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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(10): 1036-1047

Published online October 31, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.10.1036

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Screening of Food-Derived Plant Extracts to Promote Proliferation of Hanwoo Satellite Cells

In-sun Yu1,2 , Sang Yoon Choi3, Jungseok Choi4, Mina K. Kim2, and Min Jung Kim1

1Research Group of Aging and Metabolism and 3Research Group of Functional Food Materials,
Research Division of Food Functionality, Korea Food Research Institute
2Department of Food Science and Human Nutrition, Jeonbuk National University
4Department of Animal Science, Chungbuk National University

Correspondence to:Min Jung Kim, Research Group of Aging and Metabolism, Korea Food Research Institute, 245, Nongsaengmyeong-ro, Iseo-myeon, Wanju-gun, Jeonbuk 55365, Korea, E-mail: mjkim14@kfri.re.kr

Received: May 24, 2022; Revised: July 30, 2022; Accepted: July 31, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Recently, cultured meat has been considered as an alternative food source. However, the commercialization of cultured meat essentially requires the development of serum-free or low-serum media that reduces production costs. This study aimed to discover a food-derived plant extract that can maintain cell proliferation in Hanwoo satellite cells (HWSC) subsequent to reducing the amount of fetal bovine serum (FBS) by half. Totally, 115 plants were extracted by ethanol and hot water. In the primary screening, compared with the control containing 20% FBS, the proliferation rate of HWSC was screened for 230 extracts treated in a medium containing 10% FBS for 6 days. Of the 230 extracts, four ethanol extracts and four hot water extracts showed proliferation rates similar to the control. In the secondary screening, these eight extracts were subjected to surface plasmon resonance to select the extracts that directly bind to MyoD and Pax7 proteins, which are involved in the proliferation of muscle satellite cells. Of these, Pyrus pyrifolia and Hordeum vulgare, were determined to bind directly to the MyoD and Pax7 proteins. The two extracts promoted HWSC proliferation in a dose-dependent manner (25∼200 μg/mL) and exerted no negative effects on differentiation. Finally, the proliferation efficacy results were classified according to the extracted plant parts and the extraction methods. Three plant parts (the fruiting body, root, and stem) and the ethanol extraction method showed good proliferative efficacy. The results of this study can be used as basic data for research on the production of culture media for cultured meat.

Keywords: cultured meat, Hanwoo satellite cells, food-derived plant extract, proliferation, screening

전 세계적인 인구 증가로 인하여 2050년에는 70%가 증가한 더 많은 식량이 필요할 것으로 예측되는 가운데(Dias 등, 2021), 세계 육류 소비량 또한 현재보다 증가하여 2030년에는 2018~2020년도 대비 14% 증가할 것으로 예상된다(OECD와 FAO, 2021). 국내 또한 1인당 연간 육류 소비량이 해마다 증가하여 최근 9년(2010~2019) 동안 연간 약 4%씩 증가하는 것으로 나타났다(Jeong 등, 2020). 그러나 한정된 자원은 증가하는 식량 수요를 충족시킬 수 없기 때문에 새로운 단백질 공급원에 대한 니즈가 존재하고, 그 대안책으로 주목받고 있는 것 중 하나가 배양육이다. 배양육은 동물에서 채취한 줄기세포를 실험실에서 세포배양 및 조직배양기술을 활용하여 생산된다. 배양육은 동물 도축 없이 소량의 근육세포만을 채취하여 사용하기 때문에, 기존 축산법 대비 동물복지를 실현할 수 있을 뿐만 아니라 더 짧은 시간에 대량생산이 가능하다는 장점이 있다(Jeong 등, 2020). 또한, 공장식 축산 시스템하에서 발생하는 온실가스 배출 등의 환경오염과 인수공통전염병 등의 질병 발생 위험성을 현저히 줄일 수 있는 장점도 가지고 있다(Pluhar, 2010).

배양육 연구에 주로 사용되는 세포는 근육의 줄기세포라고 불리는 근육위성세포(muscle satellite cells)로, 근섬유막(sarcolemma)과 기저막(base lamina) 사이에 존재한다(Yin 등, 2013). 손상되지 않은 위성세포는 대부분 진행이 중단된 상태로 존재하다가 스트레스나 부상과 같은 외부 자극이 발생하게 되면 활성화된다. 이후 증식과 분화과정을 거치며 myoblast, myocyte, myotube를 차례로 형성하며 손상된 근육을 regeneration 시킨다(Yin 등, 2013; Laumonier 등, 2017; Massenet 등, 2021). 근육위성세포의 증식 및 분화과정에서 호르몬과 성장인자(growth factor) 등의 공급이 필요한데, 이때 주로 사용되는 배양액이 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이다. FBS는 세포 성장에 필수적인 호르몬, 성장인자, cytokine, 단백질 등을 포함하고 있기 때문에 세포 배양에 널리 사용되고 있다(Choi, 2020). 하지만 FBS는 가격이 매우 비싸고 배양육 생산비용의 80%를 차지하고 있을 정도로 배양육 원가 절감의 허들로 작용하고 있다(Choudhury 등, 2020). 그뿐만 아니라 FBS는 임신 기간 중 송아지의 탯줄 혈액으로부터 채취하기 때문에 윤리적인 문제가 존재한다(Chase 등, 2010). 따라서 배양육을 지속 가능한 미래 식량자원으로 저렴하게 대량 증식하기 위해서는 FBS 대체물 또는 첨가물 발굴이 강력히 요구된다.

식물추출물은 FBS 대체물 또는 첨가물로 사용할 수 있는 물질이다. 식물추출물은 원료 획득이 용이하고 저렴한 비용 덕분에 비용절감의 효과가 크며, FBS에 비해 윤리적 문제에서도 자유로울 수 있다(Williams 등, 2006). 또한 다양한 식물 또는 생약들은 지난 수 세기 동안 연구되어왔고 대한민국약전외한약(생약)규격집, Traditional Chinese medicine, 그리고 Ayurveda 등에 약리적 효능이 알려져 있을 뿐만 아니라 안전성 기준이 확보되어있는 이점이 있다(Atanasov 등, 2015). 그러나 동일한 식물에서 추출한 추출물이라고 하더라도 추출한 식물 부위, 추출 용매, 채집 장소, 채집 시기 등에 따라 영양 성분의 함량이나 생리 활성 정도가 다르게 나타난다(Atanasov 등, 2015). 따라서 다양한 효능이 있는 소재를 발굴하기 위해서는 다양한 추출 조건하에서도 연구를 진행할 필요가 있다.

본 연구에서는 다양한 추출물들을 활용하여 배양배지에서 FBS 양을 50% 감소시켰지만, 증식능은 기존 배양배지와 유사한 수준으로 근육위성세포의 증식을 촉진하는 식물추출물을 발굴하고자 한다. 세포는 한우에서 추출한 근육위성세포(Hanwoo satellite cell; HWSC)를 사용하였고, 추출물은 115종의 식물에서 추출한 열수추출물과 주정추출물을 사용하였다. 증식 효능이 우수한 추출물에 대해서는 분화 여부도 확인하였다. 본 연구 결과는 천연물 소재의 FBS 대체 가능성을 확인하고 배양육 배지 제조의 기초자료로써 활용하고자 한다.

추출물 준비

본 연구에서 사용된 식품 유래 식물 추출물은 한국식품연구원 소재은행 라이브러리에서 제공받았다(Table 1). 추출물 제조방법은 다음과 같다. 주정추출물은 115개의 건조시료 100 g에 1 L의 70% 주정을 넣고 50°C에서 3시간 동안 2번 반복 추출한 뒤, 상등액 여과 후 감압 농축 및 동결 건조하여 획득하였다. 열수추출물은 건조시료 100 g에 증류수 1 L를 넣고 100°C에서 3시간 동안 2번 반복 추출한 뒤, 상등액 여과, 감압 농축 및 동결건조 순으로 진행한 후 획득하였다(Fig. 1A).

Table 1 . Sources of food-derived plant extracts

NoPlant speciesPart usedHabitat locationYear gathered
1Lycium chinenseFruitsCheongyang, Chungcheongnam-do2018
2Cornus officinalisFruitsGurye, Jeollanam-do2017
3Brassica napusSeedsJindo, Jeollanam-do2018
4Paeonia lactifloraRootsYeongju, Gyeongsangbuk-do2018
5Fagopyrum tartaricum GaerthFruitsYeongwol, Gangwon-do2018
6Schisandra chinensisFruitsMungyeong, Gyeongsangbuk-do2018
7Momordica charantiaFruitsYangju, Gyeonggi-do2018
8Glycyrrhiza uralensisRootsYeongwol, Gangwon-do2017
9Coix lachrymajobi var. mayuenFruitsYeongwol, Gangwon-do2018
10Astragalus membranaceusRootsYeongwol, Gangwon-do2018
11Ziziphus jujubaFruitsBoeun, Chungcheongbuk-do2018
12Poncirus trifoliataFruitsGeochang, Gyeongsangnam-do2018
13Cirsium setidensLeaves, RootsJeongseon, Gangwon-do2018
14Raphanus sativusRootsSeogwipo, Jeju Island2018
15Raphanus sativusLeaves, RootsSeogwipo, Jeju Island2018
16Achyranthes japonica NakaiRootsYeongwol, Gangwon-do2018
17Vigna angularisFruitsYeongwol, Gangwon-do2018
18Hordeum vulgareLeavesAnseong, Gyeonggi-do2019
19Aronia melanocarpaFruitsBoryeong, Chungcheongnam-do2018
20Sesamum indicumSeedsGochang, Jeollabuk-do2018
21Aralia cordata Thunb. var. continentalisRootsGeochang, Gyeongnam2018
22Ligularia fischeriLeavesHongcheon, Gangwon-do2018
23Nelumbo nucifera GaertnRootsDalseong, Daegu2019
24Eucommia ulmoidesStemsGeochang, Gyeongnam2018
25Fallopia multifloraRootsGeochang, Gyeongnam2018
26Gastrodia elata BL.StemsGeochang, Gyeongnam2018
27Phellinus linteusFruiting bodiesSancheong, Gyeongsangnam-do2019
28Hericium erinaceumFruiting bodiesPaju, Gyeonggi-do2019
29Hippophae rhamnoidesFruitsHoengseong, Gangwon-do2018
30Hippophae rhamnoidesLeavesHoengseong, Gangwon-do2018
31Panax ginseng CA MeyerFruitsJeongseon, Gangwon-do2018
32Lentinula edodes (Berk.) PeglerFruiting bodiesGongju, Chungcheongnam-do2019
33Opuntia humifusaLeaves, RootsYeongdeok, Gyeongsangbuk-do2018
34Platycodon grandiflorumRootsSancheong, Gyeongsangnam-do2018
35Arachis hypogaeaLeavesHwaseong, Gyeonggi-do2019
36Avena sativaFruitsJeongeup, Jeollabuk-do2018
37Arctium lappaRootsYecheon, Gyeongsangbuk-do2018
38Disocorea batatasRootsYecheon, Gyeongsangbuk-do2018
39Camellia sinensisLeavesBoseong, Jeollanam-do2018
40Cudrania tricuspidataFruitsIksan, Jeollabuk-do2018
41Cirsium japonicumLeaves, RootsHongcheon, Gangwon-do2019
42Curcuma longaRootsJindo, Jeollanam-do2018
43Moringa oleiferaLeavesSuncheon, Jeollanam-do2018
44Beta vulgarisRootsSuncheon, Jeollanam-do2018
45Chenopodium quinoaSeedsHongcheon, Gangwon-do2019
46Agaricus bisporus (Lange) ImbachFruiting bodiesNonsan, Chungcheongnam-do2019
47Panicum miliaceumFruitsYeongwol, Gangwon-do2018
48Ganoderma lucidumFruiting bodiesChilgok, Gyeongsangbuk-do2019
49Citrus unshiu MarcovFruitsSeogwipo, Jeju-do2019
50Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. BigelowFruiting bodiesYangyang, Gangwon-do2019
51Capsicum annuumFruitsCheongsong, Gyeongsangbuk-do2019
52Juglans regia DodeFruitsYeongdong, Chungcheongbuk-do2019
53Canavalia ensiformisFruitsSuncheon, Jeollanam-do2019
54Cordyceps millitarisFruiting bodiesHoengseong, Gangwon-do2019
55Pteridium aquilinumLeavesSancheong, Gyeongsangnam-do2019
56Fragaria x ananassaFruitsGochang, Jeollabuk-do2019
57Sparassis crispa (Wulf.) Fr.Fruiting bodiesSancheong, Gyeongsangnam-do2019
58Arachis hypogaeaFruitsGochang, Jeollabuk-do2019
59Malus pumilaFruitsGumi, Gyeongsangbuk-do2019
60Aruncus dioicusLeaves, RootsHongcheon, Gangwon-do2019
61Aster scaber ThunbLeaves, RootsHongcheon, Gangwon-do2019
62Brassica oleracea var. italicaLeavesYeongju, Gyeongsangbuk-do2019
63Prunus persicaFruitsIcheon, Gyeonggi-do2019
64Rhynchosia NulubilisSeedsYeongwol, Gangwon-do2018
65Glycine max Merr.SeedsYeongwol, Gangwon-do2018
66Glycine max Merr.SeedsSangdong, Gangwon-do2019
67Panax ginseng C.A. MeyerRootsGeumsan, Chungcheongnam-do2019
68Perilla frutescensLeavesMiryang, Gyeongsangnam-do2020
69Allium monanthum MAX.WholeTaean, Chungcheongnam-do2020
70Codonopsis lanceolata (Siebold & Zucc.) Trautv.RootsHoengseong, Gangwon-do2019
71Citrus limonFruitsJeju, Jeju Island2020
72Pleurotus ferulaeFruiting bodiesChilgok, Gyeongsangbuk-do2020
73Capsicum annuum var. angulosumRed fruitsChangwon, Gyeongsangnam-do2020
74Capsicum annuum var. angulosumYellow fruitsChangwon, Gyeongsangnam-do2020
75Ipomoea aquaticaLeaves, RootsAnsan, Gyeonggi-do2020
76Spinacia oleraceaLeaves, RootsAnsan, Gyeonggi-do2020
77Melissa officinalisLeaves, RootsPyeongtaek, Gyeonggi-do2020
78Thymus vulgarisLeaves, RootsPyeongtaek, Gyeonggi-do2020
79Aralia elataLeavesHaenam, Jeollanam-do2020
80Coriandrum sativumAbove groundAnsan, Gyeonggi-do2020
81Coriandrum sativumRootsAnsan, Gyeonggi-do2020
82Brassica campestrisAbove groundAnsan, Gyeonggi-do2020
83Ocimum basilicumAbove groundPyeongtaek, Gyeonggi-do2020
84Triticum aestivumLeavesUiwang, Gyeonggi-do2020
85Passiflora edulisFruits, SeedsHadong, Gyeongsangnam-do2020
86Passiflora edulisSkinsHadong, Gyeongsangnam-do2020
87Morus alba LFruitsSancheong, Gyeongsangnam-do2020
88Brassica oleracea var. acephalaAbove groundYongin, Gyeonggi-do2020
89Morus alba LLeavesSancheong, Gyeongsangnam-do2020
90Zingiber officinaleRootsAndong, Gyeongsangbuk-do2020
91Pyrus pyrifoliaFruitsNaju, Jeollanam-do2020
92Allium sativumStemsChangnyeong, Gyeongsangnam-do2020
93Brassica junceLeavesYeosu, Jeollanam-do2020
94Flammulina velutipesFruiting bodiesCheongdo, Gyeongsangbuk-do2021
95Oenanthe javanica (Blume) DC.Leaves, RootsCheongdo, Gyeongsangbuk-do2021
96Cichorium intybusLeavesChungju, Chungcheongbuk-do2021
97Brassica junceaLeavesChungju, Chungcheongbuk-do2021
98Rubus crataegifolius BungeFruitsMiryang, Gyeongsangnam-do2021
99Asparagus officinalisLeaves, RootsHwacheon, Gangwon-do2021
100Panax ginseng C.A. MeyerRootsDanyang, Chungcheongbuk-do2021
101Panax ginseng C.A. MeyerLeaves, RootsDanyang, Chungcheongbuk-do2021
102Allium microdictyon Prokh.LeavesHongcheon, Gangwon-do2021
103Miricacalia firmaLeavesHongcheon, Gangwon-do2021
104Ligularia stenocephala MatsumLeavesHongcheon, Gangwon-do2021
105Acantho panaxLeavesHongcheon, Gangwon-do2021
106Pleurospermum camtschaticumLeavesHongcheon, Gangwon-do2021
107Prunus mumeFruitsGwangyang, Jeollanam-do2021
108Zea mays L.FruitsJeju, Jeju Island2021
109Zea mays L.StyleJeju, Jeju Island2021
110Eriobotrya japonicaFruitsWando, Jeollanam-do2021
111Eriobotrya japonicaLeavesWando, Jeollanam-do2021
112Prunus mumeFruitsGwangyang, Jeollanam-do2021
113Aster glehnii F.SchmidtLeaves, RootsSeongju, Gyeongsangbuk-do2021
114Prunus armeniacaFruitsYeongcheon, Gyeongsangbuk-do2021
115Vaccinium myrtillus L.FruitsHongseong, Chungcheongnam-do2021


