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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(10): 1091-1102

Published online October 31, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.10.1091

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Development of Shiitake Slice Products Containing High Ornithine Producing Lactic Acid Bacteria by Electrostatic Spraying Technology

Jeong Hyeon Oh1 , Jun Yong Jeong2, Seul Lee2, and Kwang Yup Kim1

1Department of Food Science and Biotechnology, Chungbuk National University
2Coorperation Goody & Yummy

Correspondence to:Kwang Yup Kim, Department of Food Science and Biotechnology, Chungbuk National University, 1, Chungdae-ro, Seowon-gu, Cheongju, Chungbuk 28644, Korea, E-mail: kimky@chungbuk.ac.kr

Received: April 18, 2022; Revised: August 25, 2022; Accepted: August 26, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

This study used an electrostatic oil spraying process to develop a dried shiitake slice product containing ornithine produced by lactic acid bacteria Lactobacillus koreensis CFM02 and Pediococcus acidilactici CFM10 which were isolated from kimchi. P. acidilactici CFM10 showed significantly high level of ornithine production, fast growth rate, and high acid and bile salt resistance. P. acidilactici CFM10 showed the highest ornithine production in the Rhynchosia nulubilis extract and produced an approximately 2:1 ratio of arginine and ornithine after supplementation with 0.8% arginine. Freeze-dried shiitake mushrooms showed higher antioxidant activity, β-glucan, total polyphenol, and hardness than products obtained through the sun-dried and hot air-dried methods. Optimum electrostatic oil spraying conditions for dried shiitake slice product were obtained at 85∼90°C. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) analysis revealed that electrostatic spraying induced a 29% higher adhesion efficiency than conventional spraying, and the coating thickness was less than 600 μm. In the dried shiitake slice product, the electrostatic spray method showed higher ornithine content at all concentrations compared to the conventional spray and the relatively high oil temperature of 85°C showed no significant effect on the hardness. Through this study, we developed a dried shiitake slice product containing high levels of ornithine with less amount of coated oil. These results can be utilized in the food industry as a basis for the healthy application of various oils in food industry.

Keywords: Pediococcus spp., ornithine, shiitake mushroom, electrostatic spray, confocal laser scanning microscopy

르니틴은 비단백 아미노산으로 체내 요소 회로의 중요한 중간물질로써 암모니아를 요소로 전환하여 배출하는 데 도움을 주는 아미노산이다. 특히 간의 암모니아를 해독함으로써 간 보호 효과가 있는 것으로 보고되어 있으며(Bucci 등, 1990; Elam 등, 1989) 이러한 간 보호 효과로 해외에서는 L-ornithine-L-aspartate의 형태로 간장 장애 개선 의약품에 이용되고 있다(Müting 등, 1992; Robinson 등, 1999). 이외에도 오르니틴은 성장호르몬의 분비를 자극시킴으로써 근육 합성을 증가시키고 탄수화물, 단백질, 지질의 대사를 활성화시켜 체내 지방 대사를 촉진하는 항비만 소재로 이용되고 있다(Edmonds 등, 1987; Zajac 등, 2010). 이러한 오르니틴은 근육 합성과 운동 후 피로감 개선 효과로 해외에서는 식이 보조제 형태로 섭취되고 있다(Sugino 등, 2008). 이외에도 최근 피부 탄력과 보습(Ito 등, 2018) 그리고 주름살 개선(Shi 등, 2002)과 관련한 피부미용의 효과와 인슐린 분비의 증가(Sener 등, 2000) 및 면역반응의 향상(Kawai 등, 2000)에도 관여한다고 보고되었다. 이러한 오르니틴은 생선과 육류에 흔히 존재하지만, 그 양이 풍부하지 않아 추가적인 오르니틴 섭취가 권장되고 있다(Sugino 등, 2008).

유산균 중 일부는 arginine deiminase(ADI) pathway 회로를 가지고 있어 arginine을 오르니틴으로 전환할 수 있으며 이러한 ADI pathway의 유전자 조절은 유산균의 생육 환경에 따라 다르다고 보고되었다(Cunin 등, 1986). 특히 발효식품에서 유래된 유산균의 오르니틴 생성 효소인 ADI와 arginase는 항암에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Hsueh 등, 2012; Kim 등, 2009; Park 등, 2003). 또한 Lactobacillus hilgardii X1B 균주에 의해 생성된 오르니틴은 포도주에서 효모에 의한 알코올 발효를 저해하며 동시에 부패 효모의 생육을 저해함으로써 생물학적 안정성을 부여할 수 있는 것으로 보고되었다(Yu 등, 2011). 따라서 발효식품에서 분리한 유산균의 오르니틴을 이용한다면 풍미와 영양 기능성이 증진된 제품을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

정전 분무(electrostatic spray)는 노즐 끝에서 고전압의 전극을 가하여 정전기적 전하를 적용하는 분무 기술이다. 전극이 가해진 분무액은 음전하로 대전되어 부착물을 양전하로 대전시키고 상호 간에 정전기적 인력이 발생하여 부착되는 원리이다. 이때 발생하는 정전기적 인력은 중력의 약 75배 강한 힘으로 작용하여 모든 면에 분무액 부착이 가능하게 하며, 비산되거나 침착되는 분무액의 손실을 감소시킬 수 있다(Cho와 Lee, 1996). 이러한 정전 분무 기술은 농약과 살충제, 페인트 도포에 주로 이용되고 있으며 기존 분무 방식보다 더욱 적은 양으로 균일하고 고르게 분무할 수 있는 효율적인 분무 기술임이 확인되고 있다(Barringer 등, 2005). 식품 분야에서의 정전 분무 기술 적용 연구는 유지, 소금, 당과 같은 식품 첨가제를 분무하기 위한 연구가 진행되고 있다(Barringer와 Sumonsiri, 2015). 최근에는 절연체인 오일을 분무하기 위해 팜유, 대두유, 유채유 등에 관한 분무 연구가 진행되었으며 유화제 첨가, 전압 세기의 증가, 온도 상승 등의 방법으로 오일의 표면장력을 감소시키고 이보다 더욱 높은 정전기력을 적용하여 분무액이 원자화될 수 있는 Rayleigh point에 도달시킴으로써 정전 분무 기술을 적용하고 있다(Mackey, 2018).

따라서 본 연구의 목적은 유산균을 통해 생성한 고함량의 오르니틴 발효액을 표고 슬라이스에 정전 분무함으로써 기존보다 효율적인 분무 공정을 개발하고 영양학적으로 증진된 표고 슬라이스 제품을 개발의 가능성을 확인하는 것이다.

사용 균주 및 배지

본 연구에서는 가정용 김치 18종을 수거하여 분리한 유산균 균주를 사용하였다. 유산균의 생육 배지로는 Lactobacilli MRS broth(Difco, Detroit, MI, USA)를 사용하였으며, 감별배지로는 BCP agar(PCA with bromocresol purple, Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하였다.

사용 재료 및 분석 기기

본 연구에서 사용한 표고버섯은 청주시 대형 마트에서 구입하여 사용하였다. 정전 분무기는 SE-EB(ESS, Maxcharge, Watkinsville, GA, USA)를 사용하였으며, 비교를 위한 일반 분무기는 conventional spray(Apollo industrial Co., Ltd., Siheung, Korea)를 사용하였다. 분무 오일은 (주)월터엔터프라이즈(Hanam, Korea)의 팜올레인 오일을 사용하였으며, 부착 효율성을 확인하기 위해 이용된 현미경은 confocal laser scanning microscopy(CLSM 710, Kr/Ar Ion Laser, Zeiss, Jena, Germany)를 사용하였다.

오르니틴 생성 유산균 배양

수거한 가정용 김치 10 g에 0.85% NaCl(Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan) 100 mL를 가하여 균질화하였다. 균질액 1 mL를 십진희석한 후 BCP agar에 평판 도말하여 37°C에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 노란색 환을 형성하지 않은 colony를 MRS agar에 순수 분리하고 오르니틴 생성 능력의 유무를 확인하기 위해 L-arginine monohydrochloride(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)가 1%(w/v) 첨가된 MRS broth에 접종하여 37°C에서 48시간 동안 배양하였다. 배양액을 1,970×g에서 15분 동안 원심분리한 뒤 상등액을 취한 후 thin-layer chromatography(TLC)를 통해 오르니틴의 정성을 확인하였다. TLC는 silica gel F254와 1%(w/v) L-arginine monohydrochloride, 1%(w/v) L-ornithine monohydrochloride(Merck Co., Darmstadt, Germany)를 이용하였고 이동상으로는 butanol:acetic acid:water=3:1:1(v/v/v) 비율의 혼합 용매를 이용하였다.

유산균의 선발 및 동정

오르니틴 생성 유산균을 대상으로 K939-100 ornithine assay kit(Biovision Inc., Milpitas, CA, USA)을 이용하여 오르니틴의 생성량을 분석하였다. 유산균은 L-arginine monohydrochloride가 1%(w/v) 첨가된 MRS broth에 접종하여 37°C에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 원심분리한 후 상등액 50 μL를 취해 96 well black plate(SPL, Pocheon, Korea)에 분주하고 ornithine reaction mix 50 μL(Table 1)를 혼합하여 30분간 반응시켰다. 이후 fluorescence spectrophotometer(LS-55, Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)를 이용하여 excitation/emission=535/587 nm 조건에서 측정하였다. 오르니틴 생성량이 높은 균주를 대상으로 API 50 CHL kit(API bioMerieux, Craponne, France)과 16s rRNA analysis를 통해 genus와 species를 결정하였다.

Table 1 . Ingredients of ornithine reaction mix and background control mix

IngredientsReaction mixBackground mix
Ornithine assay buffer38 μL44 μL
Diluted ornithine converter mix6 μL
Ornithine enzyme mix2 μL2 μL
Ornithine developer mix2 μL2 μL
Diluted ornithine probe2 μL2 μL


유산균의 생장 및 특성

생장곡선 분석을 위한 선발 유산균은 MRS broth에 optical density가 600 nm에서 0.1 이하가 되도록 접종하였고 MRS agar를 통한 생균수를 37°C에서 48시간 동안 4시간 간격으로 측정하였다.

내산성 및 내담즙성을 위한 유산균은 MRS broth에 접종하여 37°C에서 24시간 동안 배양한 후 원심분리한 뒤 유산균을 회수하여 PBS buffer로 세척하였다. 회수한 균체에 대해 내산성 실험은 pH 2, pH 3, pH 7의 PBS buffer solution을 혼합하였고 내담즙 실험은 0.3%, 0.6%, 1%(w/v) bile salt solution(Sigma-Aldrich Co.)을 혼합하였다. 이후 vortexing 한 뒤 37°C에서 3시간 동안 배양하였다. 유산균 배양 후 3회 반복 세척한 뒤 십진 희석하여 MRS agar에 도말하였다. 이후 37°C에서 48시간 동안 배양하여 colony 수를 측정하고 초기 생균수로 나누어 survival rate(%)로 표시하였다.

유기산 생성량 측정은 유산균을 MRS broth에 접종하여 37°C에서 48시간 동안 배양하고 1,970×g에서 15분간 원심분리하여 상등액을 회수한 다음 끓는 물에 5분간 중탕하였다. 상온에서 식힌 후 0.2 μm syringe filter로 여과시킨 여과액을 HPLC(Acme 9000, Young-lin, Anyang, Korea)로 분석하였으며 standard로 lactic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid를 사용하였다.

식물성 원료 추출물 배지의 제조 및 최적화

본 연구에서는 식용 배지 제조를 위한 식물성 원료로 서목태[(주)청양농부], 호박씨[(주)가루나라], 땅콩[(주)굿앤푸드], 단호박[(주)가루나라]을 사용하였다. 가루 형태의 원료에 10배수의 증류수를 첨가하여 60°C에서 24시간 열수 추출하였다. 추출물은 1,970×g에서 15분간 원심분리한 뒤 상등액을 여과지(Whatman No.3, Whatman, Little Chalfont, UK)로 감압 여과시킨 후 고압멸균하여 배지로 사용하였다.

식물성 원료 추출물 배지에 유산균을 접종하여 37°C에서 24시간, 48시간 배양한 뒤 1,970×g에서 15분간 원심분리하였다. 상등액은 회수하여 5% trichloroacetic acid(TCA)와 1:1로 혼합하였고 n-hexane 처리와 원심분리를 반복하여 분리된 하층액만을 유리 아미노산 정량 분석에 사용하였다. 분석 기기는 amino acid analyzer(HITACH L-8900, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하였으며 detection limit은 3 pmol(S/N 2, Asp), detector는 photometer 440, 570 nm로 20 µL를 주입하여 분석하였다.

