근감소증(sarcopenia)은 노화와 관련된 골격근의 감소와 함께 근력 또는 신체활동 수행능력 저하가 나타나는 상태이며 급성 또는 만성적으로 발생하는 근육질환이다(Cruz-Jentoft 등, 2019). 근감소증 발생과 관련된 요인은 노화, 생활습관, 만성질환, 인슐린 저항성 등으로 보고되고 있다(Lee와 Park, 2017). 근육량과 근력의 감소는 신체활동의 감소 및 근골격계 질환과 연관성이 있으며(Cruz-Jentoft 등, 2019), 당뇨병, 고혈압, 심혈관질환과 같은 대사성질환 및 우울증과 같은 심리적 상태와도 연관성이 있다고 보고되고 있다(Kim과 Yu, 2017). 평균수명의 향상에 따른 노인인구의 증가는 만성질환의 증가를 초래하며, 그로 인한 건강 및 삶의 질 저하는 중요한 문제로 대두되고 있다(Lee, 2014). 노화에 따른 대표적인 신체의 변화로 골격근과 근력의 감소를 들 수 있다(Goodpaster 등, 2006). 노화로 인한 근육량 감소는 근력저하를 초래하고, 체력의 약화, 활동성 감소로 이어져 일상생활을 저해한다(Choi 등, 2020). 골격근의 양은 40대 이후 연간 약 0.8% 감소하며, 70대 이후에서는 연간 약 1.5%까지 감소하는 것으로 보고되고 있다(Mitchell 등, 2012). 국내 근감소증 유병률은 40~64세인 중년에서 29.5%, 65세 이상 노인에서 42.8%로 보고되고 있다(Kim 등, 2014). 이러한 노화로 인한 골격근의 손상은 골격근의 세포 손상과 연관되어 있다고 보고되고 있다(Sacheck과 Blumberg, 2001). 골격근 세포 손상의 주요한 기전은 산화적 스트레스에 의한 손상이며 과격한 운동이나 노화에 의해 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 세포 손상을 유발한다고 알려져 있다(Stangel 등, 1996). 비정상적으로 증가한 ROS는 근육세포의 기능장애를 유발하며 근세포의 단백질, 지질, 핵산과 같은 세포 내 거대분자들의 손상을 일으킴으로써 세포의 사멸을 야기한다고 알려져 있다(Mason과 Wadley, 2014).

천심련(Andrographis paniculata)은 쥐꼬리망초과에 속하는 초본식물로 열대 및 아열대 아시아, 동남아시아, 인도 전역에서 발견되는 식물이다(Kumar 등, 2004). 천심련은 항염증, 항박테리아, 항바이러스와 같은 활성을 가지고 있어 아시아 지역에서 진통제로 사용되고 있다(Singh 등, 2001). 천심련에는 diterpenoids, flavonoids 및 polyphenol 성분이 존재한다고 보고되어 있으며(Rao 등, 2004), 그중 주된 생리활성 성분은 diterpenoid 계열인 andrographolide라고 알려져 있다(Jarukamjorn과 Nemoto, 2008). Andrographolide는 lipopolysaccharide로 유도된 nitric oxide(NO) 생성과 inducible NO synthase의 발현을 억제함으로써 항염증 효과를 나타낸다고 보고되어 있으며, 또한 ROS 소거와 항산화 효소의 활성을 증가시킴으로써 항산화 효과를 나타낸다고 보고되어 있다(Chiou 등, 2000; Wang 등, 2019). 그뿐만 아니라 항바이러스, 항암 및 간 보호에 관한 효과도 보고되어 있다(Chua, 2014; Khan 등, 2018; Paemanee 등, 2019). 현재 천심련과 관련한 연구로는 α-glucosidase와 α-amylase 저해 효과(Subramanian 등, 2008), 항산화 효과(Rafat 등, 2010), 항염증 효과(Chandrasekaran 등, 2010)가 보고되어 있다. 하지만 근육세포에서의 산화적 손상에 대한 천심련의 보호 효과와 관련한 연구는 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 천심련 추출물이 근육세포에서 H₂O₂ 처리로 유도된 산화적 손상에 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다.

