피부 노화는 연령 증가, 정신적 스트레스, 불규칙한 식습관 및 수면 부족 등의 과도한 산화적 스트레스가 유도됨으로써 피부의 정상적인 생리 기능 저하에 따라 지속해서 나타난다(Tobin, 2017). 또한 외부의 환경적 요인인 자외선, 미세먼지, 대기 오염물질, 흡연 등이 피부에 직접 노출되며 피부 세포의 손상과 사멸을 유도하고 피부의 탄력 저하, 주름 생성 등의 피부 노화를 가속화한다(West, 1994; Yoneta 등, 2004). 이러한 내재적 요인과 외인적 요인 모두 활성산소종에 의한 산화적 손상(oxidative damage)을 일으킬 수 있다. 대표적인 산화촉진제인 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂)와 자외선 노출은 피부 세포 내 지질 과산화 반응 촉진, 콜라겐과 엘라스틴의 사슬 절단, DNA 산화 손상에 따른 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 구조 변화 등을 통해, 피부 두께 감소, 탄력 저하, 주름 생성과 같은 피부 노화 반응을 가속화한다(Schindowski 등, 2001; Gonzaga, 2009; Zouboulis와 Makrantonaki, 2011; Watson 등, 2014; Noh 등, 2016).

피부의 진피층은 섬유아세포(fibroblast)가 주로 존재하며, 주요 구조 단백질(structural proteins)인 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴 등으로 이루어진 세포외기질로 구성되어 피부의 주름 생성과 탄력의 조절에 관여한다(Lee 등, 2013; Shon 등, 2016). 콜라겐은 인장강도 부여, 세포구조 유지 등 인체를 보호하는 필수적인 역할을 수행하며 피부 진피층의 구조 성분 중 가장 많은 부분을 차지하고 있어, 콜라겐 합성과 분해의 조절은 피부 노화 과정에 핵심이 된다(Silva 등, 2014; Subhan 등, 2015; McCabe 등, 2020). 엘라스틴은 진피층에서 콜라겐 사이에 존재하여 결합조직으로 얽혀 피부에 탄력성을 부여하고, 피브로넥틴은 세포외기질에서 피부 세포의 부착과 이동을 도와 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산을 결합시켜 주는 생물학적 접착제 역할을 한다(Kim 등, 2007; Lee 등, 2013). 나이가 들어감에 따라 섬유아세포의 기능과 세포수가 감소하면 콜라겐, 엘라스틴, 피브릴린 등 세포외기질을 구성하는 구조 단백질의 합성량이 줄어들고 피부 구조가 붕괴되어 탄력이 감소한다(Fisher 등, 2002; Frantz 등, 2010; Tobin, 2017). 이에 피부 구조 단백질의 발현을 증가시켜 피부 조직 유지를 통한 탄력과 주름 관리를 위해 섬유아세포의 정상 활성 유도를 위한 소재 및 식품 개발이 활발히 진행되고 있다(Adil 등, 2010; Jin 등, 2012; Lee 등, 2013).

콜라겐을 섭취하면 생체 내 분해과정을 통해 디펩타이드(dipeptides) 또는 트리펩타이드(tripeptides)의 형태로 혈액을 통해 흡수되어, 피부 섬유아세포의 증식 및 분해 등의 정상적인 조절 기능을 가지도록 한다(Oesser 등, 1999; Iwai 등, 2005; Ohara 등, 2010). 콜라겐 펩타이드는 섬유아세포에서 농도 의존적으로 콜라겐 전구체인 procollagen의 합성을 증가시키고, 자외선 조사로 증가한 콜라겐 분해효소 matrix-metall oproteases(MMPs)의 감소를 유도하였다(Kim 등, 2019; Lee 등, 2021). 또한, 콜라겐을 경구 섭취한 마우스에서 콜라겐 프릴린의 직경과 밀도가 증가하고, 콜라겐 type Ⅰ 및 type Ⅲ의 분포와 밀도가 유의적으로 높아지면서 수분 증가, 주름 및 탄력 개선이 확인되었다(Matsuda 등, 2006; Oba 등, 2015; Wang 등, 2017). 이렇듯 콜라겐 펩타이드는 섬유아세포의 기능 조절을 통해 피부 주름 개선 효과를 나타내지만, 세포외기질의 구조 단백질 생성과 피부 치밀도와의 연관성을 밝힌 연구는 없었다.