Amino acid analyzer를 통해 가장 높은 함량의 오르니틴을 나타낸 식물성 원료를 선정하여 L-arginine monohydrochloride를 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 1.0%(w/v)의 농도별로 첨가한 뒤 유산균을 37°C에서 24시간 동안 배양하였다. 각 농도의 배양액은 원심분리 후 상등액을 회수하여 5% TCA와 n-hexane 처리를 하고 amino acid analyzer를 통해 아미노산 분석에 사용하였다.

건표고 슬라이스의 제조

표고버섯은 5.5 cm×1 cm×0.2 cm의 크기로 절단하여 슬라이스 형태로 건조하였다. 천일건조는 야외의 일광을 이용하여 5일 동안 건조하였고 열풍건조는 45°C에서 40시간 건조하였다. 동결건조는 표고버섯 슬라이스를 deep freezer에 24시간 동안 넣어 완전 동결시킨 후 -65°C에서 70시간 동안 동결건조하여 제조하였다.

건조 방법에 따른 경도 분석

각 건조 방법을 통해 제조한 표고버섯 슬라이스의 경도는 Texture Profile Analysis(TPA) 2 bite test를 통해 분석하였으며 texture analyzer(TA XT express texture analysis, Stable Micro System Ltd., Surrey, UK)와 직경 45.0 mm의 원형 probe를 사용하였다. 측정 조건으로는 pre-test speed 1.0 mm/s, test speed 1.0 mm/s, post-test speed 1.0 mm/s, distance 1.4 mm, time 1.00 s, trigger force 5.0 g로 측정하였다.

건조 방법에 따른 항산화 활성 분석

각 건조 방법을 통해 제조한 건표고 슬라이스를 블렌더(SMX-B89J, Shinil Co., Chungnam, Korea)로 가루 형태로 만든 뒤 10배수의 70% 에탄올을 가하여 24시간 동안 교반 추출하였다. 추출액은 여과지를 이용해 감압 여과 및 감압 농축시킨 뒤 dimethyl sulfoxide solution에 완전히 녹여 분석에 사용하였다.

2,2′-Azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS, Sigma-Aldrich Co.) 라디칼 소거능 활성 측정을 위해 7 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate solution을 혼합하여 암소에서 하루 동안 방치시킨 후 증류수로 희석하였다. 제조한 ABTS radical cation solution 1 mL와 추출 시료 50 μL를 혼합하여 vortexing 한 후 암소에서 1시간 동안 반응시킨 뒤 735 nm에서 optical density를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거능 활성은 ascorbic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 작성한 표준곡선으로 AA eq mg/g of residue 단위로 나타내었다.

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma-Aldrich Co.) 라디칼 소거능 활성 측정을 위해 0.2 mM DPPH를 2시간 동안 교반한 후 하루 동안 방치시킨 뒤 에탄올로 희석하였다. 제조한 DPPH radical cation solution 800 μL와 추출 시료 200 μL를 혼합하여 vortexing 한 후 암소에서 30분간 반응시킨 뒤 520 nm에서 optical density를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능 활성은 ascorbic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로 AA eq mg/g of residue 단위로 나타내었다.

건조 방법에 따른 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 분석

총 폴리페놀 함량은 Dewanto 등(2002)의 Folin-Ciocalteu assay 방법을 이용하여 측정하였다. 추출 시료 100 μL에 2% Na2CO3 solution 2 mL를 넣어 3분간 방치시킨 후 50% Folin-Ciocalteu phenol reagent(Sigma-Aldrich Co.)를 50 mL 첨가하여 vortexing 하였다. 암소에서 30분간 방치 후 750 nm에서 optical density를 측정하였다. Total polyphenol 함량은 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 작성한 표준곡선으로 GAE(gallic acid equivalents) mg/g 단위로 나타내었다.

플라보노이드 함량 측정을 위해 추출 시료 250 μL에 증류수 1 mL와 5% NaNO2 solution 75 μL를 첨가하여 5분간 방치하였다. 10% AlCl3 solution 150 μL와 1 M NaOH solution 500 μL를 가하고 11분 뒤 510 nm에서 optical density를 측정하였다. 플라보노이드 함량은 catechin(Sigma-Aldrich Co.)을 이용하여 작성한 표준곡선으로 CAE(catechin equivalents) mg/g 단위로 나타내었다.

건조 방법에 따른 β-glucan 함량 분석

β-Glucan 함량은 β-glucan assay kit(K-YBGL, Megazyme Inc, Bray, Ireland)을 통해 측정하였으며 total glucan contents에서 ɑ-glucan contents를 제외한 값으로 구하였다.

Total glucan contents의 측정은 가루 형태의 건표고 슬라이스 시료 90 mg에 12 M sulfuric acid 2 mL를 가하여 2시간 동안 반응시켰다. 이후 증류수 10 mL를 첨가하여 100°C에서 2시간 동안 반응시키고 8 M NaOH solution 6 mL를 첨가한 후 200 mM sodium acetate로 100 mL 정용하였다. 원심분리를 통해 회수한 상층액 0.1 mL에 exo-1,3-β-glucanase와 β-glucosidase 혼합 solution을 0.1 mL 가한 후 40°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 glucose oxidase-peroxidase(GOPOD) regent를 첨가하고 40°C에서 20분간 반응시켜 510 nm에서 optical density를 측정하였다.

ɑ-Glucan contents의 측정은 가루 형태의 시료 90 mg에 1.7 M NaOH solution 2 mL를 가하여 20분 동안 반응시켰다. 이후 1.2 M sodium acetate buffer 8 mL와 amyloglucosidase 0.2 mL를 첨가하고 40°C에서 30분 동안 반응시켰다. 원심분리를 통해 회수한 상층액을 여과시킨 후 0.1 mL에 200 mM sodium acetate buffer 0.1 mL와 GOPOD regent 3 mL를 첨가하고 40°C에서 20분간 반응시켜 510 nm에서의 optical density를 측정하였다.

최적 정전기 오일 분무 조건 확립

건표고 슬라이스의 크기에 맞춰 자른 oil test paper(5.5×1 cm)를 가로 1 cm의 간격으로 3개씩 나열한 후 electrostatic spray(SE-EB, ESS, Maxcharge)를 이용하여 팜올레인 오일을 분무하였다. 분무 조건은 90°, 55°C, 1 s를 기본으로 20 cm, 30 cm, 40 cm 거리 조건에서 분무하였다. Image J software(LOCI, University of Wisconsin, Madison, WI, USA)를 통해 가장 우수한 부착 형태를 나타낸 거리를 선발하여 65°C, 75°C, 85°C의 온도에 따른 최적 분무 조건을 확립하였다.

Image J software를 이용한 오일 부착률 분석

최적 정전기 오일 분무 조건 확립을 위해 분무된 팜올레인 오일에 의해 부착되어 변색된 oil test paper를 color scanner(SL-X4305LX, Samsung, Suwon, Korea)로 이미지화하였다. 오일이 부착된 oil test paper 이미지는 Image J software를 이용하여 8 bit의 흑백 이미지로 전환시킨 뒤 변색된 영역을 선택적으로 구분하였다. 이후 threshold 기능을 이용하여 임곗값을 조정해 팜올레인 오일의 부착 면적 및 형태를 확인하였고 analyze particles 기능을 통해 해당 pixel 값을 측정하여 droplet attachment area(pixel)/ oil test paper(pixel)×100의 계산식으로 부착률(%)을 분석하였다.

CLSM을 이용한 오일 부착률 분석

건표고 슬라이스에 rhodamine B 0.1%(w/v)가 혼합된 팜올레인 오일을 electrostatic spray와 conventional spray로 분무하였다. 이후 건조시킨 시료 단편을 confocal laser scanning microscopy(CLSM)로 561 nm 파장에서 분석하였다. CLSM을 통해 확인된 이미지는 Image J software의 흑백 이미지화 및 treshold 기능을 통해 붉은색의 형광을 나타내는 팜올레인 오일 부착 부위를 추출하여 흰색으로 시각화하였다. 이후 analyze particles 기능을 통해 pixel 값을 측정하여 attachment area(pixel)/ sample total area(pixel)×100의 계산식으로 부착률(%)을 분석하였다.

CLSM을 이용한 오일 부착 두께 분석

Rhodamine B 0.1%(w/v)를 혼합한 팜올레인 오일이 부착된 시료 단편을 CLSM의 Z-stack 기능으로 표면에서부터 내부를 600 µm씩 층층이 촬영하였다. 붉은색 형광이 나타나는 팜올레인 오일의 부착 부위를 비교함으로써 오일 부착 두께를 확인하였다.

유산균 및 오일의 부착 분석

건표고 슬라이스에 rhodamine B 0.1%(w/v)가 혼합된 팜올레인 오일과 0.01%(w/v) Flouresceinisothiocyanate(FITC, Sigma-Aldrich Co.)로 염색된 약 1.4×109 CFU/mL의 유산균을 electrostatic spray와 conventional spray (Apollo industrial Co., Ltd.)로 분무하였다. 분무된 시료는 24시간 동안 실온에서 건조시킨 뒤 단편을 CLSM으로 561 nm와 488 nm 파장에서 각각 분석 후 이미지를 overlay 하였다.

오르니틴 함량 분석

건표고 슬라이스에 팜올레인 오일이 5%, 10%, 15%, 20%(v/v)의 농도로 혼합된 유산균 발효액을 분무하였다. 유산균 발효액을 분무한 건표고 슬라이스 10 g에 증류수 15 mL를 가하여 균질화한 후 50 mL로 정용하여 177×g에서 10분 동안 원심분리하였다. 이후 상등액 1 mL를 취하여 5% TCA와 n-hexane 처리 후 0.2 μm syringe filter로 여과하여 amino acid analyzer로 분석하였다.

경도 분석

팜올레인 오일을 높은 온도에서 분무함에 따라 시료의 경도에 미치는 영향을 확인하기 위해 85°C에서 분무한 건표고 슬라이스에 대해 TPA 2 bite test로 경도를 분석하였으며 pre-test speed, test speed, post-test speed, distance, time, trigger force 조건과 probe는 건조 방법에 따른 표고버섯의 경도 측정 조건과 동일하였다.

통계처리

모든 분석은 3회 반복 실험으로 측정하였고 mean±SD로 표현하였다. 통계분석은 Statistic Analysis System Program(SAS, ver. 8.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하였으며 ANOVA 및 Duncan’s multiple range test로 유의적인 차이를 검증하였다.

유산균의 선발 및 동정

BCP agar 배지에서 분리한 유산균에 대해 TLC를 진행하여 오르니틴 생성능을 가진 5개의 균주를 Fig. 1에 나타내었다. 분리된 균주에 대해 K939-100 ornithine assay kit을 이용하여 측정한 결과, Fig. 2와 같이 CFM02는 36.98 nmol/μL, CFM10은 38.10 nmol/μL의 오르니틴을 생성하였으며 다른 균주보다 유의적으로 많은 양의 오르니틴을 생성하였다.

Fig. 1. TLC analysis of ornithine production by lactic acid bacteria isolated from kimchi.

Fig. 2. Analysis of ornithine content produced by lactic acid bacteria isolated from kimchi using K939-100 ornithine assay kit. All values are means of three replicates and mean values in the bars followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).

선발된 두 균주를 API 50 CHL kit과 16s rRNA sequencing으로 동정한 결과 CFM02는 Lactobacillus koreensis, CFM10은 Pediococcus acidilactici로 판명되었다.

유산균의 생장 및 특성

생장곡선 분석 결과 Fig. 3과 같이 P. acidilactici CFM10은 접종 후부터 8시간까지 급격하게 증가하였고 L. koreensis CFM02는 접종 4시간 이후부터 16시간까지 급격하게 증가하였다. 이를 통해 P. acidilactici CFM10의 생육 속도가 비교적 빠른 것을 확인하였다. 4시간마다 측정한 균주의 생균수는 Table 2에 나타내었으며 P. acidilactici CFM10은 12시간 만에 최대 균수에 도달하였고 L. koreensis CFM02는 접종 16시간 만에 최대 균수에 도달하여 optical density value와 일치하는 경향을 나타내었다.

Table 2 . Viable cell counts of P. acidilactici CFM10 and L. koreensis CFM02 (Unit: Log CFU/mL)

TimeStrains
P. acidilactici CFM10L. koreensis CFM02
0 h8.88±0.041)7.43±0.05
4 h9.17±0.047.95±0.42
8 h9.36±0.048.24±0.07
12 h9.48±0.018.40±0.16
16 h9.43±0.028.59±0.16
20 h9.30±0.068.18±0.06
24 h9.15±0.038.08±0.06
32 h8.93±0.018.00±0.06
40 h8.70±0.057.90±0.04
48 h8.61±0.017.85±0.05

1)All values are mean±SD (n=3).