Fig. 1. Schematic diagram of the experimental timeline and two extraction methods for food-derived plants. (A) Manufacturing process of ethanol and hot water extracts, (B) schedule for the effect of the extracts on the proliferation and differentiation of Hanwoo satellite cells (HWSCs).

근육위성세포 배양

HWSC는 37°C, 5% CO2 조건하에서 콜라겐(Collagen I, Rat Tail, Corning, NY, USA)으로 코팅된 플레이트에서 배양하였다. 증식용 배지는 Ham’s F-10 Nutrient Mix(F-10; Gibco, Grand Island, NY, USA), 20% fetal bovine serum (FBS; Gibco) 그리고 1% penicilin/streptomycin(P/S; Gibco)을 혼합하여 사용하였다. 분화용 배지는 F-10 media, 2% FBS, 그리고 1% P/S를 혼합하여 사용하였다. 모든 미디아는 2일마다 교체하였다(Fig. 1B).

HWSC 증식능 평가

HWSC 증식능은 Cell Counting Kit-8(CCK-8; Enzo Life Science, Farmingdale, NY, USA)을 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 HWSC를 9,300 cells/cm2로 분주하고, 24시간 뒤 식물추출물이 100 μg/mL 농도로 첨가된 10% FBS로 교체하여 6일간 배양하였다. 배지는 2일마다 교체하였다. 6일 차에 10 μL의 CCK-8 시약을 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 반응시킨 후 분광광도계(SpectraMax M2e, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm, 650 nm 각각의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 값은 다음 식을 이용하여 증식능을 계산하였다.

Proliferationrate=ExperimentalgroupOD450nm650nm20%FBScontrolgroupOD450nm650nm

증식 효능이 우수한 식물추출물은 FBS를 반으로 감소시킨 배지(10% FBS)에 첨가된 식물추출물에서 배양된 세포가 대조군인 20% FBS에서 배양한 세포와 유사한 세포증식률을 보이는 것을 기준으로 선정하였다.

Surface plasmon resonance(SPR) 측정

추출물이 세포증식과 관련된 단백질인 MyoD와 Pax7과 직접 결합하는지 확인하기 위하여 SPR(Biacore T200, Cytiva, Marlborough, MA, USA)을 이용하여 측정하였다. 먼저 SPR칩에 단백질 고정화하였다. 덱스트란이 표면처리 되어있는 CM5 센서칩(Cytiva)을 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC; Cytiva)와 N-hydroxysuccinimide(NHS; Cytiva)를 1:1로 혼합하여 10 μL/min 유량에서 10분간 처리하였다. 그다음 anti-histidine antibody(Cytiva)를 10 μL/min 유량에서 7분간 처리한 뒤, ethanolamine(Cytiva)을 처리하여 남아있는 succinimide esters(Cytiva)를 비활성화시켰다. 마지막으로 40 μg/mL의 농도로 희석한 MyoD-6xHis(Proteintech, Chicago, IL, USA)와 Pax7-6xHis(Proteintech) 단백질 각각을 5 μL/min 유량에서 2분간 흘려주어 단백질을 고정화시켰다.

고정된 단백질과 추출물 간의 결합능은 다음과 같이 측정하였다. 10 μg/mL 농도의 추출물을 30 μg/min 유량에서 1분간 주입한 뒤 running buffer로 교체하였다. 이때 running buffer는 0.1% DMSO가 포함된 HBS-EP+(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Tween 20, pH 7.4)(Cytiva) buffer를 사용하였다. 결합능은 단백질이 고정된 flow cell에서 검출된 반응에서 단백질이 없는 flow cell에서 검출된 반응을 제거함으로써 측정하였다.

Immunocytochemistry(ICC)

HWSC의 증식과 분화에 관여하는 단백질의 발현량을 확인하기 위해 ICC를 진행하였다. 24-well의 플레이트에 콜라겐으로 코팅된 coverslip(SPL life science, Pocheon, Korea)을 놓고, 그 위에 HWSC를 9,300 cells/cm2로 분주하여 증식능 평가와 동일한 조건으로 배양하였다. 배양 6일차에 10분간 4% paraformaldehyde(Biosesang, Seongnam, Korea)로 고정하고, 1× phosphate-buffered saline (PBS, Welgene, Daegu, Korea)으로 washing 한 후, 1시간 동안 상온에서 blocking을 진행하였다. Blocking solution은 PBS에 2% goat serum(Abcam, Cambridge, UK), 2% horse serum(Abcam) 그리고 0.3% triton X-100(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 혼합하여 사용하였다. 이후 blocking solution에 Pax7 antibody(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)와 MyoD antibody(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 1:100으로 희석해서 넣고 4°C에서 overnight 동안 반응시켰다. 이후 PBS로 다시 washing 후, 2차 antibody인 Alexa Fluor 488 goat anti-mouse lgG(H+L)(Thermo Fisher Scientific)와 Alexa Fluor™ Plus 555 goat anti-rabbit IgG(H+L)(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 반응시켰다. 핵 염색은 hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific)를 이용하였고, 이미지는 Zeiss AxioImager Z2(Carl Zeiss, Jena, Germany)를 활용하여 20× 배율로 측정하였다. 분화와 관련된 마커의 변화는 6일 증식기간과 7일 분화기간을 거친 다음 MyoG antibody(Thermo Fisher Scientific)와 MyoD antibody를 이용하여 ICC로 관찰하였다.

통계분석

통계분석은 GraphPad Prism® version 9.0(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 활용하여 수행되었다. 그룹 간 평균값의 차이는 one-way ANOVA를 이용하여 분석하였고 사후 검정으로 Tukey 검정을 사용하였다.

CCK-8을 활용한 식품 유래 식물 추출물의 HWSC 증식력 스크리닝

배양육 제조 시 FBS의 사용량을 줄이기 위한 소재를 발굴하고자 FBS를 절반으로 줄이고 주정추출물 및 열수추출물을 HWSC에 100 μg/mL로 처리하여 6일 후 증식능을 측정하였다(Fig. 2). FBS를 10%로 감소시켰을 경우 20% FBS 대조군에 비해 증식효능이 23.3% 감소하였다. 식물추출물에 의한 증식능은 주정추출물과 열수추출물에서 차이가 나타났다. 주정추출물의 경우 115종의 추출물 중에서 총 4종인 참깨(Sesamum indicum), 독활(Aralia cordata Thunb. var. continentalis), 배(Pyrus pyrifolia), 그리고 새싹 인삼(잎)(Panax ginseng C. A. Meyer) 주정추출물이 20% FBS 대조군과 증식률에 있어서 유의적 차이가 나타나지 않았고, 그중 참깨, 독활, 배 주정추출물만이 10% FBS보다 유의적으로 증식률이 증가한 것으로 나타났다(Fig. 2A). 열수추출물의 경우 총 4종인 보리순(Hordeum vulgare), 미나리(Oenanthe javanica (Blume) DC.), 아스파라거스(Asparagus officinalis) 그리고 곤달비(Ligularia stenocephala Matsum) 열수추출물의 증식률이 20% FBS와 10% FBS 대조군과 유의적 차이가 나타나지 않았다(Fig. 2B). Heat map을 활용하여 추출 방법별 HWSC의 증식률 차이를 확인해 본 결과, 동일한 소재를 활용하더라도 추출 방법에 따라 세포증식률에 차이가 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 2C).

Fig. 2. Effects of 230 extracts on HWSC proliferation. HWSCs were treated with 115 ethanol extracts (A) or 115 hot water extracts (B) in 10% FBS for six days. Cell proliferation was determined using CCK-8 assay. All data are expressed as mean±SD (n≥3). One-way ANOVA with Tukey’s post hoc test was performed by comparing only 20% FBS, 10% FBS, and each extract. Values with different letters display a significant difference (P<0.05). Letters for 20% FBS and 10% FBS were set to a and c, respectively. (C) Heat map analysis represented the comparison of HWSC proliferation rate of the extracts obtained by two different extraction methods.

SPR 분석

대조군인 20% FBS의 증식률과 유의차가 없는 주정추출물 4종과 열수추출물 4종에 대하여 근육위성세포의 증식에 관여하는 단백질인 MyoD와 Pax7과 직접적으로 결합하는 식품소재를 선별하고자 SPR을 수행하였다. 그 결과, 주정추출물 중에서는 배 추출물, 열수추출물 중에서는 보리순 추출물만이 MyoD와 Pax7 단백질과의 반응에서 SPR signal이 증가하는 것으로 나타났고, 미나리 열수추출물은 MyoD 단백질에 대해서만 SPR signal이 증가하는 것으로 나타났다(Table 2). 배 주정추출물과 보리순 열수추출물의 SPR sensorgram에서 보다시피, 추출물 주입 시간인 60~120 s 사이에서 두 단백질에 대한 RU 값이 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 3). 즉, 배 주정추출물과 보리순 열수추출물은 MyoD, Pax7 단백질과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 것으로 확인되었다.

