사철쑥(Artemisia capillaris Thunberg)과 더위지기(Artemisia iwayomogi Kitamura)는 쑥속(Artemisia species) 식물이고 국화과(Compositae)에 속하는 다년생 식물로, 우리나라를 비롯한 중국, 일본, 시베리아 등 아시아 동북부 지역에 널리 분포하며(Kim과 Jang, 1996) 약용자원으로 가장 많이 사용되는 식물이다(Lee 등, 2000). 사철쑥의 경우 식품공전 ｢식품의 기준 및 규격｣(MFDS, 2022) 식품에 사용할 수 있는 원료로 등재되어 식용으로 가능하나, 더위지기의 경우 한인진이라 하여 ｢대한민국약전외한약(생약)규격집｣에 등재되어 사철쑥과 유사한 용도로 약재로 사용하고 있다(Hahn, 1966). 더위지기는 민간에서 오래 사용돼왔으나 식품에 사용할 수 있는 원료로 등재되어 있지 않으며, 사철쑥은 시중에서 더위지기와 혼용 및 오용되어 시장에서 유통되고 있으나 이들의 원재료에 대한 진위 판별이나 추출에 따른 유효성분에 관한 구체적인 비교연구는 아직 미흡한 실정이다. 그러므로 국내에서 유통되고 있는 사철쑥과 더위지기를 대상으로 주요 유효성분을 동시에 분석하는 분석법을 확립하고, 확립된 분석법을 기준으로 이들의 생리활성 성분의 함량을 확인하여 사철쑥의 품질관리와 표준화를 위한 기준점을 제시하는 것은 중요하다고 사료된다.

사철쑥은 인진호 혹은 인진이라고 불리며(Kim과 Jang, 1996), 담즙분비 촉진, 이뇨, 소염, 진통, 항균, 혈압강하, 항암, 항바이러스, 항산화 등 다양한 효능이 있는 것으로 알려져 있고(Lee 등, 1992; Lim과 Lee, 1997; Nam 등, 1998; Seo와 Yun, 2008), 주요성분으로는 scoparone, chlorogenic acid, hyperoside, betaine 등 플라보노이드류, 페놀화합물, coumarin 유도체, 다당류 등이 있는 것으로 밝혀져 있다(Wu 등, 2001). Scoparone은 coumarin 유도체로 사철쑥의 지상부에 존재하고 담즙 생성 분비를 촉진하는 이담제, 이뇨제로 보고되었으며, 항산화 활성이 높아 간 질환에 효과적인 물질로 알려져 있다(Kim 등, 1992; Kiso 등, 1984; Komiya 등, 1976). 반면에 더위지기의 효능은 플라보노이드 성분이 많이 함유되어 있어 주로 항균 활성과 항산화 연구가 많이 보고되었으며(Seo와 Yun, 2008; Seo 등, 2012; Hwang, 2009), 이외에도 항돌연변이 및 세포독성 효과(Ham 등, 1998), 알레르기와 염증을 억제하는 기능도 보고되어 있다(Seo와 Yun, 2008; Shin 등, 2006). 더위지기의 주요성분으로는 scopolin, scopoletin, chlorogenic acid 등이 있다(Wang 등, 1994; Sin 등, 2020).

사철쑥을 활용한 기능성 소재를 개발하려는 시도가 진행되고 있으며(Kim, 2014), 기능성 원료로 가치가 있다고 알려짐에 따라 최근 소비자의 수요 증가와 사철쑥에 관한 관심이 증대되고 있다. 또한 기능성 소재 개발 시 원료의 표준화 및 기준규격 설정은 매우 중요하며, 원료와 제품의 품질을 지속해서 평가하기 위해 지표성분에 대한 분석법 검증이 요구된다.

따라서 본 연구에서는 사철쑥과 더위지기가 한방에서 유사한 용도로 사용되고 있는 데에도 불구하고 두 식물 간에 주요 생리활성 물질의 차이점에 대해서는 구체적으로 밝혀져 있지 않은 점을 감안하여, 국내에서 자생하고 있는 사철쑥과 더위지기의 추출물에 대한 주요 생리활성 성분의 함량을 제시하고자 한다. 또한 식품의약품안전처에서 제시한 건강기능식품에 대한 HPLC 분석법 검증 가이드라인을 바탕으로, 가이드에서 제시한 방법 및 형식에 맞게 scoparone을 지표성분으로 이용한 사철쑥 진공 추출물의 HPLC 분석법 밸리데이션을 수행한 내용을 보고하여 사철쑥 기능성 소재 개발에 따른 표준화를 위한 기준점을 제시하고자 한다.

