비만은 에너지 섭취량이 소비량보다 많을 때, 그리고 패스트푸드의 섭취, 운동 부족 및 스트레스 등이 원인이 되어 발병하며, 그 수가 매년 증가하고 있다(Lee 등, 2021). 비만은 에너지를 지질로 축적하는 문제 이외에도 고혈압, 고지혈증, 제2형(인슐린 저항성) 당뇨병, 심혈관계 질환, 비알콜성 지방간질환(NAFLD) 등의 원인으로 알려져 있다(Song 등, 2009). 이에 따른 비만의 예방 및 치료를 위한 관심이 증가하고 있으며 소재 개발에 관한 연구가 꾸준히 이루어지고 있다.

프로바이오틱스(probiotics)는 적절한 양을 섭취했을 때 건강에 도움을 주는 살아있는 미생물로 항비만(Kerry 등, 2018), 콜레스테롤 저하(Nguyen 등, 2007), 면역기능 조절(Tsai 등, 2012), 항암(De Vries 등, 2006), 항알레르기(Song 등, 2016)와 같은 다양한 건강 기능성에 관한 연구가 이루어지고 있다. 이 중 항비만에 관한 연구로 Lactobacillus gasseri BNR17이 렙틴과 아디포넥틴의 주요 공급원인 지방세포 성장을 억제하여 항비만 활성을 가진다고 보고하였으며(Kang 등, 2013), Karimi 등(2015)은 고지방 식이로 유도한 비만 모델에서 Lactobacillus casei가 콜레스테롤 저하 효과가 있는 것으로 보고한 바 있다. 또한, Tanaka 등(2020)은 사균체 Lactobacillus plantarum L-137을 섭취한 피험자의 염증 및 지질대사를 개선했다고 보고하였으며, 사균체 Enterococcus faecalis EF-2001은 지질 축적을 감소시키고 고지방 식이(high-fat diet, HFD)에 의한 간 손상을 개선해 항비만 활성을 가진다고 보고하였다(Fan 등, 2022). 프로바이오틱스는 장내 미생물 균총의 변화를 통해 단당류 흡수 촉진, lipopolysaccharide(LPS) 감소, 에너지 대사 호르몬 및 이들 요인을 조절하고 유산균의 세포막 성분들이 항암(Bogdanov와 Dalev, 1975), 항염(Claes 등, 2012), 항돌연변이 효과(Park 등, 1998), 비만(Jeung 등, 2018) 등을 개선한다고 알려져 있다.

L. plantarum은 김치 및 유제품 발효에서 프로바이오틱스로 활용되고 있으며 대장암, 변비 증상 완화, 설사 및 항비만과 같은 건강 기능성에 대한 여러 가지 연구가 이루어져 있다(Park 등, 2014). L. plantarum은 다른 유산균과 비교하여 프로바이오틱스 효과가 뛰어나며(Lee 등, 2016c; 2016d) in vitro, in vivo 및 인체실험에서 혈액 지질 및 체중이 감소하는 효과가 있는 것으로 나타났다(Mekkes 등, 2013; Park 등, 2013). Kim과 Park(2021)은 비만이 유도된 마우스에 유산균을 투여할 경우 혈청 내 총콜레스테롤, 중성지방, ALT 및 AST 수준이 감소했다고 보고했다. 또한 간과 부고환 지방에서 fatty-acid oxidation 관련 유전자인 CPT1, CPT2, ACOX1의 발현이 증가했다고 보고하였다(Park 등, 2013).

L. plantarum nF1은 김치에서 분리한 L. plantarum pF1을 열처리 및 나노화 과정을 통해 크기가 0.5~1.0 μm로 축소한 김치 유래 열처리 유산균이다(Moon 등, 2019). nF1의 크기는 1 μm 미만으로 장 내 M 세포의 Peyer 패치를 통해 흡수가 더욱 빠르게 일어나 면역 반응을 일으키는 것으로 알려져 있으며(Lee 등, 2015a), 항암(Lee 등, 2015a), 항대장염(Lee 등, 2015b), 면역강화(Lee 등, 2016a; Choi 등, 2018; Moon 등, 2019) 및 인플루엔자 바이러스에 대한 보호 효과(Park 등, 2018b)와 같은 다양한 건강 기능성 연구가 보고되고 있다.

본 연구에서는 여러 가지 기능 중 사균체 L. plantarum nF1(nLp)이 L. plantarum nF1의 생균(pLp)과 다른 L. plantarum strain(PNU)과 비교하여 비만 억제 효과가 있는지를 45% 고지방 식이로 비만을 유도한 마우스에서 확인하였다.