Table 2 . SPR responses of eight selected plant species to MyoD and Pax7 proteins

Ethanol extractionHot water extraction
NoPlant speciesMyoDPax7NoPlant speciesMyoDPax7
20S. indicum18H. vulgare++
21A. cordata Thunb. var. continentalis95O. javanica (Blume) DC.+ND
91P. pyrifolia++99A. officinalis
101P. ginseng C. A. Meyer104L. stenocephala MatsumNDND


Fig. 3. SPR sensorgrams of the binding of two extracts to myoD and pax7 proteins. MyoD and Pax7 proteins were immobilized on the SPR chip. P. pyrifolia (A) and H. vulgare (B) bound to both proteins, resulting in increased RU at the baseline.


P. pyrifolia가 HWSC의 증식 및 분화에 미치는 영향

증식 촉진 효능을 보이는 배 주정추출물의 최적 농도 탐색을 위하여, 25~200 μg/mL 사이 다양한 농도 범위에서 증식률 테스트를 진행하였다(Fig. 4A). 그 결과 20% FBS 대조군에 비해 10% FBS 대조군은 약 80.2±2.0%의 증식률을 보였지만 25 μg/mL, 50 μg/mL의 배 주정추출물 처리군에서는 각각 85.8±7% 84.2±8% 수준의 증식률을 보여 10% FBS 대조군과 유의차가 확인되지 않았다. 하지만 100 μg/mL 처리군에서는 세포증식률이 95.6±5.0% 수준까지 증가하여 10% FBS만 함유한 군에 비해 유의적 수준으로 증식률이 개선되었고, 20% FBS 대조군과는 유의차가 나타나지 않아 세포증식률이 20% FBS만큼 개선되었다. 200 μg/mL의 추출물 처리군에서도 98.0±6.0%의 증식률을 보이며 20% FBS와 증식률과 유사한 수준까지 개선됨을 확인하였다. 따라서 배 주정추출물의 경우 100 μg/mL 이상의 농도가 근육위성세포 증식 촉진에 적합한 농도이다.

Fig. 4. Effects of P. pyrifolia on HWSC proliferation and differentiation. (A) Changes in HWSC proliferation rate by treatment with various concentrations of P. pyrifolia for 6 days. All data are expressed as mean±SD (n≥3). Statistical analysis of the data was performed by one-way ANOVA. Values with different letters display a significant difference (P<0.05). (B) Cell morphology after proliferation. (C) Immunocytochemistry (ICC) using proliferation-related biomarkers. Pax7 and MyoD were stained in green and red, respectively. Nuclei were stained in blue. (D) Cell morphology after differentiation. (E) ICC using differentiation-related biomarkers. MyoD and MyoG were stained in red and green, respectively. Nuclei were stained in blue.

6일간 증식시킨 근육 위성세포의 morphology는 배 추출물의 첨가에도 유지되었고, 농도 의존적으로 cell density가 증가하였다(Fig. 4B). 증식과 관련된 바이오마커인 MyoD와 Pax7의 발현량을 ICC로 확인한 결과, 두 단백질 모두 20% FBS 대조군에 비해 10% FBS 대조군의 발현량이 감소했고 배 주정추출물의 처리농도 의존적으로 발현량이 증가하였다(Fig. 4C). 증식과정에서 처리한 배 주정추출물이 분화에 영향을 미치는지 살펴본 결과, 배 추출물을 고농도(100, 200 μg/mL)로 처리한 군에서 myotube morphology가 확인되었다(Fig. 4D). 분화 관련 바이오마커인 MyoD와 MyoG의 발현량을 ICC로 확인한 결과, MyoD 발현량은 20% FBS≒200 μg/mL 배 추출물> 100 μg/mL 배 추출물≒10% FBS로 나타났고, MyoG 발현량은 20% FBS> 200 μg/mL 배 추출물> 100 μg/mL 배 추출물> 10% FBS로 나타났다(Fig. 4E).

H. vulgare가 HWSC의 증식 및 분화에 미치는 영향

보리순 열수추출물의 농도별 증식률 테스트를 진행하여 최적의 농도를 탐색하였다(Fig. 5A). 20% FBS 대조군에 비해 10% FBS 대조군은 약 80.2±2.0%의 증식률을 보였지만 25 μg/mL, 50 μg/mL의 보리순 추출물 처리군에서는 각각 84.9±6.0%, 82.8±5.0% 수준의 증식률을 보여 10% FBS 대조군과 유의차가 없었다. 100 μg/mL 처리군에서는 세포증식률이 88.6±2.0% 수준으로 증가하여 20% FBS 및 10% FBS 대조군과 유의차가 나지 않았다. 200 μg/mL의 추출물 처리군에서는 93.7±3.0%의 증식률을 보이며 10% FBS 대조군과 유의적 수준으로 세포증식률이 증가하였고, 20% FBS 대조군과는 유의차가 없었다. 따라서 보리순 열수추출물의 경우 10% FBS에서도 유의적 수준의 증가가 보이는 200 μg/mL가 최적의 농도이다. 6일간 증식시킨 근육 위성세포의 morphology는 보리순 추출물의 첨가에도 유지되었고, 농도 의존적으로 cell density가 증가하였다(Fig. 5B). MyoD와 Pax7의 발현량은 20% FBS 대조군에 비하여 10% FBS 대조군에서 감소하였지만, 200 μg/mL의 보리순 열수추출물 첨가 시 20% FBS 대조군 수준으로 발현량이 증가하였다(Fig. 5C). 보리순 열수추출물(200 μg/mL)을 증식과정에서 처리한 군은 7일의 분화 과정 후 morphology를 살펴본 결과 myotube가 관찰되는 것으로 보아 분화에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(Fig. 5D). MyoD와 MyoG의 발현량을 ICC로 확인한 결과, 보리순 열수추출물의 MyoD 발현량은 10% FBS의 MyoD 발현량과 유사했다(Fig. 5E). MyoG의 발현량은 20% FBS> 보리순 열수추출물> 10% FBS로 나타났다.

Fig. 5. Effects of H. vulgare on HWSC proliferation and differentiation. (A) Changes in HWSC proliferation rate by treatment with various concentrations of H. vulgar for 6 days. All data are expressed as mean±SD (n≥3). Statistical analysis of the data was performed by one-way ANOVA. Values with different letters display a significant difference (P<0.05). (B) Cell morphology after proliferation. (C) ICC using proliferation-related biomarkers. Pax7 and MyoD were stained in green and red, respectively. Nuclei were stained in blue. (D) Cell morphology after differentiation. (E) ICC using differentiation-related biomarkers. MyoD and MyoG were stained in red and green, respectively. Nuclei were stained in blue.

식물소재의 부위별 HWSC의 증식능력 비교

식물소재의 부위가 HWSC의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 115종의 식물소재를 추출방법에 따라 분리하여 확인해보았다(Table 3). 실험에 활용한 식물소재의 부위는 지상부, 자실체, 열매, 열매와 씨앗, 잎, 잎과 뿌리, 뿌리, 씨앗, 껍질, 줄기, 암술대, 전체(whole)로 총 12가지 부위로 분류되었다. 부위별로 10% FBS 대조군보다 증식률이 유의적으로 증가한 비율은 주정추출물에서는 줄기가 전체 부위 중 33.3%로 가장 높았고, 그다음으로는 뿌리 11.1%, 자실체 10%, 열매 2.85% 순이었다. 유의적이지는 않지만 단순히 평균값이 증가한 부위의 비율은 자실체 40%, 열매 25.7%, 잎 4.8%, 잎과 뿌리 42.9%였고 뿌리, 씨앗, 줄기는 모두 33.3%였다. 열수추출물에서는 10% FBS 대조군보다 증식률이 유의적으로 증가한 것이 없었지만, 단순히 평균값이 증가한 것은 지상부 50%, 열매 22.9%, 잎 19%, 잎과 뿌리 21.4%였다. HWSC의 증식률은 추출 방법과 부위 모두에 영향을 받는데, HWSC 증식을 위한 FBS 첨가제로써의 식물추출물은 열수추출보다 주정추출을 활용해서 얻는 것이 더 적합한 것으로 판단되고, 부위별로는 줄기> 뿌리> 자실체가 유용할 것으로 보인다.

Table 3 . Effect of extracted plant parts and extraction methods on HWSC proliferation

Plant partTotal number of plantsProportion of plants with proliferation efficiency by plant extraction part (%)
Ethanol extractionHot water extraction
Above ground41)-50
Fruiting bodies1010(40)2)
Fruits352.85(25.7)-22.9
Fruits, Seeds1
Leaves21-4.8-19
Leaves, Roots14-42.9-21.4
Roots1811.1(33.3)
Seeds6-33.3
Skins1
Stems333.3(33.3)
Styles1
Whole1
Total1154.35(25.2)-14.8

1)-: No plants showed increased proliferation efficiency.

2)Significant increases in proliferation compared to 10% FBS are shown outside parentheses, and non-significant increases in proliferation mean are shown in parentheses.


본 연구에서는 FBS 사용량 절감을 위하여 FBS를 50% 감소시키더라도 HWSC의 증식능을 기존 배지와 유사하게 유지하는 식물소재를 발굴하고자 하였다. 먼저 주정추출과 열수추출로 획득된 230가지의 식물추출물을 HWSC에 처리하여 CCK-8을 통해 1차 스크리닝을 진행하였다. 그 결과, 20% FBS 배지와 유의차가 없는 효능을 보이는 식물추출물은 주정추출물과 열수추출물에서 각각 4종이었다. 주정추출물에서는 참깨, 독활, 배, 새싹 인삼(잎)이, 열수추출물에서는 보리순, 미나리, 아스파라거스, 곤달비가 효과가 있는 것으로 나타나 추출용매에 따라 효능 소재가 다른 것으로 나타났다. 추출용매나 추출 방법에 따른 효능 차이는 이미 알려진 사실이다. 가시오가피의 에탄올 추출물과 물 추출물 중에서 에탄올 추출물만이 조골세포 증식을 유의적으로 촉진했고(Lim 등, 2007), 구멍갈파래를 100 MPa 60°C, 150 MPa 80°C, 15분간 고압 추출을 통해 획득한 추출물이 B cell의 성장을 자극했다고 보고된 바 있다(Han 등, 2009). 추출 부위에 따른 효능 차이 또한 널리 알려진 사실이다. 보리수나무의 부위별 에탄올 추출물을 세포에 처리하였을 때, HepG2의 세포증식 억제능은 보리수나무의 잎, 줄기, 열매 순서로 나타났다(Kim 등, 2016). 비파 씨, 과육, 잎을 에탄올 추출하여 지방전구세포에 처리하였을 때, 비파 씨 추출물은 고농도에서 지방전구세포의 생존율을 감소시켰고 비파 과육과 잎 추출물은 세포생존율에 영향을 미치지 않았다(Lee와 Lee, 2016). 이러한 차이는 본 연구에서도 동일하게 나타나서, 새싹인삼의 뿌리가 아닌 잎과 뿌리가 혼합된 주정추출물에서만 HWSC 증식효능이 나타났다. 이러한 차이는 용매나 부위에 따라 추출되는 유효성분의 양이 다르기 때문일 가능성이 있다. 본 연구에서 효능을 보이는 8종의 추출물들이 근육위성세포 증식에 미치는 영향에 관해서는 연구된 바 없으나, 일부 추출물에 대해서 추출 조건에 따라 유효성분의 함량에 차이가 존재한다는 연구는 보고되었다. 아스파라거스에 함유된 플라보노이드는 20% 주정 및 열수추출물에 각각 4.20±0.01, 13.38±0.14 mg GAE/g이 존재하였고, 플라보노이드 중 가장 많은 함량을 차지하고 있는 루틴은 주정 및 열수추출물에 각각 0.22±0.01, 0.49±0.01 mg/g이 존재하여 유효성분이 열수추출물에 더 많이 존재하는 것으로 나타났다(Han 등, 2021). 또한 주정추출물에서 인삼의 잎에는 뿌리보다 더 높은 함량의 20(S)-protopanaxadiol과 20(S)- \protopanaxatriol이 존재하고 있고, 그중에서 Rb3, Rd 그리고 Rg2는 잎에만 각각 1,150±29.73, 631.10±26.39, 17.83 \±0.59 mg/100 g dry sample이 존재하는 것으로 나타났다(Kang과 Kim, 2016).