실험재료

본 실험에 사용한 사철쑥과 더위지기는 충북 제천시와 강원도산으로 소재의 전초를 구입하여 실험에 사용하였다. HPLC 밸리데이션 시험에 사용한 사철쑥 진공 추출물은 (주)토마토푸드(Gyeonggi-do, Korea)에서 제공한 것을 사용했으며, 진공 추출물에 사용된 사철쑥은 국내에서 재배된 것으로 (주)선일물산(Seoul, Korea)으로부터 원산지를 검증받아 사용하였다. 지표성분인 scoparone 표준품은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 시료 전처리 및 HPLC에 사용된 유기용매(TEDIA Inc., Fairfield, OH, USA)는 HPLC 등급의 시약을 사용했으며, 증류수는 Millipore Milli-Q water purification system(Billerica, MA, USA)을 이용하여 사용하였다.

진공 추출

진공 방식의 추출법은 증숙 가공 장치를 사용하여 고온에서 재료에 갈변현상이 발생하지 않고 투명한 원액으로 추출하는 방법으로, 증숙 장치의 특수한 어셈블리 덮개를 사용하여 물을 전혀 사용하지 않으면서도 천연물의 수분 및 성분을 효과적으로 추출하는 방법이다.

추출물 제조

사철쑥과 더위지기의 추출 방법은 각 소재에 20배 부피의 추출용매를 가한 후, 환류냉각 추출(reflux extraction, RE) 방법으로 추출물을 제조하였다. 열수 추출은 플라스크에 건조 분말 5 g에 증류수 100 mL를 가한 후 100°C에서 2시간씩 2회 반복하여 추출하였고, 에탄올 추출은 70°C에서 2시간 추출한 다음 각각의 추출물을 Whatman No. 1(Whatman Co., Kent, England) 여과지로 여과 후 실험에 사용하였다.

표준용액의 조제

사철쑥과 더위지기의 분석에 사용한 표준품 scoparone, scopolin, chlorogenic acid, caffeic acid, scopoletin, hyperoside, isoquercitrin, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid C는 Sigma-Aldrich Co.의 것을 사용하였다. 추출용매와 표준품 제조 및 이동상에 사용한 용매는 HPLC급 용매를 사용하였다. 분석에 사용된 표준용액은 각각의 표준물질 약 10 mg을 메스플라스크에 넣고 메탄올로 용해한 후 적절히 희석하여 검량선용 표준용액을 조제하였다.

분석법 밸리데이션 수행 시 scoparone 표준물질 약 10 mg을 메스플라스크에 정밀히 달아 메탄올 10 mL로 용해한 후 농도가 1.0 mg/mL인 표준원액으로 하였으며, 밸리데이션 시험법 항목에 따라 메탄올로 적절히 희석하여 밸리데이션 검량선용 표준용액을 조제하였다.

시험용액의 조제

사철쑥 진공 추출물을 취하여 메탄올로 희석한 다음 membrane syringe filter(0.45 μm pore size, Whatman Co.)로 여과한 후 밸리데이션 시험법 항목에 적용하는 시험용액으로 사용하였다.

HPLC 분석조건

HPLC 분석은 binary pump, degasser, autosampler, DAD로 구성된 HPLC system(Shimadzu, Kyoto, Japan)을 이용하였다. 컬럼은 cosmosil C18 컬럼(4.6×250 mm I.D., 5 μm, Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan)을 사용했으며, 이동상 A는 증류수(0.1% formic acid), 이동상 B는 아세토나이트릴(0.1% formic acid)을 사용하였다. 검출파장은 330 nm이며 유속은 1.0 mL/min이었다. 컬럼 온도는 35°C로 유지하였다. 이동상의 농도구배는 10~20% B(0~30 min), 20~10% B(30~31 min), 10% B(31~40 min)였다. 표준용액 및 시험용액은 10 μL를 주입하였다.

