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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(9): 997-1006

Published online September 30, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.9.997

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Protective Effect of Ethyl Acetate Fraction from Domestic Walnut (Juglans regia) against PM2.5-induced Inflammation and Apoptosis

Jong Hyun Moon1 , Tae Yoon Kim1 , Uk Lee2, Jong Min Kim1, Hyo Lim Lee1, Min Ji Kim1, Hye Rin Jeong1, Min Ji Go1, Seung Gyum Joo1, and Ho Jin Heo1

1Division of Applied Life Science (BK21), Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University
2Divsion of Special Forest Resources, Department of Forest Bioresources, National Institute of Forest Science (NIFoS)

Correspondence to:Ho Jin Heo, Division of Applied Life Science (BK21), Gyeongsang National University, 501, Jinju-daero, Jinju, Gyeongnam 52828, Korea, E-mail: hjher@gnu.ac.kr
*These authors contributed equally to this work.

Received: May 17, 2022; Revised: July 14, 2022; Accepted: August 10, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

This study examined the protective effect of the ethyl acetate fraction from domestic walnut (Juglans regia) as a Gimcheon 1 ho (EFGC) cultivar on particulate matter (PM)2.5-induced cytotoxicity in hippocampal HT22 cells. EFGC had the highest total phenolic contents, total flavonoid contents, and total tannin contents compared to other fractions. In addition, EFGC showed significant 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS), and 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazl (DPPH) radical scavenging activities and ferric reducing/antioxidant power (FRAP). The EFGC presented an inhibitory effect of malondialdehyde (MDA) production and acetylcholinesterase (AChE) activity. The EFGC effectively decreased intracellular reactive oxygen species (ROS) contents and cellular death on hippocampal cells against PM2.5 cytotoxicity. The EFGC improved inflammatory reaction and apoptosis by regulating protein expression, such as BCl-2, p-JNK, BAX, caspase-1, and p-NF-κB.

Keywords: walnut, Juglans regia, PM2.5, inflammation, apoptosis

미세먼지는 대기오염 물질 중 하나로 오존, 이산화질소 등과 결합하여 건강을 위협하는 요소로써 최근 미세먼지에 관한 관심이 높아지고 있으며 그 위험성 또한 보고되고 있다(Ritz 등, 2019). 과거부터 수많은 역학 연구에서 미세먼지는 전 세계에서 4번째로 위험한 조기 사망 위험 요소이며, 2013년에는 WHO 산하 국제 암 연구소(International Agency for Research on Cancer, IARC)에서 1군 발암 물질로 지정하였다(Hamra 등, 2014). 미세먼지는 자연적으로 먼지, 바다 소금, 꽃가루, 화산재, 곰팡이 포자, 산불에 의해 생성되며, 인공적인 원인으로는 화석연료의 연소, 시멘트, 석회 및 화학물질을 제조하는 등 산업공정에서 만들어지는 입자와 분진, 디젤 차량에서 나오는 배기가스 등이 있다(Shah 등, 2004). 다양한 원인으로 발생 되는 미세먼지는 질소산화물, 황산화물 등을 포함하며, 이는 화학반응을 통하여 질산암모늄, 황산암모늄을 생성하고 대기 중에서 응축되어 2차 미세먼지를 생성한다(Mangia 등, 2015). 이는 직경에 따라 particulate matter(PM)10(≤10 μm), PM2.5(≤2.5 μm) 및 PM0.1(≤0.1 μm)로 분류되며, 상대적으로 직경이 작은 초미세먼지인 PM2.5와 PM0.1은 폐포 깊숙이 침투하여 침착되고 폐 세포벽을 통과해 혈액으로 흡수되어 뇌, 심장, 신장 등과 같은 다른 기관이나 조직에 손상을 줄 수 있다고 보고되고 있다(Wang 등, 2017).

PM2.5는 혈액을 타고 이동하며 혈뇌장벽(blood-brain barrier, BBB)까지 도달하여 BBB의 막 수송체를 변형시키고, 밀착 연접 단백질(tight junction protein)을 느슨하게 만들어 PM2.5가 뇌 조직 내부로 유입될 수 있다고 알려져 있다(Kim 등, 2020b). 또한, PM2.5는 호흡기를 통해 흡수될 뿐만 아니라 후각상피 세포를 통해 직접적으로 체내로 흡수되며 olfactory bulb를 거쳐 뇌의 다양한 부위에 도달하여 손상을 줄 수 있다고 보고되고 있다(Chen 등, 2020). 다양한 경로로 뇌에 도달한 PM2.5는 산화적 스트레스로 인한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성, 톨 유사 수용체 4(Tall-like receptor 4, TLR-4)와 결합하여 inflammasome을 형성하고 interleukin 1 beta(IL-1β)와 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)와 같은 전염증성 사이토카인의 발현을 유도한다(Woodward 등, 2017). 발현된 염증성 사이토카인은 신경계의 염증을 유발하고, 인산화 된 Tau 단백질과 amyloid-beta plaque 생성 등을 유도하여 뇌 신경세포를 손상시켜 궁극적으로 인지기능의 장애를 초래한다고 알려져 있다(Calderón-Garcidueñas 등, 2012). 따라서 PM2.5로 유도되는 세포독성으로 인한 인지기능 저하를 예방할 수 있는 소재에 대한 수요가 지속해서 증가하고 있어 다양한 천연 소재에 관한 연구가 필요한 실정이다.

호두(Juglans regia)는 ellagic acid, ellagitannin, phenolic acid 등과 같은 다양한 항산화 물질과 비타민 E 함량이 풍부하게 함유되어 있어 영양학적 가치가 높은 것으로 보고되고 있다(Moon 등, 2020). 또한, 미국 또는 중국의 호두 품종과 비교하여 국내산 품종에서 linoleic acid, α-linolenic acid, DHA와 같은 다중 불포화 지방산이 특히 풍부하고, 천연 항산화제인 α-토코페롤과 γ-토코페롤 등을 함유하는 것으로 보고되고 있다(Kim 등, 2020a). 특히 국산 호두 품종이 수입 품종보다 뛰어난 in vitro 뇌 신경세포 보호 효과를 확인했으며, 국내산 호두는 amyloid beta(Aβ)로 신경독성이 유도된 마우스에서 BBB의 기능을 개선시킨다고 보고하였다(Moon 등, 2020; Kim 등, 2020b). 미세먼지에 대한 노출 및 흡입은 미세먼지의 세포 내 침투를 야기하여 산화적 스트레스를 생성할 수 있으며, 더불어 구성 물질인 중금속에 의한 독성 또한 발생할 수 있기 때문에 더욱 심각한 세포 손상을 유발할 수 있다(Yuan 등, 2019). 사전 연구를 통해 국내산 호두가 H2O2로 유도된 신경세포 독성에 대해 우수한 활성을 나타냈으며(Moon 등, 2020), 미세먼지로 인한 독성에 대한 보호 효과 역시 뛰어날 것으로 판단되었다. 그러므로 본 연구에서는 호두를 이용하여 in vitro 항산화 활성과 PM2.5로 유도되는 독성에 의한 뇌 신경세포의 보호 효과를 확인하고 개선 기작을 평가함으로써 PM2.5로 유도될 수 있는 질환을 예방하는 기능성 소재로서의 가능성을 확인하고자 한다.

재료

본 실험에 사용된 시약은 Folin & Ciocalteu’s phenol reagent, Na2CO3, gallic acid, NaOH, diethylene glycol, rutin, sodium phosphate buffer, 2,2′-azinobis(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), potassium persulfate, 1,1-diphenyl 2-picrylhydrazyl(DPPH), sodium acetate buffer, HCl, 2,4,6-tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazine(TPTZ), trichloroacetic acid, thiobarbituric acid, ascorbic acid, catechin, tris HCl buffer, 5,5′-dithiobis 2-nitrobenzoic acid(DTNB), acetylthiocholine, 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA), 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM), dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 세포독성 유도를 위한 PM2.5(평균직경 1.06 μm)는 Power Technology Inc.(Arizona Test Dust, Arden Hills, MN, USA)에서 구입하였다. 그 외 사용된 용매 및 시약은 모두 1급 이상의 등급을 사용하였다.

추출물 제조

본 연구에 사용된 시료는 국내산 호두(Juglans regia) 김천 1호(Gimcheon 1 ho) 품종은 2018년 경북 김천시 시험림에서 재배된 것을 사용하였으며, 국립산림과학원(Suwon, Korea)의 정보를 바탕으로 구매하였다. 시료는 과육을 분리하여 동결건조기(FDU-8612, Operon, Gimpo, Korea)를 이용하여 동결건조하였고 노즐식 진공포장기(AZ-450E, Intrise, Ansan, Korea)로 시료를 진공 포장한 후 -20°C에서 보관하였다. 보관된 시료 80 g에 80% 에탄올을 4 L 첨가하여 40°C에서 환류 냉각하에 2시간 동안 추출을 진행하였다. 추출물은 감압농축기(N-N series, EYELA Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하여 400 mL로 정용한 후 동일한 부피의 노말 헥세인(n-hexane), 클로로포름(chloroform) 및 아세트산 에틸(ethyl acetate)을 이용하여 분획을 순차적으로 진행하였다. 분획을 통하여 획득한 각 용매의 분획물은 동결건조하여(FDU-8612, Operon) -20°C에서 보관하였다.

총 페놀성 화합물 함량 측정

총 페놀성 함량은 시료 1 mL와 증류수 9 mL, Folin & Ciocalteu’s phenol 시약을 1 mL 혼합하여 상온에서 5분간 반응시킨 후 7% Na2CO3 10 mL와 증류수 4 mL를 첨가하였다. 2시간 반응시킨 후 760 nm에서 흡광도를 측정(UV-1800, Shimadzu, Tokyo, Japan)하였으며, gallic acid equivalents(mg of GAE/g)로 결과를 나타내었다(Kim 등, 2003).

총 탄닌 함량 측정

총 탄닌 함량은 polyvinylpolypyrrolidone(PVPP)을 증류수에 용해한 후 시료 0.5 mL와 혼합하였다. 혼합액을 원심분리(3,000×g, 10분, 4°C)하여 취한 상등액을 총 페놀성 화합물 함량 측정과 동일한 방법으로 수행하였으며, tannic acid equivalents(mg of TAE/g)로 결과를 나타내었다.

총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량은 시료 1 mL에 diethylene glycol 10 mL, 그리고 1 N NaOH를 첨가한 후 30°C에서 한 시간 동안 반응시킨 뒤 420 nm에서 흡광도를 측정(UV-1800, Shimadzu)하였으며, rutin equivalents(mg of RE/g)로 결과를 나타내었다(Kim 등, 2003).

라디칼 소거 활성 효과 측정

ABTS 라디칼 소거 활성은 150 mM NaCl을 포함한 100 mM 인산 완충 용액을 2.45 mM ABTS와 1.0 mM[2,2′-azobis-(2-amidinopropane)·HCl]을 혼합하여 68°C에서 가열한 후, 여과하여 24시간 동안 냉장보관 하였다. 734 nm에서 흡광도를 0.70±0.02가 되게 조정한 DPPH 시약을 시료와 혼합하여 37°C에서 10분간 반응시켜 734 nm에서 흡광도를 측정(UV-1800, Shimadzu)하였다(Kim 등, 2003).

DPPH 라디칼 소거 활성은 DPPH 시약을 517 nm 파장에서 흡광도 값이 1.00±0.02가 나오도록 하여 실험에 사용하였다. 시료 50 μL에 DPPH 용액 1.45 mL를 혼합하여 암실에서 30분간 반응시킨 뒤, 517 nm의 파장에서 흡광도 값을 측정(UV-1800, Shimadzu)하였다(Blois, 1958).

지질과산화물 생성 억제 능력 측정

지질과산화물 생성 억제 능력측정을 위한 실험방법은 다음과 같다. 뇌 조직을 이용하여 지질과산화물 생성 억제 능력을 측정하기 위하여 4주령의 수컷 Institute of Cancer Research(ICR) 마우스를 실험동물 공급업체(Samtako, Osan, Korea)로부터 구입하였다. 항온과 항습을 유지하며 12시간마다 낮과 밤을 교대시키는 동일한 환경에서 충분한 식수와 사료를 공급하며 1주간 적응시켰다. 사육된 마우스의 뇌를 적출하여 뇌 무게의 10배에 해당하는 20 mM tris HCl buffer(pH 7.4)를 첨가하여 균질화시켰으며, 원심분리(12,000×g, 15분, 4°C)하여 얻어진 상등액을 실험에 사용하였다. 뇌 조직 상등액 0.1 mL, 10 mM FeSO4 0.1 mL, 0.1 mM ascorbic acid 0.1 mL, 시료 0.2 mL를 혼합하여 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 30% trichloroaceteic acid 0.1 mL와 1% tiobarbituric acid 0.3 mL를 첨가하여 80°C에서 20분간 가열한 후 원심분리를 통하여 상등액을 얻었다. 이렇게 얻어진 상등액을 532 nm에서 흡광도를 측정(UV-1800, Shimadzu)하였다(Chang 등, 2001). 본 동물실험은 경상국립대학교 동물윤리심의 위원회의 심의를 거쳐서 진행되었다(경상국립대학교 동물실험 인가번호: GNU-120831-M0067).

