정상적인 뼈 구조와 기능은 체내 항상성을 위한 조골세포와 파골세포 간 상호작용의 결과인 뼈 재형성(bone remodeling)을 통해 유지되지만(Chen 등, 2018), 이 과정에 불균형이 초래되면 골 질환으로 이어진다. 뼈조직의 구조적 약화로 발생하는 골다공증(osteoporosis)은 뼈 질량 감소와 골절 위험을 증가시키는 전신적인 골격계 질환으로(Kanis 등, 2013), 고령자 및 폐경기 여성에서 높은 유병률을 보인다(Liu 등, 2014). 현재 골다공증 예방 및 치료에 사용되는 bisphosphonate와 estrogen은 파골세포의 활성을 지연시켜 골흡수를 억제하는 약물로써는 유효하나 이미 소실된 뼈 질량을 회복시킬 수는 없다. 따라서 뼈 형성을 촉진하는 조골세포를 자극하여 골밀도를 증가시키는 소재 탐색에 관한 연구가 활발하다(Seo 등, 2020; 2021).

세포에서 방출된 소포체를 통한 세포 간 통신은 조직 기능과 항상성을 유지하기 위한 매우 중요한 생리학적 과정이다(De Robertis 등, 2020). 세포에서 생성 및 분비되는 extracellular vesicles(EVs)은 10~200 nm 범위의 막성 소포로 모든 생물학적 유체(우유, 혈액, 타액, 소변)에 존재하며(Kalluri와 LeBleu, 2020), 다양한 단백질, 지질, mRNA 및 miRNA의 전달을 통해 세포 간 통신을 매개한다(Zempleni 등, 2019). 특히 엑소좀은 세포 간 통신뿐만 아니라 신진대사 및 유전자 조절과 영양에도 중요한 역할을 할 수 있는 다양한 인자들을 함유한다(Zempleni 등, 2017). 우유에는 다량의 엑소좀이 포함되어 있으며, 이들 엑소좀 내에는 표피, 신경, 혈관 내피 및 erythropoietin 등의 성장을 촉진하는 성장 조절 인자와 사이토카인, 케모카인과 같은 면역 관련 인자 등이 함유되어 있다(Ballard와 Morrow, 2013).

다양한 성장 인자와 영양소가 풍부한 우유(cow milk)는 뼈 성장과 발달에 관여하며, 우유에서 추출한 유청단백질이 조골세포에 대한 성장 자극 효과를 나타내었고 이들 활성 분획의 탐색에서 락토페린의 존재를 확인하였다(Cornish 등, 2004; Naot 등, 2005). 락토페린은 상피세포 및 호중구 백혈구 전구체에 의해 생산되는 철결합 당단백질(Metz-Boutigue 등, 1984)로 눈물, 타액, 담즙, 췌장액 및 우유를 포함한 체액에 널리 분포하며 우유 유래 EVs에서도 확인되었다(Lönnerdal과 Iyer, 1995; Go 등, 2021). 철분에 대한 높은 친화력을 가진 락토페린은 항균 및 항산화 활성이 우수하여 면역 및 염증 반응에서 중요한 조절자 역할을 수행할 뿐만 아니라(Lorget 등, 2002) 세포 성장과 분화(Bi 등, 1997), 배아 발달(Ward 등, 1999), 사이토카인(Guillén 등, 2002; Kimber 등, 2002) 및 케모카인(Elass 등, 2002) 생산 등에도 관여하는 것으로 보고되었다. 또한 경구 투여된 단백질은 위장관에서 소화 효소에 의해 가수분해되어 생물학적 활성을 잃을 수 있지만, 경구 투여한 락토페린은 세포 증식 및 사이토카인 생산(Crouch 등, 1992)에 대한 효과가 in vitro에서 나타나는 것과 유사한 생리적 효과를 나타내는 것으로 보고되었다(Nichols 등, 1987). 따라서 본 연구에서는 MC3T3-E1 전조골세포를 이용하여 우유 유래 EVs가 조골세포의 분화 및 무기질화에 미치는 영향을 확인하였고, 골다공증과 같은 골 질환을 예방 및 치료할 수 있는 효과적이고 안전한 소재임을 조사하였다.