분석법의 유효성 검증

본 시험에서 HPLC를 이용한 분석 방법은 ｢건강기능식품의 기준 및 규격｣, ｢건강기능식품 기능성 원료 및 기준･규격｣, 건강기능식품 기능성 원료 인정을 위한 제출자료 작성 가이드, ICH(International Conference on Harmonisation) 가이드라인을 근거로 하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정밀성(precision), 정확성(accuracy), 정량한계(quantitation limit, LOQ)를 이용하여 과학적으로 분석법의 유효성을 확인하였다.

특이성 평가

표준용액과 시험용액(사철쑥 진공 추출물)을 HPLC로 분석한 뒤 scoparone 피크 및 인근 물질 피크의 머무름시간 및 scoparone의 UV 스펙트럼 비교를 통해 시험법의 특이성을 측정하였다.

정확도 평가

사철쑥 진공 추출물을 취하여 0.45 μm membrane syringe filter를 이용하여 여과하였다. 여과한 사철쑥 진공 추출물 시료 900 μL에 각각 1.7 μg/mL, 3.4 μg/mL, 5.1 μg/mL에 해당하는 scoparone 용액을 100 μL 첨가하여, 첨가한 scoparone 최종농도가 0.17 μg/mL, 0.34 μg/mL, 0.51 μg/mL가 되도록 회수율 시험용액을 조제하였다. 정확도는 scoparone을 첨가하지 않은 대조군과 scoparone을 첨가한 실험군(최종농도 0.17 μg/mL, 0.34 μg/mL, 0.51 μg/mL) 간의 농도 차이를 계산하여 확인했으며, 해당 정확도 시험은 표준액 제조를 포함하여 일련의 과정을 총 3회 반복하였다.

일내 정밀도(반복성) 평가

사철쑥 진공 추출물을 취하여 각각 50%, 75%, 100%의 농도가 되도록 제조한 후 0.45 μm membrane syringe filter를 이용하여 여과하였다. 농도별로 제조한 시험용액을 HPLC로 측정하여 함유된 scoparone의 함량을 계산한 뒤 이를 희석배수를 고려하여 사철쑥 진공 추출물 1.0 g에 함유된 scoparone 함량인 μg/g 단위로 환산하였다. 일내 정밀도 시험은 검량선을 위한 검량선용 표준용액 제조를 1회로 하여 검량선을 작성하고 각 사철쑥 진공 추출물 농도당 6회 각각 조제한 시험용액을 반복 측정(전처리부터 분석까지의 일련의 과정을 포함)하여 수행하였다.

일간 정밀도(재현성) 평가

사철쑥 진공 추출물을 취한 후 0.45 μm membrane syringe filter를 이용하여 여과하였다. 여과한 시험용액을 HPLC로 측정하여 함유된 scoparone의 함량을 μg/mL 단위로 계산한 뒤, 희석배수를 고려하여 사철쑥 진공 추출물 1.0 g에 함유된 scoparone 함량을 μg/g 단위로 환산하였다. 일간 정밀도 시험은 검량선을 위한 검량선용 표준용액과 100% 농도의 시험용액을 조제하여 시험용액당 6회 반복 측정했으며 이 과정을 3일 반복 수행하였다.

정량한계 측정

농도가 1.0 mg/mL인 scoparone 표준원액은 순차적으로 희석하여 0.04, 0.09, 0.17, 0.34, 0.68, 1.37, 2.73 μg/mL의 총 7개 농도로 조제하였다. 희석한 scoparone 표준용액은 HPLC를 이용하여 측정했으며, 농도별 면적을 구하여 검량선을 구하였다. 상기 과정을 총 3회 반복했으며 정량한계는 검량선 기울기 평균(S) 및 y 절편(y-intercept)의 표준편차(σ)를 이용했고 계산식은 아래와 같다.

$$정량한계(LOQ)=10\times \sigma /S$$

직선성 평가

농도가 1.0 mg/mL인 scoparone 표준원액은 순차적으로 희석하여 0.04, 0.09, 0.17, 0.34, 0.68, 1.37, 2.73 μg/mL의 총 7개 농도로 조제하였다. 희석한 scoparone 표준용액은 HPLC를 이용하여 측정했으며, 농도별 면적을 구하여 검량선을 구하였다. 표준용액 제조를 총 3회 측정했으며 결정계수(r²) 값이 0.990 이상인지의 여부를 확인하였다.