유산균 배양 및 제조

본 연구에 사용한 L. plantarum pF1(NITE 생물자원센터(Tokyo, Japan)에 수탁, Accession No: NITE-P1462)은 한국 김치에서 분리한 균으로 이뮤노바이오텍(주)(Seoul, Korea)에서 제공받았으며, 이전 연구(Lee 등, 2016c; 2016d)에서 프로바이오틱스 효과가 뛰어난 L. plantarum PNU(KCCM 11352P)는 김치에서 분리한 균주로 한국미생물보존센터(Jeongeup, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 사균체 L. plantarum nF1(nLp)은 L. plantarum pF1을 배양한 후 열처리 및 나노화 과정을 거쳐 제조하였다(Lee 등, 2015a). 생균인 pLp, PNU 균주들은 Lactobacilli De Man, Rogosa and Sharpe(MRS) broth(Difco, Sparks, MD, USA)를 이용하여 37°C에서 혐기적으로 배양하였다. 배양 후 high-speed centrifuge(1580R, LABOGENE, Lillerød, Denmark)를 이용하여 원심분리(3,000×g, 5분, 4 °C)한 후 phosphate buffered saline(PBS)에 2회 세척한 후 실험에 사용하였다.

실험동물

본 실험에 사용된 6주령 C57BL/6 수컷 마우스(체중 20±2 g)는 샘타코(Samtaco Bio Korea, Osan, Korea)에서 구입하여 온도는 23±2°C, 상대습도 55±5%, 12시간 단위 dark-light cycle로 조정되는 시설에서 사육하였으며 충분한 물과 사료를 공급하였다. AIN-93G와 고지방 식이(45% HFD)는 두열바이오텍(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다(Park 등, 2020). 마우스는 Normal(Nor, AIN-93G normal diet), Control(Con, 45% HFD), dead L. plantarum nF1(nLp, 4×10¹¹ cells/kg/d), live L. plantarum pF1(pLp, 4×10¹¹ CFU/kg/d) 및 live L. plantarum PNU(PNU, 4×10¹¹ CFU/kg/d) 군으로 각 군당 7마리로 구성하였으며, 모든 동물실험 절차는 부산대학교 동물실험윤리위원회의 허가를 받아 실험하였다(PNU-2015-0943). Normal 군을 제외한 나머지 군은 4주 동안 고지방 식이(45% HFD)를 공급하여 비만을 유도하였고, 5주차부터 시험물질 제공 군(dead L. plantarum nF1, live L. plantarum pF1, live L. plantarum PNU)에는 시험물질을 매일 마우스에 0.1 mL씩 경구투여하였으며, 동시에 고지방 식이를 4주 동안 공급하였다(Fig. 1).

Fig 1. Experimental protocols of 45% HFD-induced obesity in C57BL/6 mice. L. plantarum strains: dead Lactobacillus plantarum nF1 (NITE-P1462), live Lactobacillus plantarum pLp (NITE-P1462), live Lactobacillus plantarum KCCM 11352P.

마우스의 체중은 순화 기간 중 1회, 군 분리 시 및 실험 기간 중 1주일에 한 번씩 개체별 체중을 측정하였다. 주 2회 사육 case 별 사료섭취량을 측정하였다. 특히 실험 기간 중 체중 측정은 매 측정 시 오차를 최소화하기 위해 동일한 요일과 시간대에 같은 저울을 사용하여 측정하였다. 사료 효율(feed efficiency ratio)은 같은 실험 기간에 체중 증가량을 동일 기간의 식이 섭취량으로 나눈 값으로 하였다. 실험동물은 희생 직전에 절식 없이 마지막 한 번 체중을 측정하고 부검을 실시하였다. 마우스를 마취한 후 복부 대동맥으로부터 채혈하였으며 채혈 직후에 장기를 적출하여 무게를 측정하였다. 채취한 장기는 액체 질소로 급속 냉동하여 -80°C에서 보관하면서 실험에 사용하였다(Park 등, 2020).

혈청 지질, 혈당, 인슐린 및 아디포넥틴 분석

혈액은 30분 정도 방치한 다음 원심분리(3,000×g, 4°C, 15분)하여 혈청을 얻은 후 -80°C에서 보관하였다. Triglyceride, total cholesterol, high-density lipoprotein(HDL) cholesterol, 혈당 등의 함량은 kit(ASAN Pharm. Co., Ltd., Seoul, Korea)을 이용하여 측정하였다. 인슐린(insulin)과 아디포넥틴(adiponectin) 함량은 ELISA kit(R&D System, Minneapolis, MN, USA)을 사용하여 제조회사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다(Park 등, 2020).

간 조직의 병리학적 검사

적출한 간 조직을 10% formalin 용액(v/v)으로 고정한 후 파라핀 블록을 제작하여 5 μm 두께의 절편을 만들었다. Hematoxylin과 Eosin(H&E) 염색은 프로토콜을 사용하여 실시하였으며 Nikon 현미경(ECLIPSE 50i, Nikon Inc., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다(Park 등, 2020).