Fig. 3. Growth curve for P. acidilactici CFM10 and L. koreensis CFM02.

내산성 및 내담즙성 결과는 Fig. 4에 나타내었으며 pH 7에서는 P. acidilactici CFM10과 L. koreensis CFM02 모두 생존률이 90% 이상이었으나 pH 3에서 크게 감소하여 각각 27%, 21%를 나타내었다. 담즙산 내성은 0.3% bile salt에서 60%와 40%, 0.6%에서는 40%와 29%, 1%에서는 20%와 19%의 생존률을 나타내었다. pH 2를 제외한 모든 조건에서 P. acidilactici CFM10이 비교적 우수한 내성을 가진 것으로 나타났다. 이러한 결과는 Pediococcus spp.가 Lactobacillus spp.보다 우수한 내산성 및 담즙산 내성을 갖는다는 Kang 등(2002)Kim(2020)의 연구 결과와 일치하는 경향을 보였다.

Fig. 4. Acid tolerance and bile salt resistance of P. acidilactici CFM10 and L. koreensis CFM02. All values expressed as the mean±SD of three replicates (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).


유기산 측정 결과는 Fig. 5에 나타내었으며 P. acidilactici CFM10은 lactic acid 270.46 mM, acetic acid 62.01 mM, propionic acid 6.53 mM을 생성하였고 butyric acid는 검출되지 않았다. L. koreensis CFM02는 lactic acid 134.67 mM, acetic acid 65.20 mM, propionic acid 6.72 mM, butyric acid 31.93 mM을 생성하였다. P. acidilactici CFM10은 L. koreensis CFM02보다 2배 이상의 많은 lactic acid를 생성하였지만 butyric acid는 전혀 생성하지 않은 것으로 나타났다. L. koreensis CFM02에서만 생성된 butyric acid는 발효식품인 청국장의 valeric acid와 발효 과정에서 생성되는 alkylpyrazine과 함께 이취 요인으로 작용할 수 있다(Choi 등, 1998).

Fig. 5. Organic acid production of P. acidilactici CFM10 and L. koreensis CFM02. All values expressed as the mean±SD of three replicates (*P<0.05, ***P<0.001).


P. acidilactici CFM10은 L. koreensis CFM02보다 높은 오르니틴 생성 능력, 빠른 생육 속도, 비교적 우수한 내산성 및 내담즙성 그리고 butyric acid를 생성하지 않는다는 특성을 고려하여 오르니틴 생성을 위한 최종 유산균 균주로 선발하였다.

식물성 원료 추출물 배지의 배양에 따른 유리 아미노산 함량

식물성 원료 추출물 배지의 배양에 따른 유리 아미노산 함량은 Table 3에 나타내었다. Phenylalanine은 땅콩을 제외한 서목태, 호박씨, 단호박 추출물에서 0.83 mg/L 이하의 함량이 나타났으며 tyrosine은 모든 추출물에서 3.90 mg/L 이하의 함량이 나타났다. 모든 원료에서 phenylalanine과 tyrosine의 낮은 함량이 나타났는데, 이는 발효 중 Pediococcus acidilactici의 생육과 젖산 생성에 있어 phenylalanine과 tyrosine이 필수적이라는 Sriphochanart와 Skolpap(2011)의 연구 결과와 일치하는 경향을 보였다.

Table 3 . Amino acid content of Seomoktae, pumpkin seeds, peanuts, and sweet pumpkin extracts after fermentation of P. acidilactici CFM10 (Unit: mg/L)

MaterialSeomoktae extractPumpkin seed extractPeanut extractSweet pumpkin extract
Time24 h48 h24 h48 h24 h48 h24 h48 h
PheND1)ND0.83±0.03cND20.42±0.01a18.23±0.02bNDND
TyrNDND3.15±0.01cND3.90±0.03a3.46±0.02bNDND
Arg1.20±0.01a2)1.19±0.01aNDNDNDNDNDND
Orn382.76±0.05b414.33±0.02a115.25±0.03g120.20±0.04e237.47±0.01d242.73±0.02c104.40±0.03h116.15±0.02f

1)Not detected.

2)All values are means of three replicates and mean values in a column followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).



Arginine의 함량은 원료 추출물 중 서목태에서만 1.19~1.20 mg/L로 검출되었으며 다른 원료 추출물에서는 검출되지 않았다. 이는 P. acidilactici CFM10의 ADI pathway에 의해 arginine을 분해하여 오르니틴을 생성한 것으로 보인다(Jung 등, 2016).

오르니틴 함량은 원료 중 서목태 발효물이 가장 높은 함량을 보였으며 24시간에서 382.76 mg/L, 48시간에서 414.33 mg/L로 나타났다.

서목태 열수 추출물은 가장 높은 arginine의 함량과 오르니틴 생성량 그리고 유산균이 이용 가능한 유리 아미노산의 함량이 높아 서목태를 오르니틴 생성을 위한 식물성 배지 원료로 선정하였다.

L-Arginine 첨가량에 따른 유리 아미노산 함량

서목태 열수 추출물에 L-arginine monohydrochloride를 농도별로 첨가한 결과 Table 4와 같이 arginine의 첨가량이 많아질수록 citrulline과 오르니틴의 함량 역시 비례하여 유의적으로 높아졌다. 그중 0.8% arginine을 첨가한 경우 arginine이 3,624.32 mg/L, 오르니틴이 1,731.92 mg/L로 arginine과 ornithine이 2:1 비율로 나타났다.

Table 4 . Amino acid content of Seomoktae extract due to the amount of arginine added

Addition amount (w/v)Amino acid concentration (mg/L)
ArginineCitrullineOrnithine
No addition1.20±0.03f1)82.00±0.01f382.76±0.04f
0.2% Arg54.60±0.02e547.46±0.06e1,229.72±0.03e
0.4% Arg625.10±0.03d992.51±0.08d1,669.40±0.01d
0.6% Arg2,093.10±0.02c1,041.29±0.07c1,688.95±0.12c
0.8% Arg3,624.32±0.01b1,128.29±0.01b1,731.92±0.07b
1.0% Arg5,315.90±0.02a1,149.36±0.04a1,737.98±0.12a

1)All values are means of three replicates and mean values in a column followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).



Arginine과 ornithine의 2:1 비율은 식이 보충제에 널리 이용되고 있으며 혈중 nitric oxide(NO)의 생성과 혈관 확장에 관여하여 각종 심혈관계질환 및 발기부전을 개선할 수 있고 운동 퍼포먼스와 근력 향상을 포함한 여러 생리활성 기능에 도움을 준다고 알려져 있다(Elam 등, 1989; Müting 등, 1992; Robinson 등, 1999; Yu 등, 2009).

0.8% arginine이 첨가된 추출물은 기존 추출물보다 약 4.5배 높은 오르니틴 함량을 나타냈으며 동시에 혈류 장애 개선을 포함한 다양한 생리활성 기능에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대되어 0.8% arginine이 첨가된 서목태 열수 추출물을 최종 배지 원료로 선택하였다.

건조 방법에 따른 경도 분석

표고버섯의 원물과 각 건조 방법에 따른 경도 분석 결과는 Table 5에 나타내었다. 원물, 천일건조, 열풍건조, 동결건조에 따른 표고버섯의 경도는 유의적으로 높아졌으며 동결건조 시료는 1,528.90 g의 경도를 나타냈다.

Table 5 . Hardness of shiitake slice according to drying method using TPA 2 bite test

Dry typeHardness (g)
Raw392.07±9.35a1)2)
Sun drying981.70±15.95b
Hot air drying1,031.73±20.2c
Freeze drying1,528.90±27.25d

1)All values are expressed as the mean±SD of three replicates.

2)All values are means of three replicates and mean values in a column followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).



Ha 등(2001)의 연구에 따르면 양송이버섯을 대상으로 열풍건조에서 건조 온도가 높을수록 경도가 증가하는 경향이 나타났고 동결건조는 비교적 열풍건조에 비해 경도의 변화가 적었으며, 이러한 경향은 버섯의 조직 내부가 다공성 구조로 이루어졌기 때문이라 사료되었다. 이러한 경향과 반대로 본 연구에서는 열풍건조가 동결건조보다 낮은 경도를 보였는데, 이는 열풍건조 온도가 비교적 낮고 동결건조 시료의 건조 시간이 비교적 길었기 때문이라고 사료된다.

건조 방법에 따른 항산화 활성 분석

건조 방법에 따른 표고버섯의 항산화 활성 분석 결과는 Fig. 6에 나타내었다. ABTS 라디칼 소거 활성은 천일건조 3.49 AA eq mg/g of residue, 열풍건조 6.26 AA eq mg/g of residue, 동결건조 7.02 AA eq mg/g of residue로 나타났으며, 동결건조한 표고버섯에서 가장 높았다.

Fig. 6. Radical scavenging activity of shiitake due to drying method. All values are means of three replicates and mean values in the same bar followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).

DPPH 라디칼 소거 활성은 천일건조 2.78 AA eq mg/g of residue, 열풍건조 2.53 AA eq mg/g of residue, 동결건조 3.02 AA eq mg/g of residue로 나타났으며, ABTS 라디칼 소거능과 동일하게 동결건조한 표고버섯에서 가장 높았다.

Kim 등(2012)과 Pérez Martínez 등(2015)은 버섯의 열풍건조 시 비교적 높은 온도로 인해 캐러멜화, 마이야르 반응, 효소 반응, 색소 분해 및 ascorbic acid의 산화가 일어나 품질이 저하되고 ascorbic acid를 비롯한 항산화 물질의 활성이 저하된다고 보고하였으며, 이러한 현상은 본 연구에서 열풍건조한 표고버섯이 동결건조한 표고버섯보다 항산화 활성이 낮게 나타난 원인으로 사료된다.

총 폴리페놀, 플라보노이드 및 β-glucan 함량

총 폴리페놀 함량 및 플라보노이드 함량은 Fig. 7에 나타내었다. 총 폴리페놀 함량은 천일건조 1.89 GAE mg/g, 열풍건조 4.41 GAE mg/g, 동결건조 13.86 GAE mg/g으로 나타났으며 동결건조 표고버섯에서 가장 높게 나타났다. Choi 등(2014)의 연구에 따르면 버섯을 열풍건조할 경우 온도가 높을수록 총 폴리페놀 함량 역시 증가하지만 40~50°C 온도의 열풍건조의 경우 동결건조한 표고버섯보다 총 폴리페놀 함량이 더욱 낮았으며 이는 본 연구 결과와 일치하는 경향을 보였다.

Fig. 7. Total polyphenol and flavonoid content of shiitake due to drying method. The standard for total polyphenols is gallic acid and the standard for flavonoids is catechin. All values are means of three replicates and mean values in the same bar followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).

플라보노이드 함량은 천일건조 3.92 CAE mg/g, 열풍건조 9.51 CAE mg/g, 동결건조 7.24 CAE mg/g으로 나타났으며 열풍건조한 표고버섯에서 가장 높게 나타났다. Peleg 등(1991)은 버섯에 대한 열처리는 세포벽을 파괴하여 플라보노이드를 더욱 쉽게 시킨다고 보고하였으며, 이러한 현상은 열풍건조한 표고버섯에서 가장 높은 플라보노이드 함량이 나타난 본 연구 결과의 원인으로 사료된다.

β-Glucan의 함량은 Fig. 8에 나타내었다. β-Glucan의 함량은 천일건조 22.84%(w/w), 열풍건조 29.64%(w/w), 동결건조 32.38%(w/w)로 나타났으며 건조 방법에 따라 유의적인 차이를 나타내었다. 이러한 결과는 열풍건조보다 동결건조한 표고버섯에서 더욱 높은 β-glucan 함량이 나타난다고 보고한 Je 등(2018)의 연구 결과와 일치하는 경향을 보였다.

Fig. 8. β-Glucan content of shiitake due to drying method. All values are means of three replicates and mean values in the bars followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).

동결건조를 통한 표고버섯은 천일건조 및 열풍건조보다 높은 경도, 항산화 활성, 총 폴리페놀 함량, β-glucan 함량이 분석되어 이를 시료 제조의 건조 방법으로 선정하였다.

최적 정전기 오일 분무 조건 확립

최적 정전기 분무 조건 확립을 위한 Image J software 분석 결과는 Fig. 9에 나타내었다. 40 cm 거리에서 oil test paper의 가장 고른 오일 부착 형태를 확인할 수 있었으며 이후 온도가 증가함에 따라 부착률이 비례적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 85°C에서는 모든 oil test paper의 부착률이 98%로 확인되었으며 최적 정전기 오일 분무 조건은 90°, 40 cm, 85°C, 1 s 조건으로 확립하였다.