2차 스크리닝은 1차 스크리닝에서 선별된 8종의 식물추출물을 이용하여 MyoD와 Pax7에 직접적으로 결합하는 물질을 함유한 추출물을 발굴하기 위하여 SPR을 진행하였다. MyoD와 Pax7은 모두 근육위성세포의 증식에 관여하는 바이오마커이다(Schmidt 등, 2019). Pax7은 근육위성세포의 진행이 중단된 상태에서부터 활성화되는 시점까지 발현이 되어 있다가 myoblast가 되어 증식되면서 발현량이 감소하기 시작한다. Pax3/7은 myoblast일 때 MyoD의 전사 활성에 기여한다(Wang과 Rudnicki, 2012). 그에 따라 MyoD는 myoblast가 되어 증식되면서 발현량이 증가하다가 분화되어 myocyte가 되면서 감소한다. 즉, Pax7과 MyoD 활성화는 근육위성세포의 증식을 촉진할 수 있기 때문에 발굴하고자 하는 추출물은 두 단백질과 결합하는 물질을 함유한 식물추출물에 초점을 맞추었다. 이때 사용한 SPR 실험법은 생체분자의 직접적인 결합에 의한 상호작용을 분석하는 방법의 하나로, 매우 특이적이고 검출한계가 낮다는 장점이 있다. 금속 표면으로 된 센서칩에 단백질을 붙이고 리간드를 흘려주면서 발생하는 빛의 굴절률 변화를 통해 생체분자 상호작용의 동역학을 실시간으로 분석한다(Schasfoort, 2017). SPR은 근육세포의 활성 조절에 decorin이 영향을 주는지 확인하기 위해 골격근 분화의 음성 조절자인 myostatin과 콜라겐 형성 조절 및 안정화에 관여하는 decorin과의 결합능력을 확인하거나(Miura 등, 2006), 돼지 근육에 잔존하는 다수의 sulfonamides계 항생제 검출에 활용하기도 하였다(McGrath 등, 2005). 본 연구에서는 SPR을 통해 8종의 식물추출물 중에서 최종적으로 배 주정추출물과 보리순 열수 추출물이 두 단백질과 직접적인 결합능이 있는 것으로 밝혔다.

배 주정추출물과 보리순 열수추출물은 모두 농도별로 HWSC의 증식을 촉진했고 분화에도 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타나 배양육 배양배지 첨가제로 활용할 수 있을 것으로 사료된다. 두 추출물의 근육위성세포에 대한 증식효능에 관해서는 연구된 바 없지만 다른 세포의 증식촉진 및 기능은 일부 알려져 있다. 배 추출물은 HaCaT 및 CCD-986sk 세포증식을 촉진하고 CCD-986sk 세포에 의한 procollagen type I C-peptide의 생합성 능력도 증가시켰다(Park과 Han, 2015; Park 등, 2018). 이러한 효능은 배에 존재하는 알부틴(0.148 mg/g), 클로로겐산(0.120 mg/g), 카페인산(과육 56.2 mg/kg, 과피 73.5 mg/kg), 플라보노이드(182.5~368.9 mg/100 g) 등에 의해 나타났을 가능성이 있다(Hong 등, 2021; Park 등, 2018). 기존 연구에 따르면 Lonicera macranthoides Hand-Mazz에서 추출한 chlorogenic acid는 돼지의 skeletal muscle protein의 합성을 AKT-mTOR-S6K1-4EBP1을 통하여 합성을 증가시킨다고 보고된 바 있다(Wang 등, 2022). 보리순 추출물에 의한 세포의 증식 효능은 연구된 바 없으나, 보리순에 존재하는 비타민 B1(0.35 mg/100 g), 비타민 B2(0.091 mg/100 g), 비타민 C(57.2~158.1 mg/100 g), 비타민 E(0.85~3.15 mg/100 g), 총 페놀산(336.3~453.9 mg/100 g), 총 플라본(37.91~47.98 mg/100 g), β-glucan(3.3~7.86%) 등에 의해 나타났을 가능성이 있다(Liu와 Li, 2021; Obadi 등, 2021). 특히 비타민 C는 돼지의 근육 stem cell의 증식을 개선한다고 보고된 바 있으며(Fang 등, 2022), β-glucan은 마우스 근육세포인 C2C12 세포의 증식을 촉진하고 MyoD와 MyoG의 발현량 증가도 보고되어 있기 때문에(Li 등, 2018), HWSC에서도 유사한 기능을 가지고 있을 가능성이 있다. 이에 관해서는 추가연구가 필요하다.

HWSC를 활용한 세포증식 연구는 거의 연구된 바가 없고, 식물추출물을 이용한 근육세포증식 효능 연구는 일부만 존재한다. 레몬 머틀 추출물은 진행이 중단된 상태의 위성세포를 활성화하는데 기여하였고(Yamamoto 등, 2022), 민들레 추출물과 마늘 초음파추출물은 쥐의 골격근 세포 증식을 촉진했으며(Liu 등, 2018; Kalhotra 등, 2020), 커피에 존재하는 caffeic acid가 myotube 생성을 촉진하였다(Jang 등, 2018). 백출 열수추출물은 증식과정에서 처리 시 C2C12 세포의 증식을 촉진하였고, 분화과정에서 처리하였을 때 myotube의 길이 및 직경 그리고 MyoD와 Mrf5 단백질 발현량을 증가시켰다(Song, 2015). 본 연구는 115종의 식물을 2가지 추출법을 이용하여 총 230개의 식물추출물을 확보한 뒤, 각 추출물을 근육위성세포에 처리하여 증식효능을 관찰하였다. 이는 기존 데이터들에 추가로 HWSC 세포증식 관련 기초 데이터베이스를 제공하는 데 기여할 것으로 사료된다. 또한 추출 방법 및 식물 부위별 증식 효능의 차이를 통해서 배양육 생산에 적합한 소재의 범위를 ‘주정추출법’과 ‘줄기, 뿌리 및 자실체’로 제안하였다. 본 연구 결과는 추후 배양육 증식용 배양배지 개발에 있어서 기초자료를 제공할 것으로 기대된다.

본 연구는 한국식품연구원 기본연구사업(E0212022-02)과 산업통상자원부의 산업기술 알키미스트 프로젝트사업(20012469)의 지원을 받아 수행된 연구임.

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Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

한우 근육위성세포 증식 촉진제로서의 식품유래 식물추출물 탐색

유인선1,2․최상윤3․최정석4․김미나2․김민정1

1한국식품연구원 식품기능연구본부 노화대사연구단, 2전북대학교 생활과학대학 식품영양학과
3한국식품연구원 식품기능연구본부 기능성소재연구단, 4충북대학교 농업생명환경대학 축산학과

Received: May 24, 2022; Revised: July 30, 2022; Accepted: July 31, 2022

Screening of Food-Derived Plant Extracts to Promote Proliferation of Hanwoo Satellite Cells

In-sun Yu1,2 , Sang Yoon Choi3, Jungseok Choi4, Mina K. Kim2, and Min Jung Kim1

1Research Group of Aging and Metabolism and 3Research Group of Functional Food Materials,
Research Division of Food Functionality, Korea Food Research Institute
2Department of Food Science and Human Nutrition, Jeonbuk National University
4Department of Animal Science, Chungbuk National University

Correspondence to:Min Jung Kim, Research Group of Aging and Metabolism, Korea Food Research Institute, 245, Nongsaengmyeong-ro, Iseo-myeon, Wanju-gun, Jeonbuk 55365, Korea, E-mail: mjkim14@kfri.re.kr

Received: May 24, 2022; Revised: July 30, 2022; Accepted: July 31, 2022

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Abstract

Recently, cultured meat has been considered as an alternative food source. However, the commercialization of cultured meat essentially requires the development of serum-free or low-serum media that reduces production costs. This study aimed to discover a food-derived plant extract that can maintain cell proliferation in Hanwoo satellite cells (HWSC) subsequent to reducing the amount of fetal bovine serum (FBS) by half. Totally, 115 plants were extracted by ethanol and hot water. In the primary screening, compared with the control containing 20% FBS, the proliferation rate of HWSC was screened for 230 extracts treated in a medium containing 10% FBS for 6 days. Of the 230 extracts, four ethanol extracts and four hot water extracts showed proliferation rates similar to the control. In the secondary screening, these eight extracts were subjected to surface plasmon resonance to select the extracts that directly bind to MyoD and Pax7 proteins, which are involved in the proliferation of muscle satellite cells. Of these, Pyrus pyrifolia and Hordeum vulgare, were determined to bind directly to the MyoD and Pax7 proteins. The two extracts promoted HWSC proliferation in a dose-dependent manner (25∼200 μg/mL) and exerted no negative effects on differentiation. Finally, the proliferation efficacy results were classified according to the extracted plant parts and the extraction methods. Three plant parts (the fruiting body, root, and stem) and the ethanol extraction method showed good proliferative efficacy. The results of this study can be used as basic data for research on the production of culture media for cultured meat.

Keywords: cultured meat, Hanwoo satellite cells, food-derived plant extract, proliferation, screening

서 론

전 세계적인 인구 증가로 인하여 2050년에는 70%가 증가한 더 많은 식량이 필요할 것으로 예측되는 가운데(Dias 등, 2021), 세계 육류 소비량 또한 현재보다 증가하여 2030년에는 2018~2020년도 대비 14% 증가할 것으로 예상된다(OECD와 FAO, 2021). 국내 또한 1인당 연간 육류 소비량이 해마다 증가하여 최근 9년(2010~2019) 동안 연간 약 4%씩 증가하는 것으로 나타났다(Jeong 등, 2020). 그러나 한정된 자원은 증가하는 식량 수요를 충족시킬 수 없기 때문에 새로운 단백질 공급원에 대한 니즈가 존재하고, 그 대안책으로 주목받고 있는 것 중 하나가 배양육이다. 배양육은 동물에서 채취한 줄기세포를 실험실에서 세포배양 및 조직배양기술을 활용하여 생산된다. 배양육은 동물 도축 없이 소량의 근육세포만을 채취하여 사용하기 때문에, 기존 축산법 대비 동물복지를 실현할 수 있을 뿐만 아니라 더 짧은 시간에 대량생산이 가능하다는 장점이 있다(Jeong 등, 2020). 또한, 공장식 축산 시스템하에서 발생하는 온실가스 배출 등의 환경오염과 인수공통전염병 등의 질병 발생 위험성을 현저히 줄일 수 있는 장점도 가지고 있다(Pluhar, 2010).

배양육 연구에 주로 사용되는 세포는 근육의 줄기세포라고 불리는 근육위성세포(muscle satellite cells)로, 근섬유막(sarcolemma)과 기저막(base lamina) 사이에 존재한다(Yin 등, 2013). 손상되지 않은 위성세포는 대부분 진행이 중단된 상태로 존재하다가 스트레스나 부상과 같은 외부 자극이 발생하게 되면 활성화된다. 이후 증식과 분화과정을 거치며 myoblast, myocyte, myotube를 차례로 형성하며 손상된 근육을 regeneration 시킨다(Yin 등, 2013; Laumonier 등, 2017; Massenet 등, 2021). 근육위성세포의 증식 및 분화과정에서 호르몬과 성장인자(growth factor) 등의 공급이 필요한데, 이때 주로 사용되는 배양액이 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이다. FBS는 세포 성장에 필수적인 호르몬, 성장인자, cytokine, 단백질 등을 포함하고 있기 때문에 세포 배양에 널리 사용되고 있다(Choi, 2020). 하지만 FBS는 가격이 매우 비싸고 배양육 생산비용의 80%를 차지하고 있을 정도로 배양육 원가 절감의 허들로 작용하고 있다(Choudhury 등, 2020). 그뿐만 아니라 FBS는 임신 기간 중 송아지의 탯줄 혈액으로부터 채취하기 때문에 윤리적인 문제가 존재한다(Chase 등, 2010). 따라서 배양육을 지속 가능한 미래 식량자원으로 저렴하게 대량 증식하기 위해서는 FBS 대체물 또는 첨가물 발굴이 강력히 요구된다.

식물추출물은 FBS 대체물 또는 첨가물로 사용할 수 있는 물질이다. 식물추출물은 원료 획득이 용이하고 저렴한 비용 덕분에 비용절감의 효과가 크며, FBS에 비해 윤리적 문제에서도 자유로울 수 있다(Williams 등, 2006). 또한 다양한 식물 또는 생약들은 지난 수 세기 동안 연구되어왔고 대한민국약전외한약(생약)규격집, Traditional Chinese medicine, 그리고 Ayurveda 등에 약리적 효능이 알려져 있을 뿐만 아니라 안전성 기준이 확보되어있는 이점이 있다(Atanasov 등, 2015). 그러나 동일한 식물에서 추출한 추출물이라고 하더라도 추출한 식물 부위, 추출 용매, 채집 장소, 채집 시기 등에 따라 영양 성분의 함량이나 생리 활성 정도가 다르게 나타난다(Atanasov 등, 2015). 따라서 다양한 효능이 있는 소재를 발굴하기 위해서는 다양한 추출 조건하에서도 연구를 진행할 필요가 있다.