철의 환원 능력 측정

Ferric reducing/antioxidant power(FRAP)는 300 mM sodium acetate buffer(pH 3.6), 10 mM TPTZ in 40 mM HCl과 20 mM FeCl3(Ⅲ)로 구성된 TPTZ 용액을 제조하여 FRAP 실험에 사용하였다. 이 용액을 sodium acetate buffer(pH 3.6)와 FeCl3(Ⅲ)를 혼합하여 37°C에서 15분간 반응시켜 FRAP 혼합액을 제조하였다. FRAP 혼합액 1.5 mL에 추출물 50 μL를 반응시켜 실온에서 30분간 반응한 후 593 nm에서 흡광도 값을 측정(UV-1800, Shimadzu)하였다(Benzie와 Strain, 1996).

아세틸콜린 분해효소 억제 효과 측정

아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase, AChE) 억제 활성 측정은 아이오딘화아세틸콜린을 기질로 사용하여 측정하는 것으로 AChE는 rat의 부신 수질에서 유래한 PC12 세포배양액을 2,000 rpm으로 6분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 균질화 완충 용액[1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 1% Triton X-100(pH 7.2)] 2 mL를 첨가하여 균질화하였다. 이 세포배양액을 12,000×g에서 30분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하여 실험에 사용하였다. 모든 추출과정은 4°C에서 수행되었으며 효소 추출의 단백질 함량은 Bradford protein assay를 이용하여 정량하였다(Bradford, 1976).

뇌 해마세포(HT22) 배양

본 실험에서 사용된 HT22 세포는 마우스의 뇌 해마 조직에서 유래하였으며, 인지기능 저하와 알츠하이머병과 관련된 해마의 기능 저하 연구를 수행할 때 사용된다(Liu 등, 2009). HT22 세포는 경상국립대학교 수의대학 조직학실험실에서 분양받아(2017년 10월) 사용되었으며, 10% calf serum(CS), 50 units/mL penicillin과 streptomycin이 포함된 DMEM에서 37°C, 5% CO2 조건에서 배양되었다.

마우스 유래 뇌 해마세포(HT22)에서의 세포 생존율과 산화적 스트레스 생성 억제 효과 측정

마우스 유래 뇌 해마세포(HT22)에 대한 보호 효과를 측정하기 위해 MTT 분석법을 이용하여 실험을 진행하였다. 뇌 해마세포를 24시간 동안 배양하고 시료를 처리한 후 PM2.5를 처리하여 24시간 배양하였다. PM2.5를 처리한 HT22 세포에 MTT 용액을 처리하여 37°C에서 2시간 배양시킨 후 DMSO를 첨가하여 반응을 종결시키며, 이를 마이크로 플레이트판독기(Epoch 2, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 활용하여 570 nm(determination)와 655 nm(reference)에서 측정하였다(Heo 등, 2001).

산화적 스트레스의 생성 억제 효과를 측정하기 위해 DCF-DA 분석법을 이용하여 실험을 진행하였다. MTT 분석법과 동일하게 HT22 세포를 배양하여 실험을 진행하였으며, PM2.5를 처리한 뒤 50 μM DCF-DA를 처리한 후 DCF 함량을 측정하였다. 형광측정은 형광광도계(fluorometer, infinite F200, Tecan, Männedorf, Swiss)를 이용하여 485 nm(excitation filter)와 535 nm(emission filter)의 파장에서 측정하였다(Heo 등, 2001).

단백질 발현량 측정

단백질 발현량 측정을 위한 HT22 세포는 세포 내 산화적 스트레스 생성 억제 효과 및 생존율 측정과 동일한 조건으로 전처리하였으며 PM2.5를 처리한 후 12시간 동안 반응시켰다. 이후 1% protease inhibitor가 첨가된 RIPA 완충 용액을 세포에 처리한 후 13,000×g, 10분, 4°C 조건에서 원심분리 후 분리된 상등액을 실험에 사용하였다. 단백질 정량을 위하여 Bradford protein assay를 이용하여 정량하였다(Bradford, 1976). 세포의 단백질들은 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 분리하여 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane으로 이동시켰다. Membrane을 5% skim milk를 이용하여 1시간 동안 blocking 한 후 세척하였다. 이후 0.5% bovine serum albumin과 0.1% sodium azide를 포함한 TBST 용액을 이용하여 500:1로 희석한 1차 항체를 overnight 동안 반응시켰으며, 이후 세척 하여 2차 항체를 1시간 동안 반응시켰다. 항체와 반응시킨 membrane을 ECL solution(ECL Ottimo, TransLab, Daejeon, Korea)을 이용하여 발색시켰으며, 이는 ChemiDoc iBright Imager(CL1000 instrument, Invitrogen, Carsbad, CA, USA)를 이용하여 밀도를 측정하였고 수치화된 밀도 값은 β-actin의 값으로 나누어서 계산하였다.

통계처리

모든 실험은 반복하여 진행하였으며, 평균±표준편차로 나타내었다. 각 실험에 관한 값들은 SAS software(ver. 9.4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)와 one-way analysis of variance(ANOVA)에 의하여 평가되었으며, 그룹 간의 유의성은 Duncan의 다중범위검정법(Duncan’s new multiple-range test)으로 시행하였다(P<0.05).

총 페놀성 화합물, 탄닌 및 플라보노이드 함량 측정

페놀성 화합물과 플라보노이드는 식물의 2차 대사산물로써, 과일, 차, 채소류 등과 같은 많은 식물에서 발견되며 페놀성 화합물과 플라보노이드는 전자 또는 수소 원자를 제공하여 자유라디칼을 소거하거나, 3-hydroxy group과 같은 특정 hydroxy 그룹은 항산화 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Tsao, 2010). 가장 항산화 활성이 우수한 에탄올 추출물을 선정하기 위하여 농도를 0, 20, 40, 60, 80 및 95%로 사용하여 40°C에서 2시간 환류 냉각하에 추출을 진행하였다. 사전 연구를 통해 80% 에탄올 추출물이 가장 우수한 것을 확인하였고, 이를 이용하여 n-hexane, chloroform, 아세트산 에틸 순으로 분획을 실시하였다(Moon 등, 2020). 얻어진 분획물을 이용하여 총 폴리페놀 함량, 총 탄닌 함량 그리고 총 플라보노이드 함량을 측정하였을 때, 아세트산 에틸 분획물이 가장 높은 함량을 나타내었다(data not shown). 호두 아세트산 에틸 분획물의 총 페놀성 화합물의 함량은 815.83 mg of GAE, 총 탄닌 함량은 805.48 mg of TAE, 그리고 총 플라보노이드 함량은 138.54 mg of RE로 나타났다(Table 1).

Table 1 . Antioxidant activity of ethyl acetate fractions fromJuglans regia Gimcheon 1 ho (EFGC)

TPC1)TTC2)TFC3)ABTS4)DPPH5)FRAP6)MDA7)
815.83±26.02805.48±24.95138.54±0.9471.4499.470.74±0.030.44

1)TPC: total phenolic content. 2)TTC: total tannin content. 3)TFC: total flavonoid content. 4)ABTS: ABTS radical scavenging activity. 5)DPPH: DPPH radical scavenging activity. 6)FRAP: ferric reducing antioxidant power. 7)MDA: malondialdehyde inhibitory effect.

Results shown are mean±SD (n=3). Results of TPC, TTC, and TFC are presented as mg of GAE/g, mg of TAE/g, and mg of RE/g, respectively. Results of ABTS, DPPH, and MDA are presented as IC50 value (μg/mL). Result of FRAP is presented as absorbance at 593 nm.



호두 과육의 에테르, 부탄올, 아세트산 에틸로 분획하여 항산화 능력을 측정하였을 때 아세트산 에틸 분획물이 가장 높은 항산화 활성을 보였으며, 이는 호두에 포함된 tannin, tannic acid, gallic acid와 같은 생리활성 물질들이 아세트산 에틸 분획물에 가장 많이 함유된 것으로 판단된다(Zhang 등, 2009). 항산화 능력과 세포 생존률, 산화적 스트레스 감소와 같은 생리활성은 페놀성 화합물, 탄닌 등과 같은 생리활성 물질들에 의해 나타나는 것으로 판단되어 추후 실험은 가장 높은 함량들을 가진 호두 아세트산 에틸 분획물(EFGC)을 이용하여 진행되었다.

라디칼 소거 활성 효과

EFGC의 라디칼 소거 활성 효과를 평가하기 위해 ABTS와 DPPH를 이용하여 라디칼 소거 활성을 평가하였다(Table 1). ABTS 라디칼 소거 활성은 시료가 가지고 있는 다양한 항산화 물질에 의해 ABTS가 가지고 있는 라디칼이 제거되어 청록색이 탈색되는 방법을 이용한 방법이다(Re 등, 1999). EFGC의 ABTS 라디칼 소거 활성의 IC50은 71.44 μg/mL로 나타났으며, 양성대조군인 비타민 C의 IC50(113.05 μg/mL) 값과 비교해 보았을 때 EFGC는 양성대조군보다 높은 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거 활성은 라디칼을 띄는 DPPH가 시료 속 항산화 물질에 의해 환원되면서 고유의 자색이 탈색되는 원리를 이용한 방법이다(Blois, 1958). EFGC의 DPPH 라디칼 소거 활성의 IC50은 99.47 μg/mL로 양성대조군인 비타민 C의 IC50(108.66 μg/mL)과 비교해 보았을 때 양성대조군보다 우수한 라디칼 소거 활성을 보였다.

산화적 스트레스에 의해 생성된 라디칼은 높은 반응성을 가지고 있어 연쇄적으로 산화적 스트레스를 유발하고 세포 사멸, 염증과 같은 질병과 노화를 촉진한다(Yu 등, 2002). 라디칼 소거 활성을 가지는 페놀성 화합물이나 플라보노이드가 풍부하게 포함된 식품은 인체에서 자유 라디칼을 소거하여 산화적 스트레스로부터 유발되는 다양한 질병을 예방할 수 있다고 알려져 있다(Prakash 등, 2007). Gulcin의 연구에 의하면 호두에 풍부하게 함유되어 있는 탄닌산(tannic acid)은 양성대조군으로 사용된 합성 항산화제인 dibutyl hydroxy toluene(BHT), butylated hydroxyanisole(BHA)보다 우수한 ABTS와 DPPH 라디칼 소거 활성을 보였다(Gülcin 등, 2010). 사전에 수행된 연구에서 중국산 품종과 비교하여 국내산 호두에 토코페롤이 다량 함유되어있는 것이 확인되었으며, 이는 자유라디칼 소거 활성으로 인한 심혈관 질환 및 다양한 질환을 예방하는데 우수한 활성을 나타낸다고 알려져 있다(Kim 등, 2020b). 따라서 본 실험에서 확인한 우수한 ABTS와 DPPH 라디칼 소거 활성은 EFGC에 포함된 탄닌과 토코페롤 등과 같은 생리활성 물질들에 의해 기인하는 것으로 판단된다.

1철의 환원능력 측정

철의 환원능력은 산성 조건에서 시료에 포함된 항산화 물질에 의해 TPTZ의 Fe3+이 Fe2+로 환원되면서 무색에서 푸른색으로 색이 변하는 원리를 이용한 방법이다(Benzie와 Strain, 1996). 이러한 원리를 이용하여 EFGC를 이용하여 철의 환원능력을 평가하였다(Table 1). EFGC의 철의 환원능력은 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였으며, 200 μg/mL 농도에서 EFGC는 0.74의 환원능력을 나타내었으며 이는 양성 대조군인 비타민 C(0.66)의 환원능력 대비 유의적으로 우수한 철의 환원능력을 나타내었다. Zhang과 Lin(2009)이 수행한 연구에서 Syzygium cumini 추출 탄닌은 호두와 유사하게 gallic acid 및 ellagic acid 등으로 구성되어 매우 우수한 철의 환원능력을 나타내었으며, gallic acid와 ellagic acid는 비타민 C와 유사한 환원능력을 가진다고 보고되고 있다(Sethiya 등, 2014). 따라서 EFGC의 항산화 활성은 EFGC에 함유된 gallic acid나 ellagic acid와 같은 생리활성물질에 기인한 것으로 판단된다.

지질과산화물 생성억제능력 측정

뇌 조직은 다른 조직에 비해 불포화 지방산의 함량이 높아 산화적 스트레스에 취약하고 PM2.5의 노출에 의해 생성되는 ROS로부터 손상되기 쉬워 세포막의 지질과산화가 쉽게 일어나고 malondialdehyde(MDA) 등과 같은 지질과산화물의 생성을 야기한다(Han 등, 2020). 따라서 EFGC에 대한 지질과산화물의 생성 억제 능력을 측정하기 위하여 ICR 마우스로부터 적출한 뇌 조직을 사용하여 지질과산화물의 생성 억제 능력을 평가하였다(Table 1). EFGC의 지질과산화물 생성 억제 능력의 IC50은 0.44 μg/mL로, 양성대조군인 카테킨(20.41 μg/mL)과 비교해 보았을 때(data not shown), 현저하게 높은 지질과산화물 생성 억제 능력을 나타내었다. 탄닌은 호두에 풍부하게 함유되어 있는 생리활성 물질로 gallic acid ester나 flavan-3-ol 중합체로 구성되어있으며, 산화방지능력을 가지고 있다고 보고되고 있다(Riedl 등, 2002). Uchida 등(1990)이 수행한 연구에서 감에서 추출된 탄닌으로 in vitro 지질과산화물 생성 억제 능력을 연구하였을 때, 지질과산화물의 생성을 강력하게 억제했다고 보고했다. 따라서 EFGC의 지질과산화물 생성 억제 능력은 항산화 능력을 가지며 호두에 풍부하게 포함된 탄닌이나 탄닌 화합물로 인한 산화적 스트레스의 감소에 기인하는 것으로 판단된다.