사철쑥 진공 추출물의 scoparone 함량 측정

대량생산 규모에서 생산된 사철쑥 진공 추출물을 취한 후 0.45 μm membrane syringe filter를 이용하여 여과하였다. 이 과정을 각 시료당 6번 반복하여 총 18개의 시험용액을 조제하였다. 각각의 시험용액을 HPLC로 측정하여 함유된 scoparone의 함량을 μg/mL 단위로 계산한 후, 희석배수를 고려하여 사철쑥 진공 추출물 1.0 g에 함유된 scoparone 함량을 μg/g 단위로 환산하였다.

사철쑥과 더위지기의 주요 생리활성 물질의 비교분석

사철쑥과 더위지기의 추출물에 대한 주요 생리활성 물질로 보고된 쿠마린계, 플라보노이드계, 페놀화합물 성분을 비교하기 위해 HPLC를 이용한 동시 분석법을 확립하였다. 10종의 표준용액을 적절한 농도 범위에서 실험을 실시했으며, 면적 대 농도비의 관계로 검량선을 작성한 결과 모든 검량선은 실험 범위 내에서 0.99 이상의 결정계수(R²)를 나타내었다. 사철쑥과 더위지기의 조건별 추출물을 3 반복 전처리하여 후보 지표성분의 함량을 HPLC로 분석한 결과를 Table 1에 나타내었다.

Table 1 . Contents of marker compounds in Artemisia capillaris Thunb. and Artemisia iwayomogi Kitamura extracts.

No.	Bioactive compound (μg/g)	Artemisia capillaris Thunberg		Artemisia iwayomogi Kitamura		Coefficient of determination (R2)
		Distilled water	Ethanol	Distilled water	Ethanol
1	Scopolin	4.62±0.091)	ND2)	91.47±0.19	45.98±0.87	1
2	Chlorogenic acid	154.19±2.18	19.13±0.41	126.45±0.46	67.74±1.45	0.9999
3	Caffeic acid	3.93±0.07	0.52±0.02	58.26±0.46	2.04±0.20	0.9999
4	Scopoletin	ND	1.70±0.05	30.12±0.36	32.94±1.78	0.9999
5	Hyperoside	71.05±1.90	49.03±1.17	ND	ND	0.9999
6	Isoquercitrin	14.42±0.33	10.26±0.26	ND	ND	1
7	Isochlorogenic acid B	111.89±1.59	14.72±0.64	44.29±0.99	13.28±0.76	1
8	Isochlorogenic acid A	61.86±1.18	28.83±0.62	34.34±3.94	131.79±0.74	0.9995
9	Scoparone	57.36±0.45	138.19±0.45	ND	ND	0.9998
10	Isochlorogenic acid C	79.36±2.52	18.26±0.36	19.96±0.64	34.09±1.84	1

¹⁾Each value is expressed as the mean±SD (n=3)..

²⁾Not detected..

사철쑥 조건별 추출물에서는 scoparone, scopolin, chlorogenic acid, caffeic acid, hyperoside, isoquercitrin, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C의 피크가 확인되었다. 특히 hyperoside, scoparone은 더위지기에서 검출되지 않아 사철쑥에서 특이하게 나타나는 지표성분으로 판단되었다. Scoparone은 coumarin 유도체로 간 질환의 예방 및 치료, 항산화, 항균, 항돌연변이 활성 등의 생리활성이 보고되어 있으며(Ahn, 2000; Cho와 Chiang, 2001; Lee 등, 2002), 사철쑥 내 주성분 함량을 확인한 선행연구 결과, 수확시기 및 부위에 따라 scoparone 함량은 다르다고 보고되어 있다(Choi 등, 2007). 따라서 scoparone이 다량 함유된 사철쑥을 소재로 하여 기능성 소재 원료로 개발한다면 사철쑥의 생리활성 물질 추출과 이용이 유용하게 활용될 것으로 사료된다.

