사람이 느끼는 기본 맛에는 단맛, 짠맛, 신맛, 쓴맛 그리고 감칠맛이 있고, 기본 맛으로 분류하지는 않지만 매운맛이 존재한다. 매운맛은 미뢰만으로 느껴지는 기본적인 맛과는 다르게 입안 자극에 의해 나타나는 맛으로 미각 전달양식이 다르다. 또한 다른 맛과는 다르게 매운맛에는 단위가 존재하는데 매운맛의 단위인 스코빌 지수는 윌버 스코빌이란 미국의 화학자가 1912년 개발한 지표로써 매운 음식을 설탕물로 희석한 후 매운맛을 느끼지 못하게 되는 희석배수를 측정해서 값으로 환산한 것으로, 국내산 일반고추는 1,500, 청양고추는 10,000 스코빌 지수가 측정된다고 알려져 있다(Lee 등, 2011).

일반적으로 매운맛은 식욕을 자극하고 풍미를 증진시키며 다양한 생리기능 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 매운맛을 내는 성분들에는 마늘이나 양파에 존재하는 알리신, 후추의 피피페린, 겨자의 시니그린, 고추의 캡사이신으로 크게 나눌 수 있다. 매운맛을 내는 성분 중 고추에 존재하는 capsaicinoid는 vanillyamine과 fatty acid가 결합하여 형성된 amides이다(Peña-Alvarez 등, 2012). Capsaicinoid계 화합물은 capsaicin, dihydrocapsaicin, nordihydrocapsaicin, homodihydrocapsaicin, homocapsaicin으로 분류되고, 식염섭취 저하, 타액분비 촉진, 위산분비 증가, 콜레스테롤 저하 등의 다양한 기능을 가지고 있다(Buck과 Burks, 1986; Park 등, 1999). Capsaicinoid계 화합물을 함유하는 식품에는 capsaicin과 dihydrocapsaicin이 90% 이상을 차지하고, 나머지 성분은 미량으로 존재한다고 알려져 있다(Kang 등, 2010; Musfiroh 등, 2013). 한국에서 매운맛을 나타내는 대표적인 식품으로는 고추(Capsicum annuum)가 있다. 고추는 가지과에 속하는 작물로 할라피뇨, 꽈리고추, 타바스코 등의 이명이 존재하며, 잎과 열매를 섭취하고 고춧가루, 고추장, 김치 등에 다양하게 사용된다(Kwun 등, 2021). 고추의 capsaicinoid계 화합물의 함량은 품종에 따라 큰 차이를 나타내고 같은 품종에서도 재배지역, 주위 환경에 따라서도 차이를 나타내는 것으로 알려져 있다(Cho 등, 2004).

고추의 다양한 품종 중 파프리카는 서양에서 bell pepper 혹은 sweet pepper라고 불리며, 서양에서의 paprika는 파프리카의 건조 분말(paprika powder)을 뜻한다. 한국에서는 9~10 cm의 크기로 주황색, 녹색, 적색 등 다양한 색이 존재하고, 다양한 pytochemical을 가지고 있으며 단위 면적 당 소득이 높은 고소득 작물이다(Kim 등, 2018; Topuz 등, 2009). Musfiroh(2013)는 파프리카와 다양한 고추 품종을 HPLC를 이용하여 매운맛을 분석했을 때 녹색, 노란색, 적색 파프리카에서는 캡사이신이 검출되지 않았다고 보고하였다.

식품 분석법에 근거하여 매운맛 성분을 측정하기 위한 방법으로는 Thin layer chromatography(TLC), gas chromatography(GC), high-performance liquid chromatography(HPLC), liquid chromatography/mass spectromatry(LC/MS) 등이 보고되어 있다(Henderson 등, 1999; Peña-Alvarez 등, 2012). 다양한 방법 중 HPLC는 분석 시간이 짧고 신뢰도가 높아 최근 연구에서 많이 이용되고 있다(Sanatombi와 Sharma, 2008; Tilahun 등, 2013).

현재 국내에서 파프리카 추출색소의 매운맛을 측정하기 위한 방법은 “샘플을 5명의 피실험자에게 먹였을 경우 3명 이상이 매운맛을 느끼는 경우”로 관능적 특성을 이용하고 있다(MFDS, 2022). 매운맛을 관능적 특성으로 분석하는 것은 사람에 따라 민감성과 환경적인 영향을 받아 주관적인 평가가 담기기 때문에 객관적인 지표가 필요하다. 따라서 본 연구에서는 HPLC를 이용하여 파프리카 추출색소를 포함한 고추 품종별 캡사이신의 함량을 확인하고, method validation을 근거로 실험방법의 타당성을 제시하고자 한다.