아세틸콜린 분해효소 억제 효과 측정

아세틸콜린은 중추, 말초 신경계에 존재하는 신경전달 물질이며 신경 자극으로 인한 신호 전달에 관여하여 신경전달의 기능을 수행한다(Fedotova 등, 2020). 합성된 아세틸콜린은 시냅스 틈으로 운반된 후 시냅스 후 뉴런의 아세틸콜린 수용체에 결합함으로써 신호 전달을 진행하고 신호 전달이 완료되면 아세틸콜린은 수용체에서 분리되어 AChE에 의해 acetate와 choline으로 분해됨으로써 신경전달 과정은 종결된다(Gu와 Wang, 2021). 뇌로 유입되는 PM2.5로 인한 산화적 스트레스나 활성산소종 등의 다양한 원인으로 인하여 acetylcholine의 생성을 감소시키고 AChE의 활성을 과도하게 증가시켜 인지기능 장애에 영향을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다(Winkler 등, 1998). 따라서 본 연구에서는 EFGC의 AChE의 억제 활성을 평가하여 인지기능의 저하를 예방할 수 있는 기능성 소재로서의 사용 가능성을 확인하였다(Fig. 1A).

Fig. 1. Acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activity and neuronal protective effect of ethyl acetate fraction from Juglans regia Gimcheon 1 ho (EFGC) on PM2.5-induced cytotoxicity in HT22 cells. (A) Acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activity. (B) Cell viability of EFGC on PM2.5-induced cytotoxicity in HT22 cells. (C) Effect of EFGC on PM2.5-induced oxidative stress in HT22 cells. Results shown are mean±SD (n=3). Data were statistically considered at P<0.05, and different small letters represent a statistical difference.


EFGC의 200 mg/mL의 농도에서 22.29%의 억제 활성을 나타냈으며, 농도가 낮아짐에 따라 억제 활성이 감소하는 경향을 보였다. 호두에 함유된 탄닌과 탄닌산 화합물은 장내 대사를 통해 ellagic acid나 tannic acid 등으로 분해되고, 이는 인체로 흡수되어 우수한 AChE 억제 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Tejada 등, 2017; Turkan 등, 2019). 또한, 호두가 풍부하게 함유된 식단은 알츠하이머병으로 형질 전환된 마우스 모델에서 기억력, 학습능력 및 불안장애가 크게 개선된 것이 확인되었다(Muthaiyah 등, 2014). 더불어 호두의 구성 지방산인 conjugated linoleic acid(CLA)는 정상적인 뇌신경 발달과 인지기능에 필요하다고 알려져 있으며, α-linoleic acid는 Aβ로 유도된 인지기능 장애 마우스 모델에서 신경염증과 세포사멸을 완화한다고 보고되고 있다(Ali 등, 2020; Geddes 등, 2017). 따라서 본 실험을 통해 EFGC에 다량으로 함유된 탄닌 화합물과 다중 불포화지방산 등으로 기인하는 AChE 억제 활성을 평가하여 EFGC가 향후 뇌 신경세포 기능 개선에 도움을 줄 수 있는 천연소재로서의 이용 가치가 있음을 확인하였다.

뇌 신경세포에서의 세포 생존율 측정과 산화적 스트레스 억제 효과

PM2.5에 노출되면 PM2.5가 폐로 흡입되어 혈액을 타고 뇌에 도달하거나, 비강을 통하여 BBB를 쉽게 통과하여 뇌로 이동한다(Chen 등, 2020). 뇌 조직은 다른 조직보다 불포화 지방산의 비율이 상대적으로 높아 산화적 스트레스에 취약하기 때문에, 흡입을 통하여 뇌로 도달한 PM2.5는 ROS 생성이나 산화적 스트레스를 일으키게 되고 이는 결과적으로 신경세포의 사멸을 초래한다(Han 등, 2020). 따라서 PM2.5로 유도된 산화적 스트레스에 대한 EFGC가 가지는 세포보호 효과를 확인하고자 세포 생존율과 산화적 스트레스 억제 활성을 확인하였다(Fig. 1B, C).

본 연구에서 진행된 PM2.5로 유도된 산화적 스트레스에 대하여 세포 생존율을 측정한 결과는 다음과 같다(Fig. 1B). PM2.5로 인하여 세포독성을 유도한 HT22 cell에서의 세포 생존율은 PM2.5만 단독으로 처리한 그룹은 정상 대조군(100%) 대비 77.69%의 생존율을 나타내었으며, 20 μg/mL의 농도로 EFGC를 처리하였을 때 85.54%의 세포 생존율을 나타내었다. PM2.5와 양성대조군인 카테킨을 처리한 그룹에서는 정상 대조군 대비 94.96%의 세포 생존율을 나타내었다.

본 연구에서 진행된 PM2.5로 유도된 산화적 스트레스의 억제 효과는 다음과 같다(Fig. 1C). PM2.5를 이용하여 산화적 스트레스를 유도한 HT22 cell에서 산화적 스트레스의 함량을 측정하였을 때, PM2.5를 처리한 그룹에서는 정상대조군(100%) 대비, ROS 생성이 18.60% 증가한 것을 나타냈으며, PM2.5와 20 μg/mL의 EFGC를 동시에 처리한 그룹에서는 ROS가 정상 대조군 대비 31.17% 감소한 값을 나타내었다. 양성대조군인 카테킨과 PM2.5를 동시에 처리한 그룹에서는 41.09% 감소한 ROS 값을 나타내었다.

다양한 경로를 통해 PM2.5가 해마에 도달하면 신경독성 및 산화적 스트레스를 일으켜 해마의 부피 및 피질 두께 감소, 뇌졸중 발병률 증가, 인지기능 장애를 초래한다고 보고되고 있다(Liu 등, 2021). 호두에는 탄닌산 화합물, 다가불포화지방산이 풍부하게 함유되어 있으며, 이러한 생리활성 물질들에 의해 산화적 스트레스로 유발되는 칼슘 항상성 붕괴, 세포손상 또는 세포사멸을 완화시켰다(Carey 등, 2013). 더불어 Yan 등의 연구에서 탄닌은 산화 손상을 줄이고 인지장애를 개선하며 손상된 해마 조직에서 신경 변성 및 핵 손상을 완화한다고 보고하였다(Tian 등, 2011). 따라서 본 연구를 통해 풍부한 페놀성 화합물과 탄닌성 화합물을 가진 EFGC가 세포 내 ROS를 제거하여 뇌 해마세포를 보호함으로써 뇌 신경 신호전달 장애를 예방할 수 있는 천연 소재로 활용될 가능성을 확인하였다.

세포사멸과 염증 관련 단백질 발현량 측정

다양한 경로로 PM2.5가 인체 내로 들어와 뇌로 도달하면 PM2.5와 뇌 신경세포 외 수용체가 결합하고 수용체의 신호에 의해 nuclear factor-κB(NF-κB)경로를 활성화시킨다(Peng 등, 2017).

활성화된 NF-κB에 의해 IL-1β, interleukin 6(IL-6) 및 TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인이 방출되어 염증을 유발한다(Woodward 등, 2017). 또한, PM2.5로 인한 세포막 손상, ROS의 생성은 pro-caspase-3를 활성화시키고 세포 내 단백질 중합체를 형성함으로써 caspase-1을 활성화하여 염증성 인자를 방출하고 염증반응과 세포사멸을 초래한다(Calderón-Garcidueñas 등, 2012). 그리고 PM2.5로 유도된 염증성 인자와 ROS는 Aβ의 축적과 c-Jun N-terminal kinase(JNK)의 인산화를 유도하고 미토콘드리아 내 B-cell lymphoma 2(BCl-2)와 같은 anti-apoptosis 단백질의 인산화, BCl-2 associated X(BAX) 단백질의 방출을 유도하여 세포사멸을 초래한다(Nie 등, 2021). 더불어 세포 성장, 생존 및 세포주기 등과 같은 세포 반응을 조절하는 phospho-extracellular signal-regulated protein kinase(p-ERK1/2)와 phospho-cAMP-response element binding protein(p-CREB)을 억제하여 신경세포의 세포사멸 및 시냅스 손상을 일으키는 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(Chen 등, 2017).

따라서 HT22 세포에서 PM2.5로 유도되는 스트레스 의한 EFGC의 염증반응과 세포사멸의 개선 기작을 확인하고자 PM2.5를 처리한 HT22 cells에서 단백질 발현량을 측정하였다(Fig. 2). PM2.5를 처리한 그룹에서는 정상 대조군(100%) 대비 p-JNK(116.71%), caspase-1(114.44%), BAX(117.53 %), phospho-NF-κB(p-NF-κB, 130.34%)의 발현이 증가한 것을 확인하였다. 반면 PM2.5와 EFGC를 20 μg/mL 농도로 함께 처리한 그룹에서는 정상 대조군(100%) 대비 p-JNK(100.96%), caspase-1(100.95%), BAX(98.30%), p-NF-κB(114.13%)의 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인함으로써 호두 아세트산 에틸 분획물의 보호 효과를 확인하였다. 또한, BCl-2의 발현량은 PM2.5 처리 그룹에서 정상 대조군(100%) 대비 BCl-2(68.26%)로 하향 조절되었으며, EFGC를 20 μg/mL 농도로 함께 처리한 그룹에서는 BCl-2(106.53%)의 발현량을 개선되는 것을 확인하였다.

Fig. 2. Protective effect of ethyl acetate fraction from Juglans regia Gimcheon 1 ho (EFGC) on protein expression in PM2.5-induced HT22 cells. (A) Western blot images. (B) p-JNK, (C) BCl-2, (D) BAX, (E) caspase-1, and (F) p-NF-κB in HT22 cells. Results shown are mean±SD (n=3). Data were statistically considered at P<0.05, and different small letters represent a statistical difference

일반적으로 PM2.5의 일부는 BBB에 의해 차단되지만, PM2.5의 작은 크기로 인하여 뇌척수액을 통해 뇌로 침투할 수 있으며 PM2.5에 포함된 납, 알루미늄, 망간과 같은 금속이온이 해마로 이동하여 신경독성, 신경세포 사멸, ROS 생성 등을 일으킬 수 있다(Kim 등, 2020b). Kim 등(2020b)이 수행한 사전 연구에서 호두 추출물은 Aβ1-42로 유도된 마우스의 행동실험에서 인지기능을 개선하고 occludin이나 ZO-1과 같은 BBB 관련 단백질의 발현을 개선 시켜 PM2.5로 인하여 약화된 BBB를 강화시키는 것으로 나타났다. Zou 등(2016)의 연구에서는 호두 펩타이드의 섭취는 Aβ25-35 주입 마우스에서 해마 조직에서 NO와 AChE의 수준을 유의적으로 감소시켰으며, TNF-α, IL-1β, IL-6와 같은 전염증성 사이토카인의 발현을 완화하였다고 보고했다. 또한, 호두 단백질 가수분해물은 lipopolysaccaride(LPS)로 인지장애가 유도된 마우스와 미세아교 세포에서 superoxide dismutase(SOD) 활성, glutathione peroxidase(GSH-px) 활성 및 catalase(CAT) 활성을 개선시켰으며, IL-1β, IL-6, TNF-α와 같은 전 염증성 인자의 발현을 조절하였다(Wang 등, 2020). 호두에 풍부하게 함유되어있는 ellagitannin은 인체 내에서 가수분해되어 ellagic acid와 그 유도물질들이 형성된다(Moon 등, 2020). 또한 위관 영양법으로 마우스에 ellagic acid를 투여하였을 때 혈액에서 높은 농도에 ellagic acid가 검출되었다고 보고되고 있으며, 식물성 폴리페놀이 풍부한 식단을 섭취한 환자들의 뇌 척수액에서 caffeic acid가 높은 농도로 검출되었다(Teel과 Martin, 1988; Grabska-Kobylecka 등, 2020). 이를 고려할 때, 식이로 섭취한 생리활성 물질은 인체 내로 흡수되고 뇌에 도달함으로써 인지기능 개선과 같은 다양한 생리활성 효과를 유도할 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 국내산 호두 품종(Gimcheon 1 ho)의 분획으로 얻어진 EFGC는 PM2.5로부터 유도되는 다양한 세포독성을 완화하여 뇌 해마세포를 보호하는 데 도움을 줄 수 있을 것으로 판단되며, 이는 향후 미세먼지로부터 유발되는 다양한 세포 및 조직 독성에 관한 연구에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.

본 연구에서는 국내산 호두 아세트산 에틸 분획물에 대한 생리활성 평가를 위해 총 폴리페놀 화합물, 총 플라보노이드 화합물, 총 탄닌 화합물, ABTS와 DPPH 라디칼 소거 활성, 철의 환원 능력, 지질과산화물 생성 억제 능력, AChE의 활성 억제 효과를 확인하였다. 특히 EFGC의 철의 환원 능력과 지질과산화물 생성 억제 능력은 양성대조군으로 사용된 비타민 C, 카테킨보다 높은 활성을 나타내었다. HT22 세포에서 PM2.5로 유도되는 세포독성에 대한 세포 생존율과 산화적 스트레스 생성 억제 능력을 평가해 보았을 때 우수한 세포보호 효과를 나타내었다. 또한, EFGC는 caspase-1, BAX, p-JNK, BCl-2 및 p-NF-κB와 같은 염증성 인자와 세포사멸 관련 인자의 발현을 개선함으로써 PM2.5로 유발되는 세포독성에 대한 보호 효과를 확인하였다. 따라서 본 실험에서는 EFGC가 PM2.5로 유도된 뇌 신경세포 독성에 대하여 도움을 줄 수 있는 건강기능식품 소재로서의 산업적인 가치를 확인하였다.