Fig. 9. Image of oil attached by electrostatic spraying according to distance, temperature, conditions on paper of dried shiitake slice.

CLSM을 이용한 오일 부착률 분석

CLSM을 통한 오일 부착률 분석 결과는 Fig. 10에 나타내었다. Conventional spray로 분무한 시료 단편 전체는 1,654,419 pixel로 측정되었고 오일 부착 부위는 498,857 pixel로 측정되었으며 부착률은 약 30.15%로 나타났다. Electrostatic spray로 분무한 건표고 시료 단편 전체는 1,636,977 pixel로 측정되었고 오일 부착 부위는 978,896 pixel로 측정되어 부착률은 약 59.80%로 나타났다. CLSM을 통한 오일 부착률 분석에서는 electrostatic spray가 conventional spray보다 약 29% 높은 부착률을 나타내었으며 CLSM을 통한 분석에서도 정전기 분무가 기존의 분무 방식보다 더욱 균일하고 효율적인 오일 분무 방식이라는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 10. Analysis of oil adhesion rate of dried shiitake slice due to conventional spraying and electrostatic spraying by CLSM. attachment image at 25× magnification of palm olein oil stained with rhodamine B at 561 nm. (A) Image of shiitake mushroom with oil attached. (B) Extraction image of the oil attachment site. All values are expressed as the mean±SD of three replicates.

CLSM을 이용한 오일 부착 두께 분석

CLSM을 통한 오일 부착 두께 분석 결과는 Fig. 11에 나타내었다. Conventional spray로 오일을 분무한 시료 단편을 표면에서부터 내부로 600 μm씩 관찰한 결과 0 μm, 600 μm, 1,200 μm 내부에서 동일한 위치에 오일이 겹쳐 부착된 것을 확인할 수 있었다. 반면 electrostatic spray로 오일을 분무한 시료 단편에서는 0 μm, 600 μm, 1,200 μm에서 내부에서 각각 동일한 위치에 오일이 겹치지 않은 형태로 부착된 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 11. Oil coationg thickness analysis of dried shiitake slice by conventional spraying and electrostatic spraying by Z-stack of CLSM. Surface (0 μm), 600 μm, 1,200 μm internal 25× magnification images of dried shiitake mushrooms with palm olein oil mixed with rhodamine B.

따라서 electrostatic spray를 이용한 정전기 오일 분무는 기존의 오일 분무 방식보다 팜올레인 오일이 더욱 고르고 얇은 두께의 코팅을 가능하게 한다고 사료된다.

유산균 및 오일의 부착 분석

유산균 및 오일의 부착 형태 분석은 Fig. 12에 나타내었다. Conventional spray에서는 488 nm에서 녹색 형광으로 관찰된 P. acidilactici CFM10과 561 nm에서 붉은 형광으로 관찰된 팜올레인 오일의 부착 정도가 비교적 낮은 형태로 나타났다.

Fig. 12. Attachment images of P. acidilactici CFM10 and palm olein oil on dried shiitake slice by conventional and electrostatic spraying by CLSM at 25× magnification. (A) Attachment image of P. acidilactici CFM10 stained with FITC at 488 nm. (B) Attachment image of palm olein oil stained with rhodamine B at 561 nm. (C) Overlay image of P. acidilactici CFM10 and palm olein oil attached to dried shiitake slice.


이와 달리 electrostatic spray에서는 P. acidilactici CFM10과 팜올레인 오일의 부착 정도가 높은 것으로 나타났으며 유산균과 오일 모두 기존 분무 방식에 비해 정전 분무 방식에서에서 높은 부착 정도의 형태를 나타내었다.

오르니틴 함량 분석

오르니틴 함량은 Table 6과 같이 팜올레인 오일에 혼합된 오르니틴 발효물의 농도가 증가할수록 건표고 슬라이스에 함유된 오르니틴의 함량 역시 증가하였으며, 모든 농도에서 conventional spray보다 electrostatic spray에서 유의적으로 높은 함량이 나타났다. 일반 분무와 정전 분무 간의 오르니틴 함량 차이는 5%에서 115.20 mg/g, 10%에서 146.38 mg/g, 15%에서 138.83 mg/g, 20%에서 248.98 mg/g으로 나타났으며, 이는 정전 분무의 Coulomb’s law 특성에 의한 강한 정전기적 부착 인력과 이에 따른 분무액의 공기 중 비산 및 지면 침착 손실 감소로 인한 결과라고 사료된다.

Table 6 . Ornithine contents attached to dried shiitake by conventional spraying and electrostatic spraying methods at different concentration levels of fermented ornithine broth (Unit: mg/g)

Ornithine fermentation broth (%)Conventional sprayElectrostatic spray
5%139.90±3.47a1)2)255.10±2.32a
10%163.78±3.85b310.16±5.23b
15%192.81±4.32c331.64±0.47c
20%227.50±4.61d476.48±3.67d

1)All values are expressed as the mean±SD of three replicates.

2)All values are means of three replicates and mean values in a column followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).



경도 분석

TPA 2 bite test로 경도를 분석한 결과는 Table 7에 나타내었다. 팜올레인 오일을 분무함에 따라 경도가 낮아진 것을 확인할 수 있었으며 45°C보다 85°C에서의 경도는 낮았지만, 유의적인 차이는 나타나지 않았다.

Table 7 . Hardness of shiitake slice due to oil spray temperature using TPA test

Temperature conditionDried shiitake slice hardness (g)
Control1,528.90±27.25a1)2)
Electrostatic spraying 45°C1,126.631±19.52b
Electrostatic spraying 85°C1,115.90±24.74b

1)All values are expressed as the mean±SD of three replicates.

2)All values are means of three replicates and mean values in a column followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).



경도는 깨진 시료를 probe가 누르며 deformation이 98%에 도달했을 때 걸리는 힘을 나타내기 때문에 시료 내부로 침투된 오일의 영향을 받으며, 이로 인해 오일 분무에 따라 경도가 감소한 것이라 사료된다.

건표고 슬라이스의 85°C 분무가 45°C의 분무와 경도에서 유의적인 차이를 나타내지 않았기 때문에 높은 분무 온도에 의한 제품의 식감에는 실질적인 차이가 없을 것이라 사료된다.

본 연구에서는 다양한 생리활성 기능을 갖는 오르니틴을 유산균을 통해 생성하여 식품에 첨가하기 위해 오르니틴 생성능이 우수한 균주인 L. koreensis CFM02와 P. acidilactici CFM10을 김치로부터 분리하였다. P. acidilactici CFM10은 Generally recognized as safe(GRAS)로 인정된 균주로 L. koreensis CFM02보다 생육 속도가 빠르고 내산성 및 담즙산 내성이 우수하였으며, 이취를 발생시킬 수 있는 butyric acid를 생성하지 않았기 때문에 오르니틴 생성 유산균으로 P. acidilactici CFM10을 선정하였다. P. acidilactici CFM10 균주는 서목태 추출물에서 오르니틴 생산량이 가장 높았으며 0.8%(w/v) arginine 첨가 시 arginine과 오르니틴이 2:1 비율로 생성되어 0.8%(w/v) arginine을 최적 첨가 농도로 선정하였다. 동결건조를 통한 표고버섯은 천일건조 및 열풍건조보다 높은 경도, 항산화 활성, 총 폴리페놀 함량, β-glucan 함량이 분석되어 이를 건조 방법으로 선정하였다. Electrostatic spray와 oil test paper를 통한 건표고 슬라이스의 최적 정전기 오일 분무 조건은 90°, 40 cm, 90~85°C, 1 s 조건으로 확립되었다. CLSM을 통한 분석 결과 electrostatic spray는 conventional spray보다 부착률이 29% 높았으며 Z-stack 기능을 통한 내부 분석 결과 electrostatic spray에서 팜올레인 오일이 600 μm 이하로 더욱 얇게 코팅되었다. 건표고 슬라이스에 electrostatic spray로 분무한 경우 conventional spray로 분무했을 때 더욱 높은 오르니틴 함량이 나타났으며, 85°C의 고온에서 오일을 분무하여도 제품 경도에 유의적인 영향은 미치지 않았다. 본 연구를 통해 오르니틴이 함유되어 영양학적으로 가치가 높은 건표고 슬라이스 제품과 이에 따른 정전기 오일 분무 공정을 개발하였다. 정전기 오일 분무 공정의 개발은 오일을 포함한 분무액과 원가를 절감하고 제품의 품질을 향상시킬 수 있을 것으로 기대되며, 본 연구는 식품 산업에서 보다 효율적인 오일 코팅 공정 개발의 토대가 될 수 있을 것으로 생각된다.

이 논문은 2021(2차)년도 바이오헬스산업 핵심기술개발 및 지원사업(1345341783)의 연구수행으로 인한 결과물임을 밝힙니다.

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(10): 1091-1102

Published online October 31, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.10.1091

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

오르니틴 고생산 유산균을 정전 분무하여 제조한 표고 슬라이스 제품 개발

오정현1․정준영2․이 슬2․김광엽1

1충북대학교 식품생명공학과
2지디앤와이(주)

Received: April 18, 2022; Revised: August 25, 2022; Accepted: August 26, 2022

Development of Shiitake Slice Products Containing High Ornithine Producing Lactic Acid Bacteria by Electrostatic Spraying Technology

Jeong Hyeon Oh1 , Jun Yong Jeong2, Seul Lee2, and Kwang Yup Kim1

1Department of Food Science and Biotechnology, Chungbuk National University
2Coorperation Goody & Yummy

Correspondence to:Kwang Yup Kim, Department of Food Science and Biotechnology, Chungbuk National University, 1, Chungdae-ro, Seowon-gu, Cheongju, Chungbuk 28644, Korea, E-mail: kimky@chungbuk.ac.kr

Received: April 18, 2022; Revised: August 25, 2022; Accepted: August 26, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

This study used an electrostatic oil spraying process to develop a dried shiitake slice product containing ornithine produced by lactic acid bacteria Lactobacillus koreensis CFM02 and Pediococcus acidilactici CFM10 which were isolated from kimchi. P. acidilactici CFM10 showed significantly high level of ornithine production, fast growth rate, and high acid and bile salt resistance. P. acidilactici CFM10 showed the highest ornithine production in the Rhynchosia nulubilis extract and produced an approximately 2:1 ratio of arginine and ornithine after supplementation with 0.8% arginine. Freeze-dried shiitake mushrooms showed higher antioxidant activity, β-glucan, total polyphenol, and hardness than products obtained through the sun-dried and hot air-dried methods. Optimum electrostatic oil spraying conditions for dried shiitake slice product were obtained at 85∼90°C. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) analysis revealed that electrostatic spraying induced a 29% higher adhesion efficiency than conventional spraying, and the coating thickness was less than 600 μm. In the dried shiitake slice product, the electrostatic spray method showed higher ornithine content at all concentrations compared to the conventional spray and the relatively high oil temperature of 85°C showed no significant effect on the hardness. Through this study, we developed a dried shiitake slice product containing high levels of ornithine with less amount of coated oil. These results can be utilized in the food industry as a basis for the healthy application of various oils in food industry.

Keywords: Pediococcus spp., ornithine, shiitake mushroom, electrostatic spray, confocal laser scanning microscopy

서 론

르니틴은 비단백 아미노산으로 체내 요소 회로의 중요한 중간물질로써 암모니아를 요소로 전환하여 배출하는 데 도움을 주는 아미노산이다. 특히 간의 암모니아를 해독함으로써 간 보호 효과가 있는 것으로 보고되어 있으며(Bucci 등, 1990; Elam 등, 1989) 이러한 간 보호 효과로 해외에서는 L-ornithine-L-aspartate의 형태로 간장 장애 개선 의약품에 이용되고 있다(Müting 등, 1992; Robinson 등, 1999). 이외에도 오르니틴은 성장호르몬의 분비를 자극시킴으로써 근육 합성을 증가시키고 탄수화물, 단백질, 지질의 대사를 활성화시켜 체내 지방 대사를 촉진하는 항비만 소재로 이용되고 있다(Edmonds 등, 1987; Zajac 등, 2010). 이러한 오르니틴은 근육 합성과 운동 후 피로감 개선 효과로 해외에서는 식이 보조제 형태로 섭취되고 있다(Sugino 등, 2008). 이외에도 최근 피부 탄력과 보습(Ito 등, 2018) 그리고 주름살 개선(Shi 등, 2002)과 관련한 피부미용의 효과와 인슐린 분비의 증가(Sener 등, 2000) 및 면역반응의 향상(Kawai 등, 2000)에도 관여한다고 보고되었다. 이러한 오르니틴은 생선과 육류에 흔히 존재하지만, 그 양이 풍부하지 않아 추가적인 오르니틴 섭취가 권장되고 있다(Sugino 등, 2008).