재료 준비

본 연구에 사용된 시료는 상업용 파프리카 추출색소 3종, 파프리카, 청양고추, 고춧가루, 페페론치노, 타바스코소스이다. 파프리카 추출색소는 한솔식품원료(Hansolfood, Gunpo, Korea), 케이준식품원료(KJoonfood, Bucheon, Korea), 세림식품원료(Serimfood, Bucheon, Korea)에서 각각 구매하였고, 생파프리카, 페페론치노, 청양고추, 고춧가루, 타바스코소스는 모두 인근 마트(Jinju, Korea)에서 구매하였다. 품질변화를 최소화하기 위해 구매 후 4°C의 냉장고에서 보관하였고 48시간 이내에 실험을 진행하였다. 사용된 시약은 메탄올, 에탄올, phosphoric acid를 사용하였고, 캡사이신(순도 95.0% 이상) 표준물질은 Sigma Company(St. Louis, MO, USA)에서 구매하여 사용하였다.

캡사이신 추출

캡사이신의 추출을 위해 고체 형태의 시료들은 분쇄하여 사용하였다. 분쇄된 시료 2 g을 칭량하여 test tube에 넣고 에탄올 10 mL를 첨가한 후 4시간 동안 60°C에서 교반하여 캡사이신을 추출하였다. 교반한 추출액을 상온에서 방랭한 후 추출액의 상등액 1 mL를 0.45 µm syringe filter에 여과하였고, 여과된 추출액을 vial에 담아 HPLC를 이용하여 캡사이신을 정량 분석하였다. 캡사이신 표준물질은 각각 10 mg을 칭량하여 test tube에 넣고 에탄올 10 mL에 녹여서 1 mg/mL의 농도로 만들어 분석을 진행하였다.

HPLC 분석에 사용된 컬럼은 US-C18(150×4.6 mm, 5 µm, Imtakt Co., Kyoto, Japan)을 사용하였고, injection volume은 20 µL, eluent는 methanol/0.1% phosphoric acid＝65/35, column temperature는 30°C, flow rate는 1.0 mL/min, detection은 UV 검출기를 이용하여 280 nm의 파장에서 분석하였다(Park 등, 1999).

Method validation

캡사이신 표준물질을 파프리카 시료에 spike 한 후, HPLC 분석에 따른 peak area를 통해 회수율(recovery)을 산출하였다. 회수율은 아래의 식에 따라 산출되었다.

$$회수율\left(\%\right)=\frac{spikedsamplevalue-samplevalue}{spikevalue}\times 100$$

Method validation을 위한 시험방법은 ‘의약품 등 시험방법 밸리데이션 가이드라인(MFDS, 2015)’을 근거로 분석을 진행하였다. 반복성(repeatability)을 평가하기 위해 표준물질을 하루 동안 3가지 농도에서 3회 반복하여 측정하였다. 실험실 내 정밀성(intermediate precision)을 평가하기 위해 실험일을 달리하여 3일간 측정했으며, 재현성(reproducibility)을 평가하기 위해 본 기관을 제외한 다른 기관 2곳에서 실험을 진행하였다. 표준물질 분석을 통해 7가지 농도 범위(1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.015625 mg/mL)의 직선성(linearity), limit of detection(LOD), limit of quantitation(LOQ)을 구하였다. LOD와 LOQ는 표준품의 직선성에서 기울기의 평균값(A)과 y절편의 표준편차(B)를 이용하여 산출하였다(Araujo, 2009).

$$LOD=3.3\times B/A,LOQ=10\times B/A$$

캡사이신 함량 분석

고추의 매운맛 성분인 캡사이신의 함량을 측정하기 위해서 HPLC를 이용하여 파프리카 추출색소를 포함한 고추 품종별 분석을 진행하였다. 캡사이신 표준물질과 고춧가루, 청양고추, 파프리카 추출색소의 chromatogram은 Fig. 1에 나타내었다. Chromatogram에 나타난 캡사이신의 retention time은 9~10분대 전후로 확인되었다. 고추 품종별 캡사이신의 함량은 Table 1에 나타내었다. 고춧가루의 캡사이신 함량은 46.74 mg/100 g이었다. 청양고추와 타바스코소스의 캡사이신 함량은 각각 9.77 mg/100 g, 12.18 mg/100 g이었다. 페페론치노는 캡사이신이 443.10 mg/100 g으로 샘플 중 가장 높은 함량을 나타내었다. 샘플 중 파프리카와 3종류의 파프리카 추출색소에서는 캡사이신이 검출되지 않았다.

