우엉(burdock; Arctium lappa L.)은 국화과에 속하며 두해살이 초본으로 전 세계적으로 분포되어 있다. 특히 뿌리의 경우 유럽과 우리나라를 포함한 아시아 지역에서 식용 및 약용으로 오랫동안 사용되어 왔으며(Yang 등, 2016), 국내의 경우 경상남도를 중심으로 대량 재배되고 있고 선행 영양성분 분석 결과 탄수화물 75.7%, 조단백질 10.12%, 조지방 3.2% 등을 함유하여 영양적으로 우수한 식품으로 알려져 있다. 또한 우리나라 전통 한의학에서는 우엉의 열매, 뿌리 및 줄기를 각각 우방자(牛蒡子), 우방근(牛蒡根) 및 악실경(惡實莖)으로 부르며, 두통, 감기, 염증성 질환 등에 사용하였다.

최근 다양한 in vitro 및 in vivo 연구에 따르면 우엉 추출물은 항산화(Predes 등, 2011), 항염증(Lin 등, 1996), 항박테리아(Gentil 등, 2006), 간보호(Lin 등, 2000), 위보호(dos Santos 등, 2008), 뇌신경세포보호(Tian 등, 2014), 항비만(Han 등, 2016), 항통증(Maghsoumi-Norouzabad 등, 2016) 등의 다양한 생리활성이 보고되어 있다. 우엉 추출물의 주요 활성 성분으로는 클로로겐산(chrologenic acid), 카페인산(caffeic acid) 등 다양한 페놀성 성분들과 리그난(lignan) 계열의 악티게닌(arctigenin)으로 알려져 있고 항산화 활성을 포함한 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 보고되었다(Liu 등, 2012; Gao 등, 2018). 특히 우엉뿌리 추출물은 카페인산 그룹이 하나 더 결합된 페놀 화합물인 dicaffeoylquinic acids(diCQAs)의 이성질체가 다수 함유되어 있고, 이러한 diCQAs는 스트레스호르몬인 코르티코스테론 반복 투여에 따라 유도된 우울증 동물모델에서 모노아민 산화효소 B(monoamine oxidase B; MAO B) 활성을 억제하여 우울증 완화 및 인지기능 개선 효능이 나타나는 것으로 보고되어 있다(Lim 등, 2021). 또한 diCQAs 중 하나인 cynarin은 난소절제 동물모델에서 우울증 완화 및 인지기능 개선 효능을 나타내어(Lim 등, 2020), 우엉뿌리 추출물은 스트레스 및 긴장완화 등을 포함하는 정신질환 개선 관련 건강기능성 소재 개발의 가능성을 나타내고 있다.

우엉뿌리를 이용한 건강기능성 소재와 제품개발을 위해서는 우엉뿌리 추출물의 지표성분의 선정과 분석을 통한 표준화 및 규격화가 선행되어야 한다. 현재 우엉뿌리의 유효한 활성 성분들의 분석 방법들이 일부 보고되어 있지만 대부분 정확성, 정밀성, 회수율 등의 유효성이 검증된 연구는 정확히 보고되어 있지 않은 상황이다(Haghi 등, 2013).

따라서 본 연구에서는 우엉뿌리 추출물을 이용한 건강기능성 소재 및 제품을 개발하기 위해 cynarin을 원료 표준화를 위한 우엉뿌리 추출물의 지표성분으로 선정하고 cynarin의 효과적인 분석법을 확립하기 위한 유효성을 검증하고자 한다.

재료 및 시약

본 실험에 사용된 우엉뿌리는 부용농산(경상북도 안동시 풍천면)에서 재배, 채취 및 건조시킨 원물(GAP No. 1010904)을 사용하였다. 건조된 우엉뿌리 300 kg을 대상으로 20% 주정을 이용하여 70°C에서 6시간 동안 3회 반복 추출한 후 여과 및 농축하고 고형분 대비 13% 덱스트린을 첨가하여 분말로 제조한 것을 시료(우엉뿌리 주정 추출물; ALE)로 사용하였다. 평균 수율은 45.61±0.28%로 나타났으며, ALE를 50% 메탄올에 녹여 60분간 초음파 추출을 진행한 후 polytetrafluoroethylene(PTFE) syringe filter(0.45 μm)로 여과한 것을 최종 시험용액으로 사용하였다. 지표성분 분석을 위해 사용된 cynarin 표준품은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였으며, 분석에 사용된 모든 용매는 HPLC grade를 사용하였다.