본 연구에서는 다양한 추출물들을 활용하여 배양배지에서 FBS 양을 50% 감소시켰지만, 증식능은 기존 배양배지와 유사한 수준으로 근육위성세포의 증식을 촉진하는 식물추출물을 발굴하고자 한다. 세포는 한우에서 추출한 근육위성세포(Hanwoo satellite cell; HWSC)를 사용하였고, 추출물은 115종의 식물에서 추출한 열수추출물과 주정추출물을 사용하였다. 증식 효능이 우수한 추출물에 대해서는 분화 여부도 확인하였다. 본 연구 결과는 천연물 소재의 FBS 대체 가능성을 확인하고 배양육 배지 제조의 기초자료로써 활용하고자 한다.

재료 및 방법

추출물 준비

본 연구에서 사용된 식품 유래 식물 추출물은 한국식품연구원 소재은행 라이브러리에서 제공받았다(Table 1). 추출물 제조방법은 다음과 같다. 주정추출물은 115개의 건조시료 100 g에 1 L의 70% 주정을 넣고 50°C에서 3시간 동안 2번 반복 추출한 뒤, 상등액 여과 후 감압 농축 및 동결 건조하여 획득하였다. 열수추출물은 건조시료 100 g에 증류수 1 L를 넣고 100°C에서 3시간 동안 2번 반복 추출한 뒤, 상등액 여과, 감압 농축 및 동결건조 순으로 진행한 후 획득하였다(Fig. 1A).

Table 1 . Sources of food-derived plant extracts.

NoPlant speciesPart usedHabitat locationYear gathered
1Lycium chinenseFruitsCheongyang, Chungcheongnam-do2018
2Cornus officinalisFruitsGurye, Jeollanam-do2017
3Brassica napusSeedsJindo, Jeollanam-do2018
4Paeonia lactifloraRootsYeongju, Gyeongsangbuk-do2018
5Fagopyrum tartaricum GaerthFruitsYeongwol, Gangwon-do2018
6Schisandra chinensisFruitsMungyeong, Gyeongsangbuk-do2018
7Momordica charantiaFruitsYangju, Gyeonggi-do2018
8Glycyrrhiza uralensisRootsYeongwol, Gangwon-do2017
9Coix lachrymajobi var. mayuenFruitsYeongwol, Gangwon-do2018
10Astragalus membranaceusRootsYeongwol, Gangwon-do2018
11Ziziphus jujubaFruitsBoeun, Chungcheongbuk-do2018
12Poncirus trifoliataFruitsGeochang, Gyeongsangnam-do2018
13Cirsium setidensLeaves, RootsJeongseon, Gangwon-do2018
14Raphanus sativusRootsSeogwipo, Jeju Island2018
15Raphanus sativusLeaves, RootsSeogwipo, Jeju Island2018
16Achyranthes japonica NakaiRootsYeongwol, Gangwon-do2018
17Vigna angularisFruitsYeongwol, Gangwon-do2018
18Hordeum vulgareLeavesAnseong, Gyeonggi-do2019
19Aronia melanocarpaFruitsBoryeong, Chungcheongnam-do2018
20Sesamum indicumSeedsGochang, Jeollabuk-do2018
21Aralia cordata Thunb. var. continentalisRootsGeochang, Gyeongnam2018
22Ligularia fischeriLeavesHongcheon, Gangwon-do2018
23Nelumbo nucifera GaertnRootsDalseong, Daegu2019
24Eucommia ulmoidesStemsGeochang, Gyeongnam2018
25Fallopia multifloraRootsGeochang, Gyeongnam2018
26Gastrodia elata BL.StemsGeochang, Gyeongnam2018
27Phellinus linteusFruiting bodiesSancheong, Gyeongsangnam-do2019
28Hericium erinaceumFruiting bodiesPaju, Gyeonggi-do2019
29Hippophae rhamnoidesFruitsHoengseong, Gangwon-do2018
30Hippophae rhamnoidesLeavesHoengseong, Gangwon-do2018
31Panax ginseng CA MeyerFruitsJeongseon, Gangwon-do2018
32Lentinula edodes (Berk.) PeglerFruiting bodiesGongju, Chungcheongnam-do2019
33Opuntia humifusaLeaves, RootsYeongdeok, Gyeongsangbuk-do2018
34Platycodon grandiflorumRootsSancheong, Gyeongsangnam-do2018
35Arachis hypogaeaLeavesHwaseong, Gyeonggi-do2019
36Avena sativaFruitsJeongeup, Jeollabuk-do2018
37Arctium lappaRootsYecheon, Gyeongsangbuk-do2018
38Disocorea batatasRootsYecheon, Gyeongsangbuk-do2018
39Camellia sinensisLeavesBoseong, Jeollanam-do2018
40Cudrania tricuspidataFruitsIksan, Jeollabuk-do2018
41Cirsium japonicumLeaves, RootsHongcheon, Gangwon-do2019
42Curcuma longaRootsJindo, Jeollanam-do2018
43Moringa oleiferaLeavesSuncheon, Jeollanam-do2018
44Beta vulgarisRootsSuncheon, Jeollanam-do2018
45Chenopodium quinoaSeedsHongcheon, Gangwon-do2019
46Agaricus bisporus (Lange) ImbachFruiting bodiesNonsan, Chungcheongnam-do2019
47Panicum miliaceumFruitsYeongwol, Gangwon-do2018
48Ganoderma lucidumFruiting bodiesChilgok, Gyeongsangbuk-do2019
49Citrus unshiu MarcovFruitsSeogwipo, Jeju-do2019
50Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. BigelowFruiting bodiesYangyang, Gangwon-do2019
51Capsicum annuumFruitsCheongsong, Gyeongsangbuk-do2019
52Juglans regia DodeFruitsYeongdong, Chungcheongbuk-do2019
53Canavalia ensiformisFruitsSuncheon, Jeollanam-do2019
54Cordyceps millitarisFruiting bodiesHoengseong, Gangwon-do2019
55Pteridium aquilinumLeavesSancheong, Gyeongsangnam-do2019
56Fragaria x ananassaFruitsGochang, Jeollabuk-do2019
57Sparassis crispa (Wulf.) Fr.Fruiting bodiesSancheong, Gyeongsangnam-do2019
58Arachis hypogaeaFruitsGochang, Jeollabuk-do2019
59Malus pumilaFruitsGumi, Gyeongsangbuk-do2019
60Aruncus dioicusLeaves, RootsHongcheon, Gangwon-do2019
61Aster scaber ThunbLeaves, RootsHongcheon, Gangwon-do2019
62Brassica oleracea var. italicaLeavesYeongju, Gyeongsangbuk-do2019
63Prunus persicaFruitsIcheon, Gyeonggi-do2019
64Rhynchosia NulubilisSeedsYeongwol, Gangwon-do2018
65Glycine max Merr.SeedsYeongwol, Gangwon-do2018
66Glycine max Merr.SeedsSangdong, Gangwon-do2019
67Panax ginseng C.A. MeyerRootsGeumsan, Chungcheongnam-do2019
68Perilla frutescensLeavesMiryang, Gyeongsangnam-do2020
69Allium monanthum MAX.WholeTaean, Chungcheongnam-do2020
70Codonopsis lanceolata (Siebold & Zucc.) Trautv.RootsHoengseong, Gangwon-do2019
71Citrus limonFruitsJeju, Jeju Island2020
72Pleurotus ferulaeFruiting bodiesChilgok, Gyeongsangbuk-do2020
73Capsicum annuum var. angulosumRed fruitsChangwon, Gyeongsangnam-do2020
74Capsicum annuum var. angulosumYellow fruitsChangwon, Gyeongsangnam-do2020
75Ipomoea aquaticaLeaves, RootsAnsan, Gyeonggi-do2020
76Spinacia oleraceaLeaves, RootsAnsan, Gyeonggi-do2020
77Melissa officinalisLeaves, RootsPyeongtaek, Gyeonggi-do2020
78Thymus vulgarisLeaves, RootsPyeongtaek, Gyeonggi-do2020
79Aralia elataLeavesHaenam, Jeollanam-do2020
80Coriandrum sativumAbove groundAnsan, Gyeonggi-do2020
81Coriandrum sativumRootsAnsan, Gyeonggi-do2020
82Brassica campestrisAbove groundAnsan, Gyeonggi-do2020
83Ocimum basilicumAbove groundPyeongtaek, Gyeonggi-do2020
84Triticum aestivumLeavesUiwang, Gyeonggi-do2020
85Passiflora edulisFruits, SeedsHadong, Gyeongsangnam-do2020
86Passiflora edulisSkinsHadong, Gyeongsangnam-do2020
87Morus alba LFruitsSancheong, Gyeongsangnam-do2020
88Brassica oleracea var. acephalaAbove groundYongin, Gyeonggi-do2020
89Morus alba LLeavesSancheong, Gyeongsangnam-do2020
90Zingiber officinaleRootsAndong, Gyeongsangbuk-do2020
91Pyrus pyrifoliaFruitsNaju, Jeollanam-do2020
92Allium sativumStemsChangnyeong, Gyeongsangnam-do2020
93Brassica junceLeavesYeosu, Jeollanam-do2020
94Flammulina velutipesFruiting bodiesCheongdo, Gyeongsangbuk-do2021
95Oenanthe javanica (Blume) DC.Leaves, RootsCheongdo, Gyeongsangbuk-do2021
96Cichorium intybusLeavesChungju, Chungcheongbuk-do2021
97Brassica junceaLeavesChungju, Chungcheongbuk-do2021
98Rubus crataegifolius BungeFruitsMiryang, Gyeongsangnam-do2021
99Asparagus officinalisLeaves, RootsHwacheon, Gangwon-do2021
100Panax ginseng C.A. MeyerRootsDanyang, Chungcheongbuk-do2021
101Panax ginseng C.A. MeyerLeaves, RootsDanyang, Chungcheongbuk-do2021
102Allium microdictyon Prokh.LeavesHongcheon, Gangwon-do2021
103Miricacalia firmaLeavesHongcheon, Gangwon-do2021
104Ligularia stenocephala MatsumLeavesHongcheon, Gangwon-do2021
105Acantho panaxLeavesHongcheon, Gangwon-do2021
106Pleurospermum camtschaticumLeavesHongcheon, Gangwon-do2021
107Prunus mumeFruitsGwangyang, Jeollanam-do2021
108Zea mays L.FruitsJeju, Jeju Island2021
109Zea mays L.StyleJeju, Jeju Island2021
110Eriobotrya japonicaFruitsWando, Jeollanam-do2021
111Eriobotrya japonicaLeavesWando, Jeollanam-do2021
112Prunus mumeFruitsGwangyang, Jeollanam-do2021
113Aster glehnii F.SchmidtLeaves, RootsSeongju, Gyeongsangbuk-do2021
114Prunus armeniacaFruitsYeongcheon, Gyeongsangbuk-do2021
115Vaccinium myrtillus L.FruitsHongseong, Chungcheongnam-do2021


Fig 1. Schematic diagram of the experimental timeline and two extraction methods for food-derived plants. (A) Manufacturing process of ethanol and hot water extracts, (B) schedule for the effect of the extracts on the proliferation and differentiation of Hanwoo satellite cells (HWSCs).

근육위성세포 배양

HWSC는 37°C, 5% CO2 조건하에서 콜라겐(Collagen I, Rat Tail, Corning, NY, USA)으로 코팅된 플레이트에서 배양하였다. 증식용 배지는 Ham’s F-10 Nutrient Mix(F-10; Gibco, Grand Island, NY, USA), 20% fetal bovine serum (FBS; Gibco) 그리고 1% penicilin/streptomycin(P/S; Gibco)을 혼합하여 사용하였다. 분화용 배지는 F-10 media, 2% FBS, 그리고 1% P/S를 혼합하여 사용하였다. 모든 미디아는 2일마다 교체하였다(Fig. 1B).

HWSC 증식능 평가

HWSC 증식능은 Cell Counting Kit-8(CCK-8; Enzo Life Science, Farmingdale, NY, USA)을 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 HWSC를 9,300 cells/cm2로 분주하고, 24시간 뒤 식물추출물이 100 μg/mL 농도로 첨가된 10% FBS로 교체하여 6일간 배양하였다. 배지는 2일마다 교체하였다. 6일 차에 10 μL의 CCK-8 시약을 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 반응시킨 후 분광광도계(SpectraMax M2e, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm, 650 nm 각각의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 값은 다음 식을 이용하여 증식능을 계산하였다.

Proliferationrate=ExperimentalgroupOD450nm650nm20%FBScontrolgroupOD450nm650nm

증식 효능이 우수한 식물추출물은 FBS를 반으로 감소시킨 배지(10% FBS)에 첨가된 식물추출물에서 배양된 세포가 대조군인 20% FBS에서 배양한 세포와 유사한 세포증식률을 보이는 것을 기준으로 선정하였다.