Table 1 . Capsaicin content of peppers and paprika oleoresins (mg/100 g).

Sample	Capsaicin
Chili powder	46.74
Cheongyang chili pepper	9.77
Tabasco sauce	12.18
Peperoncino	443.1
Paprika oleoresin A	ND1)
Paprika oleoresin B	ND
Paprika oleoresin C	ND
Raw paprika	ND

¹⁾ND corresponds “not detected.”.

Fig 1. Typical chromatograms of capsaicin standard and samples using HPLC. A: capsaicin standard, B: chili powder, C: Cheongyang chili pepper, D: paprika oleoresin.

Musfiroh 등(2013)은 고추 품종을 에탄올을 이용하여 추출한 후 HPLC를 통해 캡사이신을 분석한 결과, 생파프리카에는 캡사이신이 존재하지 않는다고 보고하였다. Ham 등(2012)은 6가지 시판 고춧가루에 메탄올을 혼합하여 homogenizer로 균질화한 후 HPLC를 이용하여 분석한 결과 캡사이신 함량을 1.80~78.24 mg/100 g으로 보고하였다. Ku 등(2008)은 품종별 고추씨를 에탄올로 추출한 후 HPLC를 이용하여 고추씨의 캡사이신을 분석한 결과 캡사이신의 함량이 0.09~5.32 mg/%로 나타났고, 일반 고춧가루보다는 적은 함량을 나타낸다고 보고하였다. Yu 등(2009)은 GC를 이용하여 고추 품종별 및 시판 고춧가루의 캡사이신을 methanol, hexane, NaCl, dichloromethane을 이용하여 추출한 뒤 함량을 조사하였는데 캡사이신 함량을 25.18~123.62 mg/%로 보고하였다. Hwang 등(2011)은 재배지역별 청양고추를 메탄올 추출법을 이용하여 HPLC를 통해 캡사이신 함량을 분석하였는데 100.27~261.53 mg/%를 나타내었다. 최근 연구에서는 다양한 추출법과 다양한 분석 기기들을 사용하여 캡사이신의 분석을 진행하고 있고, 다양한 고추 품종의 캡사이신 함량 분석 결과가 보고되고 있다. 본 연구에서 시행한 캡사이신 분석에서 고추 품종별 함량에 관한 결과가 제시되었고, 분석 방법에 대한 method validation 또한 진행되었기 때문에 본 연구에서 시행한 캡사이신 분석은 간단하면서도 신뢰성 있는 분석 방법으로 판단된다.

Method validation

실험법 타당성 검토(method validation)의 정밀성(precision)을 평가하기 위해서 반복성, 실험실 내 정밀성, 재현성을 진행하였다. 반복성을 평가하기 위해서 하루 3번 반복하여 실험을 진행하였고, 실험실 내 정밀성을 위해서 실험일을 달리하여 3일간 실시하였으며, 재현성을 위해 본 기관을 제외한 2곳의 분석기관에서 실험을 진행하였다. 3곳의 분석기관에서의 직선성은 Table 2에 나타내었다. 직선성 검증을 위해 7가지 농도로 표준물질을 분석하여 측정되는 캡사이신의 감도를 이용하여 희귀방정식으로 작성하고, 정량범위 내에서 직선성을 확인하였다. 실험 결과 직선성은 7가지 농도 범위(1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.015625 mg/mL)에서 r²(상관계수)가 0.99999 이상이었으며, 상대표준편차(%RSD)는 0.00002 이하로 확인되었다. 캡사이신 표준물질을 이용하여 3곳의 기관에서 측정한 LOD와 LOQ 결과를 Table 3에 각각 나타내었다. LOD는 0.0008~0.0013 mg/mL의 범위로 나타났고, LOQ는 0.0026~0.0040 mg/mL의 범위를 나타내었다. 캡사이신 표준물질을 농도별(1, 0.5, 0.1 mg/mL)로 파프리카 시료에 spike 한 후 HPLC로 분석한 결과 나타난 peak 면적을 이용하여 회수율을 산출하였고, 반복성과 실험실 내 정밀성 평가를 Table 4에 나타내었다. 파프리카 시료를 3곳의 분석기관에서 반복성을 평가한 회수율은 98.5~101.82%로 나타났고, 3곳의 기관에서 실험실 내 정밀성을 평가한 회수율은 97.22~101.96%로 나타났다. Lee 등(2013)은 HPLC를 이용하여 국내 재배지역에 따른 고추의 캡사이신을 측정한 분석법의 검증 결과로 회수율의 값이 90~110% 범위를 나타냈고, 반복성과 재현성의 coefficients of variation은 5% 이하로 나타났다고 보고하였다. 본 결과를 토대로 매운맛에 관련된 캡사이신을 HPLC로 정량분석하는 방법은 관능적 특성에 의지한 현재의 표준분석법을 대체할 수 있는 검증된 분석법으로 활용 가능할 것으로 판단된다.