우유 유래 EVs 분리

본 실험에 사용한 우유 유래 EVs는 Fig. 1A 과정을 통해 분리하였다. 유통기한이 2022년 2월 15일까지인 시판되는 서울우유를 농협하나로마트(Andong, Korea)에서 2월 6일에 구입하여, 구입 당일 500×g로 4°C에서 10분간 원심분리하여 세포와 지방층을 제거한 다음, 2,000×g에서 4°C로 20분간 원심분리하여 세포 파편 등을 제거하였다. 원심분리한 상등액을 10,000×g로 4°C에서 30분간 2회 반복하여 원심분리하였고 마지막으로 100,000×g로 4°C에서 60분간 초원심분리한 후 상등액을 제거하고 남은 pellet을 단백 정량 후 실험 농도에 맞게 희석하여 사용하였다. 분리된 EVs는 bicinchoninic acid(BCA) protein assay(Pierce, Rockford, IL, USA) 및 나노 입자 추적 분석으로 정량화하였다. 우유 유래 EVs는 -80°C에 보관하며 실험에 사용하였다.

Fig 1. Isolation and characterization of cow milk-derived extracellular vesicles (EVs). (A) Schematic overview of the isolation of cow milk-derived EVs using differentiation centrifugation. (B) Particle size of isolated cow milk-derived EVs. (C) Representative immunoblot images of EV-associated marker CD63 and whey protein-specific marker lactoferrin in cow milk-derived EVs (n=4) and whole cow milk (n=3).

실험재료

본 실험에 사용된 모든 시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 세포 실험에 사용된 α-MEM, penicillin & streptomycin(PN/ST), fetal bovine serum(FBS)은 Gibco Laboratories(Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 단백질 발현에 대한 1차 항체와 2차 항체인 horseradish peroxidase가 결합된 anti-rabbit IgG, anti-mouse IgG 등은 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

나노 입자 추적 분석(NTA)

우유에서 분리한 EVs의 직경 및 입자 농도는 NanoSight NS300(Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK)을 사용하여 nanoparticle tracking analysis(NTA)로 분석하였다. NTA 소프트웨어는 NanoSight NTA 3.4 version(Malvern Instruments Ltd.)을 이용하였다.

Western blot

우유 유래 EVs의 단백질 농도는 BCA protein assay(Pierce)를 사용하여 정량하였다. 동량의 단백질을 10% SDS-PAGE에서 분리하고 PVDF membrane(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)으로 이동시킨 후 0.05% Tween 20(TBS-T)을 함유하는 Tris 완충액에서 5% bovine serum albumin으로 실온에서 2시간 동안 blocking 후, 1차 항체와 함께 4°C에서 overnight 하였다. Membrane을 TBS-T로 세척하고 2차 항체와 1시간 반응시킨 후, chemiluminescence kit(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)을 이용하여 단백질을 확인하였다.

우유 유래 EVs DiD labelling

DiD 표지를 위해 우유 유래 EVs[1 mg/1 mL phosphate-buffered saline(PBS)]를 dimethyl sulfoxide에 5 mM DiD(1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine perchlorate, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 1 μL와 혼합하고 25°C에서 30분 동안 incubation 하였다. MC3T3-E1 세포에 우유 유래 EVs-DiD를 처리하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 6시간과 24시간 동안 방치하였다. DiD 염료로 염색된 세포의 이미지를 형광 현미경(iRiST^TM, Logos Biosystems, Inc., Anyang, Korea)으로 확인하였다.