간과 지방 조직 내 mRNA 발현 분석

각 군 마우스의 간 조직과 지방 조직을 PBS로 세척한 후 TRIzol reagent(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리한 total RNA는 spectrophotometer(UV-2401PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 정량한 후 oligo dT primer(Invitrogen Co.)와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 2 μg의 RNA에서 mRNA에 상보적인 ss cDNA로 역전사하였다(Park 등, 2020). 이 cDNA를 template로 하여 sterol regulatory element-binding protein 1(SREBP-1c, forward 5′-AGC AGC CCC TAG AAC AAA CAC-3′ and reverse 5′-CAG CAG TGA GTC TGC CTT AAA CA-3′), peroxisome proliferator-activated receptor alpha(PPAR-α, forward 5′-TGA GCA ACT ATT CCA AAC CAG C-3′ and reverse 5′-GCA CGT AGT CTT CGA TCA CTA TC-3′), acyl CoA oxidase(ACO, forward 5′-GCC TTT GTT GTC CCT ATC CG-3′ and reverse 5′-TAC ATA CGT GCC GTC AGG C-3′), carnitine palmitoyltransferase I(CPT-1, forward 5′-GGA GGT GGT GAT AGC CGG TAT-3′ and reverse 5′-TGG GTA ATC CAT AGA GCC CAG-3′) 유전자를 polymerase chain reaction(PCR)의 방법으로 특정 유전자 부위를 BIONEER thermocycler(Mygenie 96, BIONEER, Daejeon, Korea)를 이용하여 증폭시켰다(Lee 등, 2016b). 이때 internal control로 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH, forward 5′-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TC-3′, reverse 5′-AGC CTT CTC CAT GGT CGT GA-3′)를 사용하였다. 각 PCR 산물들을 2% agarose gel(Invitrogen Co.)을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.

통계처리

모든 실험의 데이터는 평균±표준편차(standard deviation, SD)로 나타냈다. One-way analysis of variance (ANOVA)를 실시하고 Duncan’s multiple range test를 이용하여 각 처리 시료(n=3) 간의 유의성을 검증하였다. P<0.05 이하일 때 유의성이 있다고 간주하였다. SPSS v18 statistical software package(SPSS Inc., Westlands, HongKong)를 이용하여 통계분석을 하였다.

체중 및 조직 무게 변화

C57BL/6 마우스에 45% 고지방 식이를 4주 동안 공급하 여 비만을 유도하였으며, 5주차부터 고지방 식이와 함께 L. platnarum strains(nF1, pF1, PNU)을 경구투여하여 각 군의 체중 변화 및 증가량을 8주에서 비교하였다(Table 1). 전체 실험 기간에 이상 반응 없이 모든 마우스가 생존하였다. 고지방 식이로 비만을 유도한 Con 그룹의 체중은 41.4±1.3 g으로 Nor 그룹(29.6±1.2 g)에 비해 유의적으로 증가하였다(P<0.05). 반면에 pLp, PNU를 섭취한 그룹은 체중이 각각 38.4±1.2 g, 40.0±2.8 g으로 Con 그룹에 비해 7.2%, 3.4% 정도 감소하였지만(P<0.05), nLp 유산균을 섭취한 그룹은 37.5±2.3 g으로 Con 그룹에 비해 9.4% 정도 유의적으로 감소하여(P<0.05) 사균체 유산균을 섭취한 그룹인 nLp에서 높은 체중감소 효과를 나타내었다. 이는 L. plantarum LMT1-48을 섭취시킨 마우스의 체중이 고지방 식이를 섭취한 그룹에 비해 2.9~6.0% 감소한 결과(Choi 등, 2020)보다 더 우수한 효과를 보였다.

Table 1 . Effects of Lactobacillus plantarum strains on the body weight, food intake, and food efficiency ratio of high fat diet (HFD)-induced C57BL/6 mice.

	Nor	Con	nLp1)	pLp	PNU
Initial body weight (g)	22.6±1.1NS2)3)	22.3±0.8	22.7±0.4	22.8±1.1	22.9±0.7
Final body weight (g)	29.6±1.2d4)	41.4±1.3a	37.5±2.3c	38.4±1.2c	40.0±2.8ab
			(9.4%)5)	-7.20%	-3.40%
Body weight gain (g)	7.0±1.3d	19.0±1.8a	14.8±2.3c	15.6±1.3bc	17.1±2.8ab
			-22.10%	-17.80%	-10.00%
Food intake (g/d)	3.1±0.1a	3.0±0.1ab	3.0±0.1ab	2.9±0.1b	3.0±0.1ab
Food efficiency ratio (%)	3.7±0.7c	10.5±1.2a	8.3±1.3b	9.0±1.8b	9.5±1.5ab

¹⁾nLp, dead L. plantarum nF1 (NITE-P1462); pLp, live L. plantarum pF1 (NITE-P1462); PNU, live L. plantarum KCCM 11352P..

²⁾Data represent means±SD..

³⁾NS: not significantly different..

⁴⁾Mean values with different letters (a-d) in the same row are significantly different (P<0.05) according to Duncan’s multiple range test..

⁵⁾The values in parentheses are the reduction rates compared to control (%)..