사철쑥과 더위지기 추출물의 주요 생리활성 물질인 chlorogenic acid, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C는 caffeoylquinic acid 유도체 성분으로 항산화, 항염, 간 보호 효과 등 많은 생리활성이 알려져 있다(Zhao 등, 2006). 또한, caffeic acid는 주요 phenolic 화합물로 항염증, 항바이러스, 항우울과 관계가 있다고 보고돼 있다(Kim 등, 2008). Kim(2014)의 선행연구 결과, 사철쑥의 chlorogenic acid, caffeic acid 함량은 추출온도와 에탄올 농도에 영향을 받는 것으로 보고되어 있고 에탄올 농도 80%로 추출했을 때 각각 19.92 mg/g, 0.64 mg/g으로 보고되어 본 연구 결과와 유사한 결과를 얻었다. 한편, 열수 추출에서는 본 연구 결과보다 낮게 나타났고 이는 추출온도, 추출 시간, 추출 방법 등의 추출 변수 차이로 사료된다.

더위지기 추출물에서는 scopolin, chlorogenic acid, caffeic acid, scopoletin, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C의 생리활성 물질을 확인하였고, scopolin, scopoletin이 특이하게 나타났다. 또한 scopoletin, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C를 제외한 생리활성 물질들은 열수 추출 조건에서 상대적으로 높게 확인되었다. 에탄올 추출의 경우 4가지 caffeoylquinic acid류 성분 중에 가장 많이 추출되는 성분이 isochlorogenic acid A였고, 그다음으로 chlorogenic acid, isochlorogenic acid C, isochlorogenic acid B 순이었다. 열수 추출에서는 chlorogenic acid가 가장 많이 확인되어 추출하고자 하는 생리활성 물질에 따라 추출용매의 비율이 고려되어야 할 것으로 사료된다. 한편 사철쑥 외에도 Dawidowicz와 Typek(2010)은 chlorogenic acid에 대해 수분과 함께 열을 가할 경우, chlorogenic acid는 점차 감소하고 isochlorogenic acid C는 증가한 연구 결과가 보고되었다.

사철쑥 진공 추출물의 scoparone 분석법 검증

사철쑥의 지표성분으로 scoparone 선정: 사철쑥 추출물의 주요 생리활성 물질 분석을 통해 대표적인 성분으로 scoparone, chlorogenic acid, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C를 확인할 수 있었고, 그중 chlorogenic acid, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid는 caffeoylquinic acid 유도체 성분으로 많은 천연물에 함유됨에 따라 특이성에서 적합하지 않아 지표성분 대상에서 제외하였다. 또한 scoparone은 사철쑥과 더위지기의 주요 생리활성 물질 비교를 통해 사철쑥에서 특이하게 나타남이 확인되었다. 따라서 scoparone을 사철쑥 진공 추출물의 시험법을 위한 지표성분으로 선정하였다.

특이성 평가: Scoparone 표준물질과 시험용액을 동일한 분석법으로 분석하여 검출된 피크를 확인하였다. 아래 HPLC 크로마토그램의 비교를 통해 본 scoparone 분석조건에서 간섭 물질의 영향이 없음을 확인하였고, 약 26~27분대에서 표준용액과 사철쑥 진공 추출물 시험용액의 scoparone 성분에 대한 머무름시간 및 UV 스펙트럼이 일치함을 확인하였다(Fig. 1, 2).

Fig 1. The HPLC chromatogram of scoparone and vacuum extract of Artemisia capillaris Thunb. for the evaluation of specificity. (A) standard solution, (B) Artemisia capillaris vacuum extract.

Fig 2. Photo diode array spectrum of scoparone. (A) standard solution, (B) Artemisia capillaris vacuum extract.

정확도 평가: 사철쑥 진공 추출물 중 scoparone의 정확성을 측정하기 위해 표준물질 첨가법을 이용하여 회수율을 확인하였고, 시료에 이미 농도를 알고 있는 표준용액을 첨가하여 회수율을 구함으로써 정확성을 확인하였다. 검출농도를 고려하여 사철쑥 진공 추출물 시험용액 중 scoparone 농도의 약 50, 100, 150% 농도에 해당하는 0.17, 0.34, 0.51 μg/mL 농도의 scoparone을 첨가하여 동일한 전처리 방법으로 정확도 시험을 수행하였다. 농도별로 3 반복씩 수행한 시험 결과 전체 회수율 평균 구간은 100.21~106.37%였다. 이는 식품의약품안전처 건강기능식품 지표성분 밸리데이션 가이드라인(MFDS, 2018)의 회수율 시험 기준인 지표성분 10 μg/kg~1 mg/kg 농도에 해당하는 회수율 기준(70~125%)에 부합되는 결과이며, 따라서 본 시험법의 정확성을 확인하였다(Table 2).