표준용액의 제조

Cynarin의 표준품 3 mg을 취해 20 mL 용량 플라스크에 넣어 50% 메탄올로 용해 및 정용하였다. 50% 메탄올로 희석하여 PTFE syringe filter(0.45 μm)로 여과한 후 표준원액으로 사용하였다. 검량곡선 작성을 위해 단계적으로 희석하여 2.52, 5.03, 10.0625, 20.13, 40.25, 80.50 및 161.00 μg/mL의 표준용액을 제조하여 HPLC 분석을 통해 cynarin의 함량을 측정하였다.

시험방법의 검증

ALE의 cynarin 분석법 확립은 개별인정형 건강기능식품 지표성분으로서 의약품 등 분석법의 벨리데이션에 대한 가이드라인을 근거로 하여 지표성분에 대한 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정확성(precision), 정밀성(accuracy) 및 회수율(recovery) 분석을 통하여 검증을 실시하였다.

ALE의 cynarin 함량 분석을 위한 HPLC 분석조건은 Table 1과 같다. 분석 컬럼은 Supelco C18 column(250 mm×4.6 mm, 5 μm, Supelco, Bellefonte, PA, USA)을 사용하였고, HPLC는 Agilent 1260 infinity HPLC system(Agilent Technologies, Mississauga, ON, Canada)을 사용하였다. A용매는 0.2% formic acid, B용매는 메탄올을 사용하였으며 모든 용매는 사용 전 탈기 및 필터 여과 후 사용하였다. 분석 시간은 0에서 30분까지 이동상 A를 65%로 감소시켰으며, 35분까지 이동상 B를 90%까지 증가시켰다. 이후 45분까지 이동상 A를 85%로 증가시켜 초기 용매 조건으로 조절하였다. 분석시료는 10 μL 주입하였고 컬럼의 유속은 0.8 mL/min, 온도는 30°C였으며 UV는 330 nm 파장에서 측정하였다.

Table 1 . Condition of HPLC analysis for cynarin.

Instrument: Agilent 1260 Infinity
Detector: UV 330 nm
Column: Supelco C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)
Mobile phase: A (0.2% formic acid, v/v), B (methanol)
Time	A (%)	B (%)
0	85	15
30	65	35
35	10	90
38	85	15
45	85	15
Flow rate: 0.8 mL/min
Injection volume: 10 μL
Column oven temperature: 30°C

특이성

특이성은 분석 대상이 다른 배합성분 등과 혼합된 경우 분석 대상을 선택적으로 검출할 수 있는 특성을 의미하며, ALE 내 분석 대상인 cynarin peak의 동일한 retention time과 spectrum을 나타내는지를 HPLC 크로마토그램을 통해 확인하였다.

직선성

직선성은 시험용액 중 일정 범위에 있는 분석대상물질의 농도에 대하여 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력으로, cynarin 표준용액을 6개의 농도로 제조한 후 HPLC 분석을 통해 농도에 대한 peak 면적의 관계를 나타내는 표준검량선에서 검량선의 상관계수(R2)를 계산하였다.

정확성

정확성은 이미 알고 있는 측정값이 표준값에 얼마나 근접하는지를 확인하는 능력으로 시료에 이미 알고 있는 농도의 cynarin 표준용액을 넣어 회수율을 구함으로써 정확성을 확인하였다. Cynarin 표준용액을 저농도(4.025 μg/mL), 중농도(8.050 μg/mL), 고농도(16.100 μg/mL)로 전처리한 시험용액을 대상으로 동일한 HPLC 조건으로 3회 반복 시험하였다.

정밀성

정밀성이란 균일한 검체로부터 여러 번 채취하여 얻은 검체를 정해진 조건에 따라 측정하였을 때 각각의 측정값들 사이의 근접성을 말하며, ALE 내 cynarin 함량의 분석 재현성을 실험하기 위해 분석자, 분석 장비, 분석 일자를 달리하여 분석을 진행하였다.

특이성 검증

특이성이란 불순물, 배합물 등의 혼합된 상태에서 분석 대상인 특정 성분을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력으로, 대상 성분이 크로마토그램에 적절하게 표시되어 명확하게 확인할 수 있어야 한다. 표준용액인 cynarin의 머무름 시간대는 20.920분으로 피크가 검출되었고, 우엉뿌리 주정 추출물 시험용액의 크로마토그램에서는 cynarin의 머무름 시간대가 20.933분으로 검출되었다(Fig. 1). 시험용액 크로마토그램 중 검출된 피크가 표준용액인 cynarin의 피크와 동일한지 확인하기 위하여 표준용액과 시험용액의 spectrum을 확인한 결과, 표준용액과 시험용액의 해당 시간대 spectrum이 동일한 패턴임을 확인하였고 최대 흡수 파장이 330 nm로 나타났다(Fig. 2). 이러한 결과는 본 시험법이 cynarin의 분석을 위한 특이성이 있음을 의미한다.