이에 본 연구에서는 콜라겐 펩타이드가 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴과 같은 세포외기질 구조 단백질 생성을 유도함으로써 진피층의 치밀도를 증가시켜 피부 주름 개선 효과를 가짐을 밝히고자 하였다. 이를 위해 AP 콜라겐 효소분해 펩타이드(AP collagen peptide, APCP)를 인간 섬유아세포에 H₂O₂ 자극 유도 손상 모델에 처치하여 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴의 유전자의 발현 변화를 확인하였고, 피부 주름을 가진 성인 여성에서 피부 상태 변화를 확인함으로써 콜라겐 섭취가 피부 치밀도와 피부 주름 개선에 도움이 됨을 확인하였다.

재료 및 시약

본 연구에 사용한 APCP는 실꼬리돔(Nemipterus virgatus)의 비늘에서 유래한 젤라틴을 특이적인 콜라게나아제(collagenase)로 효소 분해하여 농축 및 건조 후 분말 형태로 제조하였다(Amorepacific, Seoul, Korea). APCP는 지표성분 GPH(Glycine-Proline-Hydroxyproline) 함량이 3.0±20%이면서 트리펩타이이드 함량은 15% 이상인 원료를 사용하였다(Lee 등, 2021). 인체적용시험용 식품의 시험군은 APCP(500 mg/정)를 포함하며 대조군은 APCP를 결정 셀룰로스, 유당(희석제)으로 대체하여 동일량 포함되었고, 정제 제조에 필요한 부형제(60 mg/정)는 시험군과 대조군 모두 히드록시프로필셀룰로오스, 옥수수전분, 스테라인산마그네슘, 말토덱스트린을 사용하였다.

세포주 및 세포배양

인간 섬유아세포(human dermal fibroblasts, HDFs)는 Lonza(Rockville, MD, USA)에서 구매하여 사용하였다. 세포는 10%(v/v) fetal bovine serum(FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)과 1% penicillin-streptomycin solution (Gibco)을 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, Welgene, Seoul, Korea)에 넣은 배양 배지에 37°C, 5% CO2 조건의 세포배양기에서 배양하였고, 실험은 7~9계대의 인간 섬유아세포를 사용하였다. 자극원으로 사용된 과산화수소 용액은 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

세포의 재료 처리 및 생존율 평가

인간 섬유아세포를 60 mm culture dish(Falcon, Lincoln Park, NJ, USA)에 5×105개의 농도로 분주한 후 37°C, 5% CO2에서 24시간 배양하여 배양 플레이트에 80~90%가 되도록 키웠다. 다음날 세포의 배양 배지를 제거하고 FBS 및 phenol red가 첨가되지 않은 DMEM 배양액에 녹인 H₂O₂(300, 400, 500, 600 μM)와 APCP(5.0 μg/mL)를 처리하여 24시간 배양한 후 cell counting kit 8(CCK-8, Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan)의 프로토콜에 따라 세포 생존율을 측정하였으며, 대조군에 대한 생존율을 백분율로 표시하여 나타내었다. 세포 생존율 측정 후 세포를 수거하여 이후 실험을 진행하였다.