또한, 실험 기간에 Con 그룹은 19.0±1.8 g의 체중이 증가였으나, 유산균을 섭취한 nLp(14.8±2.3 g), pLp(15.6±1.3 g), PNU(17.1±2.8 g) 그룹은 Con 그룹에 비해 각각 억제율 22.1%, 17.8%, 10.0%로 낮은 체중 증가량을 보였다(P<0.05). Park 등(2018a)의 연구에서도 혼합 유산균(Lactobacillus casei WK3, Enterococcus faecium WK5, Bifidobacterium longum WK9 및 L. plantarum K-1)을 섭취한 그룹이 고지방 식이를 섭취한 HFC 그룹에 비해 체중 증가가 0.4 g(7.5%) 낮았다고 보고하였는데, 본 실험 역시 nLp와 pLp를 섭취한 군이 Con 그룹에 비해 체중 증가가 3.4~4.2 g(10.0~22.1%) 낮아 L. platnarum의 섭취가 체중감소에 우수한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 특히 사균체 유산균을 섭취한 nLp 그룹이 생균을 섭취한 pLp, PNU 그룹보다 각 5.1%, 15.1% 높은 체중감소 효과를 보였다.

식이 섭취량의 경우는 2.9±0.1~3.1±0.1 g으로 모든 그룹 간에 큰 차이가 없었으나, 식이 효율의 경우에는 Con 그룹이 10.5±1.2%로 Nor 그룹(3.7±0.7%)에 비해 유의적으로 증가하였다(P<0.05)(Table 1). 반면 L. platnarum을 섭취한 nLp(8.3±1.3%), pLp(9.0±1.8%), PNU(9.5±1.5%) 그룹은 식이 효율이 Con 그룹에 비해 각 20.9%, 14.3%, 9.5%로 유의적으로 감소하였다(P<0.05).

Shih 등(2008)의 연구에 따르면 고지방식을 섭취하면 간세포에 콜레스테롤과 중성지방이 축적되고 간 무게가 증가한다고 보고하였다. 본 실험 결과에서도 Con 그룹의 간 조직 무게는 1.8±0.1 g으로 Nor 그룹(1.6±0.1 g)에 비해 유의적으로 증가하였으며, 유산균을 섭취한 모든 그룹에서 Con 그룹보다 유의적으로 감소하였다(P<0.05)(Table 2). 특히 사균체 유산균을 섭취한 nLp 그룹은 1.4±0.1 g으로 Con 그룹에 비해 24.0% 감소하였으며, 생균을 섭취한 pLp(1.5±0.1 g) 그룹보다 5.6% 더 감소시킨 결과를 보였다.

Table 2 . Effects of Lactobacillus plantarum strains on tissue weight of HFD-induced C57BL/6 mice.

	Nor	Con	nLp1)	pLp	PNU
Liver (g)	1.6±0.1b2)3)	1.8±0.1a	1.4±0.1c(22.2%)4)	1.5±0.1bc(16.7%)	1.5±0.2b (16.7%)
Epididymal fat (g)	0.6±0.14c	2.4±0.2a	2.0±0.3b(16.7%)	2.1±0.2ab(12.5%)	2.1±0.5ab(12.5%)

¹⁾nLp, dead L. plantarum nF1 (NITE-P1462); pLp, live L. plantarum pF1 (NITE-P1462); PNU, live L. plantarum KCCM 11352P..

²⁾Data represent means±SD..

³⁾Mean values with different letters (a-c) in the same row are significantly different (P<0.05) according to Duncan’s multiple range test..

⁴⁾The values in parentheses are the reduction rates compared to control (%)..

부고환 지방은 체내에 과잉 에너지를 저장하는 백색지방으로 내장비만의 주요 지표 중 하나이며 혈중 지질 함량 등 대사 변화를 일으킨다고 알려져 있다(Handjieva-Darlenska와 Boyadjieva, 2007). 부고환 지방의 무게는 Con 그룹 이 2.4±0.2 g을 보였으나 nLp 그룹은 2.0±0.3 g(16.6%), pLp 그룹은 2.1±0.2 g(12.5%), PNU 그룹은 2.1±0.5 g (12.5%)으로 Con 그룹에 비해 유의적으로 감소하였다(P<0.05). 이는 생균과 사균인 Lactobacillus reuteri GMNL-263을 섭취한 그룹이 HFD를 섭취한 그룹에 비해 간 및 지방 조직의 무게가 감소한 결과(Hsieh 등, 2016)와 비슷하였다.

혈청 중성지방, 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 함량 측정

유산균 섭취에 따른 마우스의 혈청 중성지방(triglyceride, TG) 함량을 조사한 결과(Fig. 2A) Con 그룹의 경우 252.5±2.6 mg/dL 함량을 보였지만, nLp 그룹은 175.2±3.4 mg/dL, pLp 그룹은 175.4±5.0 mg/dL, PNU 그룹은 184.7±1.3 mg/dL로 Con 그룹에 비해 각각 30.6%, 30.5%, 26.9% 유의적으로 감소하였다(P<0.05). nLp와 pLp가 PNU보다 3.7% 정도 유의적으로 감소하여 L. plantarum strain 간에서도 차이가 나타난 것을 확인할 수 있었다(P<0.05).