재료 및 시약

본 연구에 사용한 천심련 잎(인도산)은 (주)네추럴에프앤피(Cheongju, Korea)에서 제공받았다. 건조 분쇄한 천심련 잎에 5배수의 75% 에탄올을 가하여 85°C에서 2시간 추출하는 과정을 3회 반복하여 추출용액을 제조하였다. 이 추출용액을 여과한 후 여액을 감압농축기(CVE-3110, EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 농축하고 건고시킨 후 시료로 사용하였다. 분말 형태의 천심련 추출물 2 g을 취하여 메탄올 200 mL를 넣고 shaker를 이용하여 24시간 동안 실온에서 추출하였다. 여과지(Whatman No. 2 filter paper, Whatman International, Kent, UK)를 이용하여 여과한 후 추출물을 40°C 이하에서 감압 농축하였다. 농축액을 dimethyl sulfoxide(DMSO)로 재용해한 후 0.22 µm 멸균 필터로 여과하고 분석 전까지 -20°C에서 보관하였다. 추출물을 세포에 처리할 때 DMSO의 농도는 0.1% 이하로 조정하여 사용하였다. 실험에 사용된 시약인 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA), 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT), glutathione reductase(GR), 5,5′-dithiobis-2-nitrobenzoic acid(DTNB), β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrate(NADPH) 등은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Fetal bovine serum(FBS), Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), trypsin-EDTA, penicillin-streptomycin, Hank’s balanced salt solution(HBSS)은 Gibco-BRL(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다.

C2C12 세포 배양

마우스 유래 C2C12 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, CRL-1772, Manassas, VA, USA)에서 분양받아 사용하였다. FBS(10%)와 penicillin(100 unit/mL), streptomycin(100 μg/mL)이 함유된 DMEM을 사용하여 37°C, 5% CO₂로 조절된 배양기(Panasonic Healthcare Co., Ltd., Gunma, Japan)에서 배양하며 실험에 사용하였다.

천심련 추출물의 세포독성 및 보호 효과 측정

천심련 추출물의 세포독성 및 보호 효과는 MTT 방법을 이용하여 측정하였다. C2C12 세포를 96-well plate에 1.0×10⁴ cells/well의 농도로 분주하였다. 24시간 배양 후 천심련 추출물이 함유되고 FBS가 함유되지 않은 DMEM 배지에 천심련 추출물 1, 5 및 10 μg/mL 농도로 2시간 처리하였다. 이후 세포를 FBS가 함유되지 않은 DMEM 배지에 700 μM H₂O₂를 24시간 동안 가하여 산화적 스트레스를 유발했다. 그 후 5 mg/mL의 MTT 시약을 각 well에 20 μL씩 분주하고 2시간 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 DMSO 200 μL로 청색 formazan 결정을 가용화시켰다. 이후 microplate reader(Epoch, BioTek Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 550 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 천심련 추출물의 독성은 700 μM H₂O₂ 처리 과정을 제외하고 동일하게 진행하였다.

ROS 생성 측정

세포 내 ROS 수준은 Wang과 Joseph(1999)의 방법을 응용하여 측정하였다. 96-well black plate에 1.0×10⁴ cells/well 농도의 C2C12 세포를 분주하여 24시간 동안 배양한 후 세포에 천심련 추출물을 농도별(1, 5 및 10 μg/mL)로 처리하였다. 5시간 배양 후 10 μM의 DCFH-DA를 20 µL씩 분주하여 처리하였다. 2시간 후에 phosphate buffered saline으로 씻어준 후 각 대조군 well에는 10 μM DCFH-DA를 포함하는 HBSS를 분주하고 대조군을 제외한 나머지 well에는 10 μM DCFH-DA와 700 µM H₂O₂를 포함하는 HBSS를 분주한 후 세포 내 ROS를 나타내는 형광 강도를 485 nm의 여기 파장 및 530 nm의 방출 파장에서 2시간 동안 fluorescent spectrophotometer(Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)로 측정하였다.

Glutathione(GSH) 함량 측정

GSH 함량 측정은 Baker 등(1990)의 방법을 응용하여 측정하였다. 6-well plate에 1.5×10⁵ cells/well 농도의 근육세포를 분주하여 24시간 동안 배양한 후 천심련 추출물을 농도별(1, 5 및 10 µg/mL)로 처리해 주었다. 4시간 배양 후 700 µM H₂O₂로 24시간 동안 산화적 스트레스를 유도하였다. 배양액 제거 후 Vibra-Cell VCX 750 sonicator(Sonic & Materials, Inc., Newtown, CT, USA)를 사용하여 10초간 용해하였다. 용해물은 4°C, 10,000 rpm(9,800×g)에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 후에 상등액 180 µL에 5% sulfosalicylic acid 20 µL를 혼합한 뒤 4°C, 10,000 rpm(9,800×g)에서 5분간 원심분리 후에 상등액 20 µL에 enzyme mixture 150 µL를 첨가하여 37°C에서 10분 동안 반응시켰다. Enzyme mixture는 0.1 M potassium phosphate buffer 8 mL에 400 units/mL GR 228 µL, 3 mM DTNB 228 µL를 혼합하여 제조하였다. 반응 후에 0.2 mM NADPH를 50 µL 첨가한 뒤 흡광도 412 nm에서 측정하였다.