Table 2 . Accuracy (recovery test) results of scoparone in the vacuum extract of Artemisia capillaris (%).

Repetition #	Added amounts of scoparone (μg/mL)
	0.17	0.34	0.51
1	99.19	106.64	106.57
2	101.19	106.78	106.32
3	100.24	105.02	106.24
Mean recovery	100.21	106.15	106.37
Range of recovery	100.21∼106.37

일내 정밀도(반복성) 평가: 시료량의 변화에 따른 반복 정밀도를 확인하기 위해 사철쑥 진공 추출물을 50, 75, 100% 농도로 취하여 6회 반복 측정하였고 상대 표준편차(RSD)는 2.14%였으며, 이는 지표성분 10 μg/kg~1 mg/kg 농도 범위의 반복성 15% 이내인 식품의약품안전처 건강기능식품 지표성분 가이드라인에 부합하여 본 시험법의 일내 정밀도를 확인하였다(Table 3).

Table 3 . The intra-day precision (repeatability) results of scoparone in the vacuum extract of Artemisia capillaris.

Repetition #	Scoparone contents (μg/g)
	Amount of vacuum extract of Artemisia capillaris
	50%	75%	100%
1	0.45	0.417	0.438
2	0.434	0.426	0.408
3	0.436	0.428	0.452
4	0.405	0.427	0.452
5	0.43	0.443	0.448
6	0.425	0.424	0.449
Mean±SD	0.430±0.01	0.428±0.01	0.441±0.02
RSD1) (%)	3.45	2	3.88
Total RSD 2.14%
Range of RSD 2.00∼3.88%

¹⁾Relative standard deviation..

일간 정밀도(재현성) 평가: 사철쑥 진공 추출물 중 scoparone 함량의 실험일간 반복 정밀도를 확인하기 위해 사철쑥 진공 추출물 100% 농도에 해당하는 시험용액을 조제하여 시험용액을 1일 6회씩 총 3일간 반복 측정하였다. 총 18번의 측정에 대한 scoparone 함량의 상대 표준편차(RSD)는 6.79%로, 이는 10 μg/kg~1 mg/kg 지표성분 농도 범위의 재현성 기준 32% 이내인 식품의약품안전처 건강기능식품 지표성분 밸리데이션 가이드라인에 부합하여 본 시험법의 일간 정밀도를 확인하였다(Table 4).

Table 4 . The inter-day precision (reproducibility) results of scoparone in the vacuum extract of Artemisia capillaris (n=18).

Day	Repetition #	Scoparone contents (μg/g)	Mean	SD	RSD (%)
1	1	0.400	0.404	0.01	1.56
	2	0.412
	3	0.399
	4	0.412
	5	0.399
	6	0.404
2	1	0.47	0.463	0.01	2.22
	2	0.461
	3	0.449
	4	0.453
	5	0.474
	6	0.47
3	1	0.438	0.441	0.023	3.88
	2	0.408
	3	0.452
	4	0.452
	5	0.448
	6	0.449
	Mean	0.44
	SD	0.03
	RSD1) (%)	6.79

Amount of vacuum extract of Artemisia capillaris: 100%..

¹⁾Relative standard deviation..

정량한계 측정: 총 7개 농도(0.04~2.73 μg/mL)로 희석한 표준용액을 3회 분석한 검량선의 기울기와 y 절편(y-intercept)을 이용하여 정량한계를 구하였다. 기울기 평균(S)은 35,142이며 y 절편의 표준편차(σ)는 180으로 이를 통해 정량한계는 0.05 μg/mL로 계산하였다(Table 5).

Table 5 . The limit of quantitation (LOQ) for scoparone analysis in the vacuum extract of Artemisia capillaris.

Repetition #	Range (μg/mL)	Regression equation	r2
1	0.04∼2.73	y＝37,381х＋538.45	0.9999
2	0.04∼2.73	y＝34,012х＋213.30	0.9999
3	0.04∼2.73	y＝34,032х＋241.63	0.9999
Mean of slope (S)1)	35,142	Standard deviation of intercept (σ)2)	180
LOQ (10×σ/S)	0.05 μg/mL

¹⁾The slope of the calibration curve..