유전자 발현 분석

처리가 끝난 세포는 phosphate buffer saline(Welgene) 세척 후 Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 세포에서 RNA를 추출하였다. BioAnalyzer 2100(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)으로 RNA 정량 후, 1 μg RNA와 Superscript Ⅲ kit(Invitrogen)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이를 Taqman universal PCR master mix primer와 혼합한 후 7500 fast real-time PCR machine을 이용하여 유전자의 발현 변화를 측정하고, 각 유전자의 발현량을 GAPDH 유전자 발현량으로 보정하였다. PCR과 관련된 시약과 장치는 모두 Applied Biosystems(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 제품을 사용하였으며, PCR 방법은 제조사 제공 프로토콜을 따랐다. 유전자 발현 평가를 위한 primer는 GAPDH(Hs02786624_g1), COL1A(Hs00164004_m1), elastin(Hs00355783_m1), fibronectin(Hs01549976_m1)을 사용하였다.

인체적용시험 디자인

본 인체적용시험은 이중맹검, 무작위배정, 위약 대조 시험으로 설계되었다. 본 인체적용시험 대상자는 자의로 서면 동의한 후, 선정/제외기준 적합성 여부를 확인하고 연구에 참여하였다. APCP 1,500 mg 섭취군(APCP 1500) 및 대조식품 섭취군(Placebo)에 군당 34명씩 총 68명이 무작위 배정되었고, 시험 기간 동안 총 6명이 탈락하여 총 62명이 최종 분석되었다. 등록된 대상자는 총 12주간 시험식품 또는 대조식품을 1일 1회 3정씩 동일한 시간에 섭취하도록 하였다. 시험대상자는 유효성 및 안전성 평가를 위해 0주, 6주 및 12주 차에 방문하였다. 유효성은 안면 부위의 피부 치밀도와 피부 주름을 평가하였고, 안전성은 섭취 후 이상반응, 활력징후 및 신체검진을 실시하였다. 피엔케이피부임상연구센타(주) 생명윤리위원회의 승인(IRB 심의번호: P2110-2555) 후, 질병관리본부 임상연구정보등록 플랫폼(CRIS no. KCT0007836)에 등록하여 수행하였다.

연구대상자

만 35세 이상 60세 이하의 여성으로 육안 평가에서 눈가 주름 기준(grade)이 3등급 이상인 자를 대상으로 하였다. 시험 참여 당시에 피부질환을 앓고 있거나 치료 중인 자, 시험식품 관련 식품에 민감하거나 알레르기가 있는 자, 국소 스테로이드제를 사용하거나 경구 스테로이드제를 복용하는 자, 피부과적 시술 또는 관리를 받은 자, 주름 개선용 기능성 화장품 및 기기 사용자, 피부건강개선 건강기능식품 섭취자 또는 시험책임자의 판단에 따라 시험에 영향을 줄 수 있는 자 등 제외기준에 해당하는 자는 제외하였다. 기기적 평가를 위해 대상자는 항온항습 조건(온도 22±2°C, 습도 40~60% RH)에서 30분간 안정을 취한 후, 동일한 부위를 연구자 1인이 측정하였다.

피부 치밀도 개선

피부 치밀도 개선 평가를 위해 대상자의 눈가(crow’s feet) 및 뺨(cheek) 부위를 측정하였다. 평가 부위는 섭취 전 부위를 지정하여 항상 동일하게 측정하였다. 피부 치밀도 측정은 Skin Scanner DUB(taberna pro medicum GmbH, Lüneburg, Germany)를 이용하여 density(%) 값을 분석하였다.

피부 주름 개선

피부 주름 개선 평가를 위해 대상자의 눈가 및 마리오네트(marionette) 부위의 주름을 측정하였다. 평가 부위는 섭취 전 부위를 지정하고, 주름 촬영용 안면 고정 장비를 이용하여 항상 동일하게 측정하였다. 눈가 주름은 PRIMOS CR Small Field(GFMesstechnik GmbH, Berlin, Germany) 기기를 이용하여 Ra(average roughness), Rmax(maximum peak-to-valley), Rp(maximum profile peak height), Rv(maximum profile valley depth), Rz(average maximum height of the profile), 부피(mm³) 값을 분석하였다. 마리오네트 주름은 PRIMOS Lite(GFMesstechnik GmbH) 기기를 이용하여 Ra, Rmax, Rp, Rv, Rz, 부피 값을 분석하였다.