Fig 2. Effects of Lactobacillus plantarum strains on serum levels of triglyceride (TG), total cholesterol (TC), and HDL cholesterol (HDL-C) in HFD-induced C57BL/6 mice. nLp, dead L. plantarum nF1 (NITE-P1462); pLp, live L. plantarum pF1 (NITE-P1462); PNU, live L. plantarum KCCM 11352P. Mean values with different letters (a-d) on the bars are significantly different (P<0.05) according to Duncan’s multiple range test.

Lee 등(2006)의 연구에 따르면 고지방 식이로 비만을 유도할 경우 총콜레스테롤(total cholesterol, TC) 함량이 증가한다고 보고하였다. 본 실험 결과에서도 Con 그룹의 TC농도는 255.5±20.3 mg/dL로 Nor 그룹(194.0±6.9 mg/dL)에 비해 유의적으로 증가하였으며, L. plantarum을 섭취한 모든 그룹에서 Con 그룹보다 유의적으로 감소하였다(P<0.05)(Fig. 2B). 사균체인 nLp(227.9±8.8 mg/dL) 그룹과 생균인 pLp(234.3±13.0 mg/dL), PNU(227.7±10.5 mg/dL) 그룹은 비슷하게 총콜레스테롤 함량을 감소시킨 것을 확인할 수 있었다.

HDL 콜레스테롤은 혈액 중의 동맥경화를 일으키는 저밀도 콜레스테롤(LDL, VLDL 콜레스테롤 등)을 제거하여 간으로 이동시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Kim 등, 2009). 고지방 식이로 비만을 유도한 Con 그룹의 HDL 콜레스테롤 함량은 67.7±8.5 mg/dL로 Nor 그룹(95.8±0.7 mg/dL)에 비해 유의적으로 감소하였다(P<0.05)(Fig. 2C). 반면 유산균을 섭취한 nLp(91.0±1.2 mg/dL), pLp(84.2±2.0 mg/dL), PNU(83.0±1.5 mg/dL) 그룹은 HDL 콜레스테롤 함량이 Con 그룹에 비해서 각각 34.4%, 24.4%, 22.6% 정도 유의적으로 증가하였다(P<0.05). 특히, 사균체 유산균을 섭취한 그룹인 nLp의 HDL 콜레스테롤 함량이 생균인 pLp, PNU에 비해 유의적으로 높게 증가하였다(P<0.05). 이는 가열 살균한 균을 섭취한 HKLAB 그룹이 생균을 섭취한 LLAB 그룹보다 HDL을 18% 더 증가시켰다고 한 결과(Kim 등, 2009)와 비슷하게 나타나 HDL 콜레스테롤 함량을 증가시키는 데 생균보다 사균체가 유리하다고 생각된다.

따라서 L. plantarum의 섭취는 고지방 식이에 의해 증가한 중성지방 및 콜레스테롤 함량을 감소시키는 효과가 있는 것으로 생각되며, HDL 콜레스테롤 함량을 증가시키는 사균체의 경우 유산균의 세포벽 물질들이 콜레스테롤 흡수를 억제함으로써 지질대사에 영향을 미쳐(Khalil 등, 2018) 항비만 효과뿐만 아니라 고지혈증 개선에도 효과가 있을 것으로 생각된다.

혈당, 인슐린, adiponectin 함량 측정

혈당은 인슐린의 합성 및 분비를 결정하는 가장 강력한 인자이며, 인슐린은 간, 근육 및 지방조직에 작용하여 혈당조절에 기여한다(Meisenherg와 Simmons, 2016). 혈당의 농도는 Con 그룹이 621.9±3.0 mg/dL를 보였으나 nLp 그룹은 359.0±1.3 mg/dL, pLp 그룹은 380.8±2.9 mg/dL, PNU 그룹은 435.7±5.8 mg/dL로 Con 그룹에 비해 각각 42.3%, 38.8%, 29.9% 유의적으로 감소하였다(P<0.05)(Fig. 3A). 이는 사균체 HK Lr263 또는 생균 live Lr263을 투여했을 때 HFD 그룹보다 혈당 수치를 10.2~11.2% 감소시켰으며, 대사증후군의 중요한 혈청 수치를 감소시켰다고 보고한 Hsieh 등(2016)의 연구보다 더 높은 결과를 나타내었다.

Fig 3. Effects of Lactobacillus plantarum strains on serum levels of glucose, insulin, and adiponectin in HFD-induced C57BL/6 mice. nLp, dead L. plantarum nF1 (NITE-P1462); pLp, live L. plantarum pF1 (NITE-P1462); PNU, live L. plantarum KCCM 11352P. Mean values with different letters (a-e) on the bars are significantly different (P<0.05) according to Duncan’s multiple range test.