본 연구는 정부의 재원으로 한국연구재단(National Research Foundation of Korea, Daejeon, Korea)의 개인기초연구(2018R1D1A3B07043398)의 지원을 받아 수행된 결과로 이에 감사드립니다.

  1. Ali W, Ikram M, Park HY, Jo MG, Ullah R, Ahmad S, et al. Oral administration of alpha linoleic acid rescues Aβ-induced glia-mediated neuroinflammation and cognitive dysfunction in C57BL/6N mice. Cells. 2020. 9:667. https://doi.org/10.3390/cells9030667
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  2. Benzie IFF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “Antioxidant power”: The FRAP assay. Anal Biochem. 1996. 239:70-76.
    Pubmed CrossRef
  3. Blois MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature. 1958. 181:1199-1200.
    CrossRef
  4. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976. 72:248-254.
    CrossRef
  5. Calderón-Garcidueñas L, Kavanaugh M, Block M, D’Angiulli A, Delgado-Chávez R, Torres-Jardón R, et al. Neuroinflammation, hyperphosphorylated tau, diffuse amyloid plaques, and down-regulation of the cellular prion protein in air pollution exposed children and young adults. J Alzheimers Dis. 2012. 28:93-107.
    Pubmed CrossRef
  6. Carey AN, Fisher DR, Joseph JA, Shukitt-Hale B. The ability of walnut extract and fatty acids to protect against the deleterious effects of oxidative stress and inflammation in hippocampal cells. Nutr Neurosci. 2013. 16:13-20.
    Pubmed CrossRef
  7. Chang ST, Wu JH, Wang SY, Kang PL, Yang NS, Shyur LF. Antioxidant activity of extracts from Acacia confusa Bark and heartwood. J Agric Food Chem. 2001. 49:3420-3424.
    Pubmed CrossRef
  8. Chen M, Li B, Sang N. Particulate matter (PM2.5) exposure season-dependently induces neuronal apoptosis and synaptic injuries. J Environ Sci. 2017. 54:336-345.
    Pubmed CrossRef
  9. Chen X, Guo J, Huang Y, Liu S, Huang Y, Zhang Z, et al. Urban airborne PM2.5-activated microglia mediate neurotoxicity through glutaminase-containing extracellular vesicles in olfactory bulb. Environ Pollut. 2020. 264:114716. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2020.114716
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  10. Fedotova MV, Kruchinin SE, Chuev GN. Hydration features of the neurotransmitter acetylcholine. J Mol Liq. 2020. 304:112757. https://doi.org/10.1016/j.molliq.2020.112757
    CrossRef
  11. Geddes RI, Hayashi K, Bongers Q, Wehber M, Anderson IM, Jansen AD, et al. Conjugated linoleic acid administration induces amnesia in male sprague dawley rats and exacerbates recovery from functional deficits induced by a controlled cortical impact injury. Plos One. 2017. 12:e0169494. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0169494
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  12. Grabska-Kobylecka I, Kaczmarek-Bak J, Figlus M, Prymont-Przyminska A, Zwolinska A, Sarniak A, et al. The presence of caffeic acid in cerebrospinal fluid: Evidence that dietary polyphenols can cross the blood-brain barrier in humans. Nutrients. 2020. 12:1531. https://doi.org/10.3390/nu12051531
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  13. Gu X, Wang X. An overview of recent analysis and detection of acetylcholine. Anal Biochem. 2021. 632:114381. http://doi.org/10.1016/j.ab.2021.114381
    Pubmed CrossRef
  14. Gülçin İ, Huyut Z, Elmastaş M, Aboul-Enein HY. Radical scavenging and antioxidant activity of tannic acid. Arabian J Chem. 2010. 3:43-53.
    CrossRef
  15. Hamra GB, Guha N, Cohen A, Laden F, Raaschou-Nielsen O, Samet JM, et al. Outdoor particulate matter exposure and lung cancer: A systematic review and meta-analysis. Environ Health Perspect. 2014. 122:906-911.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  16. Han HJ, Park SK, Kim MJ, An JW, Lee SJ, Kang JY, et al. Industrial potential of domestic Zanthoxylum piperitum and Zanthoxylum schinifolium: Protective effect of both extracts on high glucose-induced neurotoxicity. Korean J Food Sci Technol. 2020. 52:274-283.
  17. Heo HJ, Cho HY, Hong B, Kim HK, Kim EK, Kim BG, et al. Protective effect of 4′, 5-dihydroxy-3′,6,7-trimethoxyflavone from Artemisia asiatica against Aβ-induced oxidative stress in PC12 cells. Amyloid. 2001. 8:194-201.
    Pubmed CrossRef
  18. Kim DO, Jeong SW, Lee CY. Antioxidant capacity of phenolic phytochemicals from various cultivars of plums. Food Chem. 2003. 81:321-326.
    CrossRef
  19. Kim GH, Kim JM, Park SK, Kang JY, Han HJ, Shin EJ, et al. Nutritional composition of domestic and imported walnuts (Juglans regia L.). J Korean Soc Food Sci Nutr. 2020a. 49:608-616.
    CrossRef
  20. Kim JM, Lee U, Kang JY, Park SK, Shin EJ, Kim HJ, et al. Anti-amnesic effect of walnut via the regulation of BBB function and neuro-inflammation in Aβ1-42-induced mice. Antioxidants. 2020b. 9:976. https://doi.org/10.3390/antiox9100976
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  21. Liu F, Wang Z, Wei Y, Liu R, Jiang C, Gong C, et al. The leading role of adsorbed lead in PM2.5-induced hippocampal neuronal apoptosis and synaptic damage. J Hazard Mater. 2021. 416:125867. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.125867
    Pubmed CrossRef
  22. Liu J, Li L, Suo WZ. HT22 hippocampal neuronal cell line possesses functional cholinergic properties. Life Sci. 2009. 84:267-271.
    Pubmed CrossRef
  23. Mangia C, Cervino M, Gianicolo EAL. Secondary particulate matter originating from an industrial source and its impact on population health. Int J Environ Res Public Health. 2015. 12:7667-7681.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  24. Moon JH, Lee U, Kim JM, Park SK, Kang JY, Shin EJ, et al. Metabolic analysis and neuroprotective effect of domestic and imported walnuts (Juglans regia L.). J Korean Soc Food Sci Nutr. 2020. 49:907-918.
    CrossRef
  25. Muthaiyah B, Essa MM, Lee M, Chauhan V, Kaur K, Chauhan A. Dietary supplementation of walnuts improves memory deficits and learning skills in transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 2014. 42:1397-1405.
    Pubmed CrossRef
  26. Nie Z, Xia X, Zhao Y, Zhang S, Zhang Y, Wang J. JNK selective inhibitor, IQ-1S, protects the mice against lipopolysaccharides-induced sepsis. Bioorg Med Chem. 2021. 30:115945. https:// doi.org/10.1016/j.bmc.2020.115945
    Pubmed CrossRef
  27. Peng H, Zhao XH, Bi TT, Yuan XY, Guo JB, Peng SQ. PM2.5 obtained from urban areas in Beijing induces apoptosis by activating nuclear factor-kappa B. Military Med Res. 2017. 4:27. https://doi.org/10.1186/s40779-017-0136-3
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  28. Prakash D, Singh BN, Upadhyay G. Antioxidant and free radical scavenging activities of phenols from onion (Allium cepa). Food Chem. 2007. 102:1389-1393.
    CrossRef
  29. Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biol Med. 1999. 26:1231-1237.
    CrossRef
  30. Riedl KM, Carando S, Alessio HM, McCarthy M, Hagerman AE. Antioxidant activity of tannins and tannin-protein complexes: Assessment in vitro and in vivo. ACS Symposium Series. 2002. 807:188-200.
    CrossRef
  31. Ritz B, Hoffmann B, Peters A. The effects of fine dust, ozone, and nitrogen dioxide on health. Dtsch Arztebl Int. 2019. 116:881-886.
    CrossRef
  32. Sethiya NK, Trivedi A, Mishra S. The total antioxidant content and radical scavenging investigation on 17 phytochemical from dietary plant sources used globally as functional food. Biomed Prev Nutr. 2014. 4:439-444.
    CrossRef
  33. Shah SD, Cocker DR, Miller JW, Norbeck JM. Emission rates of particulate matter and elemental and organic carbon from in-use diesel engines. Environ Sci Technol. 2004. 38:2544-2550.
    Pubmed CrossRef
  34. Teel RW, Martin RM. Disposition of the plant phenol ellagic acid in the mouse following oral administration by gavage. Xenobiotica. 1988. 18:397-405.
    Pubmed CrossRef
  35. Tejada S, Setzer WN, Daglia M, Nabavi SF, Sureda A, Braidy N, et al. Neuroprotective effects of ellagitannins: A brief review. Curr Drug Targets. 2017. 18:1518-1528.
    CrossRef
  36. Tian Y, Zou B, Yang L, Xu SF, Yang J, Yao P, et al. High molecular weight persimmon tannin ameliorates cognition deficits and attenuates oxidative damage in senescent mice induced by D-galactose. Food Chem Toxicol. 2011. 49:1728-1736.
    Pubmed CrossRef
  37. Tsao R. Chemistry and biochemistry of dietary polyphenols. Nutrients. 2010. 2:1231-1246.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  38. Turkan F, Taslimi P, Saltan FZ. Tannic acid as a natural antioxidant compound: Discovery of a potent metabolic enzyme inhibitor for a new therapeutic approach in diabetes and Alzheimer’s disease. J Biochem Mol Toxicol. 2019. 33:e22340. https://doi.org/10.1002/jbt.22340
    CrossRef
  39. Uchida S, Ohta H, Niwa M, Mori A, Nonaka GI, Nishioka I, et al. Prolongation of life span of stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP) ingesting persimmon tannin. Chem Pharm Bull. 1990. 38:1049-1052.
    Pubmed CrossRef
  40. Wang J, Huang J, Wang L, Chen C, Yang D, Jin M, et al. Urban particulate matter triggers lung inflammation via the ROS-MAPK-NF-κB signaling pathway. J Thorac Dis. 2017. 9:4398-4412.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  41. Wang S, Zheng L, Zhao T, Zhang Q, Liu Y, Sun B, et al. Inhibitory effects of walnut (Juglans regia) peptides on neuroinflammation and oxidative stress in lipopolysaccharide-induced cognitive impairment mice. J Agric Food Chem. 2020. 68:2381-2392.
    Pubmed CrossRef
  42. Winkler J, Thal LJ, Gage FH, Fisher LJ. Cholinergic strategies for Alzheimer’s disease. J Mol Med. 1998. 76:555-567.
    Pubmed CrossRef
  43. Woodward NC, Levine MC, Haghani A, Shirmohammadi F, Saffari A, Sioutas C, et al. Toll-like receptor 4 in glial inflammatory responses to air pollution in vitro and in vivo. J Neuroinflammation. 2017. 14:84. https://doi.org/10.1186/s12974-017-0858-x
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  44. Yu L, Haley S, Perret J, Harris M, Wilson J, Qian M. Free radical scavenging properties of wheat extracts. J Agric Food Chem. 2002. 50:1619-1624.
    Pubmed CrossRef
  45. Yuan Y, Wu Y, Ge X, Nie D, Wang M, Zhou H, et al. In vitro toxicity evaluation of heavy metals in urban air particulate matter on human lung epithelial cells. Sci Total Environ. 2019. 678:301-308.
    Pubmed CrossRef
  46. Zhang LL, Lin YM. Antioxidant tannins from Syzygium cumini fruit. Afr J Biotechnol. 2009. 8:2301-2309.
  47. Zhang Z, Liao L, Moore J, Wu T, Wang Z. Antioxidant phenolic compounds from walnut kernels (Juglans regia L.). Food Chem. 2009. 113:160-165.
    CrossRef
  48. Zou J, Cai PS, Xiong CM, Ruan JL. Neuroprotective effect of peptides extracted from walnut (Juglans Sigilata Dode) proteins on Aβ25-35-induced memory impairment in mice. J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci. 2016. 36:21-30.
    Pubmed CrossRef

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(9): 997-1006

Published online September 30, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.9.997

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

미세먼지로 유도된 산화적 스트레스에 대한 국내산 호두(Juglans regia) 아세트산 에틸 분획물의 뇌 해마세포 보호 효과

문종현1*․김태윤1*․이 욱2․김종민1․이효림1․김민지1․정혜린1․고민지1․주승겸1․허호진1

1경상국립대학교 응용생명과학부(BK21), 농업생명과학연구원
2국립산림과학원 산림특용자원연구과

Received: May 17, 2022; Revised: July 14, 2022; Accepted: August 10, 2022

Protective Effect of Ethyl Acetate Fraction from Domestic Walnut (Juglans regia) against PM2.5-induced Inflammation and Apoptosis

Jong Hyun Moon1* , Tae Yoon Kim1* , Uk Lee2, Jong Min Kim1, Hyo Lim Lee1, Min Ji Kim1, Hye Rin Jeong1, Min Ji Go1, Seung Gyum Joo1, and Ho Jin Heo1

1Division of Applied Life Science (BK21), Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University
2Divsion of Special Forest Resources, Department of Forest Bioresources, National Institute of Forest Science (NIFoS)

Correspondence to:Ho Jin Heo, Division of Applied Life Science (BK21), Gyeongsang National University, 501, Jinju-daero, Jinju, Gyeongnam 52828, Korea, E-mail: hjher@gnu.ac.kr
*These authors contributed equally to this work.