Surface plasmon resonance(SPR) 측정

추출물이 세포증식과 관련된 단백질인 MyoD와 Pax7과 직접 결합하는지 확인하기 위하여 SPR(Biacore T200, Cytiva, Marlborough, MA, USA)을 이용하여 측정하였다. 먼저 SPR칩에 단백질 고정화하였다. 덱스트란이 표면처리 되어있는 CM5 센서칩(Cytiva)을 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC; Cytiva)와 N-hydroxysuccinimide(NHS; Cytiva)를 1:1로 혼합하여 10 μL/min 유량에서 10분간 처리하였다. 그다음 anti-histidine antibody(Cytiva)를 10 μL/min 유량에서 7분간 처리한 뒤, ethanolamine(Cytiva)을 처리하여 남아있는 succinimide esters(Cytiva)를 비활성화시켰다. 마지막으로 40 μg/mL의 농도로 희석한 MyoD-6xHis(Proteintech, Chicago, IL, USA)와 Pax7-6xHis(Proteintech) 단백질 각각을 5 μL/min 유량에서 2분간 흘려주어 단백질을 고정화시켰다.

고정된 단백질과 추출물 간의 결합능은 다음과 같이 측정하였다. 10 μg/mL 농도의 추출물을 30 μg/min 유량에서 1분간 주입한 뒤 running buffer로 교체하였다. 이때 running buffer는 0.1% DMSO가 포함된 HBS-EP+(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Tween 20, pH 7.4)(Cytiva) buffer를 사용하였다. 결합능은 단백질이 고정된 flow cell에서 검출된 반응에서 단백질이 없는 flow cell에서 검출된 반응을 제거함으로써 측정하였다.

Immunocytochemistry(ICC)

HWSC의 증식과 분화에 관여하는 단백질의 발현량을 확인하기 위해 ICC를 진행하였다. 24-well의 플레이트에 콜라겐으로 코팅된 coverslip(SPL life science, Pocheon, Korea)을 놓고, 그 위에 HWSC를 9,300 cells/cm2로 분주하여 증식능 평가와 동일한 조건으로 배양하였다. 배양 6일차에 10분간 4% paraformaldehyde(Biosesang, Seongnam, Korea)로 고정하고, 1× phosphate-buffered saline (PBS, Welgene, Daegu, Korea)으로 washing 한 후, 1시간 동안 상온에서 blocking을 진행하였다. Blocking solution은 PBS에 2% goat serum(Abcam, Cambridge, UK), 2% horse serum(Abcam) 그리고 0.3% triton X-100(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 혼합하여 사용하였다. 이후 blocking solution에 Pax7 antibody(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)와 MyoD antibody(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 1:100으로 희석해서 넣고 4°C에서 overnight 동안 반응시켰다. 이후 PBS로 다시 washing 후, 2차 antibody인 Alexa Fluor 488 goat anti-mouse lgG(H+L)(Thermo Fisher Scientific)와 Alexa Fluor™ Plus 555 goat anti-rabbit IgG(H+L)(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 반응시켰다. 핵 염색은 hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific)를 이용하였고, 이미지는 Zeiss AxioImager Z2(Carl Zeiss, Jena, Germany)를 활용하여 20× 배율로 측정하였다. 분화와 관련된 마커의 변화는 6일 증식기간과 7일 분화기간을 거친 다음 MyoG antibody(Thermo Fisher Scientific)와 MyoD antibody를 이용하여 ICC로 관찰하였다.

통계분석

통계분석은 GraphPad Prism® version 9.0(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 활용하여 수행되었다. 그룹 간 평균값의 차이는 one-way ANOVA를 이용하여 분석하였고 사후 검정으로 Tukey 검정을 사용하였다.

결 과

CCK-8을 활용한 식품 유래 식물 추출물의 HWSC 증식력 스크리닝

배양육 제조 시 FBS의 사용량을 줄이기 위한 소재를 발굴하고자 FBS를 절반으로 줄이고 주정추출물 및 열수추출물을 HWSC에 100 μg/mL로 처리하여 6일 후 증식능을 측정하였다(Fig. 2). FBS를 10%로 감소시켰을 경우 20% FBS 대조군에 비해 증식효능이 23.3% 감소하였다. 식물추출물에 의한 증식능은 주정추출물과 열수추출물에서 차이가 나타났다. 주정추출물의 경우 115종의 추출물 중에서 총 4종인 참깨(Sesamum indicum), 독활(Aralia cordata Thunb. var. continentalis), 배(Pyrus pyrifolia), 그리고 새싹 인삼(잎)(Panax ginseng C. A. Meyer) 주정추출물이 20% FBS 대조군과 증식률에 있어서 유의적 차이가 나타나지 않았고, 그중 참깨, 독활, 배 주정추출물만이 10% FBS보다 유의적으로 증식률이 증가한 것으로 나타났다(Fig. 2A). 열수추출물의 경우 총 4종인 보리순(Hordeum vulgare), 미나리(Oenanthe javanica (Blume) DC.), 아스파라거스(Asparagus officinalis) 그리고 곤달비(Ligularia stenocephala Matsum) 열수추출물의 증식률이 20% FBS와 10% FBS 대조군과 유의적 차이가 나타나지 않았다(Fig. 2B). Heat map을 활용하여 추출 방법별 HWSC의 증식률 차이를 확인해 본 결과, 동일한 소재를 활용하더라도 추출 방법에 따라 세포증식률에 차이가 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 2C).

Fig 2. Effects of 230 extracts on HWSC proliferation. HWSCs were treated with 115 ethanol extracts (A) or 115 hot water extracts (B) in 10% FBS for six days. Cell proliferation was determined using CCK-8 assay. All data are expressed as mean±SD (n≥3). One-way ANOVA with Tukey’s post hoc test was performed by comparing only 20% FBS, 10% FBS, and each extract. Values with different letters display a significant difference (P<0.05). Letters for 20% FBS and 10% FBS were set to a and c, respectively. (C) Heat map analysis represented the comparison of HWSC proliferation rate of the extracts obtained by two different extraction methods.

SPR 분석

대조군인 20% FBS의 증식률과 유의차가 없는 주정추출물 4종과 열수추출물 4종에 대하여 근육위성세포의 증식에 관여하는 단백질인 MyoD와 Pax7과 직접적으로 결합하는 식품소재를 선별하고자 SPR을 수행하였다. 그 결과, 주정추출물 중에서는 배 추출물, 열수추출물 중에서는 보리순 추출물만이 MyoD와 Pax7 단백질과의 반응에서 SPR signal이 증가하는 것으로 나타났고, 미나리 열수추출물은 MyoD 단백질에 대해서만 SPR signal이 증가하는 것으로 나타났다(Table 2). 배 주정추출물과 보리순 열수추출물의 SPR sensorgram에서 보다시피, 추출물 주입 시간인 60~120 s 사이에서 두 단백질에 대한 RU 값이 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 3). 즉, 배 주정추출물과 보리순 열수추출물은 MyoD, Pax7 단백질과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 것으로 확인되었다.

Table 2 . SPR responses of eight selected plant species to MyoD and Pax7 proteins.

Ethanol extractionHot water extraction
NoPlant speciesMyoDPax7NoPlant speciesMyoDPax7
20S. indicum18H. vulgare++
21A. cordata Thunb. var. continentalis95O. javanica (Blume) DC.+ND
91P. pyrifolia++99A. officinalis
101P. ginseng C. A. Meyer104L. stenocephala MatsumNDND


Fig 3. SPR sensorgrams of the binding of two extracts to myoD and pax7 proteins. MyoD and Pax7 proteins were immobilized on the SPR chip. P. pyrifolia (A) and H. vulgare (B) bound to both proteins, resulting in increased RU at the baseline.


P. pyrifolia가 HWSC의 증식 및 분화에 미치는 영향

증식 촉진 효능을 보이는 배 주정추출물의 최적 농도 탐색을 위하여, 25~200 μg/mL 사이 다양한 농도 범위에서 증식률 테스트를 진행하였다(Fig. 4A). 그 결과 20% FBS 대조군에 비해 10% FBS 대조군은 약 80.2±2.0%의 증식률을 보였지만 25 μg/mL, 50 μg/mL의 배 주정추출물 처리군에서는 각각 85.8±7% 84.2±8% 수준의 증식률을 보여 10% FBS 대조군과 유의차가 확인되지 않았다. 하지만 100 μg/mL 처리군에서는 세포증식률이 95.6±5.0% 수준까지 증가하여 10% FBS만 함유한 군에 비해 유의적 수준으로 증식률이 개선되었고, 20% FBS 대조군과는 유의차가 나타나지 않아 세포증식률이 20% FBS만큼 개선되었다. 200 μg/mL의 추출물 처리군에서도 98.0±6.0%의 증식률을 보이며 20% FBS와 증식률과 유사한 수준까지 개선됨을 확인하였다. 따라서 배 주정추출물의 경우 100 μg/mL 이상의 농도가 근육위성세포 증식 촉진에 적합한 농도이다.

Fig 4. Effects of P. pyrifolia on HWSC proliferation and differentiation. (A) Changes in HWSC proliferation rate by treatment with various concentrations of P. pyrifolia for 6 days. All data are expressed as mean±SD (n≥3). Statistical analysis of the data was performed by one-way ANOVA. Values with different letters display a significant difference (P<0.05). (B) Cell morphology after proliferation. (C) Immunocytochemistry (ICC) using proliferation-related biomarkers. Pax7 and MyoD were stained in green and red, respectively. Nuclei were stained in blue. (D) Cell morphology after differentiation. (E) ICC using differentiation-related biomarkers. MyoD and MyoG were stained in red and green, respectively. Nuclei were stained in blue.

6일간 증식시킨 근육 위성세포의 morphology는 배 추출물의 첨가에도 유지되었고, 농도 의존적으로 cell density가 증가하였다(Fig. 4B). 증식과 관련된 바이오마커인 MyoD와 Pax7의 발현량을 ICC로 확인한 결과, 두 단백질 모두 20% FBS 대조군에 비해 10% FBS 대조군의 발현량이 감소했고 배 주정추출물의 처리농도 의존적으로 발현량이 증가하였다(Fig. 4C). 증식과정에서 처리한 배 주정추출물이 분화에 영향을 미치는지 살펴본 결과, 배 추출물을 고농도(100, 200 μg/mL)로 처리한 군에서 myotube morphology가 확인되었다(Fig. 4D). 분화 관련 바이오마커인 MyoD와 MyoG의 발현량을 ICC로 확인한 결과, MyoD 발현량은 20% FBS≒200 μg/mL 배 추출물> 100 μg/mL 배 추출물≒10% FBS로 나타났고, MyoG 발현량은 20% FBS> 200 μg/mL 배 추출물> 100 μg/mL 배 추출물> 10% FBS로 나타났다(Fig. 4E).

H. vulgare가 HWSC의 증식 및 분화에 미치는 영향

보리순 열수추출물의 농도별 증식률 테스트를 진행하여 최적의 농도를 탐색하였다(Fig. 5A). 20% FBS 대조군에 비해 10% FBS 대조군은 약 80.2±2.0%의 증식률을 보였지만 25 μg/mL, 50 μg/mL의 보리순 추출물 처리군에서는 각각 84.9±6.0%, 82.8±5.0% 수준의 증식률을 보여 10% FBS 대조군과 유의차가 없었다. 100 μg/mL 처리군에서는 세포증식률이 88.6±2.0% 수준으로 증가하여 20% FBS 및 10% FBS 대조군과 유의차가 나지 않았다. 200 μg/mL의 추출물 처리군에서는 93.7±3.0%의 증식률을 보이며 10% FBS 대조군과 유의적 수준으로 세포증식률이 증가하였고, 20% FBS 대조군과는 유의차가 없었다. 따라서 보리순 열수추출물의 경우 10% FBS에서도 유의적 수준의 증가가 보이는 200 μg/mL가 최적의 농도이다. 6일간 증식시킨 근육 위성세포의 morphology는 보리순 추출물의 첨가에도 유지되었고, 농도 의존적으로 cell density가 증가하였다(Fig. 5B). MyoD와 Pax7의 발현량은 20% FBS 대조군에 비하여 10% FBS 대조군에서 감소하였지만, 200 μg/mL의 보리순 열수추출물 첨가 시 20% FBS 대조군 수준으로 발현량이 증가하였다(Fig. 5C). 보리순 열수추출물(200 μg/mL)을 증식과정에서 처리한 군은 7일의 분화 과정 후 morphology를 살펴본 결과 myotube가 관찰되는 것으로 보아 분화에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(Fig. 5D). MyoD와 MyoG의 발현량을 ICC로 확인한 결과, 보리순 열수추출물의 MyoD 발현량은 10% FBS의 MyoD 발현량과 유사했다(Fig. 5E). MyoG의 발현량은 20% FBS> 보리순 열수추출물> 10% FBS로 나타났다.