Bonini 등(1995)의 연구에 따르면 고지방 식이를 섭취하면 혈중 인슐린 수치가 상승하게 되는데, 이는 지방세포에서 간으로의 유리지방산 이동이 증가하기 때문이라고 하였다. 본 실험 결과에서도 Con 그룹의 인슐린 농도(67.7±8.5 mg/dL)는 Nor 그룹(18.1±0.2 mg/dL)에 비해 3.7배 유의적으로 증가하였으며, L. plantarum을 섭취한 모든 그룹에 서 유의적으로 감소하였다(P<0.05)(Fig. 3B). nLp 그룹은 18.8±3.9 ng/mL로 Con 그룹에 비해 63.3% 감소시켰고 Nor 그룹과 비슷한 수준을 나타냈으며, pLp(33.1±0.7 ng/mL), PNU(33.2±1.3 ng/mL) 그룹보다도 유의적으로 낮게 나타났다(P<0.05). 특히 이 결과에서 생균을 섭취한 그룹(pLp, PNU)보다 사균을 섭취한 nLp 그룹에서 인슐린 감소 효과가 더 뛰어난 것을 확인할 수 있었다. Gauffin Cano 등(2012)의 연구에서도 Bacteroides uniformis CECT 7771을 투여한 마우스에서 체중감소뿐만 아니라 혈중 콜레스테롤, glucose, 인슐린 등이 감소하였다고 보고하였다. nLp는 혈중 포도당 및 인슐린의 수준을 크게 감소시켜 당뇨 예방에도 가능성이 있다고 생각된다.

Adiponectin은 지방세포의 분화과정에서 발현이 증가하는 단백질로 정상 쥐의 지방조직에서는 높게 발현되지만, 비만 혹은 당뇨 모델 마우스에서는 그 발현이 현저히 감소하여 비만과 음의 상관관계를 가지고 있다고 알려져 있다(Bonini 등, 1995). Con 그룹보다 L. plantarum을 섭취한 모든 그룹에서 유의적으로 증가하였다(P<0.05)(Fig. 3C). nLp 그룹은 2.4±0.2 μg/mL로 Con 그룹에 비해 1.8배 높은 함량을 나타냈고, pLp(1.9±0.3 μg/mL), PNU(1.9±0.3 μg/mL) 그룹보다도 1.3배 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).

따라서 nLp는 혈중 포도당 및 인슐린의 수준을 현저히 감소시켜 비만 이외에도 혈당 개선 및 당뇨 예방에도 효과가 있을 것으로 생각되며, nLp는 대사성 증후군을 예방하는 효과를 가질 수 있을 것으로 사료된다.

간 조직의 병리학적 검사

유산균이 간 조직 내 지방(지방구) 축적에 미치는 영향을 보고자 간 조직의 병리학적 결과를 확인하였다(Fig. 4). Con 그룹은 L. plantarum을 섭취한 다른 그룹(nLp, pLp, PNU)에 비해 불규칙한 세포 배열과 간 조직 중심 정맥 주변에 지질이 축적된 것을 확인할 수 있었다. 이는 장기간 고지방 식이를 섭취할 경우 포도당 대사가 불균형해지고 혈액을 통해 포도당 및 지방의 유입이 증가하면서 간에 지방이 축적되 고 비대해진다는 Grgoire 등(2002)의 연구와 유사한 결과를 나타내었다. 반면 L. plantarum 투여군은 간 조직 내 지방구의 수 및 크기가 Con 그룹보다 적게 나타났다. 특히 생균을 섭취한 pLp, PNU 그룹보다 사균인 nLp를 섭취한 그룹에서 지방 축적 억제 효과 및 지방간 개선 효과가 더 있는 것으로 나타났으며, 이 결과는 간 조직 무게, 혈당 수치 결과들과 비슷한 양상을 보였다.

Fig 4. Histological images of adipocytes in liver of Lactobacillus plantarum strains treated HFD-induced C57BL/6 mice. nLp, dead L. plantarum nF1 (NITE-P1462); pLp, live L. plantarum pF1 (NITE-P1462); PNU, live L. plantarum KCCM 11352P.

간 조직에서의 mRNA 발현

nF1이 간에서 비만 관련 유전자의 조절이 확실히 있음을 나타내었다. 간 조직에서 지방합성(lipogenesis)과 관련된 유전자인 SREBP-1c의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과 Con 그룹보다 L. plantarum을 섭취한 모든 그룹에서 유의적으로 감소하였다(P<0.05)(Fig. 5). SREBPs는 콜레스테롤 대사 및 지방산 대사와 관련된 여러 유전자의 발현을 조절하는 전사인자로 알려져 있으며, 고지방 식이에 의해 유도된 높은 수준의 SREBP-1c는 fatty acid synthase(FAS)의 발현을 증가시켜 간 및 지방조직에서 지방생성을 초래하는 것으로 보고되었다(Shimano, 2009). nLp 그룹은 0.20±0.04로 Con 그룹에 비해 80.0% 낮은 발현 수준을 보였고, pLp(0.49±0.13), PNU(0.32±0.07) 그룹보다도 유의적으로 낮게 나타났으며(P<0.05), 이 실험 결과에서 생균보다 사균체가 지방합성을 더 많이 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

Fig 5. Effects of Lactobacillus plantarum strains on mRNA levels of SREBP-1c in the liver of HFD-induced C57BL/6 mice. nLp, dead L. plantarum nF1 (NITE-P1462); pLp, live L. plantarum pF1 (NITE-P1462); PNU, live L. plantarum KCCM 11352P. Data represent means±SD. Mean values with different letters (a-c) on the bars are significantly different (P<0.05) according to Duncan’s multiple range test.