Received: May 17, 2022; Revised: July 14, 2022; Accepted: August 10, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

This study examined the protective effect of the ethyl acetate fraction from domestic walnut (Juglans regia) as a Gimcheon 1 ho (EFGC) cultivar on particulate matter (PM)2.5-induced cytotoxicity in hippocampal HT22 cells. EFGC had the highest total phenolic contents, total flavonoid contents, and total tannin contents compared to other fractions. In addition, EFGC showed significant 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS), and 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazl (DPPH) radical scavenging activities and ferric reducing/antioxidant power (FRAP). The EFGC presented an inhibitory effect of malondialdehyde (MDA) production and acetylcholinesterase (AChE) activity. The EFGC effectively decreased intracellular reactive oxygen species (ROS) contents and cellular death on hippocampal cells against PM2.5 cytotoxicity. The EFGC improved inflammatory reaction and apoptosis by regulating protein expression, such as BCl-2, p-JNK, BAX, caspase-1, and p-NF-κB.

Keywords: walnut, Juglans regia, PM2.5, inflammation, apoptosis

서 론

미세먼지는 대기오염 물질 중 하나로 오존, 이산화질소 등과 결합하여 건강을 위협하는 요소로써 최근 미세먼지에 관한 관심이 높아지고 있으며 그 위험성 또한 보고되고 있다(Ritz 등, 2019). 과거부터 수많은 역학 연구에서 미세먼지는 전 세계에서 4번째로 위험한 조기 사망 위험 요소이며, 2013년에는 WHO 산하 국제 암 연구소(International Agency for Research on Cancer, IARC)에서 1군 발암 물질로 지정하였다(Hamra 등, 2014). 미세먼지는 자연적으로 먼지, 바다 소금, 꽃가루, 화산재, 곰팡이 포자, 산불에 의해 생성되며, 인공적인 원인으로는 화석연료의 연소, 시멘트, 석회 및 화학물질을 제조하는 등 산업공정에서 만들어지는 입자와 분진, 디젤 차량에서 나오는 배기가스 등이 있다(Shah 등, 2004). 다양한 원인으로 발생 되는 미세먼지는 질소산화물, 황산화물 등을 포함하며, 이는 화학반응을 통하여 질산암모늄, 황산암모늄을 생성하고 대기 중에서 응축되어 2차 미세먼지를 생성한다(Mangia 등, 2015). 이는 직경에 따라 particulate matter(PM)10(≤10 μm), PM2.5(≤2.5 μm) 및 PM0.1(≤0.1 μm)로 분류되며, 상대적으로 직경이 작은 초미세먼지인 PM2.5와 PM0.1은 폐포 깊숙이 침투하여 침착되고 폐 세포벽을 통과해 혈액으로 흡수되어 뇌, 심장, 신장 등과 같은 다른 기관이나 조직에 손상을 줄 수 있다고 보고되고 있다(Wang 등, 2017).

PM2.5는 혈액을 타고 이동하며 혈뇌장벽(blood-brain barrier, BBB)까지 도달하여 BBB의 막 수송체를 변형시키고, 밀착 연접 단백질(tight junction protein)을 느슨하게 만들어 PM2.5가 뇌 조직 내부로 유입될 수 있다고 알려져 있다(Kim 등, 2020b). 또한, PM2.5는 호흡기를 통해 흡수될 뿐만 아니라 후각상피 세포를 통해 직접적으로 체내로 흡수되며 olfactory bulb를 거쳐 뇌의 다양한 부위에 도달하여 손상을 줄 수 있다고 보고되고 있다(Chen 등, 2020). 다양한 경로로 뇌에 도달한 PM2.5는 산화적 스트레스로 인한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성, 톨 유사 수용체 4(Tall-like receptor 4, TLR-4)와 결합하여 inflammasome을 형성하고 interleukin 1 beta(IL-1β)와 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)와 같은 전염증성 사이토카인의 발현을 유도한다(Woodward 등, 2017). 발현된 염증성 사이토카인은 신경계의 염증을 유발하고, 인산화 된 Tau 단백질과 amyloid-beta plaque 생성 등을 유도하여 뇌 신경세포를 손상시켜 궁극적으로 인지기능의 장애를 초래한다고 알려져 있다(Calderón-Garcidueñas 등, 2012). 따라서 PM2.5로 유도되는 세포독성으로 인한 인지기능 저하를 예방할 수 있는 소재에 대한 수요가 지속해서 증가하고 있어 다양한 천연 소재에 관한 연구가 필요한 실정이다.

호두(Juglans regia)는 ellagic acid, ellagitannin, phenolic acid 등과 같은 다양한 항산화 물질과 비타민 E 함량이 풍부하게 함유되어 있어 영양학적 가치가 높은 것으로 보고되고 있다(Moon 등, 2020). 또한, 미국 또는 중국의 호두 품종과 비교하여 국내산 품종에서 linoleic acid, α-linolenic acid, DHA와 같은 다중 불포화 지방산이 특히 풍부하고, 천연 항산화제인 α-토코페롤과 γ-토코페롤 등을 함유하는 것으로 보고되고 있다(Kim 등, 2020a). 특히 국산 호두 품종이 수입 품종보다 뛰어난 in vitro 뇌 신경세포 보호 효과를 확인했으며, 국내산 호두는 amyloid beta(Aβ)로 신경독성이 유도된 마우스에서 BBB의 기능을 개선시킨다고 보고하였다(Moon 등, 2020; Kim 등, 2020b). 미세먼지에 대한 노출 및 흡입은 미세먼지의 세포 내 침투를 야기하여 산화적 스트레스를 생성할 수 있으며, 더불어 구성 물질인 중금속에 의한 독성 또한 발생할 수 있기 때문에 더욱 심각한 세포 손상을 유발할 수 있다(Yuan 등, 2019). 사전 연구를 통해 국내산 호두가 H2O2로 유도된 신경세포 독성에 대해 우수한 활성을 나타냈으며(Moon 등, 2020), 미세먼지로 인한 독성에 대한 보호 효과 역시 뛰어날 것으로 판단되었다. 그러므로 본 연구에서는 호두를 이용하여 in vitro 항산화 활성과 PM2.5로 유도되는 독성에 의한 뇌 신경세포의 보호 효과를 확인하고 개선 기작을 평가함으로써 PM2.5로 유도될 수 있는 질환을 예방하는 기능성 소재로서의 가능성을 확인하고자 한다.

재료 및 방법

재료

본 실험에 사용된 시약은 Folin & Ciocalteu’s phenol reagent, Na2CO3, gallic acid, NaOH, diethylene glycol, rutin, sodium phosphate buffer, 2,2′-azinobis(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), potassium persulfate, 1,1-diphenyl 2-picrylhydrazyl(DPPH), sodium acetate buffer, HCl, 2,4,6-tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazine(TPTZ), trichloroacetic acid, thiobarbituric acid, ascorbic acid, catechin, tris HCl buffer, 5,5′-dithiobis 2-nitrobenzoic acid(DTNB), acetylthiocholine, 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA), 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM), dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 세포독성 유도를 위한 PM2.5(평균직경 1.06 μm)는 Power Technology Inc.(Arizona Test Dust, Arden Hills, MN, USA)에서 구입하였다. 그 외 사용된 용매 및 시약은 모두 1급 이상의 등급을 사용하였다.

추출물 제조

본 연구에 사용된 시료는 국내산 호두(Juglans regia) 김천 1호(Gimcheon 1 ho) 품종은 2018년 경북 김천시 시험림에서 재배된 것을 사용하였으며, 국립산림과학원(Suwon, Korea)의 정보를 바탕으로 구매하였다. 시료는 과육을 분리하여 동결건조기(FDU-8612, Operon, Gimpo, Korea)를 이용하여 동결건조하였고 노즐식 진공포장기(AZ-450E, Intrise, Ansan, Korea)로 시료를 진공 포장한 후 -20°C에서 보관하였다. 보관된 시료 80 g에 80% 에탄올을 4 L 첨가하여 40°C에서 환류 냉각하에 2시간 동안 추출을 진행하였다. 추출물은 감압농축기(N-N series, EYELA Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하여 400 mL로 정용한 후 동일한 부피의 노말 헥세인(n-hexane), 클로로포름(chloroform) 및 아세트산 에틸(ethyl acetate)을 이용하여 분획을 순차적으로 진행하였다. 분획을 통하여 획득한 각 용매의 분획물은 동결건조하여(FDU-8612, Operon) -20°C에서 보관하였다.

총 페놀성 화합물 함량 측정

총 페놀성 함량은 시료 1 mL와 증류수 9 mL, Folin & Ciocalteu’s phenol 시약을 1 mL 혼합하여 상온에서 5분간 반응시킨 후 7% Na2CO3 10 mL와 증류수 4 mL를 첨가하였다. 2시간 반응시킨 후 760 nm에서 흡광도를 측정(UV-1800, Shimadzu, Tokyo, Japan)하였으며, gallic acid equivalents(mg of GAE/g)로 결과를 나타내었다(Kim 등, 2003).

총 탄닌 함량 측정

총 탄닌 함량은 polyvinylpolypyrrolidone(PVPP)을 증류수에 용해한 후 시료 0.5 mL와 혼합하였다. 혼합액을 원심분리(3,000×g, 10분, 4°C)하여 취한 상등액을 총 페놀성 화합물 함량 측정과 동일한 방법으로 수행하였으며, tannic acid equivalents(mg of TAE/g)로 결과를 나타내었다.

총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량은 시료 1 mL에 diethylene glycol 10 mL, 그리고 1 N NaOH를 첨가한 후 30°C에서 한 시간 동안 반응시킨 뒤 420 nm에서 흡광도를 측정(UV-1800, Shimadzu)하였으며, rutin equivalents(mg of RE/g)로 결과를 나타내었다(Kim 등, 2003).

라디칼 소거 활성 효과 측정

ABTS 라디칼 소거 활성은 150 mM NaCl을 포함한 100 mM 인산 완충 용액을 2.45 mM ABTS와 1.0 mM[2,2′-azobis-(2-amidinopropane)·HCl]을 혼합하여 68°C에서 가열한 후, 여과하여 24시간 동안 냉장보관 하였다. 734 nm에서 흡광도를 0.70±0.02가 되게 조정한 DPPH 시약을 시료와 혼합하여 37°C에서 10분간 반응시켜 734 nm에서 흡광도를 측정(UV-1800, Shimadzu)하였다(Kim 등, 2003).

DPPH 라디칼 소거 활성은 DPPH 시약을 517 nm 파장에서 흡광도 값이 1.00±0.02가 나오도록 하여 실험에 사용하였다. 시료 50 μL에 DPPH 용액 1.45 mL를 혼합하여 암실에서 30분간 반응시킨 뒤, 517 nm의 파장에서 흡광도 값을 측정(UV-1800, Shimadzu)하였다(Blois, 1958).

지질과산화물 생성 억제 능력 측정

지질과산화물 생성 억제 능력측정을 위한 실험방법은 다음과 같다. 뇌 조직을 이용하여 지질과산화물 생성 억제 능력을 측정하기 위하여 4주령의 수컷 Institute of Cancer Research(ICR) 마우스를 실험동물 공급업체(Samtako, Osan, Korea)로부터 구입하였다. 항온과 항습을 유지하며 12시간마다 낮과 밤을 교대시키는 동일한 환경에서 충분한 식수와 사료를 공급하며 1주간 적응시켰다. 사육된 마우스의 뇌를 적출하여 뇌 무게의 10배에 해당하는 20 mM tris HCl buffer(pH 7.4)를 첨가하여 균질화시켰으며, 원심분리(12,000×g, 15분, 4°C)하여 얻어진 상등액을 실험에 사용하였다. 뇌 조직 상등액 0.1 mL, 10 mM FeSO4 0.1 mL, 0.1 mM ascorbic acid 0.1 mL, 시료 0.2 mL를 혼합하여 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 30% trichloroaceteic acid 0.1 mL와 1% tiobarbituric acid 0.3 mL를 첨가하여 80°C에서 20분간 가열한 후 원심분리를 통하여 상등액을 얻었다. 이렇게 얻어진 상등액을 532 nm에서 흡광도를 측정(UV-1800, Shimadzu)하였다(Chang 등, 2001). 본 동물실험은 경상국립대학교 동물윤리심의 위원회의 심의를 거쳐서 진행되었다(경상국립대학교 동물실험 인가번호: GNU-120831-M0067).

철의 환원 능력 측정

Ferric reducing/antioxidant power(FRAP)는 300 mM sodium acetate buffer(pH 3.6), 10 mM TPTZ in 40 mM HCl과 20 mM FeCl3(Ⅲ)로 구성된 TPTZ 용액을 제조하여 FRAP 실험에 사용하였다. 이 용액을 sodium acetate buffer(pH 3.6)와 FeCl3(Ⅲ)를 혼합하여 37°C에서 15분간 반응시켜 FRAP 혼합액을 제조하였다. FRAP 혼합액 1.5 mL에 추출물 50 μL를 반응시켜 실온에서 30분간 반응한 후 593 nm에서 흡광도 값을 측정(UV-1800, Shimadzu)하였다(Benzie와 Strain, 1996).