Fig 5. Effects of H. vulgare on HWSC proliferation and differentiation. (A) Changes in HWSC proliferation rate by treatment with various concentrations of H. vulgar for 6 days. All data are expressed as mean±SD (n≥3). Statistical analysis of the data was performed by one-way ANOVA. Values with different letters display a significant difference (P<0.05). (B) Cell morphology after proliferation. (C) ICC using proliferation-related biomarkers. Pax7 and MyoD were stained in green and red, respectively. Nuclei were stained in blue. (D) Cell morphology after differentiation. (E) ICC using differentiation-related biomarkers. MyoD and MyoG were stained in red and green, respectively. Nuclei were stained in blue.

식물소재의 부위별 HWSC의 증식능력 비교

식물소재의 부위가 HWSC의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 115종의 식물소재를 추출방법에 따라 분리하여 확인해보았다(Table 3). 실험에 활용한 식물소재의 부위는 지상부, 자실체, 열매, 열매와 씨앗, 잎, 잎과 뿌리, 뿌리, 씨앗, 껍질, 줄기, 암술대, 전체(whole)로 총 12가지 부위로 분류되었다. 부위별로 10% FBS 대조군보다 증식률이 유의적으로 증가한 비율은 주정추출물에서는 줄기가 전체 부위 중 33.3%로 가장 높았고, 그다음으로는 뿌리 11.1%, 자실체 10%, 열매 2.85% 순이었다. 유의적이지는 않지만 단순히 평균값이 증가한 부위의 비율은 자실체 40%, 열매 25.7%, 잎 4.8%, 잎과 뿌리 42.9%였고 뿌리, 씨앗, 줄기는 모두 33.3%였다. 열수추출물에서는 10% FBS 대조군보다 증식률이 유의적으로 증가한 것이 없었지만, 단순히 평균값이 증가한 것은 지상부 50%, 열매 22.9%, 잎 19%, 잎과 뿌리 21.4%였다. HWSC의 증식률은 추출 방법과 부위 모두에 영향을 받는데, HWSC 증식을 위한 FBS 첨가제로써의 식물추출물은 열수추출보다 주정추출을 활용해서 얻는 것이 더 적합한 것으로 판단되고, 부위별로는 줄기> 뿌리> 자실체가 유용할 것으로 보인다.

Table 3 . Effect of extracted plant parts and extraction methods on HWSC proliferation.

Plant partTotal number of plantsProportion of plants with proliferation efficiency by plant extraction part (%)
Ethanol extractionHot water extraction
Above ground41)-50
Fruiting bodies1010(40)2)
Fruits352.85(25.7)-22.9
Fruits, Seeds1
Leaves21-4.8-19
Leaves, Roots14-42.9-21.4
Roots1811.1(33.3)
Seeds6-33.3
Skins1
Stems333.3(33.3)
Styles1
Whole1
Total1154.35(25.2)-14.8

1)-: No plants showed increased proliferation efficiency..

2)Significant increases in proliferation compared to 10% FBS are shown outside parentheses, and non-significant increases in proliferation mean are shown in parentheses..


고 찰

본 연구에서는 FBS 사용량 절감을 위하여 FBS를 50% 감소시키더라도 HWSC의 증식능을 기존 배지와 유사하게 유지하는 식물소재를 발굴하고자 하였다. 먼저 주정추출과 열수추출로 획득된 230가지의 식물추출물을 HWSC에 처리하여 CCK-8을 통해 1차 스크리닝을 진행하였다. 그 결과, 20% FBS 배지와 유의차가 없는 효능을 보이는 식물추출물은 주정추출물과 열수추출물에서 각각 4종이었다. 주정추출물에서는 참깨, 독활, 배, 새싹 인삼(잎)이, 열수추출물에서는 보리순, 미나리, 아스파라거스, 곤달비가 효과가 있는 것으로 나타나 추출용매에 따라 효능 소재가 다른 것으로 나타났다. 추출용매나 추출 방법에 따른 효능 차이는 이미 알려진 사실이다. 가시오가피의 에탄올 추출물과 물 추출물 중에서 에탄올 추출물만이 조골세포 증식을 유의적으로 촉진했고(Lim 등, 2007), 구멍갈파래를 100 MPa 60°C, 150 MPa 80°C, 15분간 고압 추출을 통해 획득한 추출물이 B cell의 성장을 자극했다고 보고된 바 있다(Han 등, 2009). 추출 부위에 따른 효능 차이 또한 널리 알려진 사실이다. 보리수나무의 부위별 에탄올 추출물을 세포에 처리하였을 때, HepG2의 세포증식 억제능은 보리수나무의 잎, 줄기, 열매 순서로 나타났다(Kim 등, 2016). 비파 씨, 과육, 잎을 에탄올 추출하여 지방전구세포에 처리하였을 때, 비파 씨 추출물은 고농도에서 지방전구세포의 생존율을 감소시켰고 비파 과육과 잎 추출물은 세포생존율에 영향을 미치지 않았다(Lee와 Lee, 2016). 이러한 차이는 본 연구에서도 동일하게 나타나서, 새싹인삼의 뿌리가 아닌 잎과 뿌리가 혼합된 주정추출물에서만 HWSC 증식효능이 나타났다. 이러한 차이는 용매나 부위에 따라 추출되는 유효성분의 양이 다르기 때문일 가능성이 있다. 본 연구에서 효능을 보이는 8종의 추출물들이 근육위성세포 증식에 미치는 영향에 관해서는 연구된 바 없으나, 일부 추출물에 대해서 추출 조건에 따라 유효성분의 함량에 차이가 존재한다는 연구는 보고되었다. 아스파라거스에 함유된 플라보노이드는 20% 주정 및 열수추출물에 각각 4.20±0.01, 13.38±0.14 mg GAE/g이 존재하였고, 플라보노이드 중 가장 많은 함량을 차지하고 있는 루틴은 주정 및 열수추출물에 각각 0.22±0.01, 0.49±0.01 mg/g이 존재하여 유효성분이 열수추출물에 더 많이 존재하는 것으로 나타났다(Han 등, 2021). 또한 주정추출물에서 인삼의 잎에는 뿌리보다 더 높은 함량의 20(S)-protopanaxadiol과 20(S)- \protopanaxatriol이 존재하고 있고, 그중에서 Rb3, Rd 그리고 Rg2는 잎에만 각각 1,150±29.73, 631.10±26.39, 17.83 \±0.59 mg/100 g dry sample이 존재하는 것으로 나타났다(Kang과 Kim, 2016).

2차 스크리닝은 1차 스크리닝에서 선별된 8종의 식물추출물을 이용하여 MyoD와 Pax7에 직접적으로 결합하는 물질을 함유한 추출물을 발굴하기 위하여 SPR을 진행하였다. MyoD와 Pax7은 모두 근육위성세포의 증식에 관여하는 바이오마커이다(Schmidt 등, 2019). Pax7은 근육위성세포의 진행이 중단된 상태에서부터 활성화되는 시점까지 발현이 되어 있다가 myoblast가 되어 증식되면서 발현량이 감소하기 시작한다. Pax3/7은 myoblast일 때 MyoD의 전사 활성에 기여한다(Wang과 Rudnicki, 2012). 그에 따라 MyoD는 myoblast가 되어 증식되면서 발현량이 증가하다가 분화되어 myocyte가 되면서 감소한다. 즉, Pax7과 MyoD 활성화는 근육위성세포의 증식을 촉진할 수 있기 때문에 발굴하고자 하는 추출물은 두 단백질과 결합하는 물질을 함유한 식물추출물에 초점을 맞추었다. 이때 사용한 SPR 실험법은 생체분자의 직접적인 결합에 의한 상호작용을 분석하는 방법의 하나로, 매우 특이적이고 검출한계가 낮다는 장점이 있다. 금속 표면으로 된 센서칩에 단백질을 붙이고 리간드를 흘려주면서 발생하는 빛의 굴절률 변화를 통해 생체분자 상호작용의 동역학을 실시간으로 분석한다(Schasfoort, 2017). SPR은 근육세포의 활성 조절에 decorin이 영향을 주는지 확인하기 위해 골격근 분화의 음성 조절자인 myostatin과 콜라겐 형성 조절 및 안정화에 관여하는 decorin과의 결합능력을 확인하거나(Miura 등, 2006), 돼지 근육에 잔존하는 다수의 sulfonamides계 항생제 검출에 활용하기도 하였다(McGrath 등, 2005). 본 연구에서는 SPR을 통해 8종의 식물추출물 중에서 최종적으로 배 주정추출물과 보리순 열수 추출물이 두 단백질과 직접적인 결합능이 있는 것으로 밝혔다.

배 주정추출물과 보리순 열수추출물은 모두 농도별로 HWSC의 증식을 촉진했고 분화에도 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타나 배양육 배양배지 첨가제로 활용할 수 있을 것으로 사료된다. 두 추출물의 근육위성세포에 대한 증식효능에 관해서는 연구된 바 없지만 다른 세포의 증식촉진 및 기능은 일부 알려져 있다. 배 추출물은 HaCaT 및 CCD-986sk 세포증식을 촉진하고 CCD-986sk 세포에 의한 procollagen type I C-peptide의 생합성 능력도 증가시켰다(Park과 Han, 2015; Park 등, 2018). 이러한 효능은 배에 존재하는 알부틴(0.148 mg/g), 클로로겐산(0.120 mg/g), 카페인산(과육 56.2 mg/kg, 과피 73.5 mg/kg), 플라보노이드(182.5~368.9 mg/100 g) 등에 의해 나타났을 가능성이 있다(Hong 등, 2021; Park 등, 2018). 기존 연구에 따르면 Lonicera macranthoides Hand-Mazz에서 추출한 chlorogenic acid는 돼지의 skeletal muscle protein의 합성을 AKT-mTOR-S6K1-4EBP1을 통하여 합성을 증가시킨다고 보고된 바 있다(Wang 등, 2022). 보리순 추출물에 의한 세포의 증식 효능은 연구된 바 없으나, 보리순에 존재하는 비타민 B1(0.35 mg/100 g), 비타민 B2(0.091 mg/100 g), 비타민 C(57.2~158.1 mg/100 g), 비타민 E(0.85~3.15 mg/100 g), 총 페놀산(336.3~453.9 mg/100 g), 총 플라본(37.91~47.98 mg/100 g), β-glucan(3.3~7.86%) 등에 의해 나타났을 가능성이 있다(Liu와 Li, 2021; Obadi 등, 2021). 특히 비타민 C는 돼지의 근육 stem cell의 증식을 개선한다고 보고된 바 있으며(Fang 등, 2022), β-glucan은 마우스 근육세포인 C2C12 세포의 증식을 촉진하고 MyoD와 MyoG의 발현량 증가도 보고되어 있기 때문에(Li 등, 2018), HWSC에서도 유사한 기능을 가지고 있을 가능성이 있다. 이에 관해서는 추가연구가 필요하다.

HWSC를 활용한 세포증식 연구는 거의 연구된 바가 없고, 식물추출물을 이용한 근육세포증식 효능 연구는 일부만 존재한다. 레몬 머틀 추출물은 진행이 중단된 상태의 위성세포를 활성화하는데 기여하였고(Yamamoto 등, 2022), 민들레 추출물과 마늘 초음파추출물은 쥐의 골격근 세포 증식을 촉진했으며(Liu 등, 2018; Kalhotra 등, 2020), 커피에 존재하는 caffeic acid가 myotube 생성을 촉진하였다(Jang 등, 2018). 백출 열수추출물은 증식과정에서 처리 시 C2C12 세포의 증식을 촉진하였고, 분화과정에서 처리하였을 때 myotube의 길이 및 직경 그리고 MyoD와 Mrf5 단백질 발현량을 증가시켰다(Song, 2015). 본 연구는 115종의 식물을 2가지 추출법을 이용하여 총 230개의 식물추출물을 확보한 뒤, 각 추출물을 근육위성세포에 처리하여 증식효능을 관찰하였다. 이는 기존 데이터들에 추가로 HWSC 세포증식 관련 기초 데이터베이스를 제공하는 데 기여할 것으로 사료된다. 또한 추출 방법 및 식물 부위별 증식 효능의 차이를 통해서 배양육 생산에 적합한 소재의 범위를 ‘주정추출법’과 ‘줄기, 뿌리 및 자실체’로 제안하였다. 본 연구 결과는 추후 배양육 증식용 배양배지 개발에 있어서 기초자료를 제공할 것으로 기대된다.

감사의 글

본 연구는 한국식품연구원 기본연구사업(E0212022-02)과 산업통상자원부의 산업기술 알키미스트 프로젝트사업(20012469)의 지원을 받아 수행된 연구임.

Fig 1.

Fig 1.Schematic diagram of the experimental timeline and two extraction methods for food-derived plants. (A) Manufacturing process of ethanol and hot water extracts, (B) schedule for the effect of the extracts on the proliferation and differentiation of Hanwoo satellite cells (HWSCs).
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Fig 2.