Fig 1. HPLC chromatogram of cynarin (A) and Arctium lappa root extract (ALE) (B).

Fig 2. Diode array detector spectrums of cynarin from standard solution (A) and ALE (B).

직선성 확인

직선성이란 분석 대상인 특정 성분의 농도 또는 양에 비례하여 일정 범위 내에 직선적인 측정값을 의미한다. ALE의 cynarin 함량을 측정하기 위해 2.51, 5.03, 10.06, 20.12, 40.25, 80.50, 161.00 μg/mL로 cynarin 표준용액을 조제하여 3회 반복 분석하였다. 검출된 cynarin peak 면적을 통하여 검량선을 작성하였으며, 상관계수(R²)는 각각 0.9995, 0.9999, 0.9999 이상으로 높은 직선성이 나타나 분석에 적합함이 확인되었다(Fig. 3).

Fig 3. Calibration curves of cynarin standard solutions.

정확성 및 회수율 확인

정확성이란 특정 성분의 측정값이 이미 알고 있는 참값이나 표준값에 근접한 정도를 의미하며, ALE의 정확성을 측정하기 위하여 시료에 cynarin 표준용액을 가하여 전처리한 후 이론량에 대한 검출량의 백분율인 회수율을 측정하였다. Cynarin 표준용액의 검출농도가 약 4.02, 8.05, 16.10 μg/mL가 되도록 농도를 가하여 전처리한 후 회수율을 측정한 결과, 2.51~161.00 μg/mL cynarin 농도 범위에서 회수율이 95.05~98.26%로 나타났으며 RSD는 0.28~3.28%로 나타났다(Table 2).

Table 2 . Accuracy of HPLC analysis for cynarin.

Cynarin concentration (μg/mL)		Recovery (%)
Spiked	Recovered	Mean±SD	RSD1) (%)
4.02	3.93±0.052)	97.54±1.14	1.43
8.05	7.65±0.21	95.05±2.55	3.28
16.1	15.82±0.04	98.25±0.23	0.28

¹⁾RSD: relative standard deviation..

²⁾Values are mean±SD (n=3)..

정밀성 확인

실험실 내 정밀성: 실험실 내 정밀성은 실험실 내에서 분석 일자, 분석자, 분석 기구 등을 달리하여 측정하는 방법으로 각 시험 결과의 일치 정도를 확인하는 정도를 나타낸다. 따라서 ALE의 cynarin 함량 분석 재현성 시험을 위해 분석 일자, 분석자, 분석 장비를 달리하여 분석을 진행하였다. ALE를 약 500 mg 취해 전처리하여 분석하였고, 실험마다 5회 반복 실험하여 측정값을 비교하였다. 실험 장비는 Agilent HPLC 1260 series 두 장비(KHSI-A-022, KHSI-A-128)를 사용하여 3일간 두 명의 시험자가 분석하였다. 실험 간의 분석 결과 cynarin의 검출시간은 약 21분대, 함량은 평균 1.41 mg/g으로 분석되었고, 이때 표준편차 0.05, 상대표준편차 3.39였다(Table 3).

Table 3 . Intra-day and inter-day variabilities of cynarin.

Precision			Amount (mg/kg)	Average (mg/kg)	RSD (%)
Intra-day1) variability	User A (n=5)	Agilent HPLC 1260 (KHSI-A-022)	1.36±0.0073)	1.41±0.05	3.39
	User B (n=5)	Agilent HPLC 1260 (KHSI-A-022)	1.40±0.024
Inter-day2) variability	User A (n=5)	Agilent HPLC 1260 (KHSI-A-128)	1.45±0.004

¹⁾Intra-day: intra-day precision expressed as within-laboratory within-day variations..

²⁾Inter-day: inter-day precision expressed as within-laboratory across-day variations..

³⁾Values are mean±SD (n=5)..