세포배양 및 분화

전조골세포인 MC3T3-E1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 성장배지는 α-MEM(Gibco BRL) 배지에 10% FBS(Gibco BRL), 100 U/mL penicillin과 100 mg/mL streptomycin(Gibco BRL)을 첨가하였으며, 분화유도배지는 성장배지에 10 mM β-glycerol phosphate(Sigma-Aldrich)와 50 μg/mL의 비타민 C(Sigma-Aldrich)를 추가로 첨가하였다. 우유 유래 EVs를 분화배지에 0, 1, 5, 10 μg/mL 농도가 되도록 제조하여 세포에 처리한 후 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양하였고 배지는 3일마다 교환하면서 7일까지 실험을 진행하였다.

세포증식 유도 측정

조골세포 생존 및 증식에 미치는 우유 유래 EVs의 효과를 확인하기 위해 MTT assay를 실시하였다. 실험방법은 이전에 보고된 논문과 동일한 방법으로 실험하였다(Seo 등, 2021). 간단하게 서술하면 먼저 MC3T3-E1 세포를 1×10⁴ cells/well 밀도로 96-well plate에 분주한 후 24시간 동안 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양한 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 2회 세척한 다음 우유 유래 EVs를 0, 1, 5 및 10 μg/mL 농도로 분화배지에 첨가하여 세포에 처리하였다. 세포는 3일과 7일 배양 후 5 mg/mL 농도의 3-(3,4-dimethylthiazoly-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Sigma-Aldrich) 시약을 첨가하여 환원 정도를 측정하였다.

Alkaline phosphatase(ALP) 활성 측정

염기성 인산분해효소(ALP)의 활성을 측정하여 우유 유래 EVs가 조골세포 활성에 미치는 영향을 확인하였다. MC3T3-E1 전조골세포는 1×10⁵ cells/well 밀도로 12 well plate에 분주하였고, 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 성장배지로 배양하였다. 안정화된 세포는 성장배지를 제거하고 10 mM β-glycerol phosphate와 50 μg/mL의 비타민 C가 첨가된 분화배지에 우유 유래 EVs를 농도별(0, 1, 5 및 10 μg/mL)로 제조하여 세포에 처리하였다. 3일과 7일간 배양한 세포의 배양액은 수거하고 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후 radioimmunoprecipitation assay buffer(Boston Bio Products, Ashland, MA, USA)를 이용하여 분리하였다. 세포 현탁액은 1,000×g에서 4°C로 10분간 원심분리한 후 상등액에서 ALP 효소 활성과 단백질을 정량하였다. 실험방법은 이전에 보고된 논문과 동일한 방법으로 실험하였다(Seo 등, 2021). 즉, 상등액에 1 M Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, lysis buffer 및 5 mM p-nitrophenolphosphate(p-NPP)를 각각 첨가하여 37°C에서 30분간 반응시킨 후 1 N NaOH로 반응을 중지하였고, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. ALP activity는 p-NPP로부터 생성된 p-nitrophenol(PNP)을 측정하여 PNP에 관한 표준그래프를 작성한 후 활성도를 계산하였다. 단백질은 BCA protein assay kit(Pierce)을 사용하여 정량하였다. 세포에서 측정된 ALP activity는 단백질량(mg/mL)으로 나누어 단위 단백질량당 효소활성도를 산출하여 unit으로 나타내었다.

Von Kossa 염색법

칼슘과 함께 인산 이온의 침착을 확인하기 위해 Von Kossa 염색법을 실시하였다. MC3T3-E1 세포(1×10⁵ cells/well)를 12-well plate에 분주하고 세포가 100% confluency 될 때 우유 유래 EVs가 0, 1, 5 및 10 μg/mL 농도로 첨가된 분화배지를 3일 및 7일 동안 처리하여 배양하였다. 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후 70% 에탄올로 4°C에서 30분 동안 고정시킨 다음, 3% 질산은 용액을 처리하여 1시간 동안 UV 광선 아래에서 반응시켰다. 질산은 용액을 제거하고 증류수로 세척 후 광학 현미경으로 관찰하였다. 인산 이온의 침착으로 무기질화 된 결절(nodules)은 두꺼운 암갈색 줄무늬로 나타난다.