²⁾The standard deviation of the response..

직선성 평가: 표준물질 scoparone을 메탄올에 녹여 표준용액을 제조하였다. 제조한 표준용액을 적절한 농도로 희석하여 분석한 결과, 0.04~2.73 μg/mL 범위에서 직선성이 나타남을 확인하였다. 시험 시 발생할 수 있는 오차범위를 확인하기 위해 3회 측정하였고 3개의 시험 모두 검량선의 결정계수(r²) 값이 0.9999로 해당 농도 범위에서 직선성을 나타내었다(Table 6).

Table 6 . The linearity for scoparone analyses in the vacuum extract of Artemisia capillaris.

Repetition #	Range (μg/mL)	Regression equation	r2
1	0.04∼2.73	y＝37,381х＋538.45	0.9999
2	0.04∼2.73	y＝34,012х＋213.30	0.9999
3	0.04∼2.73	y＝34,032х＋241.63	0.9999

Calibration curves of scoparone standard solution..

사철쑥 진공 추출물의 scoparone 함량 측정: 대량생산 규모에서 생산한 사철쑥 진공 추출물에 대하여 scoparone 함량을 측정하였다(Table 7). 측정 결과 사철쑥 진공 추출물 시료의 scoparone 함량은 각각 0.404±0.01, 0.463±0.01, 0.441±0.02 μg/g으로 측정되어 대량생산에 따른 차이가 발생하지 않음을 확인하였다.

Table 7 . The scoparone contents in the vacuum extract of Artemisia capillaris produced on a pilot scale.

Repetition #	Scoparone contents (μg/g)
	Sample 1	Sample 2	Sample 3
1	0.4	0.47	0.438
2	0.412	0.461	0.408
3	0.399	0.449	0.452
4	0.412	0.453	0.452
5	0.399	0.474	0.448
6	0.404	0.47	0.449
Mean±SD	0.404±0.01	0.463±0.01	0.441±0.01

본 연구에서는 용매추출법을 통해 사철쑥과 더위지기 추출물을 제조했으며, 추출용매에 따른 주요 생리활성 성분 분석을 실시하였다. 용매추출에 따른 생리활성 성분의 함량을 비교한 결과, 사철쑥의 경우 특이하게 hyperoside, scoparone이 확인되고 더위지기에서는 확인이 되지 않아 사철쑥에서 특이하게 나타나는 생리활성 성분임을 알 수 있었다. 또한 더위지기에서는 scopolin, scopoletin이 특이하게 확인되었으며, 특히 scopolin이 사철쑥에 비해 다량 함유되어 있음을 알 수 있었다. 사철쑥 진공 추출물에 함유된 scoparone 지표성분의 함량 및 표준화를 위해 HPLC 분석법 밸리데이션을 수행하였다. HPLC 밸리데이션은 식품의약품안전처에서 제공하는 ‘기능성 원료 인정을 위한 제출자료 작성 가이드[민원인 안내서]’에 따라 수행되었으며, 분석법 검증 결과 특이성, 정확도, 정밀도, 정량한계, 직선성이 모두 제시하는 가이드라인에 부합하였다. 분석법 검증 결과 HPLC를 이용한 분석 방법에서 표준용액의 머무름시간과 사철쑥 진공 추출물의 머무름시간이 일치하였으며, 동일한 스펙트럼을 나타내는 것으로 특이성을 확인하였다. Scoparone의 검량선은 결정계수 값이 0.999 이상으로 나타나 높은 직선성을 보여주어 분석에 적합함을 알 수 있었고 정량한계는 0.05 μg/mL로 나타났다. 정밀도 측정 결과 scoparone은 일간 정밀도에서 6.79%의 정밀도를 보여주었으며 일내 정밀도에서는 2.00~3.88%의 정밀성을 나타내었다. 또한 scoparone은 100.21~106.37% 범위의 회수율을 보여주어 실험방법에 대한 정확성을 검증하였다. 본 연구 결과 사철쑥 진공 추출물의 지표성분인 scoparone의 HPLC를 이용한 분석법이 신뢰성이 있음을 검증하였다.

본 연구는 산림청(한국임업진흥원) 산림과학기술 연구개발사업 ‘2020192B10-2222-BA01’의 지원에 의하여 이루어진 것입니다.