유산균 중 일부는 arginine deiminase(ADI) pathway 회로를 가지고 있어 arginine을 오르니틴으로 전환할 수 있으며 이러한 ADI pathway의 유전자 조절은 유산균의 생육 환경에 따라 다르다고 보고되었다(Cunin 등, 1986). 특히 발효식품에서 유래된 유산균의 오르니틴 생성 효소인 ADI와 arginase는 항암에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Hsueh 등, 2012; Kim 등, 2009; Park 등, 2003). 또한 Lactobacillus hilgardii X1B 균주에 의해 생성된 오르니틴은 포도주에서 효모에 의한 알코올 발효를 저해하며 동시에 부패 효모의 생육을 저해함으로써 생물학적 안정성을 부여할 수 있는 것으로 보고되었다(Yu 등, 2011). 따라서 발효식품에서 분리한 유산균의 오르니틴을 이용한다면 풍미와 영양 기능성이 증진된 제품을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

정전 분무(electrostatic spray)는 노즐 끝에서 고전압의 전극을 가하여 정전기적 전하를 적용하는 분무 기술이다. 전극이 가해진 분무액은 음전하로 대전되어 부착물을 양전하로 대전시키고 상호 간에 정전기적 인력이 발생하여 부착되는 원리이다. 이때 발생하는 정전기적 인력은 중력의 약 75배 강한 힘으로 작용하여 모든 면에 분무액 부착이 가능하게 하며, 비산되거나 침착되는 분무액의 손실을 감소시킬 수 있다(Cho와 Lee, 1996). 이러한 정전 분무 기술은 농약과 살충제, 페인트 도포에 주로 이용되고 있으며 기존 분무 방식보다 더욱 적은 양으로 균일하고 고르게 분무할 수 있는 효율적인 분무 기술임이 확인되고 있다(Barringer 등, 2005). 식품 분야에서의 정전 분무 기술 적용 연구는 유지, 소금, 당과 같은 식품 첨가제를 분무하기 위한 연구가 진행되고 있다(Barringer와 Sumonsiri, 2015). 최근에는 절연체인 오일을 분무하기 위해 팜유, 대두유, 유채유 등에 관한 분무 연구가 진행되었으며 유화제 첨가, 전압 세기의 증가, 온도 상승 등의 방법으로 오일의 표면장력을 감소시키고 이보다 더욱 높은 정전기력을 적용하여 분무액이 원자화될 수 있는 Rayleigh point에 도달시킴으로써 정전 분무 기술을 적용하고 있다(Mackey, 2018).

따라서 본 연구의 목적은 유산균을 통해 생성한 고함량의 오르니틴 발효액을 표고 슬라이스에 정전 분무함으로써 기존보다 효율적인 분무 공정을 개발하고 영양학적으로 증진된 표고 슬라이스 제품을 개발의 가능성을 확인하는 것이다.

재료 및 방법

사용 균주 및 배지

본 연구에서는 가정용 김치 18종을 수거하여 분리한 유산균 균주를 사용하였다. 유산균의 생육 배지로는 Lactobacilli MRS broth(Difco, Detroit, MI, USA)를 사용하였으며, 감별배지로는 BCP agar(PCA with bromocresol purple, Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하였다.

사용 재료 및 분석 기기

본 연구에서 사용한 표고버섯은 청주시 대형 마트에서 구입하여 사용하였다. 정전 분무기는 SE-EB(ESS, Maxcharge, Watkinsville, GA, USA)를 사용하였으며, 비교를 위한 일반 분무기는 conventional spray(Apollo industrial Co., Ltd., Siheung, Korea)를 사용하였다. 분무 오일은 (주)월터엔터프라이즈(Hanam, Korea)의 팜올레인 오일을 사용하였으며, 부착 효율성을 확인하기 위해 이용된 현미경은 confocal laser scanning microscopy(CLSM 710, Kr/Ar Ion Laser, Zeiss, Jena, Germany)를 사용하였다.

오르니틴 생성 유산균 배양

수거한 가정용 김치 10 g에 0.85% NaCl(Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan) 100 mL를 가하여 균질화하였다. 균질액 1 mL를 십진희석한 후 BCP agar에 평판 도말하여 37°C에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 노란색 환을 형성하지 않은 colony를 MRS agar에 순수 분리하고 오르니틴 생성 능력의 유무를 확인하기 위해 L-arginine monohydrochloride(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)가 1%(w/v) 첨가된 MRS broth에 접종하여 37°C에서 48시간 동안 배양하였다. 배양액을 1,970×g에서 15분 동안 원심분리한 뒤 상등액을 취한 후 thin-layer chromatography(TLC)를 통해 오르니틴의 정성을 확인하였다. TLC는 silica gel F254와 1%(w/v) L-arginine monohydrochloride, 1%(w/v) L-ornithine monohydrochloride(Merck Co., Darmstadt, Germany)를 이용하였고 이동상으로는 butanol:acetic acid:water=3:1:1(v/v/v) 비율의 혼합 용매를 이용하였다.

유산균의 선발 및 동정

오르니틴 생성 유산균을 대상으로 K939-100 ornithine assay kit(Biovision Inc., Milpitas, CA, USA)을 이용하여 오르니틴의 생성량을 분석하였다. 유산균은 L-arginine monohydrochloride가 1%(w/v) 첨가된 MRS broth에 접종하여 37°C에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 원심분리한 후 상등액 50 μL를 취해 96 well black plate(SPL, Pocheon, Korea)에 분주하고 ornithine reaction mix 50 μL(Table 1)를 혼합하여 30분간 반응시켰다. 이후 fluorescence spectrophotometer(LS-55, Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)를 이용하여 excitation/emission=535/587 nm 조건에서 측정하였다. 오르니틴 생성량이 높은 균주를 대상으로 API 50 CHL kit(API bioMerieux, Craponne, France)과 16s rRNA analysis를 통해 genus와 species를 결정하였다.

Table 1 . Ingredients of ornithine reaction mix and background control mix.

IngredientsReaction mixBackground mix
Ornithine assay buffer38 μL44 μL
Diluted ornithine converter mix6 μL
Ornithine enzyme mix2 μL2 μL
Ornithine developer mix2 μL2 μL
Diluted ornithine probe2 μL2 μL


유산균의 생장 및 특성

생장곡선 분석을 위한 선발 유산균은 MRS broth에 optical density가 600 nm에서 0.1 이하가 되도록 접종하였고 MRS agar를 통한 생균수를 37°C에서 48시간 동안 4시간 간격으로 측정하였다.

내산성 및 내담즙성을 위한 유산균은 MRS broth에 접종하여 37°C에서 24시간 동안 배양한 후 원심분리한 뒤 유산균을 회수하여 PBS buffer로 세척하였다. 회수한 균체에 대해 내산성 실험은 pH 2, pH 3, pH 7의 PBS buffer solution을 혼합하였고 내담즙 실험은 0.3%, 0.6%, 1%(w/v) bile salt solution(Sigma-Aldrich Co.)을 혼합하였다. 이후 vortexing 한 뒤 37°C에서 3시간 동안 배양하였다. 유산균 배양 후 3회 반복 세척한 뒤 십진 희석하여 MRS agar에 도말하였다. 이후 37°C에서 48시간 동안 배양하여 colony 수를 측정하고 초기 생균수로 나누어 survival rate(%)로 표시하였다.

유기산 생성량 측정은 유산균을 MRS broth에 접종하여 37°C에서 48시간 동안 배양하고 1,970×g에서 15분간 원심분리하여 상등액을 회수한 다음 끓는 물에 5분간 중탕하였다. 상온에서 식힌 후 0.2 μm syringe filter로 여과시킨 여과액을 HPLC(Acme 9000, Young-lin, Anyang, Korea)로 분석하였으며 standard로 lactic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid를 사용하였다.

식물성 원료 추출물 배지의 제조 및 최적화

본 연구에서는 식용 배지 제조를 위한 식물성 원료로 서목태[(주)청양농부], 호박씨[(주)가루나라], 땅콩[(주)굿앤푸드], 단호박[(주)가루나라]을 사용하였다. 가루 형태의 원료에 10배수의 증류수를 첨가하여 60°C에서 24시간 열수 추출하였다. 추출물은 1,970×g에서 15분간 원심분리한 뒤 상등액을 여과지(Whatman No.3, Whatman, Little Chalfont, UK)로 감압 여과시킨 후 고압멸균하여 배지로 사용하였다.

식물성 원료 추출물 배지에 유산균을 접종하여 37°C에서 24시간, 48시간 배양한 뒤 1,970×g에서 15분간 원심분리하였다. 상등액은 회수하여 5% trichloroacetic acid(TCA)와 1:1로 혼합하였고 n-hexane 처리와 원심분리를 반복하여 분리된 하층액만을 유리 아미노산 정량 분석에 사용하였다. 분석 기기는 amino acid analyzer(HITACH L-8900, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하였으며 detection limit은 3 pmol(S/N 2, Asp), detector는 photometer 440, 570 nm로 20 µL를 주입하여 분석하였다.

Amino acid analyzer를 통해 가장 높은 함량의 오르니틴을 나타낸 식물성 원료를 선정하여 L-arginine monohydrochloride를 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 1.0%(w/v)의 농도별로 첨가한 뒤 유산균을 37°C에서 24시간 동안 배양하였다. 각 농도의 배양액은 원심분리 후 상등액을 회수하여 5% TCA와 n-hexane 처리를 하고 amino acid analyzer를 통해 아미노산 분석에 사용하였다.

건표고 슬라이스의 제조

표고버섯은 5.5 cm×1 cm×0.2 cm의 크기로 절단하여 슬라이스 형태로 건조하였다. 천일건조는 야외의 일광을 이용하여 5일 동안 건조하였고 열풍건조는 45°C에서 40시간 건조하였다. 동결건조는 표고버섯 슬라이스를 deep freezer에 24시간 동안 넣어 완전 동결시킨 후 -65°C에서 70시간 동안 동결건조하여 제조하였다.

건조 방법에 따른 경도 분석

각 건조 방법을 통해 제조한 표고버섯 슬라이스의 경도는 Texture Profile Analysis(TPA) 2 bite test를 통해 분석하였으며 texture analyzer(TA XT express texture analysis, Stable Micro System Ltd., Surrey, UK)와 직경 45.0 mm의 원형 probe를 사용하였다. 측정 조건으로는 pre-test speed 1.0 mm/s, test speed 1.0 mm/s, post-test speed 1.0 mm/s, distance 1.4 mm, time 1.00 s, trigger force 5.0 g로 측정하였다.

건조 방법에 따른 항산화 활성 분석

각 건조 방법을 통해 제조한 건표고 슬라이스를 블렌더(SMX-B89J, Shinil Co., Chungnam, Korea)로 가루 형태로 만든 뒤 10배수의 70% 에탄올을 가하여 24시간 동안 교반 추출하였다. 추출액은 여과지를 이용해 감압 여과 및 감압 농축시킨 뒤 dimethyl sulfoxide solution에 완전히 녹여 분석에 사용하였다.

2,2′-Azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS, Sigma-Aldrich Co.) 라디칼 소거능 활성 측정을 위해 7 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate solution을 혼합하여 암소에서 하루 동안 방치시킨 후 증류수로 희석하였다. 제조한 ABTS radical cation solution 1 mL와 추출 시료 50 μL를 혼합하여 vortexing 한 후 암소에서 1시간 동안 반응시킨 뒤 735 nm에서 optical density를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거능 활성은 ascorbic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 작성한 표준곡선으로 AA eq mg/g of residue 단위로 나타내었다.

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma-Aldrich Co.) 라디칼 소거능 활성 측정을 위해 0.2 mM DPPH를 2시간 동안 교반한 후 하루 동안 방치시킨 뒤 에탄올로 희석하였다. 제조한 DPPH radical cation solution 800 μL와 추출 시료 200 μL를 혼합하여 vortexing 한 후 암소에서 30분간 반응시킨 뒤 520 nm에서 optical density를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능 활성은 ascorbic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로 AA eq mg/g of residue 단위로 나타내었다.