Alizarin-red 염색법에 의한 골 무기질화 형성도 측정

Alizarin-red 염색법을 이용하여 조골세포 분화 지표인 골 무기질화의 진행 정도를 확인하였다. 무기질화된 세포 외 기질의 Ca은 alizarin-red 염색 시료와 복합체를 형성하여 붉은색으로 염색된다. 이전에 보고된 논문을 요약하면(Seo 등, 2021), 전조골세포인 MC3T3-E1 cell은 1×10⁵ cells/well 밀도로 12-well plate에 분주하였고, 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 성장배지로 배양하였다. 안정화된 세포는 성장배지를 제거하고 10 mM β-glycerol phosphate와 50 μg/mL의 비타민 C가 첨가된 분화배지에 우유 유래 EVs를 농도별(0, 1, 5 및 10 μg/mL)로 제조하여 세포에 처리하였다. 3일과 7일간 배양한 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후 70% 에탄올로 4°C에서 1시간 동안 고정시켰다. 고정된 세포를 40 mM alizarin red solution(pH 4.2, Sigma-Aldrich)에 10분간 방치한 후 증류수로 세척하고 현미경으로 nodule 정도를 관찰하였다. 무기질화 형성 정도를 정량하기 위해 10 mM sodium phosphate(pH 7.0) 용액에 10% cetylpyridinium chloride를 첨가한 용액을 제조하여 plate에 넣고 15분간 반응시킨 후, microplate reader(AU/M200, Tecan Systems Inc., San Jose, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계처리

실험 결과는 SPSS(Version 26.0, IBM, Armonk, NY, USA) 통계 프로그램을 이용하여 평균과 표준오차로 나타내었다. 유의성 분석은 one-way analysis of variance(ANOVA) 검정을 실시한 후 Duncan’s multiple range test로 사후검정하였으며 유의수준은 P<0.05이다.

우유 유래 EVs 분리 및 검증

우유 유래 EVs는 Fig. 1A와 같은 방법으로 분리하였다. 우유 단백질의 80% 이상을 차지하는 우유 카제인은 엑소좀 분리 과정을 방해할 수 있으므로(García-Martínez 등, 2022), 본 연구에서는 초원심분리 과정을 통해 카제인을 완전히 제거하는 엑소좀 분리 기술을 확립하였다. 우유에서 분리한 EVs를 나노 입자 추적 분석한 결과에서 우유 유래 EVs의 평균 직경은 156±2.5 nm이며 100~250 nm 범위 내의 크기임을 확인하였다(Fig. 1B). 이는 Blans 등(2017)이 우유 유래 엑소좀의 크기가 10~200 nm였다고 발표한 연구 결과와도 일치하였다.

BoMiProt database에 따르면 우유 유래 엑소좀에서만 1,300개 이상의 단백질이 발견되었으며 다수의 우유 단백질과 그 유도체 및 생리활성 펩티드 등이 항발암성(예: β-lactoglobulin, lactoferrin, α-lactalbumin), 항고혈압성(예: α-lactorphin, β-lactorphin, β-actosin B, casein-derived lactotripeptides) 및 면역조절(lactoferrin, lactoperoxidase, milk growth factor, immunoglobulin G) 등에 관여한다고 보고하였다(Maity 등, 2020). 본 연구에서 분리한 우유 유래 EVs를 Western blot 분석 방법을 통해 단백질 발현을 확인한 결과, 우유에서 분리한 EVs에서 EVs 마커 단백질인 CD63과 유청단백질인 lactoferrin이 존재하는 것을 확인하였다(Fig. 1C). 또한 Whole 우유에서는 EVs 마커 단백질인 CD63이 발현되지 않았으며, 유청단백질인 lactoferrin이 발현하는 것을 확인하였다(Fig. 1C).