통계분석

본 연구 결과에 대한 통계분석은 SPSS statistics(version 26.0, IBM Corp., New York, NY, USA)를 이용하여 분석하였다. 인간 섬유아세포를 이용한 in vitro 시험에서는 independent t-test를 사용하여 군간 차이를 P<0.05 이하 수준으로 검정하였다. 인체적용시험에서는 데이터의 정규성은 Shapiro-Wilk 방법으로 검정하였고, 시험군 간 사전 동질성 검정은 정규성 검정 후 independent t-test를 실시하였다. 군 간 비교는 섭취 전 대비 변화율을 이용하여 정규성 검정 후 independent t-test를 사용하여 P<0.05 이하 수준으로 검정하였다.

세포 생존율 평가

H₂O₂는 다양한 피부 노화 세포 시험의 자극원으로 사용되고 있다(Park과 Bae, 2016; Wen 등, 2017). H₂O₂로 유도된 세포 손상에 대한 APCP의 효과를 확인한 결과는 Fig. 1과 같다. 인간 섬유아세포에 H₂O₂를 각각 0, 300, 400, 500, 600 μM 농도로 24시간 처리한 뒤 세포 생존율을 평가한 결과, 농도 증가에 따라 세포 생존율이 감소하여 H₂O₂에 의한 세포 손상이 확인되었다. 세포 손상이 나타난 H₂O₂ 300, 400, 500 μM 농도에서 APCP 5 μg/mL 동시 처치 시 유의한 수준으로 세포 생존율이 증가하여 APCP의 세포 손상 억제 효능을 확인할 수 있었다(P<0.001). H₂O₂ 600 μM에서는 세포 생존율이 50% 수준으로 손상이 일어나 세포 회복 능력을 상실하여, APCP에 의한 세포 손상 억제 효능이 보이지 않았다.

Fig 1. Effect of APCP on the cell viability of H₂O₂-induced human dermal fibroblasts (HDFs) cell. HDFs were treated with different concentrations of H₂O₂ (0, 300, 400, 500, and 600 μM) in the presence of 5 μg/mL APCP for 24 h. CCK-8 tests were performed to indicate the relative cell viability of HDFs. ^***P< 0.001. Results were expressed as the mean±standard deviation.