건조 방법에 따른 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 분석

총 폴리페놀 함량은 Dewanto 등(2002)의 Folin-Ciocalteu assay 방법을 이용하여 측정하였다. 추출 시료 100 μL에 2% Na2CO3 solution 2 mL를 넣어 3분간 방치시킨 후 50% Folin-Ciocalteu phenol reagent(Sigma-Aldrich Co.)를 50 mL 첨가하여 vortexing 하였다. 암소에서 30분간 방치 후 750 nm에서 optical density를 측정하였다. Total polyphenol 함량은 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 작성한 표준곡선으로 GAE(gallic acid equivalents) mg/g 단위로 나타내었다.

플라보노이드 함량 측정을 위해 추출 시료 250 μL에 증류수 1 mL와 5% NaNO2 solution 75 μL를 첨가하여 5분간 방치하였다. 10% AlCl3 solution 150 μL와 1 M NaOH solution 500 μL를 가하고 11분 뒤 510 nm에서 optical density를 측정하였다. 플라보노이드 함량은 catechin(Sigma-Aldrich Co.)을 이용하여 작성한 표준곡선으로 CAE(catechin equivalents) mg/g 단위로 나타내었다.

건조 방법에 따른 β-glucan 함량 분석

β-Glucan 함량은 β-glucan assay kit(K-YBGL, Megazyme Inc, Bray, Ireland)을 통해 측정하였으며 total glucan contents에서 ɑ-glucan contents를 제외한 값으로 구하였다.

Total glucan contents의 측정은 가루 형태의 건표고 슬라이스 시료 90 mg에 12 M sulfuric acid 2 mL를 가하여 2시간 동안 반응시켰다. 이후 증류수 10 mL를 첨가하여 100°C에서 2시간 동안 반응시키고 8 M NaOH solution 6 mL를 첨가한 후 200 mM sodium acetate로 100 mL 정용하였다. 원심분리를 통해 회수한 상층액 0.1 mL에 exo-1,3-β-glucanase와 β-glucosidase 혼합 solution을 0.1 mL 가한 후 40°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 glucose oxidase-peroxidase(GOPOD) regent를 첨가하고 40°C에서 20분간 반응시켜 510 nm에서 optical density를 측정하였다.

ɑ-Glucan contents의 측정은 가루 형태의 시료 90 mg에 1.7 M NaOH solution 2 mL를 가하여 20분 동안 반응시켰다. 이후 1.2 M sodium acetate buffer 8 mL와 amyloglucosidase 0.2 mL를 첨가하고 40°C에서 30분 동안 반응시켰다. 원심분리를 통해 회수한 상층액을 여과시킨 후 0.1 mL에 200 mM sodium acetate buffer 0.1 mL와 GOPOD regent 3 mL를 첨가하고 40°C에서 20분간 반응시켜 510 nm에서의 optical density를 측정하였다.

최적 정전기 오일 분무 조건 확립

건표고 슬라이스의 크기에 맞춰 자른 oil test paper(5.5×1 cm)를 가로 1 cm의 간격으로 3개씩 나열한 후 electrostatic spray(SE-EB, ESS, Maxcharge)를 이용하여 팜올레인 오일을 분무하였다. 분무 조건은 90°, 55°C, 1 s를 기본으로 20 cm, 30 cm, 40 cm 거리 조건에서 분무하였다. Image J software(LOCI, University of Wisconsin, Madison, WI, USA)를 통해 가장 우수한 부착 형태를 나타낸 거리를 선발하여 65°C, 75°C, 85°C의 온도에 따른 최적 분무 조건을 확립하였다.

Image J software를 이용한 오일 부착률 분석

최적 정전기 오일 분무 조건 확립을 위해 분무된 팜올레인 오일에 의해 부착되어 변색된 oil test paper를 color scanner(SL-X4305LX, Samsung, Suwon, Korea)로 이미지화하였다. 오일이 부착된 oil test paper 이미지는 Image J software를 이용하여 8 bit의 흑백 이미지로 전환시킨 뒤 변색된 영역을 선택적으로 구분하였다. 이후 threshold 기능을 이용하여 임곗값을 조정해 팜올레인 오일의 부착 면적 및 형태를 확인하였고 analyze particles 기능을 통해 해당 pixel 값을 측정하여 droplet attachment area(pixel)/ oil test paper(pixel)×100의 계산식으로 부착률(%)을 분석하였다.

CLSM을 이용한 오일 부착률 분석

건표고 슬라이스에 rhodamine B 0.1%(w/v)가 혼합된 팜올레인 오일을 electrostatic spray와 conventional spray로 분무하였다. 이후 건조시킨 시료 단편을 confocal laser scanning microscopy(CLSM)로 561 nm 파장에서 분석하였다. CLSM을 통해 확인된 이미지는 Image J software의 흑백 이미지화 및 treshold 기능을 통해 붉은색의 형광을 나타내는 팜올레인 오일 부착 부위를 추출하여 흰색으로 시각화하였다. 이후 analyze particles 기능을 통해 pixel 값을 측정하여 attachment area(pixel)/ sample total area(pixel)×100의 계산식으로 부착률(%)을 분석하였다.

CLSM을 이용한 오일 부착 두께 분석

Rhodamine B 0.1%(w/v)를 혼합한 팜올레인 오일이 부착된 시료 단편을 CLSM의 Z-stack 기능으로 표면에서부터 내부를 600 µm씩 층층이 촬영하였다. 붉은색 형광이 나타나는 팜올레인 오일의 부착 부위를 비교함으로써 오일 부착 두께를 확인하였다.

유산균 및 오일의 부착 분석

건표고 슬라이스에 rhodamine B 0.1%(w/v)가 혼합된 팜올레인 오일과 0.01%(w/v) Flouresceinisothiocyanate(FITC, Sigma-Aldrich Co.)로 염색된 약 1.4×109 CFU/mL의 유산균을 electrostatic spray와 conventional spray (Apollo industrial Co., Ltd.)로 분무하였다. 분무된 시료는 24시간 동안 실온에서 건조시킨 뒤 단편을 CLSM으로 561 nm와 488 nm 파장에서 각각 분석 후 이미지를 overlay 하였다.

오르니틴 함량 분석

건표고 슬라이스에 팜올레인 오일이 5%, 10%, 15%, 20%(v/v)의 농도로 혼합된 유산균 발효액을 분무하였다. 유산균 발효액을 분무한 건표고 슬라이스 10 g에 증류수 15 mL를 가하여 균질화한 후 50 mL로 정용하여 177×g에서 10분 동안 원심분리하였다. 이후 상등액 1 mL를 취하여 5% TCA와 n-hexane 처리 후 0.2 μm syringe filter로 여과하여 amino acid analyzer로 분석하였다.

경도 분석

팜올레인 오일을 높은 온도에서 분무함에 따라 시료의 경도에 미치는 영향을 확인하기 위해 85°C에서 분무한 건표고 슬라이스에 대해 TPA 2 bite test로 경도를 분석하였으며 pre-test speed, test speed, post-test speed, distance, time, trigger force 조건과 probe는 건조 방법에 따른 표고버섯의 경도 측정 조건과 동일하였다.

통계처리

모든 분석은 3회 반복 실험으로 측정하였고 mean±SD로 표현하였다. 통계분석은 Statistic Analysis System Program(SAS, ver. 8.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하였으며 ANOVA 및 Duncan’s multiple range test로 유의적인 차이를 검증하였다.

결과 및 고찰

유산균의 선발 및 동정

BCP agar 배지에서 분리한 유산균에 대해 TLC를 진행하여 오르니틴 생성능을 가진 5개의 균주를 Fig. 1에 나타내었다. 분리된 균주에 대해 K939-100 ornithine assay kit을 이용하여 측정한 결과, Fig. 2와 같이 CFM02는 36.98 nmol/μL, CFM10은 38.10 nmol/μL의 오르니틴을 생성하였으며 다른 균주보다 유의적으로 많은 양의 오르니틴을 생성하였다.

Fig 1. TLC analysis of ornithine production by lactic acid bacteria isolated from kimchi.

Fig 2. Analysis of ornithine content produced by lactic acid bacteria isolated from kimchi using K939-100 ornithine assay kit. All values are means of three replicates and mean values in the bars followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).

선발된 두 균주를 API 50 CHL kit과 16s rRNA sequencing으로 동정한 결과 CFM02는 Lactobacillus koreensis, CFM10은 Pediococcus acidilactici로 판명되었다.

유산균의 생장 및 특성

생장곡선 분석 결과 Fig. 3과 같이 P. acidilactici CFM10은 접종 후부터 8시간까지 급격하게 증가하였고 L. koreensis CFM02는 접종 4시간 이후부터 16시간까지 급격하게 증가하였다. 이를 통해 P. acidilactici CFM10의 생육 속도가 비교적 빠른 것을 확인하였다. 4시간마다 측정한 균주의 생균수는 Table 2에 나타내었으며 P. acidilactici CFM10은 12시간 만에 최대 균수에 도달하였고 L. koreensis CFM02는 접종 16시간 만에 최대 균수에 도달하여 optical density value와 일치하는 경향을 나타내었다.

Table 2 . Viable cell counts of P. acidilactici CFM10 and L. koreensis CFM02 (Unit: Log CFU/mL).

TimeStrains
P. acidilactici CFM10L. koreensis CFM02
0 h8.88±0.041)7.43±0.05
4 h9.17±0.047.95±0.42
8 h9.36±0.048.24±0.07
12 h9.48±0.018.40±0.16
16 h9.43±0.028.59±0.16
20 h9.30±0.068.18±0.06
24 h9.15±0.038.08±0.06
32 h8.93±0.018.00±0.06
40 h8.70±0.057.90±0.04
48 h8.61±0.017.85±0.05

1)All values are mean±SD (n=3)..



Fig 3. Growth curve for P. acidilactici CFM10 and L. koreensis CFM02.

내산성 및 내담즙성 결과는 Fig. 4에 나타내었으며 pH 7에서는 P. acidilactici CFM10과 L. koreensis CFM02 모두 생존률이 90% 이상이었으나 pH 3에서 크게 감소하여 각각 27%, 21%를 나타내었다. 담즙산 내성은 0.3% bile salt에서 60%와 40%, 0.6%에서는 40%와 29%, 1%에서는 20%와 19%의 생존률을 나타내었다. pH 2를 제외한 모든 조건에서 P. acidilactici CFM10이 비교적 우수한 내성을 가진 것으로 나타났다. 이러한 결과는 Pediococcus spp.가 Lactobacillus spp.보다 우수한 내산성 및 담즙산 내성을 갖는다는 Kang 등(2002)Kim(2020)의 연구 결과와 일치하는 경향을 보였다.

Fig 4. Acid tolerance and bile salt resistance of P. acidilactici CFM10 and L. koreensis CFM02. All values expressed as the mean±SD of three replicates (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).


유기산 측정 결과는 Fig. 5에 나타내었으며 P. acidilactici CFM10은 lactic acid 270.46 mM, acetic acid 62.01 mM, propionic acid 6.53 mM을 생성하였고 butyric acid는 검출되지 않았다. L. koreensis CFM02는 lactic acid 134.67 mM, acetic acid 65.20 mM, propionic acid 6.72 mM, butyric acid 31.93 mM을 생성하였다. P. acidilactici CFM10은 L. koreensis CFM02보다 2배 이상의 많은 lactic acid를 생성하였지만 butyric acid는 전혀 생성하지 않은 것으로 나타났다. L. koreensis CFM02에서만 생성된 butyric acid는 발효식품인 청국장의 valeric acid와 발효 과정에서 생성되는 alkylpyrazine과 함께 이취 요인으로 작용할 수 있다(Choi 등, 1998).

Fig 5. Organic acid production of P. acidilactici CFM10 and L. koreensis CFM02. All values expressed as the mean±SD of three replicates (*P<0.05, ***P<0.001).


P. acidilactici CFM10은 L. koreensis CFM02보다 높은 오르니틴 생성 능력, 빠른 생육 속도, 비교적 우수한 내산성 및 내담즙성 그리고 butyric acid를 생성하지 않는다는 특성을 고려하여 오르니틴 생성을 위한 최종 유산균 균주로 선발하였다.

식물성 원료 추출물 배지의 배양에 따른 유리 아미노산 함량

식물성 원료 추출물 배지의 배양에 따른 유리 아미노산 함량은 Table 3에 나타내었다. Phenylalanine은 땅콩을 제외한 서목태, 호박씨, 단호박 추출물에서 0.83 mg/L 이하의 함량이 나타났으며 tyrosine은 모든 추출물에서 3.90 mg/L 이하의 함량이 나타났다. 모든 원료에서 phenylalanine과 tyrosine의 낮은 함량이 나타났는데, 이는 발효 중 Pediococcus acidilactici의 생육과 젖산 생성에 있어 phenylalanine과 tyrosine이 필수적이라는 Sriphochanart와 Skolpap(2011)의 연구 결과와 일치하는 경향을 보였다.