간 조직에서 지방 분해(fatty acid β-oxidation)와 관련된 유전자(PPAR-α, CPT-1, ACO)의 mRNA 발현 수준을 확인하였다(Fig. 6). PPAR-α는 주로 간, 갈색지방 조직에서 발현되며, 지질 및 지단백질 대사에 관여하는 유전자를 조절하는 역할을 한다(Braissant와 Wahli, 1998). PPAR-α의 mRNA 발현 수준은 L. plantarum을 섭취한 모든 그룹에서 Con 그룹보다 유의적으로 증가하였다(P<0.05)(Fig. 6A). 특히 nLp 그룹은 4.76±0.08로 Con 그룹에 비해 47.6% 높은 발현 수준을 보였고, pLp(30.5%), PNU(35.2%) 그룹보다도 유의적으로 높게 나타나(P<0.05) 생균을 섭취한 그룹보다 사균체를 섭취한 nLp 그룹에서 높은 지방 분해효과를 나타내었다.

Fig 6. Effects of Lactobacillus plantarum strains on mRNA levels of PPAR-α, CPT-1, and ACO in the liver of HFD-induced C57BL/6 mice. nLp, dead L. plantarum nF1 (NITE-P1462); pLp, live L. plantarum pF1 (NITE-P1462); PNU, live L. plantarum KCCM 11352P. Data represent means±SD. Mean values with different letters (a-e) on the bars are significantly different (P<0.05) according to Duncan’s multiple range test.

CPT-1과 ACO는 미토콘드리아 지방산 산화에서 속도를 제한하는 효소(Kobayashi 등, 2010)로 에너지 항상성 및 지방생성에 필수적인 역할을 하는 PPAR의 표적 유전자이다(Ahmed 등, 2007). CPT-1의 mRNA 발현은 nLp(4.52±0.19) 그룹이 Con 그룹에 비해 4.52배 유의적으로 높은 발현 수준을 보였다(P<0.05)(Fig. 6B). 그뿐만 아니라 생균을 섭취한 pLp(1.57±0.04), PNU(1.40±0.10) 그룹보다도 각각 2.9배, 3.2배 높게 나타나, L. acidophilus NX2-6의 cell-free extract가 SREBP-1c 및 FAS의 수준을 낮추고 CPT-1의 발현을 촉진하였다는 Tang 등(2020)과 비슷한 결과를 나타내었다. 또한, ACO의 mRNA 발현 수준은 다른 fatty acid β-oxidation과 관련된 유전자와 마찬가지로 L. plantarum을 섭취한 모든 그룹에서 Con 그룹보다 유의적으로 증가하였다(P<0.05)(Fig. 6C). nLp 그룹은 1.30±0.05로 pLp 그룹(1.35±0.07)과 비슷한 발현량을 보였으며 Con 그룹에 비해 1.30배 유의적으로 높게 나타났으며(P<0.05), nLp와 pLp가 PNU보다 유의적으로 증가하여 L. plantarum strain 간에서도 차이가 있는 것을 확인할 수 있었다(P<0.05).

따라서 nLp는 지방합성과 관련된 유전자를 감소시키고 지방 분해와 관련된 유전자를 증가시켜 간의 지방합성을 억제하고 분해하는 데 도움을 주는 것으로 나타났다.

지방조직에서의 mRNA 발현

지방조직에서 fatty acid β-oxidation과 관련된 유전자(PPAR-α, CPT-1)의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과 L. plantarum을 섭취한 모든 그룹에서 Con 그룹보다 유의적으로 증가하였다(P<0.05)(Fig. 7). PPAR-α의 발현 수준은 nLp(3.00±0.50), PNU(2.38±0.44), pLp(1.81±0.36) 그 룹 순으로 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 특히, nLp는 Con 그룹에 비해 3.0배, PNU와 pLp 그룹에 비해 1.7배, 1.3배 높은 발현 수준을 보여(Fig. 7A)

Fig 7. Effects of Lactobacillus plantarum strains on mRNA levels of PPAR-α and CPT-1 in the epididymal fat of HFD-induced C57BL/6 mice. nLp, dead L. plantarum nF1 (NITE-P1462); pLp, live L. plantarum pF1 (NITE-P1462); PNU, live L. plantarum KCCM 11352P. Data represent means±SD. Mean values with different letters (a-c) on the bars are significantly different (P<0.05) according to Duncan’s multiple range test.