아세틸콜린 분해효소 억제 효과 측정

아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase, AChE) 억제 활성 측정은 아이오딘화아세틸콜린을 기질로 사용하여 측정하는 것으로 AChE는 rat의 부신 수질에서 유래한 PC12 세포배양액을 2,000 rpm으로 6분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 균질화 완충 용액[1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 1% Triton X-100(pH 7.2)] 2 mL를 첨가하여 균질화하였다. 이 세포배양액을 12,000×g에서 30분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하여 실험에 사용하였다. 모든 추출과정은 4°C에서 수행되었으며 효소 추출의 단백질 함량은 Bradford protein assay를 이용하여 정량하였다(Bradford, 1976).

뇌 해마세포(HT22) 배양

본 실험에서 사용된 HT22 세포는 마우스의 뇌 해마 조직에서 유래하였으며, 인지기능 저하와 알츠하이머병과 관련된 해마의 기능 저하 연구를 수행할 때 사용된다(Liu 등, 2009). HT22 세포는 경상국립대학교 수의대학 조직학실험실에서 분양받아(2017년 10월) 사용되었으며, 10% calf serum(CS), 50 units/mL penicillin과 streptomycin이 포함된 DMEM에서 37°C, 5% CO2 조건에서 배양되었다.

마우스 유래 뇌 해마세포(HT22)에서의 세포 생존율과 산화적 스트레스 생성 억제 효과 측정

마우스 유래 뇌 해마세포(HT22)에 대한 보호 효과를 측정하기 위해 MTT 분석법을 이용하여 실험을 진행하였다. 뇌 해마세포를 24시간 동안 배양하고 시료를 처리한 후 PM2.5를 처리하여 24시간 배양하였다. PM2.5를 처리한 HT22 세포에 MTT 용액을 처리하여 37°C에서 2시간 배양시킨 후 DMSO를 첨가하여 반응을 종결시키며, 이를 마이크로 플레이트판독기(Epoch 2, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 활용하여 570 nm(determination)와 655 nm(reference)에서 측정하였다(Heo 등, 2001).

산화적 스트레스의 생성 억제 효과를 측정하기 위해 DCF-DA 분석법을 이용하여 실험을 진행하였다. MTT 분석법과 동일하게 HT22 세포를 배양하여 실험을 진행하였으며, PM2.5를 처리한 뒤 50 μM DCF-DA를 처리한 후 DCF 함량을 측정하였다. 형광측정은 형광광도계(fluorometer, infinite F200, Tecan, Männedorf, Swiss)를 이용하여 485 nm(excitation filter)와 535 nm(emission filter)의 파장에서 측정하였다(Heo 등, 2001).

단백질 발현량 측정

단백질 발현량 측정을 위한 HT22 세포는 세포 내 산화적 스트레스 생성 억제 효과 및 생존율 측정과 동일한 조건으로 전처리하였으며 PM2.5를 처리한 후 12시간 동안 반응시켰다. 이후 1% protease inhibitor가 첨가된 RIPA 완충 용액을 세포에 처리한 후 13,000×g, 10분, 4°C 조건에서 원심분리 후 분리된 상등액을 실험에 사용하였다. 단백질 정량을 위하여 Bradford protein assay를 이용하여 정량하였다(Bradford, 1976). 세포의 단백질들은 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 분리하여 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane으로 이동시켰다. Membrane을 5% skim milk를 이용하여 1시간 동안 blocking 한 후 세척하였다. 이후 0.5% bovine serum albumin과 0.1% sodium azide를 포함한 TBST 용액을 이용하여 500:1로 희석한 1차 항체를 overnight 동안 반응시켰으며, 이후 세척 하여 2차 항체를 1시간 동안 반응시켰다. 항체와 반응시킨 membrane을 ECL solution(ECL Ottimo, TransLab, Daejeon, Korea)을 이용하여 발색시켰으며, 이는 ChemiDoc iBright Imager(CL1000 instrument, Invitrogen, Carsbad, CA, USA)를 이용하여 밀도를 측정하였고 수치화된 밀도 값은 β-actin의 값으로 나누어서 계산하였다.

통계처리

모든 실험은 반복하여 진행하였으며, 평균±표준편차로 나타내었다. 각 실험에 관한 값들은 SAS software(ver. 9.4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)와 one-way analysis of variance(ANOVA)에 의하여 평가되었으며, 그룹 간의 유의성은 Duncan의 다중범위검정법(Duncan’s new multiple-range test)으로 시행하였다(P<0.05).

결과 및 고찰

총 페놀성 화합물, 탄닌 및 플라보노이드 함량 측정

페놀성 화합물과 플라보노이드는 식물의 2차 대사산물로써, 과일, 차, 채소류 등과 같은 많은 식물에서 발견되며 페놀성 화합물과 플라보노이드는 전자 또는 수소 원자를 제공하여 자유라디칼을 소거하거나, 3-hydroxy group과 같은 특정 hydroxy 그룹은 항산화 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Tsao, 2010). 가장 항산화 활성이 우수한 에탄올 추출물을 선정하기 위하여 농도를 0, 20, 40, 60, 80 및 95%로 사용하여 40°C에서 2시간 환류 냉각하에 추출을 진행하였다. 사전 연구를 통해 80% 에탄올 추출물이 가장 우수한 것을 확인하였고, 이를 이용하여 n-hexane, chloroform, 아세트산 에틸 순으로 분획을 실시하였다(Moon 등, 2020). 얻어진 분획물을 이용하여 총 폴리페놀 함량, 총 탄닌 함량 그리고 총 플라보노이드 함량을 측정하였을 때, 아세트산 에틸 분획물이 가장 높은 함량을 나타내었다(data not shown). 호두 아세트산 에틸 분획물의 총 페놀성 화합물의 함량은 815.83 mg of GAE, 총 탄닌 함량은 805.48 mg of TAE, 그리고 총 플라보노이드 함량은 138.54 mg of RE로 나타났다(Table 1).

Table 1 . Antioxidant activity of ethyl acetate fractions fromJuglans regia Gimcheon 1 ho (EFGC).

TPC1)TTC2)TFC3)ABTS4)DPPH5)FRAP6)MDA7)
815.83±26.02805.48±24.95138.54±0.9471.4499.470.74±0.030.44

1)TPC: total phenolic content. 2)TTC: total tannin content. 3)TFC: total flavonoid content. 4)ABTS: ABTS radical scavenging activity. 5)DPPH: DPPH radical scavenging activity. 6)FRAP: ferric reducing antioxidant power. 7)MDA: malondialdehyde inhibitory effect..

Results shown are mean±SD (n=3). Results of TPC, TTC, and TFC are presented as mg of GAE/g, mg of TAE/g, and mg of RE/g, respectively. Results of ABTS, DPPH, and MDA are presented as IC50 value (μg/mL). Result of FRAP is presented as absorbance at 593 nm..



호두 과육의 에테르, 부탄올, 아세트산 에틸로 분획하여 항산화 능력을 측정하였을 때 아세트산 에틸 분획물이 가장 높은 항산화 활성을 보였으며, 이는 호두에 포함된 tannin, tannic acid, gallic acid와 같은 생리활성 물질들이 아세트산 에틸 분획물에 가장 많이 함유된 것으로 판단된다(Zhang 등, 2009). 항산화 능력과 세포 생존률, 산화적 스트레스 감소와 같은 생리활성은 페놀성 화합물, 탄닌 등과 같은 생리활성 물질들에 의해 나타나는 것으로 판단되어 추후 실험은 가장 높은 함량들을 가진 호두 아세트산 에틸 분획물(EFGC)을 이용하여 진행되었다.

라디칼 소거 활성 효과

EFGC의 라디칼 소거 활성 효과를 평가하기 위해 ABTS와 DPPH를 이용하여 라디칼 소거 활성을 평가하였다(Table 1). ABTS 라디칼 소거 활성은 시료가 가지고 있는 다양한 항산화 물질에 의해 ABTS가 가지고 있는 라디칼이 제거되어 청록색이 탈색되는 방법을 이용한 방법이다(Re 등, 1999). EFGC의 ABTS 라디칼 소거 활성의 IC50은 71.44 μg/mL로 나타났으며, 양성대조군인 비타민 C의 IC50(113.05 μg/mL) 값과 비교해 보았을 때 EFGC는 양성대조군보다 높은 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거 활성은 라디칼을 띄는 DPPH가 시료 속 항산화 물질에 의해 환원되면서 고유의 자색이 탈색되는 원리를 이용한 방법이다(Blois, 1958). EFGC의 DPPH 라디칼 소거 활성의 IC50은 99.47 μg/mL로 양성대조군인 비타민 C의 IC50(108.66 μg/mL)과 비교해 보았을 때 양성대조군보다 우수한 라디칼 소거 활성을 보였다.

산화적 스트레스에 의해 생성된 라디칼은 높은 반응성을 가지고 있어 연쇄적으로 산화적 스트레스를 유발하고 세포 사멸, 염증과 같은 질병과 노화를 촉진한다(Yu 등, 2002). 라디칼 소거 활성을 가지는 페놀성 화합물이나 플라보노이드가 풍부하게 포함된 식품은 인체에서 자유 라디칼을 소거하여 산화적 스트레스로부터 유발되는 다양한 질병을 예방할 수 있다고 알려져 있다(Prakash 등, 2007). Gulcin의 연구에 의하면 호두에 풍부하게 함유되어 있는 탄닌산(tannic acid)은 양성대조군으로 사용된 합성 항산화제인 dibutyl hydroxy toluene(BHT), butylated hydroxyanisole(BHA)보다 우수한 ABTS와 DPPH 라디칼 소거 활성을 보였다(Gülcin 등, 2010). 사전에 수행된 연구에서 중국산 품종과 비교하여 국내산 호두에 토코페롤이 다량 함유되어있는 것이 확인되었으며, 이는 자유라디칼 소거 활성으로 인한 심혈관 질환 및 다양한 질환을 예방하는데 우수한 활성을 나타낸다고 알려져 있다(Kim 등, 2020b). 따라서 본 실험에서 확인한 우수한 ABTS와 DPPH 라디칼 소거 활성은 EFGC에 포함된 탄닌과 토코페롤 등과 같은 생리활성 물질들에 의해 기인하는 것으로 판단된다.

1철의 환원능력 측정

철의 환원능력은 산성 조건에서 시료에 포함된 항산화 물질에 의해 TPTZ의 Fe3+이 Fe2+로 환원되면서 무색에서 푸른색으로 색이 변하는 원리를 이용한 방법이다(Benzie와 Strain, 1996). 이러한 원리를 이용하여 EFGC를 이용하여 철의 환원능력을 평가하였다(Table 1). EFGC의 철의 환원능력은 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였으며, 200 μg/mL 농도에서 EFGC는 0.74의 환원능력을 나타내었으며 이는 양성 대조군인 비타민 C(0.66)의 환원능력 대비 유의적으로 우수한 철의 환원능력을 나타내었다. Zhang과 Lin(2009)이 수행한 연구에서 Syzygium cumini 추출 탄닌은 호두와 유사하게 gallic acid 및 ellagic acid 등으로 구성되어 매우 우수한 철의 환원능력을 나타내었으며, gallic acid와 ellagic acid는 비타민 C와 유사한 환원능력을 가진다고 보고되고 있다(Sethiya 등, 2014). 따라서 EFGC의 항산화 활성은 EFGC에 함유된 gallic acid나 ellagic acid와 같은 생리활성물질에 기인한 것으로 판단된다.

지질과산화물 생성억제능력 측정

뇌 조직은 다른 조직에 비해 불포화 지방산의 함량이 높아 산화적 스트레스에 취약하고 PM2.5의 노출에 의해 생성되는 ROS로부터 손상되기 쉬워 세포막의 지질과산화가 쉽게 일어나고 malondialdehyde(MDA) 등과 같은 지질과산화물의 생성을 야기한다(Han 등, 2020). 따라서 EFGC에 대한 지질과산화물의 생성 억제 능력을 측정하기 위하여 ICR 마우스로부터 적출한 뇌 조직을 사용하여 지질과산화물의 생성 억제 능력을 평가하였다(Table 1). EFGC의 지질과산화물 생성 억제 능력의 IC50은 0.44 μg/mL로, 양성대조군인 카테킨(20.41 μg/mL)과 비교해 보았을 때(data not shown), 현저하게 높은 지질과산화물 생성 억제 능력을 나타내었다. 탄닌은 호두에 풍부하게 함유되어 있는 생리활성 물질로 gallic acid ester나 flavan-3-ol 중합체로 구성되어있으며, 산화방지능력을 가지고 있다고 보고되고 있다(Riedl 등, 2002). Uchida 등(1990)이 수행한 연구에서 감에서 추출된 탄닌으로 in vitro 지질과산화물 생성 억제 능력을 연구하였을 때, 지질과산화물의 생성을 강력하게 억제했다고 보고했다. 따라서 EFGC의 지질과산화물 생성 억제 능력은 항산화 능력을 가지며 호두에 풍부하게 포함된 탄닌이나 탄닌 화합물로 인한 산화적 스트레스의 감소에 기인하는 것으로 판단된다.

아세틸콜린 분해효소 억제 효과 측정

아세틸콜린은 중추, 말초 신경계에 존재하는 신경전달 물질이며 신경 자극으로 인한 신호 전달에 관여하여 신경전달의 기능을 수행한다(Fedotova 등, 2020). 합성된 아세틸콜린은 시냅스 틈으로 운반된 후 시냅스 후 뉴런의 아세틸콜린 수용체에 결합함으로써 신호 전달을 진행하고 신호 전달이 완료되면 아세틸콜린은 수용체에서 분리되어 AChE에 의해 acetate와 choline으로 분해됨으로써 신경전달 과정은 종결된다(Gu와 Wang, 2021). 뇌로 유입되는 PM2.5로 인한 산화적 스트레스나 활성산소종 등의 다양한 원인으로 인하여 acetylcholine의 생성을 감소시키고 AChE의 활성을 과도하게 증가시켜 인지기능 장애에 영향을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다(Winkler 등, 1998). 따라서 본 연구에서는 EFGC의 AChE의 억제 활성을 평가하여 인지기능의 저하를 예방할 수 있는 기능성 소재로서의 사용 가능성을 확인하였다(Fig. 1A).