Table 3 . Amino acid content of Seomoktae, pumpkin seeds, peanuts, and sweet pumpkin extracts after fermentation of P. acidilactici CFM10 (Unit: mg/L).

MaterialSeomoktae extractPumpkin seed extractPeanut extractSweet pumpkin extract
Time24 h48 h24 h48 h24 h48 h24 h48 h
PheND1)ND0.83±0.03cND20.42±0.01a18.23±0.02bNDND
TyrNDND3.15±0.01cND3.90±0.03a3.46±0.02bNDND
Arg1.20±0.01a2)1.19±0.01aNDNDNDNDNDND
Orn382.76±0.05b414.33±0.02a115.25±0.03g120.20±0.04e237.47±0.01d242.73±0.02c104.40±0.03h116.15±0.02f

1)Not detected..

2)All values are means of three replicates and mean values in a column followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test)..



Arginine의 함량은 원료 추출물 중 서목태에서만 1.19~1.20 mg/L로 검출되었으며 다른 원료 추출물에서는 검출되지 않았다. 이는 P. acidilactici CFM10의 ADI pathway에 의해 arginine을 분해하여 오르니틴을 생성한 것으로 보인다(Jung 등, 2016).

오르니틴 함량은 원료 중 서목태 발효물이 가장 높은 함량을 보였으며 24시간에서 382.76 mg/L, 48시간에서 414.33 mg/L로 나타났다.

서목태 열수 추출물은 가장 높은 arginine의 함량과 오르니틴 생성량 그리고 유산균이 이용 가능한 유리 아미노산의 함량이 높아 서목태를 오르니틴 생성을 위한 식물성 배지 원료로 선정하였다.

L-Arginine 첨가량에 따른 유리 아미노산 함량

서목태 열수 추출물에 L-arginine monohydrochloride를 농도별로 첨가한 결과 Table 4와 같이 arginine의 첨가량이 많아질수록 citrulline과 오르니틴의 함량 역시 비례하여 유의적으로 높아졌다. 그중 0.8% arginine을 첨가한 경우 arginine이 3,624.32 mg/L, 오르니틴이 1,731.92 mg/L로 arginine과 ornithine이 2:1 비율로 나타났다.

Table 4 . Amino acid content of Seomoktae extract due to the amount of arginine added.

Addition amount (w/v)Amino acid concentration (mg/L)
ArginineCitrullineOrnithine
No addition1.20±0.03f1)82.00±0.01f382.76±0.04f
0.2% Arg54.60±0.02e547.46±0.06e1,229.72±0.03e
0.4% Arg625.10±0.03d992.51±0.08d1,669.40±0.01d
0.6% Arg2,093.10±0.02c1,041.29±0.07c1,688.95±0.12c
0.8% Arg3,624.32±0.01b1,128.29±0.01b1,731.92±0.07b
1.0% Arg5,315.90±0.02a1,149.36±0.04a1,737.98±0.12a

1)All values are means of three replicates and mean values in a column followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test)..



Arginine과 ornithine의 2:1 비율은 식이 보충제에 널리 이용되고 있으며 혈중 nitric oxide(NO)의 생성과 혈관 확장에 관여하여 각종 심혈관계질환 및 발기부전을 개선할 수 있고 운동 퍼포먼스와 근력 향상을 포함한 여러 생리활성 기능에 도움을 준다고 알려져 있다(Elam 등, 1989; Müting 등, 1992; Robinson 등, 1999; Yu 등, 2009).

0.8% arginine이 첨가된 추출물은 기존 추출물보다 약 4.5배 높은 오르니틴 함량을 나타냈으며 동시에 혈류 장애 개선을 포함한 다양한 생리활성 기능에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대되어 0.8% arginine이 첨가된 서목태 열수 추출물을 최종 배지 원료로 선택하였다.

건조 방법에 따른 경도 분석

표고버섯의 원물과 각 건조 방법에 따른 경도 분석 결과는 Table 5에 나타내었다. 원물, 천일건조, 열풍건조, 동결건조에 따른 표고버섯의 경도는 유의적으로 높아졌으며 동결건조 시료는 1,528.90 g의 경도를 나타냈다.

Table 5 . Hardness of shiitake slice according to drying method using TPA 2 bite test.

Dry typeHardness (g)
Raw392.07±9.35a1)2)
Sun drying981.70±15.95b
Hot air drying1,031.73±20.2c
Freeze drying1,528.90±27.25d

1)All values are expressed as the mean±SD of three replicates..

2)All values are means of three replicates and mean values in a column followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test)..



Ha 등(2001)의 연구에 따르면 양송이버섯을 대상으로 열풍건조에서 건조 온도가 높을수록 경도가 증가하는 경향이 나타났고 동결건조는 비교적 열풍건조에 비해 경도의 변화가 적었으며, 이러한 경향은 버섯의 조직 내부가 다공성 구조로 이루어졌기 때문이라 사료되었다. 이러한 경향과 반대로 본 연구에서는 열풍건조가 동결건조보다 낮은 경도를 보였는데, 이는 열풍건조 온도가 비교적 낮고 동결건조 시료의 건조 시간이 비교적 길었기 때문이라고 사료된다.

건조 방법에 따른 항산화 활성 분석

건조 방법에 따른 표고버섯의 항산화 활성 분석 결과는 Fig. 6에 나타내었다. ABTS 라디칼 소거 활성은 천일건조 3.49 AA eq mg/g of residue, 열풍건조 6.26 AA eq mg/g of residue, 동결건조 7.02 AA eq mg/g of residue로 나타났으며, 동결건조한 표고버섯에서 가장 높았다.

Fig 6. Radical scavenging activity of shiitake due to drying method. All values are means of three replicates and mean values in the same bar followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).

DPPH 라디칼 소거 활성은 천일건조 2.78 AA eq mg/g of residue, 열풍건조 2.53 AA eq mg/g of residue, 동결건조 3.02 AA eq mg/g of residue로 나타났으며, ABTS 라디칼 소거능과 동일하게 동결건조한 표고버섯에서 가장 높았다.

Kim 등(2012)과 Pérez Martínez 등(2015)은 버섯의 열풍건조 시 비교적 높은 온도로 인해 캐러멜화, 마이야르 반응, 효소 반응, 색소 분해 및 ascorbic acid의 산화가 일어나 품질이 저하되고 ascorbic acid를 비롯한 항산화 물질의 활성이 저하된다고 보고하였으며, 이러한 현상은 본 연구에서 열풍건조한 표고버섯이 동결건조한 표고버섯보다 항산화 활성이 낮게 나타난 원인으로 사료된다.

총 폴리페놀, 플라보노이드 및 β-glucan 함량

총 폴리페놀 함량 및 플라보노이드 함량은 Fig. 7에 나타내었다. 총 폴리페놀 함량은 천일건조 1.89 GAE mg/g, 열풍건조 4.41 GAE mg/g, 동결건조 13.86 GAE mg/g으로 나타났으며 동결건조 표고버섯에서 가장 높게 나타났다. Choi 등(2014)의 연구에 따르면 버섯을 열풍건조할 경우 온도가 높을수록 총 폴리페놀 함량 역시 증가하지만 40~50°C 온도의 열풍건조의 경우 동결건조한 표고버섯보다 총 폴리페놀 함량이 더욱 낮았으며 이는 본 연구 결과와 일치하는 경향을 보였다.

Fig 7. Total polyphenol and flavonoid content of shiitake due to drying method. The standard for total polyphenols is gallic acid and the standard for flavonoids is catechin. All values are means of three replicates and mean values in the same bar followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).

플라보노이드 함량은 천일건조 3.92 CAE mg/g, 열풍건조 9.51 CAE mg/g, 동결건조 7.24 CAE mg/g으로 나타났으며 열풍건조한 표고버섯에서 가장 높게 나타났다. Peleg 등(1991)은 버섯에 대한 열처리는 세포벽을 파괴하여 플라보노이드를 더욱 쉽게 시킨다고 보고하였으며, 이러한 현상은 열풍건조한 표고버섯에서 가장 높은 플라보노이드 함량이 나타난 본 연구 결과의 원인으로 사료된다.

β-Glucan의 함량은 Fig. 8에 나타내었다. β-Glucan의 함량은 천일건조 22.84%(w/w), 열풍건조 29.64%(w/w), 동결건조 32.38%(w/w)로 나타났으며 건조 방법에 따라 유의적인 차이를 나타내었다. 이러한 결과는 열풍건조보다 동결건조한 표고버섯에서 더욱 높은 β-glucan 함량이 나타난다고 보고한 Je 등(2018)의 연구 결과와 일치하는 경향을 보였다.

Fig 8. β-Glucan content of shiitake due to drying method. All values are means of three replicates and mean values in the bars followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).

동결건조를 통한 표고버섯은 천일건조 및 열풍건조보다 높은 경도, 항산화 활성, 총 폴리페놀 함량, β-glucan 함량이 분석되어 이를 시료 제조의 건조 방법으로 선정하였다.

최적 정전기 오일 분무 조건 확립

최적 정전기 분무 조건 확립을 위한 Image J software 분석 결과는 Fig. 9에 나타내었다. 40 cm 거리에서 oil test paper의 가장 고른 오일 부착 형태를 확인할 수 있었으며 이후 온도가 증가함에 따라 부착률이 비례적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 85°C에서는 모든 oil test paper의 부착률이 98%로 확인되었으며 최적 정전기 오일 분무 조건은 90°, 40 cm, 85°C, 1 s 조건으로 확립하였다.

Fig 9. Image of oil attached by electrostatic spraying according to distance, temperature, conditions on paper of dried shiitake slice.

CLSM을 이용한 오일 부착률 분석

CLSM을 통한 오일 부착률 분석 결과는 Fig. 10에 나타내었다. Conventional spray로 분무한 시료 단편 전체는 1,654,419 pixel로 측정되었고 오일 부착 부위는 498,857 pixel로 측정되었으며 부착률은 약 30.15%로 나타났다. Electrostatic spray로 분무한 건표고 시료 단편 전체는 1,636,977 pixel로 측정되었고 오일 부착 부위는 978,896 pixel로 측정되어 부착률은 약 59.80%로 나타났다. CLSM을 통한 오일 부착률 분석에서는 electrostatic spray가 conventional spray보다 약 29% 높은 부착률을 나타내었으며 CLSM을 통한 분석에서도 정전기 분무가 기존의 분무 방식보다 더욱 균일하고 효율적인 오일 분무 방식이라는 것을 확인할 수 있었다.

Fig 10. Analysis of oil adhesion rate of dried shiitake slice due to conventional spraying and electrostatic spraying by CLSM. attachment image at 25× magnification of palm olein oil stained with rhodamine B at 561 nm. (A) Image of shiitake mushroom with oil attached. (B) Extraction image of the oil attachment site. All values are expressed as the mean±SD of three replicates.

CLSM을 이용한 오일 부착 두께 분석

CLSM을 통한 오일 부착 두께 분석 결과는 Fig. 11에 나타내었다. Conventional spray로 오일을 분무한 시료 단편을 표면에서부터 내부로 600 μm씩 관찰한 결과 0 μm, 600 μm, 1,200 μm 내부에서 동일한 위치에 오일이 겹쳐 부착된 것을 확인할 수 있었다. 반면 electrostatic spray로 오일을 분무한 시료 단편에서는 0 μm, 600 μm, 1,200 μm에서 내부에서 각각 동일한 위치에 오일이 겹치지 않은 형태로 부착된 것을 확인할 수 있었다.

Fig 11. Oil coationg thickness analysis of dried shiitake slice by conventional spraying and electrostatic spraying by Z-stack of CLSM. Surface (0 μm), 600 μm, 1,200 μm internal 25× magnification images of dried shiitake mushrooms with palm olein oil mixed with rhodamine B.

따라서 electrostatic spray를 이용한 정전기 오일 분무는 기존의 오일 분무 방식보다 팜올레인 오일이 더욱 고르고 얇은 두께의 코팅을 가능하게 한다고 사료된다.

유산균 및 오일의 부착 분석

유산균 및 오일의 부착 형태 분석은 Fig. 12에 나타내었다. Conventional spray에서는 488 nm에서 녹색 형광으로 관찰된 P. acidilactici CFM10과 561 nm에서 붉은 형광으로 관찰된 팜올레인 오일의 부착 정도가 비교적 낮은 형태로 나타났다.

