방생성 전사인자 및 지방세포 발현 유전자의 발현에 미치는 영향

EEVP의 지방세포 분화억제 기전을 파악하기 위하여 지방생성 전사인자 및 지방세포 발현 유전자의 발현에 미치는 영향을 western blot 분석을 통해 조사하였다. Fig. 4A 및 B의 결과에서 알 수 있듯이, 분화된 3T3-L1 지방세포에서는 지방생성 전사인자인 PPARγ, C/EBPα, C/EBPβ 및 SREBP-1c의 발현이 증가했으며 EEVP의 처리 농도 증가에 따라 점진적으로 감소하였다. 아울러 대표적인 지방세포 발현 유전자에 속하는 aP2 및 leptin의 발현도 분화된 지방세포에서 증가했으며, 이들의 발현 또한 EEVP 처리에 의해 농도 의존적으로 감소하였다(Fig. 4C 및 D). 따라서 EEVP에 의한 지방세포의 분화억제는 지방생성 전사인자뿐만 아니라 지방세포 발현 유전자의 억제에 의한 결과임을 알 수 있다.

Fig 4. Effect of EEVP on the expression of adipogenic transcription factors and adipocyte-specific genes in the differentiated 3T3-L1 cells. Differentiation was induced by culturing 3T3-L1 preadipocytes in a differentiation medium in the presence or absence of EEVP for 8 days. (A and C) Cellular proteins were extracted and expression of the indicated proteins was analyzed by western blot analysis. (B and D) The relative density of each protein band was quantified using ImageJ software. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared to non-differentiated cells; ^#P<0.05, ^##P<0.01, ^###P<0.001 compared to differentiated cells.

그동안의 선행 연구에 의하면, 지방전구세포인 3T3-L1 세포가 지방세포로 분화되는 초기에 SREBP-1c의 발현이 증가하며, 이어서 지방생성 과정을 촉진하는 C/EBPβ 및 C/EBPδ를 시작으로 C/EBPα 및 PPARγ의 발현을 유도한다고 알려져 있다(Lefterova 등, 2008; White와 Stephens, 2010). PPARγ는 지방세포 분화 과정에서 aP2 및 leptin과 glucose transporter 4, fatty acid transporter, acetyl CoA oxidase 및 lipoprotein lipase를 포함하여 지방 조직 생성과 유지하는 것에 관련이 있는 유전자의 발현을 조절한다(Williams 등, 2020). 또한, C/EBPα는 분화를 직접 조절하는 전사인자로 알려져 있으며 C/EBP의 반응성 요소는 aP2와 leptin에 존재하고 있다. Leptin 및 aP2와 같은 유전자의 promoter는 C/EBPα 및 PPARγ에 의해 조절되며, aP2는 지방산 대사와 tumor necrosis factor α와 같은 염증성 인자의 발현과도 연관되어 있다(Jeon 등, 2004; Saraf 등, 2012). Leptin은 지방세포 분화 과정에서 분비되는 호르몬으로 음식 섭취 관리와 식욕 자극에 관련되고 지질 및 포도당 대사 및 염증 과정과 상관관계가 있다고 알려져 있으며, SREBP-1c는 인슐린 대사작용으로 지질 대사의 유전자 발현을 조절하고 지방 조직과 간에 풍부하게 있다(Lee 등, 2009; Yang 등, 2008). 따라서 EEVP는 지방세포 분화의 억제뿐만 아니라 인슐린 저항성과 간 기능 개선에도 탁월한 효능을 지닐 것으로 예상한다.