Malondialdehyde(MDA) 함량 측정

MDA 함량 측정은 Buege와 Aust(1978)의 방법을 응용하여 측정하였다. 6-well plate에 1.5×10⁵ cells/well 농도의 근육세포를 분주하여 24시간 동안 배양한 후 천심련 추출물을 농도별(1, 5 및 10 μg/mL)로 처리해 주었다. 4시간 배양 후 700 μM H₂O₂로 24시간 동안 산화적 스트레스를 유도하였다. 배양액 제거 후 sonicator를 사용하여 10초간 용해하였다. 용해물은 4°C, 10,000 rpm(9,800×g)에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 후에 상등액 200 μL에 15% trichloroacetic acid와 0.375% thiobarbituric acid를 혼합한 용액을 200 μL 첨가하여 100°C에서 15분 동안 가열하여 반응시켰다. 그 후 4°C, 13,000 rpm(16,600×g)에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액 200 μL를 흡광도 535 nm에서 측정하였다.

Lactate dehydrogenase(LDH) 및 creatine kinase(CK) 활성 측정

LDH와 CK는 assay kit(ab-102526 및 ab-155901, Abcam, Cambridge, UK)을 사용하여 손상된 세포에 의해 배지로 방출된 LDH와 CK를 측정하였다. 6-well plate에 1.0×10⁵ cells/well 농도의 근육세포를 분주하여 48시간 동안 배양한 후 2% horse serum(HS)이 함유된 DMEM 배지로 갈아주어 세포 분화를 진행하였다. 48시간에 한 번씩 2% HS가 함유된 DMEM으로 갈아주면서 5일간 분화를 진행했으며, 6일째 되는 날 천심련 추출물을 농도별(1, 5 및 10 µg/mL)로 처리하였다. 24시간 배양 후 세포를 FBS가 함유되지 않은 DMEM 배지에 700 µM H₂O₂를 1시간 30분 동안 가하여 산화적 스트레스를 유발했다. 배양액 제거 후 세포를 모아 sonication 해준 뒤 4°C, 10,000 rpm(9,800×g)에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 후에 상등액 50 µL에 enzyme mixture를 첨가한 후 바로 흡광도 450 nm에서 측정하였다.

통계분석

통계분석은 SAS ver. 9.4(Statistical Analysis System, SAS Institute, Cary, NC, USA) 소프트웨어를 이용하여 실시하였다. 데이터 간의 유의차는 one-way ANOVA의 Duncan’s multiple range test를 통해 P<0.05 수준에서 검증하였다.

천심련 추출물의 세포독성 및 보호 효과

천심련의 세포독성 및 보호 효과를 확인하기 위해 추출물을 제조하여 C2C12 세포주를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 천심련 추출물을 1, 5 및 10 μg/mL 농도로 처리한 결과 모든 농도에서 세포독성은 보이지 않았다(Fig. 1A). 산화적 스트레스는 과량의 ROS 생성으로 인해 체내 불균형이 일어나 발생하는 것으로, H₂O₂와 같은 ROS는 세포의 DNA, 단백질, 지질 등의 체내 구성요소를 파괴해 세포의 사멸을 유도한다고 알려져 있다(Finkel과 Holbrook, 2000). H₂O₂를 C2C12 세포에 700 µM 처리한 경우 세포 생존율이 약 70% 수준으로 감소하였으며, 천심련 추출물 처리 시 H₂O₂ 처리군에 비해 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하였다(Fig. 1B). 이 결과를 통해 천심련 추출물이 H₂O₂로 유도된 산화적 스트레스에 대해 세포보호 효과가 있는 것으로 판단되었다.

Fig 1. Cytotoxicity (A) and protective effect (B) of Andrographis paniculata extract (APE) in C2C12 myoblasts. Each value was expressed as the mean±standard error (n=3). Means with different letters (a-d) on the bars are significantly different by Duncan’s multiple range test at P<0.05. Q, 50 μM quercetin.