Fig 12. Attachment images of P. acidilactici CFM10 and palm olein oil on dried shiitake slice by conventional and electrostatic spraying by CLSM at 25× magnification. (A) Attachment image of P. acidilactici CFM10 stained with FITC at 488 nm. (B) Attachment image of palm olein oil stained with rhodamine B at 561 nm. (C) Overlay image of P. acidilactici CFM10 and palm olein oil attached to dried shiitake slice.


이와 달리 electrostatic spray에서는 P. acidilactici CFM10과 팜올레인 오일의 부착 정도가 높은 것으로 나타났으며 유산균과 오일 모두 기존 분무 방식에 비해 정전 분무 방식에서에서 높은 부착 정도의 형태를 나타내었다.

오르니틴 함량 분석

오르니틴 함량은 Table 6과 같이 팜올레인 오일에 혼합된 오르니틴 발효물의 농도가 증가할수록 건표고 슬라이스에 함유된 오르니틴의 함량 역시 증가하였으며, 모든 농도에서 conventional spray보다 electrostatic spray에서 유의적으로 높은 함량이 나타났다. 일반 분무와 정전 분무 간의 오르니틴 함량 차이는 5%에서 115.20 mg/g, 10%에서 146.38 mg/g, 15%에서 138.83 mg/g, 20%에서 248.98 mg/g으로 나타났으며, 이는 정전 분무의 Coulomb’s law 특성에 의한 강한 정전기적 부착 인력과 이에 따른 분무액의 공기 중 비산 및 지면 침착 손실 감소로 인한 결과라고 사료된다.

Table 6 . Ornithine contents attached to dried shiitake by conventional spraying and electrostatic spraying methods at different concentration levels of fermented ornithine broth (Unit: mg/g).

Ornithine fermentation broth (%)Conventional sprayElectrostatic spray
5%139.90±3.47a1)2)255.10±2.32a
10%163.78±3.85b310.16±5.23b
15%192.81±4.32c331.64±0.47c
20%227.50±4.61d476.48±3.67d

1)All values are expressed as the mean±SD of three replicates..

2)All values are means of three replicates and mean values in a column followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test)..



경도 분석

TPA 2 bite test로 경도를 분석한 결과는 Table 7에 나타내었다. 팜올레인 오일을 분무함에 따라 경도가 낮아진 것을 확인할 수 있었으며 45°C보다 85°C에서의 경도는 낮았지만, 유의적인 차이는 나타나지 않았다.

Table 7 . Hardness of shiitake slice due to oil spray temperature using TPA test.

Temperature conditionDried shiitake slice hardness (g)
Control1,528.90±27.25a1)2)
Electrostatic spraying 45°C1,126.631±19.52b
Electrostatic spraying 85°C1,115.90±24.74b

1)All values are expressed as the mean±SD of three replicates..

2)All values are means of three replicates and mean values in a column followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test)..



경도는 깨진 시료를 probe가 누르며 deformation이 98%에 도달했을 때 걸리는 힘을 나타내기 때문에 시료 내부로 침투된 오일의 영향을 받으며, 이로 인해 오일 분무에 따라 경도가 감소한 것이라 사료된다.

건표고 슬라이스의 85°C 분무가 45°C의 분무와 경도에서 유의적인 차이를 나타내지 않았기 때문에 높은 분무 온도에 의한 제품의 식감에는 실질적인 차이가 없을 것이라 사료된다.

요 약

본 연구에서는 다양한 생리활성 기능을 갖는 오르니틴을 유산균을 통해 생성하여 식품에 첨가하기 위해 오르니틴 생성능이 우수한 균주인 L. koreensis CFM02와 P. acidilactici CFM10을 김치로부터 분리하였다. P. acidilactici CFM10은 Generally recognized as safe(GRAS)로 인정된 균주로 L. koreensis CFM02보다 생육 속도가 빠르고 내산성 및 담즙산 내성이 우수하였으며, 이취를 발생시킬 수 있는 butyric acid를 생성하지 않았기 때문에 오르니틴 생성 유산균으로 P. acidilactici CFM10을 선정하였다. P. acidilactici CFM10 균주는 서목태 추출물에서 오르니틴 생산량이 가장 높았으며 0.8%(w/v) arginine 첨가 시 arginine과 오르니틴이 2:1 비율로 생성되어 0.8%(w/v) arginine을 최적 첨가 농도로 선정하였다. 동결건조를 통한 표고버섯은 천일건조 및 열풍건조보다 높은 경도, 항산화 활성, 총 폴리페놀 함량, β-glucan 함량이 분석되어 이를 건조 방법으로 선정하였다. Electrostatic spray와 oil test paper를 통한 건표고 슬라이스의 최적 정전기 오일 분무 조건은 90°, 40 cm, 90~85°C, 1 s 조건으로 확립되었다. CLSM을 통한 분석 결과 electrostatic spray는 conventional spray보다 부착률이 29% 높았으며 Z-stack 기능을 통한 내부 분석 결과 electrostatic spray에서 팜올레인 오일이 600 μm 이하로 더욱 얇게 코팅되었다. 건표고 슬라이스에 electrostatic spray로 분무한 경우 conventional spray로 분무했을 때 더욱 높은 오르니틴 함량이 나타났으며, 85°C의 고온에서 오일을 분무하여도 제품 경도에 유의적인 영향은 미치지 않았다. 본 연구를 통해 오르니틴이 함유되어 영양학적으로 가치가 높은 건표고 슬라이스 제품과 이에 따른 정전기 오일 분무 공정을 개발하였다. 정전기 오일 분무 공정의 개발은 오일을 포함한 분무액과 원가를 절감하고 제품의 품질을 향상시킬 수 있을 것으로 기대되며, 본 연구는 식품 산업에서 보다 효율적인 오일 코팅 공정 개발의 토대가 될 수 있을 것으로 생각된다.

감사의 글

이 논문은 2021(2차)년도 바이오헬스산업 핵심기술개발 및 지원사업(1345341783)의 연구수행으로 인한 결과물임을 밝힙니다.

Fig 1.

Fig 1.TLC analysis of ornithine production by lactic acid bacteria isolated from kimchi.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 1091-1102https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.10.1091

Fig 2.

Fig 2.Analysis of ornithine content produced by lactic acid bacteria isolated from kimchi using K939-100 ornithine assay kit. All values are means of three replicates and mean values in the bars followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 1091-1102https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.10.1091

Fig 3.

Fig 3.Growth curve for P. acidilactici CFM10 and L. koreensis CFM02.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 1091-1102https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.10.1091

Fig 4.

Fig 4.Acid tolerance and bile salt resistance of P. acidilactici CFM10 and L. koreensis CFM02. All values expressed as the mean±SD of three replicates (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 1091-1102https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.10.1091

Fig 5.

Fig 5.Organic acid production of P. acidilactici CFM10 and L. koreensis CFM02. All values expressed as the mean±SD of three replicates (*P<0.05, ***P<0.001).
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Fig 6.

Fig 6.Radical scavenging activity of shiitake due to drying method. All values are means of three replicates and mean values in the same bar followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 1091-1102https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.10.1091

Fig 7.

Fig 7.Total polyphenol and flavonoid content of shiitake due to drying method. The standard for total polyphenols is gallic acid and the standard for flavonoids is catechin. All values are means of three replicates and mean values in the same bar followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 1091-1102https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.10.1091

Fig 8.

Fig 8.β-Glucan content of shiitake due to drying method. All values are means of three replicates and mean values in the bars followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 1091-1102https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.10.1091

Fig 9.

Fig 9.Image of oil attached by electrostatic spraying according to distance, temperature, conditions on paper of dried shiitake slice.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 1091-1102https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.10.1091

Fig 10.

Fig 10.Analysis of oil adhesion rate of dried shiitake slice due to conventional spraying and electrostatic spraying by CLSM. attachment image at 25× magnification of palm olein oil stained with rhodamine B at 561 nm. (A) Image of shiitake mushroom with oil attached. (B) Extraction image of the oil attachment site. All values are expressed as the mean±SD of three replicates.
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Fig 11.

Fig 11.Oil coationg thickness analysis of dried shiitake slice by conventional spraying and electrostatic spraying by Z-stack of CLSM. Surface (0 μm), 600 μm, 1,200 μm internal 25× magnification images of dried shiitake mushrooms with palm olein oil mixed with rhodamine B.
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Fig 12.

Fig 12.Attachment images of P. acidilactici CFM10 and palm olein oil on dried shiitake slice by conventional and electrostatic spraying by CLSM at 25× magnification. (A) Attachment image of P. acidilactici CFM10 stained with FITC at 488 nm. (B) Attachment image of palm olein oil stained with rhodamine B at 561 nm. (C) Overlay image of P. acidilactici CFM10 and palm olein oil attached to dried shiitake slice.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 1091-1102https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.10.1091

Table 1 . Ingredients of ornithine reaction mix and background control mix.

IngredientsReaction mixBackground mix
Ornithine assay buffer38 μL44 μL
Diluted ornithine converter mix6 μL
Ornithine enzyme mix2 μL2 μL
Ornithine developer mix2 μL2 μL
Diluted ornithine probe2 μL2 μL

Table 2 . Viable cell counts of P. acidilactici CFM10 and L. koreensis CFM02 (Unit: Log CFU/mL).

TimeStrains
P. acidilactici CFM10L. koreensis CFM02
0 h8.88±0.041)7.43±0.05
4 h9.17±0.047.95±0.42
8 h9.36±0.048.24±0.07
12 h9.48±0.018.40±0.16
16 h9.43±0.028.59±0.16
20 h9.30±0.068.18±0.06
24 h9.15±0.038.08±0.06
32 h8.93±0.018.00±0.06
40 h8.70±0.057.90±0.04
48 h8.61±0.017.85±0.05

1)All values are mean±SD (n=3)..


Table 3 . Amino acid content of Seomoktae, pumpkin seeds, peanuts, and sweet pumpkin extracts after fermentation of P. acidilactici CFM10 (Unit: mg/L).

MaterialSeomoktae extractPumpkin seed extractPeanut extractSweet pumpkin extract
Time24 h48 h24 h48 h24 h48 h24 h48 h
PheND1)ND0.83±0.03cND20.42±0.01a18.23±0.02bNDND
TyrNDND3.15±0.01cND3.90±0.03a3.46±0.02bNDND
Arg1.20±0.01a2)1.19±0.01aNDNDNDNDNDND
Orn382.76±0.05b414.33±0.02a115.25±0.03g120.20±0.04e237.47±0.01d242.73±0.02c104.40±0.03h116.15±0.02f

1)Not detected..

2)All values are means of three replicates and mean values in a column followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test)..


Table 4 . Amino acid content of Seomoktae extract due to the amount of arginine added.

Addition amount (w/v)Amino acid concentration (mg/L)
ArginineCitrullineOrnithine
No addition1.20±0.03f1)82.00±0.01f382.76±0.04f
0.2% Arg54.60±0.02e547.46±0.06e1,229.72±0.03e
0.4% Arg625.10±0.03d992.51±0.08d1,669.40±0.01d
0.6% Arg2,093.10±0.02c1,041.29±0.07c1,688.95±0.12c
0.8% Arg3,624.32±0.01b1,128.29±0.01b1,731.92±0.07b
1.0% Arg5,315.90±0.02a1,149.36±0.04a1,737.98±0.12a

1)All values are means of three replicates and mean values in a column followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test)..


Table 5 . Hardness of shiitake slice according to drying method using TPA 2 bite test.

Dry typeHardness (g)
Raw392.07±9.35a1)2)
Sun drying981.70±15.95b
Hot air drying1,031.73±20.2c
Freeze drying1,528.90±27.25d

1)All values are expressed as the mean±SD of three replicates..

2)All values are means of three replicates and mean values in a column followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test)..


Table 6 . Ornithine contents attached to dried shiitake by conventional spraying and electrostatic spraying methods at different concentration levels of fermented ornithine broth (Unit: mg/g).

Ornithine fermentation broth (%)Conventional sprayElectrostatic spray
5%139.90±3.47a1)2)255.10±2.32a
10%163.78±3.85b310.16±5.23b
15%192.81±4.32c331.64±0.47c
20%227.50±4.61d476.48±3.67d

1)All values are expressed as the mean±SD of three replicates..

2)All values are means of three replicates and mean values in a column followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test)..


Table 7 . Hardness of shiitake slice due to oil spray temperature using TPA test.

Temperature conditionDried shiitake slice hardness (g)
Control1,528.90±27.25a1)2)
Electrostatic spraying 45°C1,126.631±19.52b
Electrostatic spraying 85°C1,115.90±24.74b

1)All values are expressed as the mean±SD of three replicates..

2)All values are means of three replicates and mean values in a column followed by different superscript letters are significantly (P<0.05) different (Duncan’s multiple range test)..


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