H₂O₂에 의한 COL1A, elastin 및 fibronectin 유전자 감소 회복

진피층의 콜라겐, 엘라스틴 및 피브로넥틴과 같은 피부 구조 단백질의 발현은 피부의 탄력 및 세부구조를 결정하는데 주요하게 작용한다고 알려져 있다(Shon 등, 2016). 특히 진피 내 존재하는 섬유아세포가 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, protoeglycan, lamine 등을 합성하여 세포 외로 분비하는 중요한 역할을 하는데, 산화스트레스 등 내외적 요인에 의해 섬유아세포가 정상적 기능을 못하면 이러한 피부 구조 단백질 생성이 감소하면서 피부 노화가 나타난다(Frantz 등, 2010; Smith 등, 1986; Oikarinen, 1994). 본 연구에서는 섬유아세포에서 APCP 처치가 세포외기질 구조 단백질 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하였다(Fig. 2). 세포에 H₂O₂ 500 μM 처리 시, COL1A, elastin 및 fibronectin 유전자 발현이 모두 유의적으로 감소하였다(Fig. 2A~C). APCP를 섬유아세포에 처치 시 procollagen 발현을 유도하고(Kim 등, 2009), 자외선 유도로 감소한 콜라겐 type Ⅰ 유전자인 COL1A 및 TGFβ1(transforming growth factor β1) 유전자 발현을 증가시켜 진피층의 구조 손상을 방어하였다(Lee 등, 2021). 본 연구에서도 H₂O₂ 자극에 의해 섬유아세포의 COL1A 유전자 발현이 감소하였으나(P<0.001), APCP 5 μg/mL 처치 시 COL1A 유전자의 발현이 유의적으로 증가함이 확인되었다(Fig. 2D, P<0.01). 엘라스틴은 피부 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 또 다른 주요 피부 구조 단백질로써 피부 탄력에 영향을 미친다(Weihermann 등, 2017). 엘라스틴도 MMPs가 활성화되면서 엘라스틴을 비정상적으로 분해하여 구조 변성을 유도한다(McCabe 등, 2020). 섬유아세포에 H₂O₂ 처치 시 감소한 elastin 유전자가 APCP 5 μg/mL에 의해 유의적으로 증가하였다(Fig. 2E, P<0.05). 피브로넥틴은 고분자 당단백질로 콜라겐과 피브린의 결합에 중요한 구성요소로 작용하며, 피부의 구조를 유지하여 주름 형성을 예방하고 상처 회복에 밀접하게 관련되어있다고 알려져 있다(Kang과 Yoo, 2009). 산화스트레스에 노출된 섬유아세포의 피브로넥틴 합성 능력 변화를 확인한 결과, H₂O₂ 처치 시 fibronectin 유전자의 발현이 감소하였으나(P<0.001), APCP 5 μg/mL 처치 시 fibronectin 유전자의 발현이 유의적으로 증가함이 확인되었다(Fig. 2F, P<0.01). 이러한 결과를 종합해보면, H₂O₂와 같은 산화스트레스는 섬유아세포의 세포외기질 구조단백질 생성을 억제하였으나, APCP가 섬유아세포의 활성을 유도함으로써 이러한 구조 단백질 합성을 회복시킬 수 있음을 시사한다.

Fig 2. Effect of APCP on relative mRNA expression levels of COL1A, elastin, and fibronectin in H₂O₂-induced human dermal fibroblasts (HDFs) cell. HDFs were treated with different concentrations of H₂O₂ (0, 300, 400, and 500 μM) in the presence of different concentrations of APCP (0, 0.5, and 5 μg/mL), and cultured for 24 h. Total RNA was extracted from cells and the relative mRNA expression were measured by qRT-PCR. The relative mRNA expression of COL1A (A), elastin (B), and fibronectin (C) were analyzed in HDFs treated with 0, 300, 400, and 500 μM of H₂O₂ for 24 h. HDFs treated with 500 μM H₂O₂ in the presence of 0, 0.5, and 5 μg/mL APCP were analyzed for the relative mRNA expression levels of COL1A (D), elastin (E), and fibronectin (F). ^**P<0.01 and ^***P<0.001 versus the control group, and ^#P<0.5 and ^##P<0.01 compared with H₂O₂-treated control group as determined by the independent t-test. Results were expressed as the mean±standard deviation.

피부 치밀도 개선 효과

피부 치밀도는 피부의 탄력과 주름과 매우 밀접한 관계를 보이는 지표로, 피부 노화가 진행되면서 콜라겐, 엘라스틴의 생성 및 분해가 원활하지 못해 매트릭스의 견고성이 떨어지고, 표피-진피 경계부의 rete ridge pattern이 평평해지는 피부 조직 구조 이상으로 피부 치밀도가 감소하게 된다(Rinnerthaler 등, 2015). Bolke 등(2019)의 연구에서 콜라겐 펩타이드 섭취 시 피부 탄력과 주름이 개선되며 이때 표피층의 밀도가 높아짐이 확인되었다. 콜라겐 펩타이드가 진피층에 존재하는 섬유아세포의 구조 단백질 합성을 증가시켜 피부 치밀도를 높임을 확인하기 위해, 본 연구에서는 표피층과 진피층의 치밀도를 동시에 평가하는 Skin scanner-DUB를 이용하여 APCP 12주 섭취 시 눈가 및 뺨 부위의 피부 치밀도를 확인하였다(Fig. 3). 섭취 전 눈가 피부 치밀도는 APCP 1,500 mg 섭취군이 9.00±2.29%, 대조식품 섭취군은 8.76±2.10%로 군 간 차이가 없었다. 시험식품 섭취 후 APCP 1,500 mg 섭취군은 6주 및 12주에 피부 치밀도가 증가하여 대조식품 섭취군 대비 유의적인 개선을 나타내었다(Fig. 3A~B, P<0.01). 뺨 부위 피부 치밀도도 섭취 전 군 간 차이가 없었으나 APCP 1,500 mg 섭취군에서 피부 치밀도가 증가하였고, 섭취 후 12주에는 대조식품 섭취군 대비 유의적인 개선을 나타내어(Fig. 3C~D, P<0.05) APCP 1,500 mg 섭취는 피부 치밀도를 증가시키는 효과를 가진다고 판단된다.