ROS 생성에 대한 천심련 추출물의 억제 효과

ROS는 일중항 산소, 수산기 라디칼 및 과산화수소 등의 활성산소로 세포의 구성 성분들에 비가역적인 손상을 야기하며 세포의 자가사멸과 연관되어 있다(Filomeni 등, 2015). 또한 과도하게 생성된 ROS는 골격근에서 구조적 손상 및 염증반응을 일으켜 근육조직의 피로 및 손상을 야기한다고 알려져 있다(Jeong 등, 2017). C2C12 세포에 H₂O₂ 처리 시 ROS 생성량이 처리시간에 따라 급격하게 증가하였으나 천심련 추출물의 ROS 생성량은 모든 시간대에서 H₂O₂ 처리군보다 낮았다(Fig. 2A). 특히 H₂O₂ 처리 후 60분대에서 천심련 추출물의 농도별(1, 5 및 10 μg/mL) ROS 생성량은 H₂O₂ 처리군에 비해 각각 13.1, 14.4 및 17.3% 감소하였다(Fig. 2B). 따라서 천심련 추출물 처리로 인해 H₂O₂로 유도된 C2C12 세포 내 ROS가 농도 의존적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. Mussard 등(2020)은 천심련에 존재하는 andrographolide, flavonoid 및 terpenoid와 같은 다양한 기능성 성분들이 산화적 스트레스로 유도된 ROS의 생성을 감소시켰다고 보고한 바 있다. 이처럼 본 연구의 천심련 추출물이 H₂O₂ 처리로 유도되는 ROS를 제거하여 산화적 스트레스로부터 근육세포를 보호할 것으로 생각된다.

Fig 2. Effects of Andrographis paniculata extract (APE) on reactive oxygen species production in C2C12 myoblasts. Fluorescence intensity after H₂O₂ treatment during 2 h (A) and at 60 min (B). Each value was expressed as the mean±standard error (n=3). Means with different letters (a-c) on the bars are significantly different by Duncan’s multiple range test at P<0.05. Q, 50 μM quercetin.

GSH 생성에 대한 천심련 추출물의 효과

GSH는 세포 손상을 야기하는 ROS에 대한 세포 방어 기전에서 중심적인 역할을 한다고 알려져 있다(Gajowik과 Dobrzynska, 2014). GSH는 세포질에서 생산되어 미토콘드리아 또는 핵과 같은 세포 내 소기관으로 전달되며 세포 내 GSH 농도가 높을수록 산화적 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있고, 노화성 질병을 방지할 수 있다고 알려져 있다(Mailloux 등, 2013). H₂O₂를 처리한 자극군의 GSH 함량은 14.7 nmol/mg protein으로 대조군 27.2 nmol/mg protein보다 유의적으로 감소하였다. 천심련 추출물 처리 시 1, 5 및 10 μg/mL의 농도에서 모두 자극군 대비 GSH 함량이 유의적으로 증가하였다(Fig. 3). H₂O₂는 산화적 스트레스를 유도하여 항산화 기작의 불균형을 야기해 GSH의 수준을 유의적으로 감소시킨 것으로 생각된다. Woo 등(2008)은 천심련의 주요한 활성 성분인 andrographolide가 심근세포에서 GSH의 농도를 증가시켰다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서 이러한 증가는 천심련 추출물에 존재하는 andrographolide 성분의 항산화 작용으로 인해 GSH가 oxidized glutathione으로 산화되는 것을 방지하여 GSH의 농도가 증가한 것으로 생각된다.

Fig 3. Effects of Andrographis paniculata extract (APE) on the generation of glutathione (GSH) in C2C12 myoblasts. Each value was expressed as the mean±standard error (n=3). Means with different letters (a,b) on the bars are significantly different by Duncan’s multiple range test at P<0.05. Q, 50 μM quercetin.

MDA 생성에 대한 천심련 추출물의 억제 효과

H₂O₂로 유도된 산화적 스트레스는 ROS를 생성하고 항산화 효소에 의한 항산화 체계를 무너뜨려 세포 내 항산화 활성을 고갈시킨다고 알려져 있다(Yu 등, 2015). 과량의 ROS는 세포막에 존재하는 다가불포화지방산과 반응하여 과산화지질을 형성하게 되는데, MDA는 지질과산화 산물로 산화적 스트레스의 지표로 사용된다(Cao 등, 2015). H₂O₂를 처리한 자극군의 MDA 함량은 0.32 nmol/mg protein으로 대조군 함량인 0.19 nmol/mg protein에 비해 유의적으로 증가하였으며, 천심련 추출물 처리 시 1, 5 및 10 μg/mL의 농도에서 자극군 대비 각각 23.3%, 33.4% 및 54.5% 감소시켰다(Fig. 4). 이와 같은 결과는 천심련 추출물이 ROS를 부분적으로 제거함과 동시에 지질과산화 과정을 효과적으로 방지함으로써 H₂O₂로 유도된 산화적 스트레스에 대한 보호 효과가 있는 것으로 판단되었다.