우유 유래 EVs-DiD 표지 후 MC3T3-E1 전조골세포에 처리하여 6시간 및 24시간 후 조골세포 안으로 internalization이 되는지 확인하기 위해 DiD-EV 라벨링(붉은색 지표) 처리한 결과, 대조군과 달리 우유 유래 EVs 처리 6시간 및 24시간 후 모두에서 우유 유래 EVs가 세포 내로 유입되었으며, 시간의 경과와 함께 유입된 우유 유래 EVs도 증가하였음을 형광 현미경을 통해 확인하였다(Fig. 2).

Fig 2. Uptake of cow milk-derived EVs by osteoblastic MC3T3-E1 cells. (A) Schematic diagram of the experimental procedure. (B) Confocal microscopy images showing internalization of DiD-labeled cow milk-derived EVs into MC3T3-E1 cells for 0, 6, 24 h (n=4/sample). Cell nuclei were counter stained with DAPI.

우유 유래 EVs는 전조골세포 MC3T3-E1 세포의 증식을 촉진한다

본 연구에서 이용된 MC3T3-E1 세포주는 mouse calvaria 유래의 전조골세포로 적절한 자극이 주어졌을 때 골수의 stromal cell이나 결합조직의 mesenchymal stem cell로부터 분화되어 생성된다. MC3T3-E1 세포는 증식 및 분화하고 세포외 기질에 무기질을 침착함으로써 골형성 과정에 핵심적인 역할을 수행한다(Kim 등, 1991). 우유 유래 EVs가 조골세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였고, MC3T3-E1 세포증식률을 비교했을 때 우유 유래 EVs 처리 후 3일 차에서는 우유 유래 EVs 1 μg/mL(135.20±1.88), 5 μg/mL(122.88±2.17) 및 10 μg/mL(121.62±2.89) 농도 처리군 모두 대조군(100.00±5.38)보다 유의적으로 높은 수준의 증식률을 나타내었다. 특히 우유 유래 EVs 1 μg/mL 농도 처리군에서 가장 높은 증식률을 보였으며, 이는 실험 7일 차의 결과와도 일치하였다. 우유 유래 EVs 처리 7일 차에서 우유 유래 EVs 1 μg/mL(104.29±1.26)와 5 μg/mL(100.52±3.47) 농도 처리군은 대조군과 동일한 수준의 세포증식률을 나타내었으며 10 μg/mL(91.64±2.01) 농도 처리군은 대조군보다 낮은 증식률을 보였으나 통계적 유의성은 나타나지 않았다. 이는 우유 유래 EVs 10 μg/mL 농도가 세포증식을 촉진하기에는 높은 농도라 생각된다. 그러나 90% 이상의 증식률을 나타내었으므로 우유 유래 EVs가 조골세포 증식을 촉진하는 안전한 소재인 것으로 생각된다(Fig. 3A).

Fig 3. Cell proliferation and ALP activity by cow milk-derived EVs in osteoblastic MC3T3-E1 cells. (A) Cell proliferation was measured by MTT assay. P<0.05 compared to the cells without the treatment. Data presented as mean±SEM (n=8). (B, C) Alkaline phosphatase (ALP) activity in MC3T3-E1 cells (synthesized ALP, B) and the media (secreted ALP, C) treated with cow milk EVs. Data presented as mean±SEM (n=3). One unit of p-nitrophenol as products being converted form p-nitrophenyl phosphate as substrate for 30 minute reaction time. Cellular ALP 1 unit (U)=1 nmole p-nitrophenol/mg of protein/30 min, medium ALP 1 unit=1 nmole p-nitrophenol/mL/30 min. Different letters mean significantly different cow milk EVs concentration as analyzed by one- way ANOVA, Duncan’s multiple range test (P<0.05).