Fig 3. Effects of APCP intake on improving skin density. Skin scanner image and relative mean change in skin density of the crow’s feet (A, B) and the cheek (C, D) after APCP 1,500 mg and placebo ingestion. ^*P<0.05 and ^**P<0.01 versus the placebo group at the same time point as determined by the independent t-test. Results were expressed as the mean±standard deviation.

피부 주름 개선 효과

피부 주름은 안면부의 움직임이 많은 눈가, 입가 부근에서 많이 관찰되며, 나이가 들어감에 따라 피부 치밀도가 감소하면서 얼굴 부위별 주름 형성의 차이를 보인다(Friedman, 2005; Lee 등, 2006). 30대 중반부터는 눈가 피부 탄력 저하와 미간 및 입가 주름이 두드러지기 시작하고, 40대에는 눈가 주름 및 깊은 미간 주름(glabellar furrows)이 나타나고, 입 주변에 불규칙한 선이 형성되며 마리오네트 라인이 생긴다. 50대에는 입 주변과 목의 주름이 확연히 보이고, 60대에는 피부가 얇아지며 얼굴 전체적으로 깊은 주름이 형성된다(Friedman, 2005; Zoumalan과 Larrabee, 2011; Park과 Bae, 2012). 본 연구에서는 피부 노화로 나타나는 대표적 안면 주름 부위인 눈가와 입 주변 마리오네트 부위의 개선 효과를 평가하였다(Table 1, 2). PRIMOS CR Small Field를 이용한 눈가 주름 평가에서 APCP 1,500 mg 섭취군은 대조식품 섭취군 대비 6주 및 12주에 Ra 지표가 개선되었다(Fig. 4A, P<0.05, P<0.01). Rmax, Rp, Rz 지표에서도 APCP 1,500 mg 섭취군에서 대조식품 섭취군 대비 12주에 유의적 개선이 확인되었다(Fig. 4B~D, P<0.05). Rv 지표와 부피 측정 지표에서도 APCP 1,500 mg 섭취군은 주름 개선 양상이 확인되었으나 대조군 대비 유의한 차이는 없었다. 피부 치밀도/두께 감소와 피부 주름 지표인 평균 거칠기의 증가가 상관성을 가진다는 이전 연구와 같이(Lee 등, 2006), 본 연구에서도 APCP 섭취로 눈가 부위의 피부 치밀도와 눈가 주름이 모두 유의하게 개선되었음이 확인되었다.

Table 1 . Skin-wrinkling parameters in the crow’s feet as measured by PRIMOS CR Small.