Fig 4. Effects of Andrographis paniculata extract (APE) on the generation of malondialdehyde (MDA) in C2C12 myoblasts. Each value was expressed as the mean±standard error (n=3). Means with different letters (a-e) on the bars are significantly different by Duncan’s multiple range test at P<0.05. Q, 50 μM quercetin.

LDH 및 CK 활성에 대한 천심련 추출물의 효과

혈중 LDH 및 CK의 농도는 근육 손상의 정도를 나타내는 지표로 사용된다. 세포막의 파괴, 조직괴사 및 스트레스로 인해 지질과산화 등이 일어나면 세포막의 투과성이 증가하여 세포질 내 LDH가 혈중으로 방출된다(Harris 등, 1992). CK 또한 근조직이 손상되면 세포막 투과성이 증가하여 CK가 세포 간질액으로 이동하기 때문에 혈중 농도가 높아져 혈중 LDH 및 CK 농도는 근질환 또는 근손상을 추정하는 지표로 사용될 수 있다(Suh 등, 2007). 본 연구에서는 LDH와 CK의 활성을 단핵의 근아세포(myoblast)가 분화된 형태인 다핵의 근관세포(myotube)에서 측정함으로써 천심련 추출물이 근관세포 손상 및 세포막 투과성에 미치는 영향에 대해 평가하였다. C2C12 myotube에 H₂O₂ 처리 시 대조군에 비해 73%의 세포 생존력을 보였으나 천심련 추출물 처리 시 농도 의존적으로 증가함을 알 수 있었다(Fig. 5A). H₂O₂ 처리 시 세포 외로 방출된 LDH 및 CK의 양은 대조군에 비해 유의적으로 증가하였으며 천심련 추출물 처리 시 이를 다시 유의적으로 감소시키는 경향을 나타냈다(Fig. 5B 및 5C). 이러한 결과를 통해 천심련 추출물이 근아세포뿐만 아니라 근관세포에서도 산화적 스트레스로부터 근손상을 억제할 수 있는 것으로 판단되었다.

Fig 5. Effects of Andrographis paniculata extract (APE) on cell viability (A), lactate dehydrogenase (B), and creatine kinase (C) activities in C2C12 myotubes. Each value was expressed as the mean±standard error (n=3). Means with different letters (a-d) on the bars are significantly different by Duncan’s multiple range test at P<0.05. Q, 50 μM quercetin.

본 연구는 천심련 추출물의 H₂O₂로 유도된 산화적 스트레스에 대한 근육세포 보호 효과에 대해 평가하였다. 천심련 추출물은 10 μg/mL의 농도까지 독성이 나타나지 않았으며, H₂O₂ 처리로 감소한 세포 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다. 천심련 추출물은 1, 5 및 10 μg/mL 농도에서 H₂O₂에 의한 ROS 생성량을 각각 13.1, 14.4 및 17.3% 감소시켜 근육세포에서 H₂O₂ 처리로 인한 산화적 손상으로부터 보호할 수 있음을 확인하였다. 산화적 손상으로부터 보호해주는 항산화 물질인 GSH 함량의 경우, H₂O₂ 처리로 감소한 GSH 함량은 천심련 추출물 처리에 따라 유의적으로 증가하였다. 지질과산화물의 대표적인 물질인 MDA 함량의 경우, H₂O₂ 처리로 증가한 MDA 함량을 천심련 추출물 1, 5 및 10 μg/mL 농도에서 각각 23.3%, 33.4% 및 54.5% 감소시켰다. 또한 myoblast의 분화된 형태인 myotube에서 H₂O₂ 처리로 근손상 지표인 LDH 및 CK 활성이 증가하였고, 이를 천심련 추출물이 유의적으로 억제하여 근손상을 억제할 수 있음을 확인하였다. 결론적으로 본 연구를 통해 천심련 추출물은 근육세포의 산화적 스트레스를 효과적으로 개선할 수 있는 사코페니아 개선 소재로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구는 2020년도 교육부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 지자체-대학 협력기반 지역혁신 사업의 결과입니다.