Yun 등(2020)은 MC3T3-E1 세포에 소 초유 엑소좀을 20, 50, 100, 150, 300 또는 500 ng/mL로 처리하여 세포독성과 증식을 평가한 결과 어떤 엑소좀 농도에서도 세포독성은 확인되지 않았으며, 100 ng/mL 농도의 소 초유 엑소좀 처리군에서 세포증식이 촉진되었다고 보고하였다. Yun 등(2020)의 연구에서 사용된 소 초유 엑소좀과는 달리 본 연구에서는 소의 성숙유로 제조된 시판우유에서 EVs를 분리하였으므로 초유와 성숙유의 차이로 인한 EVs 조성 및 성분의 농도에 관한 후속 연구가 필요하리라 사료된다. Sun 등(2013)은 엑소좀의 소포 구조가 타 세포로 유입되어 생물학적 역할을 수행한다고 제안했는데, 본 연구에서도 우유 유래 EVs가 MC3T3-E1 전조골세포 내로 유입되었음(Fig. 2B)을 확인했으며, 우유 유래 EVs 처리 3일째와 7일째 모두에서 우유 유래 EVs 1 μg/mL(135.20±1.88) 농도로 처리했을 때 세포증식이 촉진되었음을 확인하였다(Fig. 3A).

Cornish와 Naot(2010)는 lactoferrin이 골형성 세포인 조골세포의 증식 및 분화를 자극하고 이들 조골세포의 생존 인자로 작용한다고 보고하였으며, 소 우유로부터 정제된 lactoferrin이 rat osteoblast-like cell의 세포증식을 자극하고 이와 유사한 세포증식 효과가 human osteoblast-like cell line인 Saos-2 cell과 stromal cell line인 ST2 cell에서도 관찰되었다(Cornish 등, 2004). 본 연구에서 우유로부터 분리한 EVs에도 lactoferrin이 존재하였으며 우유 유래 EVs에 포함된 lactoferrin이 조골세포의 증식에 긍정적인 효과를 나타낼 것이라는 문헌들도 있지만, 조골세포의 증식에 관여하는 기전에 관한 후속 연구가 필요하다고 사료된다.

우유 유래 EVs는 전조골세포 MC3T3-E1 세포의 분화를 촉진한다

ALP 효소는 조골세포의 분화 초기에 나타나는 표지인자이므로 ALP 효소 활성을 측정하여 우유 유래 EVs 처리가 조골세포의 분화에 미치는 영향을 확인하였다(Kim 등, 2001). 전조골세포로부터 성숙 조골세포로 분화하기 위해서는 ALP의 도움이 필요하며(Kim, 2014), 특히 ALP가 석회화 과정 중 무기인산을 운반하고 인산칼슘 침착을 촉진하는 역할을 수행하므로 세포외막과 석회화 조직에서 높은 농도로 존재한다. 우유 유래 EVs를 각각 1, 5 및 10 μg/mL 농도로 처리한 MC3T3-E1 세포의 ALP 활성 결과를 Fig. 3B, C에 나타내었다. 세포 내 ALP 활성도로 합성된 ALP 효소의 활성을 확인했는데, 우유 유래 EVs 처리 후 3일 차에서는 우유 유래 EVs 1 μg/mL(13.82±0.46), 5 μg/mL(12.62±0.33) 및 10 μg/mL(15.92±0.16) 농도 처리군 모두가 대조군(10.89±0.16)보다 유의적으로 세포 내 ALP 활성이 증가하였으며 우유 유래 EVs 처리 후 7일 차에서는 대조군(6.12±0.31)보다 우유 유래 EVs 10 μg/mL(12.59±2.42) 농도 처리군에서만 유의적으로 세포 내 ALP 활성이 증가하였다. 우유 유래 EVs 1 μg/mL(8.42±0.30)와 5 μg/mL(7.32±0.04) 농도 처리군은 대조군(6.12±0.31)과 비교하여 유의성은 없었으나 대조군보다는 높은 활성을 보였다. 실험 3일과 7일 차 모두에서 우유 유래 EVs 10 μg/mL 농도 처리군이 조골세포의 ALP 활성을 유의적으로 촉진하는 것으로 나타났다. 또한, 세포 내 ALP 활성은 우유 유래 EVs에 의해 3일 차에 가장 높았으며 7일 차에는 3일 차보다 낮게 나타났는데, 이는 Seo 등(2021)의 이전 연구 결과와 달리 우유 유래 EVs가 조골세포의 분화 시기를 빠르게 촉진한 것으로 생각된다. 배지 내의 ALP 활성도는 세포 외로 분비된 ALP 효소를 확인할 수 있다. 우유 유래 EVs 처리 후 3일 차에서는 분비된 ALP 효소가 많지 않았으나, 그중 우유 유래 EVs 1 μg/mL(12.87±0.21) 농도 처리군이 가장 높은 ALP 활성을 나타내었고 대조군(10.65±0.13)과의 비교에서도 유의적으로 증가한 ALP 활성을 보였다. 우유 유래 EVs 처리 후 7일 차에서는 우유 유래 EVs 1 μg/mL(25.25±0.50), 5 μg/mL(23.88±0.60) 및 10 μg/mL(37.83±2074) 농도 처리군 모두가 대조군(12.79±0.94)보다 유의적으로 ALP 활성이 증가하였으며 3일 차보다 7일 차의 배지 내 ALP 활성도가 더 높았다.