Group	week	Ra		Rmax		Rp		Rv		Rz		Volume
		Value (um)	% Change	Value (um)	% Change	Value (um)	% Change	Value (um)	% Change	Value (um)	% Change	Value (mm3)	% Change
APCP1500	0	21.59±3.95		203.75±49.94		121.05±41.57		102.76±25.34		107.44±33.79		40.5±23.47
	6	19.78±3.64	-8.37±10.30*	194.29±56.97	-4.64±11.94	116.07±47.18	-4.12±14.05	98.55±26.01	-4.09±13.5	99.63±32.6	-7.27±9.88	43.49±25.96	-7.38±16.64
	12	18.94±3.52	-12.3±12.76**	187.63±49.07	-7.91±11.63*	112.67±40.15	-6.92±12.94*	95.27±24.8	-7.29±13.53	96.58±29.8	-10.11±12.60*	43.78±24.57	-8.1±11.42
Placebo	0	20.05±3.79		188.11±48.25		114.66±39.85		92.14±21.24		111.11±20.11		43.87±24.73
	6	19.44±3.43	-3.01±8.32	179.67±39.1	-4.49±13.4	108.98±33.69	-4.96±18.16	89.83±21.36	-2.5±14.57	107.35±17.61	-3.39±9.17	45.4±25.73	-3.49±13.59
	12	19.32±3.34	-3.61±7.92	185.7±39.39	-1.28±14.15	115.34±33.94	0.59±19.69	88.75±19.51	-3.67±13.49	107.38±16.81	-3.36±7.44	45.86±26.05	-4.53±14.16

*P<0.05, **P<0.01 vs. the placebo group, as determined using the independent t-test. Data are presented as the mean±SD..

Table 2 . Skin-wrinkling parameters in the marionette lines as measured by PRIMOS Lite.

Group	week	Ra		Rmax		Rp		Rv		Rz		Volume
		Value (um)	% Change	Value (um)	% Change	Value (um)	% Change	Value (um)	% Change	Value (um)	% Change	Value (mm3)	% Change
APCP1500	0	29.87±5.37		243.88±76.66		128.64±73.97		136.12±61.95		144.65±27.17		70.34±44.61
	6	28.81±4.94	-3.56±10.44**	219±65.07	-10.2±17.34	112.8±52.74	-12.31±23.01	125.67±57.53	-7.68±19.5	139.55±24.22	-3.52±11.09**	77.88±46.54	-10.72±33.95
	12	26.98±4.38	-9.69±10.55**	211.89±68.94	-13.12±13.97*	112.92±66.18	-12.22±22.3	118.11±48.86	-13.23±16.44	131.09±21.63	-9.37±10.78**	81.42±49.27	-15.76±47.14
Placebo	0	28.36±4.59		215.87±54.64		117.75±59.64		116.29±32.88		136.95±22.27		76.19±52.39
	6	29.45±5.01	3.82±9.24	214.86±60.41	-0.47±19.57	116.73±55.99	-0.86±18.26	115.75±35.16	-0.46±38.48	143.02±25.43	4.43±9.47	83.38±62.44	-9.43±32.36
	12	27.81±3.86	-1.95±7.6	203.66±45.52	-5.65±17	113.28±42.8	-3.8±30.7	107.95±36.68	-7.18±22.62	134.07±18.4	-2.1±8.03	81.07±56.89	-6.4±25.07

*P<0.05, **P<0.01 vs. the placebo group, as determined using the independent t-test. Data are presented as the mean±SD..

Fig 4. Effects of APCP intake on improving skin wrinkle parameters in the crow’s feet. Relative changes in skin- wrinkling parameters in the crow’s feet using the PRIMOS CR small field after 6 and 12 weeks. (A) Ra, average roughness; (B) Rmax, maximum peak-to-valley; (C) Rp, maximum profile peak height; (D) Rz, average maximum height of the profile. ^*P<0.05 and ^**P<0.01 versus the placebo group at the same time point as determined by the independent t-test. Results were expressed as the mean±standard error of mean.

노화가 진행되면서 윗입술과 아랫입술은 얇아지며 입 주변 피부 주름은 방사상으로 늘어난다. 이러한 입 주변의 노화는 콜라겐 소실이 주요 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Park과 Bae, 2012). 입 주변의 피부 주름 개선 확인을 위해 PRIMOS Lite를 이용하여 마리오네트 부위의 주름을 평가하였다(Table 2, Fig. 5). APCP 1,500 mg 섭취 시 Ra 및 Rz 지표는 섭취 후 6주 및 12주에 대조식품 섭취군 대비 마리오네트 주름 개선이 확인되었다(Fig. 5A, 5C, P<0.01). Rmax 지표도 APCP 섭취군에서 12주 차에 유의적 개선이 확인되었다(Fig. 5B, P<0.05). 나머지 지표에서도 APCP 섭취군은 주름 개선 양상이 확인되었다. 이러한 결과를 토대로 APCP 섭취는 눈가 및 마리오네트 등 안면 피부 주름 개선 효과를 가진다고 판단된다.