Fig 1. Acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activity and neuronal protective effect of ethyl acetate fraction from Juglans regia Gimcheon 1 ho (EFGC) on PM2.5-induced cytotoxicity in HT22 cells. (A) Acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activity. (B) Cell viability of EFGC on PM2.5-induced cytotoxicity in HT22 cells. (C) Effect of EFGC on PM2.5-induced oxidative stress in HT22 cells. Results shown are mean±SD (n=3). Data were statistically considered at P<0.05, and different small letters represent a statistical difference.


EFGC의 200 mg/mL의 농도에서 22.29%의 억제 활성을 나타냈으며, 농도가 낮아짐에 따라 억제 활성이 감소하는 경향을 보였다. 호두에 함유된 탄닌과 탄닌산 화합물은 장내 대사를 통해 ellagic acid나 tannic acid 등으로 분해되고, 이는 인체로 흡수되어 우수한 AChE 억제 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Tejada 등, 2017; Turkan 등, 2019). 또한, 호두가 풍부하게 함유된 식단은 알츠하이머병으로 형질 전환된 마우스 모델에서 기억력, 학습능력 및 불안장애가 크게 개선된 것이 확인되었다(Muthaiyah 등, 2014). 더불어 호두의 구성 지방산인 conjugated linoleic acid(CLA)는 정상적인 뇌신경 발달과 인지기능에 필요하다고 알려져 있으며, α-linoleic acid는 Aβ로 유도된 인지기능 장애 마우스 모델에서 신경염증과 세포사멸을 완화한다고 보고되고 있다(Ali 등, 2020; Geddes 등, 2017). 따라서 본 실험을 통해 EFGC에 다량으로 함유된 탄닌 화합물과 다중 불포화지방산 등으로 기인하는 AChE 억제 활성을 평가하여 EFGC가 향후 뇌 신경세포 기능 개선에 도움을 줄 수 있는 천연소재로서의 이용 가치가 있음을 확인하였다.

뇌 신경세포에서의 세포 생존율 측정과 산화적 스트레스 억제 효과

PM2.5에 노출되면 PM2.5가 폐로 흡입되어 혈액을 타고 뇌에 도달하거나, 비강을 통하여 BBB를 쉽게 통과하여 뇌로 이동한다(Chen 등, 2020). 뇌 조직은 다른 조직보다 불포화 지방산의 비율이 상대적으로 높아 산화적 스트레스에 취약하기 때문에, 흡입을 통하여 뇌로 도달한 PM2.5는 ROS 생성이나 산화적 스트레스를 일으키게 되고 이는 결과적으로 신경세포의 사멸을 초래한다(Han 등, 2020). 따라서 PM2.5로 유도된 산화적 스트레스에 대한 EFGC가 가지는 세포보호 효과를 확인하고자 세포 생존율과 산화적 스트레스 억제 활성을 확인하였다(Fig. 1B, C).

본 연구에서 진행된 PM2.5로 유도된 산화적 스트레스에 대하여 세포 생존율을 측정한 결과는 다음과 같다(Fig. 1B). PM2.5로 인하여 세포독성을 유도한 HT22 cell에서의 세포 생존율은 PM2.5만 단독으로 처리한 그룹은 정상 대조군(100%) 대비 77.69%의 생존율을 나타내었으며, 20 μg/mL의 농도로 EFGC를 처리하였을 때 85.54%의 세포 생존율을 나타내었다. PM2.5와 양성대조군인 카테킨을 처리한 그룹에서는 정상 대조군 대비 94.96%의 세포 생존율을 나타내었다.

본 연구에서 진행된 PM2.5로 유도된 산화적 스트레스의 억제 효과는 다음과 같다(Fig. 1C). PM2.5를 이용하여 산화적 스트레스를 유도한 HT22 cell에서 산화적 스트레스의 함량을 측정하였을 때, PM2.5를 처리한 그룹에서는 정상대조군(100%) 대비, ROS 생성이 18.60% 증가한 것을 나타냈으며, PM2.5와 20 μg/mL의 EFGC를 동시에 처리한 그룹에서는 ROS가 정상 대조군 대비 31.17% 감소한 값을 나타내었다. 양성대조군인 카테킨과 PM2.5를 동시에 처리한 그룹에서는 41.09% 감소한 ROS 값을 나타내었다.

다양한 경로를 통해 PM2.5가 해마에 도달하면 신경독성 및 산화적 스트레스를 일으켜 해마의 부피 및 피질 두께 감소, 뇌졸중 발병률 증가, 인지기능 장애를 초래한다고 보고되고 있다(Liu 등, 2021). 호두에는 탄닌산 화합물, 다가불포화지방산이 풍부하게 함유되어 있으며, 이러한 생리활성 물질들에 의해 산화적 스트레스로 유발되는 칼슘 항상성 붕괴, 세포손상 또는 세포사멸을 완화시켰다(Carey 등, 2013). 더불어 Yan 등의 연구에서 탄닌은 산화 손상을 줄이고 인지장애를 개선하며 손상된 해마 조직에서 신경 변성 및 핵 손상을 완화한다고 보고하였다(Tian 등, 2011). 따라서 본 연구를 통해 풍부한 페놀성 화합물과 탄닌성 화합물을 가진 EFGC가 세포 내 ROS를 제거하여 뇌 해마세포를 보호함으로써 뇌 신경 신호전달 장애를 예방할 수 있는 천연 소재로 활용될 가능성을 확인하였다.

세포사멸과 염증 관련 단백질 발현량 측정

다양한 경로로 PM2.5가 인체 내로 들어와 뇌로 도달하면 PM2.5와 뇌 신경세포 외 수용체가 결합하고 수용체의 신호에 의해 nuclear factor-κB(NF-κB)경로를 활성화시킨다(Peng 등, 2017).

활성화된 NF-κB에 의해 IL-1β, interleukin 6(IL-6) 및 TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인이 방출되어 염증을 유발한다(Woodward 등, 2017). 또한, PM2.5로 인한 세포막 손상, ROS의 생성은 pro-caspase-3를 활성화시키고 세포 내 단백질 중합체를 형성함으로써 caspase-1을 활성화하여 염증성 인자를 방출하고 염증반응과 세포사멸을 초래한다(Calderón-Garcidueñas 등, 2012). 그리고 PM2.5로 유도된 염증성 인자와 ROS는 Aβ의 축적과 c-Jun N-terminal kinase(JNK)의 인산화를 유도하고 미토콘드리아 내 B-cell lymphoma 2(BCl-2)와 같은 anti-apoptosis 단백질의 인산화, BCl-2 associated X(BAX) 단백질의 방출을 유도하여 세포사멸을 초래한다(Nie 등, 2021). 더불어 세포 성장, 생존 및 세포주기 등과 같은 세포 반응을 조절하는 phospho-extracellular signal-regulated protein kinase(p-ERK1/2)와 phospho-cAMP-response element binding protein(p-CREB)을 억제하여 신경세포의 세포사멸 및 시냅스 손상을 일으키는 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(Chen 등, 2017).

따라서 HT22 세포에서 PM2.5로 유도되는 스트레스 의한 EFGC의 염증반응과 세포사멸의 개선 기작을 확인하고자 PM2.5를 처리한 HT22 cells에서 단백질 발현량을 측정하였다(Fig. 2). PM2.5를 처리한 그룹에서는 정상 대조군(100%) 대비 p-JNK(116.71%), caspase-1(114.44%), BAX(117.53 %), phospho-NF-κB(p-NF-κB, 130.34%)의 발현이 증가한 것을 확인하였다. 반면 PM2.5와 EFGC를 20 μg/mL 농도로 함께 처리한 그룹에서는 정상 대조군(100%) 대비 p-JNK(100.96%), caspase-1(100.95%), BAX(98.30%), p-NF-κB(114.13%)의 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인함으로써 호두 아세트산 에틸 분획물의 보호 효과를 확인하였다. 또한, BCl-2의 발현량은 PM2.5 처리 그룹에서 정상 대조군(100%) 대비 BCl-2(68.26%)로 하향 조절되었으며, EFGC를 20 μg/mL 농도로 함께 처리한 그룹에서는 BCl-2(106.53%)의 발현량을 개선되는 것을 확인하였다.

Fig 2. Protective effect of ethyl acetate fraction from Juglans regia Gimcheon 1 ho (EFGC) on protein expression in PM2.5-induced HT22 cells. (A) Western blot images. (B) p-JNK, (C) BCl-2, (D) BAX, (E) caspase-1, and (F) p-NF-κB in HT22 cells. Results shown are mean±SD (n=3). Data were statistically considered at P<0.05, and different small letters represent a statistical difference

일반적으로 PM2.5의 일부는 BBB에 의해 차단되지만, PM2.5의 작은 크기로 인하여 뇌척수액을 통해 뇌로 침투할 수 있으며 PM2.5에 포함된 납, 알루미늄, 망간과 같은 금속이온이 해마로 이동하여 신경독성, 신경세포 사멸, ROS 생성 등을 일으킬 수 있다(Kim 등, 2020b). Kim 등(2020b)이 수행한 사전 연구에서 호두 추출물은 Aβ1-42로 유도된 마우스의 행동실험에서 인지기능을 개선하고 occludin이나 ZO-1과 같은 BBB 관련 단백질의 발현을 개선 시켜 PM2.5로 인하여 약화된 BBB를 강화시키는 것으로 나타났다. Zou 등(2016)의 연구에서는 호두 펩타이드의 섭취는 Aβ25-35 주입 마우스에서 해마 조직에서 NO와 AChE의 수준을 유의적으로 감소시켰으며, TNF-α, IL-1β, IL-6와 같은 전염증성 사이토카인의 발현을 완화하였다고 보고했다. 또한, 호두 단백질 가수분해물은 lipopolysaccaride(LPS)로 인지장애가 유도된 마우스와 미세아교 세포에서 superoxide dismutase(SOD) 활성, glutathione peroxidase(GSH-px) 활성 및 catalase(CAT) 활성을 개선시켰으며, IL-1β, IL-6, TNF-α와 같은 전 염증성 인자의 발현을 조절하였다(Wang 등, 2020). 호두에 풍부하게 함유되어있는 ellagitannin은 인체 내에서 가수분해되어 ellagic acid와 그 유도물질들이 형성된다(Moon 등, 2020). 또한 위관 영양법으로 마우스에 ellagic acid를 투여하였을 때 혈액에서 높은 농도에 ellagic acid가 검출되었다고 보고되고 있으며, 식물성 폴리페놀이 풍부한 식단을 섭취한 환자들의 뇌 척수액에서 caffeic acid가 높은 농도로 검출되었다(Teel과 Martin, 1988; Grabska-Kobylecka 등, 2020). 이를 고려할 때, 식이로 섭취한 생리활성 물질은 인체 내로 흡수되고 뇌에 도달함으로써 인지기능 개선과 같은 다양한 생리활성 효과를 유도할 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 국내산 호두 품종(Gimcheon 1 ho)의 분획으로 얻어진 EFGC는 PM2.5로부터 유도되는 다양한 세포독성을 완화하여 뇌 해마세포를 보호하는 데 도움을 줄 수 있을 것으로 판단되며, 이는 향후 미세먼지로부터 유발되는 다양한 세포 및 조직 독성에 관한 연구에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.

요 약

본 연구에서는 국내산 호두 아세트산 에틸 분획물에 대한 생리활성 평가를 위해 총 폴리페놀 화합물, 총 플라보노이드 화합물, 총 탄닌 화합물, ABTS와 DPPH 라디칼 소거 활성, 철의 환원 능력, 지질과산화물 생성 억제 능력, AChE의 활성 억제 효과를 확인하였다. 특히 EFGC의 철의 환원 능력과 지질과산화물 생성 억제 능력은 양성대조군으로 사용된 비타민 C, 카테킨보다 높은 활성을 나타내었다. HT22 세포에서 PM2.5로 유도되는 세포독성에 대한 세포 생존율과 산화적 스트레스 생성 억제 능력을 평가해 보았을 때 우수한 세포보호 효과를 나타내었다. 또한, EFGC는 caspase-1, BAX, p-JNK, BCl-2 및 p-NF-κB와 같은 염증성 인자와 세포사멸 관련 인자의 발현을 개선함으로써 PM2.5로 유발되는 세포독성에 대한 보호 효과를 확인하였다. 따라서 본 실험에서는 EFGC가 PM2.5로 유도된 뇌 신경세포 독성에 대하여 도움을 줄 수 있는 건강기능식품 소재로서의 산업적인 가치를 확인하였다.

감사의 글

본 연구는 정부의 재원으로 한국연구재단(National Research Foundation of Korea, Daejeon, Korea)의 개인기초연구(2018R1D1A3B07043398)의 지원을 받아 수행된 결과로 이에 감사드립니다.

Fig 1.