Go 등(2021)의 연구에서는 우유 엑소좀이 Saos-2 세포와 MC3T3-E1 전조골세포에서 세포 외 matrix의 합성을 촉진하는 ALP 활성 증가를 보고하였으며, Takayama와 Mizumachi(2009)는 human osteoblast line인 MG63 세포에 lactoferrin을 처리했을 때 ALP 활성과 osteocalcin 수준이 증가하였음을 보고하였다.

우유 유래 EVs가 전조골세포 MC3T3-E1 세포외 기질에 무기질 침착을 촉진한다

전조골세포로부터 조골세포로 분화되면 골기질 성분을 합성하여 무기질 침착을 촉진하여 골형성을 증가시킨다(Seo 등, 2020). 본 연구에서는 우유에서 분리한 EVs 처리가 무기질화에 미치는 영향을 확인하기 위해 무기질화된 세포의 기질을 Von Kossa 및 alizarin red로 염색하여 확인하였다(Fig. 4).

Fig 4. Cow milk-derived EVs modulated extracellular matrix Ca deposits in osteoblastic MC3T3-E1 cells. (A) Extracellular matrix Ca deposits (bone nodule formation) for matrix mineralization were measured by von Kossa (A) and Alizarin red S (B) staining. Cells were cultured at 12-well plates for 3 and 7 days with the 0∼10 μg/mL cow milk EVs treatment. Representative image of 3 replicates in 12-well plate. Magnification rate, ×100. (C) Quantification analysis of cells stained using Alizarin red S dye which binds with Ca (n=3). Different letter superscripts mean significantly different cow milk EVs concentration as analyzed by one-way ANOVA, Duncan’s multiple range test (P<0.05).

세포외 기질의 인산염을 염색하기 위해 Von Kossa 염색하여 칼슘과 함께 인산 이온의 침착을 평가하였다(Fig. 4A). Von Kossa 염색에서는 우유 유래 EVs 처리 7일 차에 무기질화된 nodules의 증가가 확인되었으며, 인산이온의 침착이 우유 유래 EVs 처리군 모두에서 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. Naot 등(2005)은 lactoferrin이 조골세포 분화 및 무기질화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 rat osteoblast-like cell을 primary culture 하여 lactoferrin을 17~18일 동안 처리 후 Von Kossa 염색을 통해 무기질화된 nodules를 확인한 결과, 농도 의존적으로 무기질 침착이 증가하였음을 확인하였다. Naot 등(2005)은 lactoferrin이 뼈를 합성하는 조골세포의 증식을 자극하며 뼈 matrix의 합성과 무기질화를 촉진하는 조골세포의 능력을 향상할 수 있다고 보고하였다.