EEVP의 지방세포 분화억제에 미치는 AMPK 경로의 역할

AMPK는 에너지 균형을 조절하는 중요한 조절인자로 지방생성 전사인자의 발현을 억제함으로써 지방전구세포의 분화를 차단하여 비만을 억제하는 인자로 알려져 있다(Ahmad 등, 2020; Pang 등, 2008). 아울러 AMPK의 항비만 활성은 FAS의 활성 저해와도 깊은 연관성을 가진다(Dagon 등, 2006; Fang 등, 2022). 따라서 EEVP에 의한 지방세포의 분화억제 과정에 AMPK 신호계가 관여하는지를 조사했으며, 이를 위해 AMPK가 활성화되었음을 의미하는 AMPK의 인산화 여부와 AMPK의 하위 단계에 작용하는 ACC의 발현 변화를 조사하였다. 본 연구 결과에 의하면, 비록 AMPK와 ACC의 총단백질 발현에는 유의적인 변화가 없었지만, EEVP에 의해 3T3-L1 세포가 지방세포로 분화되는 정도가 억제됨에 따라 AMPK와 ACC의 인산화가 증가하여 EEVP에 의한 지방세포 분화억제에는 AMPK의 활성화가 관여하고 있음을 알 수 있다(Fig. 5).

Fig 5. Effect of EEVP on phosphorylation of AMPK and ACC in differentiated 3T3-L1 cells. Differentiation was induced by culturing 3T3-L1 preadipocytes in a differentiation medium in the presence or absence of EEVP for 8 days. (A) Cellular proteins were extracted and the expression of AMPK and ACC and their phosphorylation status (p-AMPK and p-ACC) were analyzed by western blot analysis. (B) The relative density of the bands was quantified using ImageJ software. *P<0.05, ***P<0.001 compared to non-differentiated cells.

최근 연구에 의하면 AMPK는 간 손상의 예방에 관여한다는 것이 밝혀진 바 있고, AMPK의 활성화는 알코올 또는 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병 및 비만에 의해 유발된 쥐의 지방간을 완화할 수 있었으며, 천연 AMPK 작용제는 간세포의 지질 대사, 염증 및 산화스트레스를 조절할 수 있어 결과적으로 지방간을 억제했다(Fang 등, 2022). 아울러 AMPK의 활성 증가는 지방생성에 관여하는 FAS와 SREBP-1c의 발현을 차단하여 지방산과 콜레스테롤의 합성을 억제할 수 있다. 동시에 지방산 산화 및 지질 분해에 관여하는 유전자들의 발현을 증가시켜 지질 균형을 유지할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Lundsgaard 등, 2020; Zhou 등, 2015). 따라서 EEVP의 지방세포 분화억제 과정에는 AMPK에 의존적인 지방생성 전사인자의 활성 저해가 관여할 것으로 추측되며, AMPK의 활성과 연관된 ATP 합성-미토콘드리아의 기능 관련 신호전달계 연계성 등을 포함한 추가적인 연구가 요구된다. 아울러 문모초에 함유된 핵심 유효 생리활성성분의 분석과 그들의 역할에 관한 연구 또한 필요할 것으로 판단된다.

본 연구에서는 3T3-L1 지방전구세포에서 문모초 에탄올 추출물(EEVP)에 의한 lipid droplet과 중성지방 생성 억제와 연관된 항비만 효과를 조사하였다. 3T3-L1 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 EEVP 처리조건에서, EEVP의 처리 농도 의존적으로 lipid droplet의 형성 및 중성지방의 생성이 유의적으로 억제되었다. 이러한 EEVP에 의한 지방세포 분화억제는 지방생성 전사인자와 지방세포 발현 유전자의 발현 억제와 밀접한 연관성이 있었다. 아울러 EEVP의 항비만 효과에는 AMPK 신호계의 활성화가 관여하고 있음을 AMPK 및 ACC의 인산화 증가로 확인하였다. 본 연구 결과는 EEVP가 에너지 대사 신호 경로의 조절을 통해 항비만 활성을 가질 수 있음을 의미하며, 문모초 추출물은 향후 항비만 기능성 소재로서의 활용이 가능할 수 있음을 시사한다.

이 논문은 2021학년도 동의대학교 연구년 지원에 의하여 연구되었음.