Fig 1.Acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activity and neuronal protective effect of ethyl acetate fraction from Juglans regia Gimcheon 1 ho (EFGC) on PM2.5-induced cytotoxicity in HT22 cells. (A) Acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activity. (B) Cell viability of EFGC on PM2.5-induced cytotoxicity in HT22 cells. (C) Effect of EFGC on PM2.5-induced oxidative stress in HT22 cells. Results shown are mean±SD (n=3). Data were statistically considered at P<0.05, and different small letters represent a statistical difference.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 997-1006https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.9.997

Fig 2.

Fig 2.Protective effect of ethyl acetate fraction from Juglans regia Gimcheon 1 ho (EFGC) on protein expression in PM2.5-induced HT22 cells. (A) Western blot images. (B) p-JNK, (C) BCl-2, (D) BAX, (E) caspase-1, and (F) p-NF-κB in HT22 cells. Results shown are mean±SD (n=3). Data were statistically considered at P<0.05, and different small letters represent a statistical difference
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 997-1006https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.9.997

Table 1 . Antioxidant activity of ethyl acetate fractions fromJuglans regia Gimcheon 1 ho (EFGC).

TPC1)TTC2)TFC3)ABTS4)DPPH5)FRAP6)MDA7)
815.83±26.02805.48±24.95138.54±0.9471.4499.470.74±0.030.44

1)TPC: total phenolic content. 2)TTC: total tannin content. 3)TFC: total flavonoid content. 4)ABTS: ABTS radical scavenging activity. 5)DPPH: DPPH radical scavenging activity. 6)FRAP: ferric reducing antioxidant power. 7)MDA: malondialdehyde inhibitory effect..

Results shown are mean±SD (n=3). Results of TPC, TTC, and TFC are presented as mg of GAE/g, mg of TAE/g, and mg of RE/g, respectively. Results of ABTS, DPPH, and MDA are presented as IC50 value (μg/mL). Result of FRAP is presented as absorbance at 593 nm..


References

  1. Ali W, Ikram M, Park HY, Jo MG, Ullah R, Ahmad S, et al. Oral administration of alpha linoleic acid rescues Aβ-induced glia-mediated neuroinflammation and cognitive dysfunction in C57BL/6N mice. Cells. 2020. 9:667. https://doi.org/10.3390/cells9030667
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  2. Benzie IFF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “Antioxidant power”: The FRAP assay. Anal Biochem. 1996. 239:70-76.
    Pubmed CrossRef
  3. Blois MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature. 1958. 181:1199-1200.
    CrossRef
  4. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976. 72:248-254.
    CrossRef
  5. Calderón-Garcidueñas L, Kavanaugh M, Block M, D’Angiulli A, Delgado-Chávez R, Torres-Jardón R, et al. Neuroinflammation, hyperphosphorylated tau, diffuse amyloid plaques, and down-regulation of the cellular prion protein in air pollution exposed children and young adults. J Alzheimers Dis. 2012. 28:93-107.
    Pubmed CrossRef
  6. Carey AN, Fisher DR, Joseph JA, Shukitt-Hale B. The ability of walnut extract and fatty acids to protect against the deleterious effects of oxidative stress and inflammation in hippocampal cells. Nutr Neurosci. 2013. 16:13-20.
    Pubmed CrossRef
  7. Chang ST, Wu JH, Wang SY, Kang PL, Yang NS, Shyur LF. Antioxidant activity of extracts from Acacia confusa Bark and heartwood. J Agric Food Chem. 2001. 49:3420-3424.
    Pubmed CrossRef
  8. Chen M, Li B, Sang N. Particulate matter (PM2.5) exposure season-dependently induces neuronal apoptosis and synaptic injuries. J Environ Sci. 2017. 54:336-345.
    Pubmed CrossRef
  9. Chen X, Guo J, Huang Y, Liu S, Huang Y, Zhang Z, et al. Urban airborne PM2.5-activated microglia mediate neurotoxicity through glutaminase-containing extracellular vesicles in olfactory bulb. Environ Pollut. 2020. 264:114716. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2020.114716
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  10. Fedotova MV, Kruchinin SE, Chuev GN. Hydration features of the neurotransmitter acetylcholine. J Mol Liq. 2020. 304:112757. https://doi.org/10.1016/j.molliq.2020.112757
    CrossRef
  11. Geddes RI, Hayashi K, Bongers Q, Wehber M, Anderson IM, Jansen AD, et al. Conjugated linoleic acid administration induces amnesia in male sprague dawley rats and exacerbates recovery from functional deficits induced by a controlled cortical impact injury. Plos One. 2017. 12:e0169494. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0169494
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  12. Grabska-Kobylecka I, Kaczmarek-Bak J, Figlus M, Prymont-Przyminska A, Zwolinska A, Sarniak A, et al. The presence of caffeic acid in cerebrospinal fluid: Evidence that dietary polyphenols can cross the blood-brain barrier in humans. Nutrients. 2020. 12:1531. https://doi.org/10.3390/nu12051531
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  13. Gu X, Wang X. An overview of recent analysis and detection of acetylcholine. Anal Biochem. 2021. 632:114381. http://doi.org/10.1016/j.ab.2021.114381
    Pubmed CrossRef
  14. Gülçin İ, Huyut Z, Elmastaş M, Aboul-Enein HY. Radical scavenging and antioxidant activity of tannic acid. Arabian J Chem. 2010. 3:43-53.
    CrossRef
  15. Hamra GB, Guha N, Cohen A, Laden F, Raaschou-Nielsen O, Samet JM, et al. Outdoor particulate matter exposure and lung cancer: A systematic review and meta-analysis. Environ Health Perspect. 2014. 122:906-911.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  16. Han HJ, Park SK, Kim MJ, An JW, Lee SJ, Kang JY, et al. Industrial potential of domestic Zanthoxylum piperitum and Zanthoxylum schinifolium: Protective effect of both extracts on high glucose-induced neurotoxicity. Korean J Food Sci Technol. 2020. 52:274-283.
  17. Heo HJ, Cho HY, Hong B, Kim HK, Kim EK, Kim BG, et al. Protective effect of 4′, 5-dihydroxy-3′,6,7-trimethoxyflavone from Artemisia asiatica against Aβ-induced oxidative stress in PC12 cells. Amyloid. 2001. 8:194-201.
    Pubmed CrossRef
  18. Kim DO, Jeong SW, Lee CY. Antioxidant capacity of phenolic phytochemicals from various cultivars of plums. Food Chem. 2003. 81:321-326.
    CrossRef
  19. Kim GH, Kim JM, Park SK, Kang JY, Han HJ, Shin EJ, et al. Nutritional composition of domestic and imported walnuts (Juglans regia L.). J Korean Soc Food Sci Nutr. 2020a. 49:608-616.
    CrossRef
  20. Kim JM, Lee U, Kang JY, Park SK, Shin EJ, Kim HJ, et al. Anti-amnesic effect of walnut via the regulation of BBB function and neuro-inflammation in Aβ1-42-induced mice. Antioxidants. 2020b. 9:976. https://doi.org/10.3390/antiox9100976
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  21. Liu F, Wang Z, Wei Y, Liu R, Jiang C, Gong C, et al. The leading role of adsorbed lead in PM2.5-induced hippocampal neuronal apoptosis and synaptic damage. J Hazard Mater. 2021. 416:125867. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.125867
    Pubmed CrossRef
  22. Liu J, Li L, Suo WZ. HT22 hippocampal neuronal cell line possesses functional cholinergic properties. Life Sci. 2009. 84:267-271.
    Pubmed CrossRef
  23. Mangia C, Cervino M, Gianicolo EAL. Secondary particulate matter originating from an industrial source and its impact on population health. Int J Environ Res Public Health. 2015. 12:7667-7681.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  24. Moon JH, Lee U, Kim JM, Park SK, Kang JY, Shin EJ, et al. Metabolic analysis and neuroprotective effect of domestic and imported walnuts (Juglans regia L.). J Korean Soc Food Sci Nutr. 2020. 49:907-918.
    CrossRef
  25. Muthaiyah B, Essa MM, Lee M, Chauhan V, Kaur K, Chauhan A. Dietary supplementation of walnuts improves memory deficits and learning skills in transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 2014. 42:1397-1405.
    Pubmed CrossRef
  26. Nie Z, Xia X, Zhao Y, Zhang S, Zhang Y, Wang J. JNK selective inhibitor, IQ-1S, protects the mice against lipopolysaccharides-induced sepsis. Bioorg Med Chem. 2021. 30:115945. https:// doi.org/10.1016/j.bmc.2020.115945
    Pubmed CrossRef
  27. Peng H, Zhao XH, Bi TT, Yuan XY, Guo JB, Peng SQ. PM2.5 obtained from urban areas in Beijing induces apoptosis by activating nuclear factor-kappa B. Military Med Res. 2017. 4:27. https://doi.org/10.1186/s40779-017-0136-3
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  28. Prakash D, Singh BN, Upadhyay G. Antioxidant and free radical scavenging activities of phenols from onion (Allium cepa). Food Chem. 2007. 102:1389-1393.
    CrossRef
  29. Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biol Med. 1999. 26:1231-1237.
    CrossRef
  30. Riedl KM, Carando S, Alessio HM, McCarthy M, Hagerman AE. Antioxidant activity of tannins and tannin-protein complexes: Assessment in vitro and in vivo. ACS Symposium Series. 2002. 807:188-200.
    CrossRef
  31. Ritz B, Hoffmann B, Peters A. The effects of fine dust, ozone, and nitrogen dioxide on health. Dtsch Arztebl Int. 2019. 116:881-886.
    CrossRef
  32. Sethiya NK, Trivedi A, Mishra S. The total antioxidant content and radical scavenging investigation on 17 phytochemical from dietary plant sources used globally as functional food. Biomed Prev Nutr. 2014. 4:439-444.
    CrossRef
  33. Shah SD, Cocker DR, Miller JW, Norbeck JM. Emission rates of particulate matter and elemental and organic carbon from in-use diesel engines. Environ Sci Technol. 2004. 38:2544-2550.
    Pubmed CrossRef
  34. Teel RW, Martin RM. Disposition of the plant phenol ellagic acid in the mouse following oral administration by gavage. Xenobiotica. 1988. 18:397-405.
    Pubmed CrossRef
  35. Tejada S, Setzer WN, Daglia M, Nabavi SF, Sureda A, Braidy N, et al. Neuroprotective effects of ellagitannins: A brief review. Curr Drug Targets. 2017. 18:1518-1528.
    CrossRef
  36. Tian Y, Zou B, Yang L, Xu SF, Yang J, Yao P, et al. High molecular weight persimmon tannin ameliorates cognition deficits and attenuates oxidative damage in senescent mice induced by D-galactose. Food Chem Toxicol. 2011. 49:1728-1736.
    Pubmed CrossRef
  37. Tsao R. Chemistry and biochemistry of dietary polyphenols. Nutrients. 2010. 2:1231-1246.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  38. Turkan F, Taslimi P, Saltan FZ. Tannic acid as a natural antioxidant compound: Discovery of a potent metabolic enzyme inhibitor for a new therapeutic approach in diabetes and Alzheimer’s disease. J Biochem Mol Toxicol. 2019. 33:e22340. https://doi.org/10.1002/jbt.22340
    CrossRef
  39. Uchida S, Ohta H, Niwa M, Mori A, Nonaka GI, Nishioka I, et al. Prolongation of life span of stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP) ingesting persimmon tannin. Chem Pharm Bull. 1990. 38:1049-1052.
    Pubmed CrossRef
  40. Wang J, Huang J, Wang L, Chen C, Yang D, Jin M, et al. Urban particulate matter triggers lung inflammation via the ROS-MAPK-NF-κB signaling pathway. J Thorac Dis. 2017. 9:4398-4412.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  41. Wang S, Zheng L, Zhao T, Zhang Q, Liu Y, Sun B, et al. Inhibitory effects of walnut (Juglans regia) peptides on neuroinflammation and oxidative stress in lipopolysaccharide-induced cognitive impairment mice. J Agric Food Chem. 2020. 68:2381-2392.
    Pubmed CrossRef
  42. Winkler J, Thal LJ, Gage FH, Fisher LJ. Cholinergic strategies for Alzheimer’s disease. J Mol Med. 1998. 76:555-567.
    Pubmed CrossRef
  43. Woodward NC, Levine MC, Haghani A, Shirmohammadi F, Saffari A, Sioutas C, et al. Toll-like receptor 4 in glial inflammatory responses to air pollution in vitro and in vivo. J Neuroinflammation. 2017. 14:84. https://doi.org/10.1186/s12974-017-0858-x
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  44. Yu L, Haley S, Perret J, Harris M, Wilson J, Qian M. Free radical scavenging properties of wheat extracts. J Agric Food Chem. 2002. 50:1619-1624.
    Pubmed CrossRef
  45. Yuan Y, Wu Y, Ge X, Nie D, Wang M, Zhou H, et al. In vitro toxicity evaluation of heavy metals in urban air particulate matter on human lung epithelial cells. Sci Total Environ. 2019. 678:301-308.
    Pubmed CrossRef
  46. Zhang LL, Lin YM. Antioxidant tannins from Syzygium cumini fruit. Afr J Biotechnol. 2009. 8:2301-2309.
  47. Zhang Z, Liao L, Moore J, Wu T, Wang Z. Antioxidant phenolic compounds from walnut kernels (Juglans regia L.). Food Chem. 2009. 113:160-165.
    CrossRef
  48. Zou J, Cai PS, Xiong CM, Ruan JL. Neuroprotective effect of peptides extracted from walnut (Juglans Sigilata Dode) proteins on Aβ25-35-induced memory impairment in mice. J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci. 2016. 36:21-30.
    Pubmed CrossRef