Alizarin red 염색에서는 우유 유래 EVs 처리 3일 차에 무기질화된 nodules의 증가가 농도 의존적으로 증가하였다(Fig. 4B). 염색된 무기질화된 결절 생성물을 정량하기 위해 10% cetylpyridinium chloride로 용해 후 흡광도 값을 측정하였고 우유 유래 EVs를 처리하지 않은 대조군에 대한 상대 활성으로 나타내었다(Fig. 4C). 우유 유래 EVs 처리 3일 차에서는 모든 우유 유래 EVs 1 μg/mL(123.72±10.01), 5 μg/mL(128.08±1.68) 및 10 μg/mL(201.74±4.06) 농도 처리군에서 대조군(100.00±3.36)보다 무기질 결절 형성이 유의적으로 증가하였으며, 7일 차에서는 우유 유래 EVs 5 μg/mL(140.07±8.16)와 10 μg/mL(134.59±1.29) 농도 처리군에서 대조군(100.00±0.56)보다 유의적으로 증가하였고 우유 유래 EVs 1 μg/mL(106.41±8.78) 농도 처리군에서는 대조군과 유의적 차이는 없었으나 높은 경향을 나타내었다. 따라서 본 연구에서는 우유 유래 EVs가 MC3T3-E1 전조골세포의 분화를 조절하여 세포 외 matrix 형성과 무기질 침착을 촉진하여 뼈 형성을 증가시킴을 확인하였다. 본 연구 이후로 조골세포의 분화 및 무기질화 촉진을 위한 우유 유래 EVs 내의 유효 활성 인자 확인 및 골 형성 촉진을 위한 신호전달 작용 기전에 관한 후속 연구가 더 필요하다 사료된다.

현재 골다공증 예방 및 치료에 사용되는 bisphosphonate와 estrogen은 파골세포의 활성을 지연시켜 뼈 재흡수를 억제하는 약물로써는 유효하나 이미 소실된 뼈 질량을 회복시킬 수는 없다. 또한 만성 질환인 골다공증에 약리학적 치료를 위한 약물보다는 천연 및 무독성의 식품 단백질에 의한 치료가 골다공증의 예방 및 치료에 더 유효한 방법이 될 수 있다. 따라서 본 연구에서는 MC3T3-E1 전조골세포을 이용하여 우유 유래 extracellular vesicles(EVs)가 조골세포의 분화 및 무기질화에 미치는 영향을 확인하였고, 골다공증과 같은 골질환을 예방 및 치료할 수 있는 효과적이고 안전한 소재임을 조사하였다. 우유 유래 EVs를 분화배지에 0, 1, 5, 10 μg/mL 농도가 되도록 제조하여 MC3T3-E1 세포에 처리하여 3일 및 7일 동안 배양하였고 ALP 활성도, Von Kossa 및 alizarin red 염색법 등에 의해 조골세포의 활성 변화를 분석하였다. 초원심분리에 의해 분리된 우유 유래 EVs의 평균 직경은 156±2.5 nm였으며, EV 관련 마커 단백질인 CD63 및 유청단백질 특이적 마커인 락토페린의 존재를 immunoblot 분석을 통해 확인하였다. MTT 분석 결과는 우유 유래 EVs가 3일째에 조골세포 증식을 증가시키는 것으로 나타났다. 세포 외 ALP 활성은 3일째에 우유 유래 EVs 농도가 증가함에 따라 유의하게 증가하였다. Von Kossa 및 alizarin red 염색 결과 우유 유래 EVs 처리 후 3일 및 7일에 용량 의존적 방식으로 광물화된 결절이 유의하게 증가하였다. 본 연구 결과에서 우유 유래 EVs가 조골세포의 증식, 분화 및 광물화를 자극하여 골다공증과 같은 골 질환을 예방 및 치료할 수 있는 안전한 소재로서의 가능성을 확인하였다.

이 논문은 2019학년도 안동대학교 학술연구조성비에 의하여 연구되었음.