Table 2 . Linearities of three institutional cross validation of capsaicin standards.

Institution	Linearity (R2)	%RSD	Slope	Intercept
Institution A	0.99999	0	11,884	6.3
Institution B	0.99993	0.00001	11,889	29.7
Institution C	0.99998	0.00001	11,779	10.8

Table 3 . Limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of three institutional cross validation of capsaicin standards.

Institution	LOD (mg/mL)	LOQ (mg/mL)
Institution A	0.0013	0.004
Institution B	0.0008	0.0026
Institution C	0.0012	0.0035

Table 4 . Repeatability and intermediate precision of three institutional cross validation of paprika.

Institution		Conc.(mg/mL)	Repeatability		Intermediate precision
			Recovery (%)	%RSD	Recovery (%)	%RSD
Institution A	Product A	1	99.8	0.49	99.9	0.48
		0.5	100.15	0.29	100.19	0.27
		0.1	100.1	0.45	100.13	0.16
	Product B	1	100.12	0.22	100.12	0.29
		0.5	100.3	0.34	100.2	0.09
		0.1	99.71	0.56	100.62	1.22
	Product C	1	100.15	0.3	100.04	0.35
		0.5	101.15	0.21	100.84	0.33
		0.1	99.53	0.49	100.39	0.75
Institution B	Product A	1	100.16	0.23	100.59	0.54
		0.5	100.26	0.54	100.02	0.62
		0.1	100.59	0.59	101.96	1.9
	Product B	1	99.69	0.31	100.15	0.62
		0.5	101.43	0.28	101	0.72
		0.1	98.5	1.27	99.71	0.86
	Product C	1	99.58	0.62	99.92	0.68
		0.5	101.82	0.95	101.88	0.34
		0.1	99.64	1.74	99.98	2.59
Institution C	Product A	1	100.35	0.44	99.29	1.36
		0.5	100.62	0.98	100.48	0.13
		0.1	99.62	0.31	97.22	2.29
	Product B	1	100.23	0.33	99.47	0.9
		0.5	100.84	0.32	101.15	1.26
		0.1	100.47	1.14	98.44	2.35
	Product C	1	100.33	0.42	99.28	1.5
		0.5	100.77	0.94	100.55	0.73
		0.1	99.99	1.56	98.48	2.54

본 연구는 파프리카 추출색소를 포함한 고추 품종별 캡사이신 함량 분석과 method validation을 진행하였다. 캡사이신 추출은 에탄올을 이용하여 추출했으며, 분석기기는 HPLC를 이용하여 캡사이신 분석을 진행하였다. 캡사이신 함량 분석 결과 파프리카와 3종의 파프리카 색소에서는 캡사이신이 검출되지 않았고, 파프리카를 제외한 고추 품종별 캡사이신 함량은 9.77~443.10 mg/100 g을 나타내었다. 캡사이신 함량 시험법의 method validation 평가 결과 3곳의 기관별 직선성에서의 r² 값은 모두 0.99999 이상이었으며, %RSD는 0.00002보다 낮은 값을 나타냈다. LOD는 0.0008~0.0013 mg/mL, LOQ는 0.0026~0.0040 mg/mL였으며, 파프리카 시료를 이용한 회수율은 97.22~101.96% 범위로 나타났다. 본 연구 결과를 토대로 현재 식품첨가물공전에서 제시하는 파프리카 추출색소의 매운맛 분석법에 대해서는 HPLC 분석법에 대한 채택이 필요할 것으로 확신한다.

본 연구는 식품의약품안전처(22192식품위017)의 지원으로 수행된 연구로 이에 감사드립니다.