Fig 5. Effects of APCP intake on improving skin wrinkle parameters in the marionette lines. Relative changes in skin-wrinkling parameters in the marionette lines using the PRIMOS Lites after 6 and 12 weeks. (A) Ra, average roughness; (B) Rmax, maximum peak-to-valley; (C) Rz, average maximum height of the profile. ^*P<0.05 and ^**P<0.01 versus the placebo group at the same time point as determined by the independent t-test. Results were expressed as the mean±standard error of mean.

산화스트레스 등 내외부 요인의 지속적 노출은 진피층 섬유아세포의 기능 이상을 야기하여 세포외기질에 구조적 변화를 유도함으로써 피부 노화를 일으킨다. 본 연구는 APCP가 세포외기질을 구성하는 피부 구조 단백질 유전자 변화에 미치는 영향을 살펴보고, 노화 여성에서 APCP 섭취에 따른 피부 치밀도 및 피부 주름 개선 효과를 확인하고자 하였다. 이를 위해 H₂O₂ 자극에 의해 손상된 인간 섬유아세포에 APCP 처리 후 세포 생존율 및 유전자 변화를 확인하였다. 또한 피부 주름을 가진 만 35~60세 여성 총 68명을 대상으로 APCP 섭취 시 피부 치밀도와 피부 주름 지표 변화를 측정하였다. 인체적용시험은 이중눈가림, 무작위배정, 위약 대조시험으로 수행되었으며, APCP 1,500 mg과 대조식품을 12주간 1일 1회 섭취하였다. H₂O₂ 처리는 인간 섬유아세포에 세포 손상을 일으켜 생존력을 감소시켰고, APCP를 동시 처리하면 생존력이 증가함에 따라 손상된 세포를 회복시키는 데 효과적이라는 것이 확인되었다. 또한 APCP는 H₂O₂ 자극에 의해 감소한 COL1A, elastin, fibronectin 유전자 발현을 유의미하게 증가시켜 세포외기질 구조 단백질 생성을 통해 정상적 피부 구조 유지 역할을 할 수 있을 것으로 판단되었다. 노화 피부를 가진 성인 여성을 대상으로 한 인체적용시험 결과, 눈가 및 뺨 부위의 피부 치밀도 평가에서 APCP 1,500 mg 섭취군은 12주에 대조식품 섭취군 대비 유의적인 개선 효과를 보였다. 피부 주름 개선 평가에서 눈가 주름은 Ra, Rmax, Rp 및 Rz 지표에 대해 APCP 1,500 mg 섭취군이 대조식품 섭취군 대비 유의적인 개선 효과를 보였고, 마리오네트 주름도 Ra, Rmax 및 Rz 지표에 대해 통계적으로 유의한 개선 효과를 보였다. 본 연구 결과는 APCP가 산화스트레스와 같은 피부 노화 과정에서 진피 세포의 정상적 기능 유도로 세포외기질 구조 단백질 유전자 발현을 증가시켜 진피 치밀도를 높임으로써 피부 주름 개선에 도움을 줄 수 있음을 시사한다. 이상의 결과를 통해 APCP는 광노화와 같은 외인적 요인뿐만 아니라 산화스트레스와 같은 내인적 요인에 의한 노화 상태에 대해서도 세포를 보호하고 세포의 정상적 기능 수행을 가능하게 함으로써, 노화를 억제하고 건강한 피부를 유지하는 데 도움을 주는 피부 건강 개선 기능성 식품 원료로 활용되기를 기대한다.