Fig 2.Effects of 230 extracts on HWSC proliferation. HWSCs were treated with 115 ethanol extracts (A) or 115 hot water extracts (B) in 10% FBS for six days. Cell proliferation was determined using CCK-8 assay. All data are expressed as mean±SD (n≥3). One-way ANOVA with Tukey’s post hoc test was performed by comparing only 20% FBS, 10% FBS, and each extract. Values with different letters display a significant difference (P<0.05). Letters for 20% FBS and 10% FBS were set to a and c, respectively. (C) Heat map analysis represented the comparison of HWSC proliferation rate of the extracts obtained by two different extraction methods.
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Fig 3.

Fig 3.SPR sensorgrams of the binding of two extracts to myoD and pax7 proteins. MyoD and Pax7 proteins were immobilized on the SPR chip. P. pyrifolia (A) and H. vulgare (B) bound to both proteins, resulting in increased RU at the baseline.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 1036-1047https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.10.1036

Fig 4.

Fig 4.Effects of P. pyrifolia on HWSC proliferation and differentiation. (A) Changes in HWSC proliferation rate by treatment with various concentrations of P. pyrifolia for 6 days. All data are expressed as mean±SD (n≥3). Statistical analysis of the data was performed by one-way ANOVA. Values with different letters display a significant difference (P<0.05). (B) Cell morphology after proliferation. (C) Immunocytochemistry (ICC) using proliferation-related biomarkers. Pax7 and MyoD were stained in green and red, respectively. Nuclei were stained in blue. (D) Cell morphology after differentiation. (E) ICC using differentiation-related biomarkers. MyoD and MyoG were stained in red and green, respectively. Nuclei were stained in blue.
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Fig 5.

Fig 5.Effects of H. vulgare on HWSC proliferation and differentiation. (A) Changes in HWSC proliferation rate by treatment with various concentrations of H. vulgar for 6 days. All data are expressed as mean±SD (n≥3). Statistical analysis of the data was performed by one-way ANOVA. Values with different letters display a significant difference (P<0.05). (B) Cell morphology after proliferation. (C) ICC using proliferation-related biomarkers. Pax7 and MyoD were stained in green and red, respectively. Nuclei were stained in blue. (D) Cell morphology after differentiation. (E) ICC using differentiation-related biomarkers. MyoD and MyoG were stained in red and green, respectively. Nuclei were stained in blue.
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Table 1 . Sources of food-derived plant extracts.

NoPlant speciesPart usedHabitat locationYear gathered
1Lycium chinenseFruitsCheongyang, Chungcheongnam-do2018
2Cornus officinalisFruitsGurye, Jeollanam-do2017
3Brassica napusSeedsJindo, Jeollanam-do2018
4Paeonia lactifloraRootsYeongju, Gyeongsangbuk-do2018
5Fagopyrum tartaricum GaerthFruitsYeongwol, Gangwon-do2018
6Schisandra chinensisFruitsMungyeong, Gyeongsangbuk-do2018
7Momordica charantiaFruitsYangju, Gyeonggi-do2018
8Glycyrrhiza uralensisRootsYeongwol, Gangwon-do2017
9Coix lachrymajobi var. mayuenFruitsYeongwol, Gangwon-do2018
10Astragalus membranaceusRootsYeongwol, Gangwon-do2018
11Ziziphus jujubaFruitsBoeun, Chungcheongbuk-do2018
12Poncirus trifoliataFruitsGeochang, Gyeongsangnam-do2018
13Cirsium setidensLeaves, RootsJeongseon, Gangwon-do2018
14Raphanus sativusRootsSeogwipo, Jeju Island2018
15Raphanus sativusLeaves, RootsSeogwipo, Jeju Island2018
16Achyranthes japonica NakaiRootsYeongwol, Gangwon-do2018
17Vigna angularisFruitsYeongwol, Gangwon-do2018
18Hordeum vulgareLeavesAnseong, Gyeonggi-do2019
19Aronia melanocarpaFruitsBoryeong, Chungcheongnam-do2018
20Sesamum indicumSeedsGochang, Jeollabuk-do2018
21Aralia cordata Thunb. var. continentalisRootsGeochang, Gyeongnam2018
22Ligularia fischeriLeavesHongcheon, Gangwon-do2018
23Nelumbo nucifera GaertnRootsDalseong, Daegu2019
24Eucommia ulmoidesStemsGeochang, Gyeongnam2018
25Fallopia multifloraRootsGeochang, Gyeongnam2018
26Gastrodia elata BL.StemsGeochang, Gyeongnam2018
27Phellinus linteusFruiting bodiesSancheong, Gyeongsangnam-do2019
28Hericium erinaceumFruiting bodiesPaju, Gyeonggi-do2019
29Hippophae rhamnoidesFruitsHoengseong, Gangwon-do2018
30Hippophae rhamnoidesLeavesHoengseong, Gangwon-do2018
31Panax ginseng CA MeyerFruitsJeongseon, Gangwon-do2018
32Lentinula edodes (Berk.) PeglerFruiting bodiesGongju, Chungcheongnam-do2019
33Opuntia humifusaLeaves, RootsYeongdeok, Gyeongsangbuk-do2018
34Platycodon grandiflorumRootsSancheong, Gyeongsangnam-do2018
35Arachis hypogaeaLeavesHwaseong, Gyeonggi-do2019
36Avena sativaFruitsJeongeup, Jeollabuk-do2018
37Arctium lappaRootsYecheon, Gyeongsangbuk-do2018
38Disocorea batatasRootsYecheon, Gyeongsangbuk-do2018
39Camellia sinensisLeavesBoseong, Jeollanam-do2018
40Cudrania tricuspidataFruitsIksan, Jeollabuk-do2018
41Cirsium japonicumLeaves, RootsHongcheon, Gangwon-do2019
42Curcuma longaRootsJindo, Jeollanam-do2018
43Moringa oleiferaLeavesSuncheon, Jeollanam-do2018
44Beta vulgarisRootsSuncheon, Jeollanam-do2018
45Chenopodium quinoaSeedsHongcheon, Gangwon-do2019
46Agaricus bisporus (Lange) ImbachFruiting bodiesNonsan, Chungcheongnam-do2019
47Panicum miliaceumFruitsYeongwol, Gangwon-do2018
48Ganoderma lucidumFruiting bodiesChilgok, Gyeongsangbuk-do2019
49Citrus unshiu MarcovFruitsSeogwipo, Jeju-do2019
50Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. BigelowFruiting bodiesYangyang, Gangwon-do2019
51Capsicum annuumFruitsCheongsong, Gyeongsangbuk-do2019
52Juglans regia DodeFruitsYeongdong, Chungcheongbuk-do2019
53Canavalia ensiformisFruitsSuncheon, Jeollanam-do2019
54Cordyceps millitarisFruiting bodiesHoengseong, Gangwon-do2019
55Pteridium aquilinumLeavesSancheong, Gyeongsangnam-do2019
56Fragaria x ananassaFruitsGochang, Jeollabuk-do2019
57Sparassis crispa (Wulf.) Fr.Fruiting bodiesSancheong, Gyeongsangnam-do2019
58Arachis hypogaeaFruitsGochang, Jeollabuk-do2019
59Malus pumilaFruitsGumi, Gyeongsangbuk-do2019
60Aruncus dioicusLeaves, RootsHongcheon, Gangwon-do2019
61Aster scaber ThunbLeaves, RootsHongcheon, Gangwon-do2019
62Brassica oleracea var. italicaLeavesYeongju, Gyeongsangbuk-do2019
63Prunus persicaFruitsIcheon, Gyeonggi-do2019
64Rhynchosia NulubilisSeedsYeongwol, Gangwon-do2018
65Glycine max Merr.SeedsYeongwol, Gangwon-do2018
66Glycine max Merr.SeedsSangdong, Gangwon-do2019
67Panax ginseng C.A. MeyerRootsGeumsan, Chungcheongnam-do2019
68Perilla frutescensLeavesMiryang, Gyeongsangnam-do2020
69Allium monanthum MAX.WholeTaean, Chungcheongnam-do2020
70Codonopsis lanceolata (Siebold & Zucc.) Trautv.RootsHoengseong, Gangwon-do2019
71Citrus limonFruitsJeju, Jeju Island2020
72Pleurotus ferulaeFruiting bodiesChilgok, Gyeongsangbuk-do2020
73Capsicum annuum var. angulosumRed fruitsChangwon, Gyeongsangnam-do2020
74Capsicum annuum var. angulosumYellow fruitsChangwon, Gyeongsangnam-do2020
75Ipomoea aquaticaLeaves, RootsAnsan, Gyeonggi-do2020
76Spinacia oleraceaLeaves, RootsAnsan, Gyeonggi-do2020
77Melissa officinalisLeaves, RootsPyeongtaek, Gyeonggi-do2020
78Thymus vulgarisLeaves, RootsPyeongtaek, Gyeonggi-do2020
79Aralia elataLeavesHaenam, Jeollanam-do2020
80Coriandrum sativumAbove groundAnsan, Gyeonggi-do2020
81Coriandrum sativumRootsAnsan, Gyeonggi-do2020
82Brassica campestrisAbove groundAnsan, Gyeonggi-do2020
83Ocimum basilicumAbove groundPyeongtaek, Gyeonggi-do2020
84Triticum aestivumLeavesUiwang, Gyeonggi-do2020
85Passiflora edulisFruits, SeedsHadong, Gyeongsangnam-do2020
86Passiflora edulisSkinsHadong, Gyeongsangnam-do2020
87Morus alba LFruitsSancheong, Gyeongsangnam-do2020
88Brassica oleracea var. acephalaAbove groundYongin, Gyeonggi-do2020
89Morus alba LLeavesSancheong, Gyeongsangnam-do2020
90Zingiber officinaleRootsAndong, Gyeongsangbuk-do2020
91Pyrus pyrifoliaFruitsNaju, Jeollanam-do2020
92Allium sativumStemsChangnyeong, Gyeongsangnam-do2020
93Brassica junceLeavesYeosu, Jeollanam-do2020
94Flammulina velutipesFruiting bodiesCheongdo, Gyeongsangbuk-do2021
95Oenanthe javanica (Blume) DC.Leaves, RootsCheongdo, Gyeongsangbuk-do2021
96Cichorium intybusLeavesChungju, Chungcheongbuk-do2021
97Brassica junceaLeavesChungju, Chungcheongbuk-do2021
98Rubus crataegifolius BungeFruitsMiryang, Gyeongsangnam-do2021
99Asparagus officinalisLeaves, RootsHwacheon, Gangwon-do2021
100Panax ginseng C.A. MeyerRootsDanyang, Chungcheongbuk-do2021
101Panax ginseng C.A. MeyerLeaves, RootsDanyang, Chungcheongbuk-do2021
102Allium microdictyon Prokh.LeavesHongcheon, Gangwon-do2021
103Miricacalia firmaLeavesHongcheon, Gangwon-do2021
104Ligularia stenocephala MatsumLeavesHongcheon, Gangwon-do2021
105Acantho panaxLeavesHongcheon, Gangwon-do2021
106Pleurospermum camtschaticumLeavesHongcheon, Gangwon-do2021
107Prunus mumeFruitsGwangyang, Jeollanam-do2021
108Zea mays L.FruitsJeju, Jeju Island2021
109Zea mays L.StyleJeju, Jeju Island2021
110Eriobotrya japonicaFruitsWando, Jeollanam-do2021
111Eriobotrya japonicaLeavesWando, Jeollanam-do2021
112Prunus mumeFruitsGwangyang, Jeollanam-do2021
113Aster glehnii F.SchmidtLeaves, RootsSeongju, Gyeongsangbuk-do2021
114Prunus armeniacaFruitsYeongcheon, Gyeongsangbuk-do2021
115Vaccinium myrtillus L.FruitsHongseong, Chungcheongnam-do2021

Table 2 . SPR responses of eight selected plant species to MyoD and Pax7 proteins.

Ethanol extractionHot water extraction
NoPlant speciesMyoDPax7NoPlant speciesMyoDPax7
20S. indicum18H. vulgare++
21A. cordata Thunb. var. continentalis95O. javanica (Blume) DC.+ND
91P. pyrifolia++99A. officinalis
101P. ginseng C. A. Meyer104L. stenocephala MatsumNDND

Table 3 . Effect of extracted plant parts and extraction methods on HWSC proliferation.

Plant partTotal number of plantsProportion of plants with proliferation efficiency by plant extraction part (%)
Ethanol extractionHot water extraction
Above ground41)-50
Fruiting bodies1010(40)2)
Fruits352.85(25.7)-22.9
Fruits, Seeds1
Leaves21-4.8-19
Leaves, Roots14-42.9-21.4
Roots1811.1(33.3)
Seeds6-33.3
Skins1
Stems333.3(33.3)
Styles1
Whole1
Total1154.35(25.2)-14.8

1)-: No plants showed increased proliferation efficiency..

2)Significant increases in proliferation compared to 10% FBS are shown outside parentheses, and non-significant increases in proliferation mean are shown in parentheses..


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