지방조직에서도 생균보다 사균에서 지방 분해효과가 높은 것을 확인할 수 있었다. CPT-1은 PPAR-α에 의해 발현이 증가함으로써 지방산의 β-oxidation의 경로를 촉진해 세포 내 지방 축적을 억제한다고 알려져 있다(Johnson과 Olefsky, 2013). 유산균을 섭취한 모든 그룹에서 CPT-1의 mRNA 발현 수준은 nLp, pLp, PNU로 비슷하게 나타났지만, Con 그룹보다는 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05)(Fig. 7B). 따라서 지방조직에서 nLp는 β-oxidation과 관련된 유전자를 증가시켜 지방의 축적을 억제하여 항비만 효과가 있는 것으로 생각된다.

최근 프로바이오틱스, 프리바이오틱스(prebiotics), 포스트바이오틱스(postbiotics)에 대한 많은 연구가 이루어지고 있으나, 프로바이오틱스는 장내 미생물군에 직접적으로 영향을 끼치고 안전성, 안정성에 대한 한계가 있어 포스트바이오틱스에 대한 관심이 높아지고 있다(Żółkiewicz 등, 2020). 포스트바이오틱스는 미생물이 생성하는 대사물질뿐만 아니라 미생물 그 자체도 포함한다고 정의하고 있으며(Salminen 등, 2021), 이들의 기능성은 lipoteichoic acid, peptidoglycan, S-layer 단백질 및 세포외 다당류(exopolysaccharides, EPS) 등과 같은 유산균의 세포벽 물질에 의해 효과가 나타나는 것으로 알려져 있다(Kim과 Park, 2021). 유산균의 단쇄지방산이 포도당 신생합성을 활성화해 체중과 지방세포를 감소시킨다고 보고한 Han 등(2018)의 연구와 같이 nF1의 EPS가 단쇄지방산 생성과도 연관이 많은 것으로 보인다. 또한, 사균체의 EPS가 SCFA의 생성과도 연관이 있는 것으로 보인다. 따라서 본 연구에 사용한 유산 균 사균체 L. plantarum nF1 역시 포스트바이오틱스라고 정의할 수 있으며, 이의 항비만 효과는 다양한 세포벽 물질 등에 의해 매개되는 것으로 생각된다. 하지만 정확히 L. plantarum nF1의 항비만 기능성이 어떠한 성분과 기작에 의해 나타내는지에 대한 추가적인 연구가 필요하다.

본 연구에서는 사균체 L. plantarum nF1(nLp)의 항비만 기능성을 확인하였다. 고지방 식이로 비만이 유도된 마우스의 체중에서 nLp를 섭취한 그룹이 Con 그룹에 비해 유의적으로 체중이 감소하였으며 간과 부고환 지방 무게 역시 현저히 감소하였다. 혈청 내 중성지방, 총콜레스테롤, 혈당 및 인슐린의 함량은 Con 그룹과 비교하여 L. plantarum을 섭취한 그룹에서 유의적으로 감소하였으며, 특히 nLp 그룹이 다른 그룹에 비해 더 유의적으로 감소하였다(P<0.05). 비만과 관련 있는 호르몬인 adiponectin과 HDL-콜레스테롤 함량 역시 다른 L. plantarum에 비해 nLp 그룹이 유의적으로 증가하였으며, 비만을 예방하는 효과가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다. 병리학적으로 간 조직을 관찰한 결과 지질이 축적되고 불규칙한 핵 배열을 가진 Con 그룹에 비해 L. plantarum을 섭취한 그룹(nLp, pLp, PNU)에서는 지방구의 수 및 크기가 감소한 것을 확인할 수 있었으며, nLp를 섭취한 그룹이 지방 축적 억제 효과 및 지방간 개선 효과가 가장 높은 것으로 나타났다. 간 조직에서 lipogenesis에 관련된 유전자인 SREBP-1c의 발현은 Con 그룹보다 L. plantarum을 섭취한 그룹에서 유의적으로 낮았으며 특히 nLp 그룹이 가장 낮은 수준을 보였다. 또한, β-oxidation 관련된 유전자의 발현은 Con 그룹에 비해 L. plantarum을 섭취한 그룹에서 유의적으로 높았으며, 특히 nLp 그룹은 PPAR-α, CPT-1의 발현이 Con 그룹에 비해 4.5배 높은 발현 수준을 보였다. 지방조직에서도 PPAR-α 유전자 발현은 Con 그룹에 비해 31.2% 유의적으로 높은 수준을 보였다(P<0.05). 따라서 L. plantarum은 지질대사 이상을 억제하는 것을 확인하였으며, 사균체인 L. plantarum nF1은 생균인 pLp에 비해 유의적인 항비만 효과가 있는 것으로 나타났다.

본 연구는 경기도 지역협력연구센터 사업의 일환으로 수행하였으며[GRRC-CHA2017-B03, 기능성 김치 및 태명청 음료의 건강기능식품 개발], 이뮤노바이오텍(주)의 지원에 감사를 드립니다.