반복성: 반복성은 동일 조작 조건하에 반복분석을 통해 얻은 측정치들 사이의 근접성을 나타내며, ALE의 cynarin 함량 반복성 시험을 위해 검체량을 달리하여 분석을 진행하였다. 시료량을 각각 300 mg, 500 mg, 1,000 mg으로 취하고 각각 5회 반복 실험을 하여 측정값을 비교하였다. 분석 결과 cynarin의 함량은 평균 1.45 mg/g으로 나타났고, RSD는 각각 0.39%, 0.28%, 0.59%로 나타났다(Table 4). 이러한 결과는 RSD 2% 이하 우수한 정밀성을 나타내는 수치이므로(Hong 등, 2021), 본 분석법은 cynarin 분석을 위한 표준화된 시험방법이라 판단된다.

Table 4 . Repeatability of analytical method for cynarin in ALE.

Sample (mg)	Cynarin concentration (mg/g)	RSD (%)
300	1.496±0.0051)	0.39
500	1.457±0.003	0.28
1,000	1.422±0.007	0.59

¹⁾Values are mean±SD (n=3)..

제조공정별 ALE 내 cynarin 함량

ALE의 기준규격을 설정하기 위하여 GMP 시설을 갖춘 공정을 통해 대량 추출 후 ALE 내 cynarin 함량을 설정하였다. 우엉뿌리 원물 50 kg, 50 kg, 100 kg을 각각 추출하여, ALE Lot 1(SD-KFRI-001), ALE Lot 2(SD-KFRI-002), ALE Lot 3(SD-KFRI-003)을 얻었으며, ALE 생산량은 각각 25.7 kg, 25.9 kg, 52.3 kg으로 나타났다. ALE 3 Lot을 각각 3 반복 분석한 결과를 토대로 cynarin의 범위를 구하였다(Table 5). 전체 평균±표준편차, 평균의 80~120%, 각 Lot 별 하한치~상한치, 각 Lot 별 95% 신뢰구간에서의 하한치~상한치를 분석하여 분석오차 및 Lot 별 함량을 모두 포함할 수 있는 기준규격으로 1.30 mg/g의 80~120%인 1.04~1.56 mg/g으로 설정하였다(Table 6).

Table 5 . Amount of cynarin in ALE.

Lot No.	Cynarin concentration (mg/g)
SD-KFRI-001	1.31	1.29	1.31
SD-KFRI-002	1.30	1.28	1.31
SD-KFRI-003	1.29	1.28	1.30
Mean±SD	1.30±0.0101)	1.28±0.0058	1.31±0.0058

¹⁾Values are mean±SD (n=3)..

Table 6 . Amount of cynarin in ALE.

Lot No.	SD1)	SE2)	Minimum	Maximum	Confidence interval for mean
					Lower bound	Upper bound
SD-KFRI-001	0.010	0.0058	1.29	1.31	1.2752	1.3248
SD-KFRI-002	0.0058	0.0033	1.28	1.29	1.2690	1.2977
SD-KFRI-003	0.0058	0.0033	1.30	1.30	1.2923	1.3210

¹⁾SD: standard deviation in triplicate experiments..

²⁾SE: standard error in triplicate experiments..

ALE를 식약처 건강기능식품 개별인정원료로 개발하기 위한 연구의 목적으로 추출물의 원료표준화를 위한 지표성분으로 cynarin을 설정하였으며, 이에 대한 HPLC 분석법 유효성을 검증하였다. Cynarin의 분석은 0.2% formic acid와 메탄올 용매를 이동상으로 하였고 C18 역상 컬럼을 사용하여 최대흡광도인 330 nm에서 약 21분대의 크로마토그램 머무름 시간대에서 검출하였다. 검출된 cynarin peak 면적을 통해 검량선을 작성하였으며 상관계수(R²)는 0.9999 이상으로 높은 직선성이 나타났다. Cynarin의 정확성을 측정하기 위하여 시료에 cynarin 표준용액을 전처리한 후 그 회수율을 측정하였을 때, 2.51~161.00 μg/mL cynarin 농도 범위에서 회수율이 95.05~98.26%로 나타났으며 RSD는 0.28~3.28%로 나타났다. Cynarin의 정밀성을 확인하고자 분석 일자, 분석자, 분석 장비를 달리하여 분석을 5회 반복 진행한 결과 cynarin의 검출 시간은 약 21분대, 함량은 평균 1.41 mg/g으로 분석되었고 이때 RSD는 0.28~0.59% 수준으로 확인되어 높은 정밀성을 나타냈다. 따라서 본 분석법을 통해 ALE의 지표성분인 cynarin 분석법은 적합한 시험법임을 검증하였으며, 향후 기능성 원료 개발을 위한 기초자료로 활용될 것으로 사료된다.

본 연구는 한국식품연구원 기본사업의 지원을 받아 연구되었습니다(과제번호: E0210201-02).