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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(9): 905-911

Published online September 30, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.9.905

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Artemether Can Attenuate Thrombus Formation by Inhibiting U46619-Induced Platelet Activation

Chang-Eun Park and Dong-Ha Lee

Department of Biomedical Laboratory Science, Molecular Diagnostics Research Institute, Namseoul University

Correspondence to:Dong-Ha Lee, Department of Biomedical Laboratory Science, Namseoul University, 91, Daehak-ro, Seonghwan-eup, Seobuk-gu, Cheonan-si, Chungnam 31020, Korea, E-mail: dhlee@nsu.ac.kr

Received: May 19, 2022; Revised: July 18, 2022; Accepted: August 10, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Department of Biomedical Laboratory Science, Molecular Diagnostics Research Institute, Namseoul UniversityWhen blood vessels are damaged, a prompt hemostatic response follows to lower blood loss and maintain normal circulation, and platelet activation and aggregation are essential components of this response. Nevertheless, abnormal or excessive platelet aggregation underlies the etiologies of cardiovascular diseases such as thrombosis, atherosclerosis, and stroke. Therefore, the identification of substances that regulate platelet activation and suppress platelet aggregation is an important aspect of developments aimed at treating and preventing cardiovascular diseases. Artemether is a methyl ether derivative of artemisinin derived from the antimalarial plant Artemisia genus. We studied the effects of artemether on platelet functions using U46619-induced human platelets and found that artemether upregulated the cyclic adenosine monophosphate-dependent pathway and downregulated intracellular calcium mobilization, glycoprotein IIb/IIIa (αIIb/β3)-mediated signaling, and clot retraction. We suggest that artemether has effective antiplatelet and antithrombotic effects and is a potential therapeutic candidate for the prevention of platelet-induced cardiovascular disease.

Keywords: artemether, cAMP, intracellular Ca2+, fibrin clot

혈구 세포 중 하나로 알려진 혈소판은 손상된 혈관에 작용하여 지혈의 역할을 담당하지만, 비정상적으로 과도하게 작용하는 경우 혈전증, 심근경색증, 동맥경화증 등의 심혈관계 장애를 일으킬 수 있다. 이런 이유로 혈소판의 활성화를 적절히 저해하는 역할을 할 수 있는 약물들이 개발되고 있지만 여러 부작용과 적용의 한계들로 인하여 심혈관계 질환에 의해 발생하는 사망자의 수는 감소하지 않는 실정이다(Jackson, 2011). 또한 최근 코로나바이러스감염증-19 백신의 사용에 의한 출혈성 뇌졸중, 뇌정맥동 혈전증 등의 부작용 사례가 보고되었고 이런 이유로 EMA에서는 특정 백신의 사용 제한을 권고하기도 하였다(Kantarcioglu 등, 2021). 따라서 부작용이 적으면서 항혈전 예방 및 치료에 효과적이고 안정적인 성분의 지속적인 발굴이 필요하다고 판단된다.

활성화 물질에 의해 혈소판이 자극받으면 세포질 막에 위치한 인지질이 가수분해되어 방출되어 나오는 arachidonic acid가 TXA2로 전환된다(Morello 등, 2009; Jennings, 2009). 분비가 증가된 TXA2는 주변의 혈소판막 수용체에 결합하고, 이는 혈소판 응집을 지속적으로 일어나게 하는 증폭제로 작용한다고 알려져 있다(Sabatine과 Jang, 2000). 뿐만 아니라 TXA2의 유사체 중 하나로 사용되는 U46619(9, 11-dideoxy 9a,11a-methanoepoxy prostaglandin F2a)가 세포질 내로 동원되는 Ca2+를 증가시킴으로써 myosin light chain 및 pleckstrin과 같은 세포골격 단백질들을 인산화하면서 혈소판 응집을 유도한다고 보고된 바 있다(Cattaneo 등, 1991; Su 등, 1999).

정상적으로 혈액이 순환되는 중에는 nitric oxide나 prostaglandin I2의 ​​혈관 내피세포에서 방출되며 cAMP와 cGMP의 생성 증가를 유도한다. 혈소판 내에서 증가된 cAMP에 의해 protein kinase A(PKA)의 활성화가, cGMP에 의해 protein kinase G(PKG)의 활성화가 유도되고, 활성화된 PKA와 PKG는 inositol triphosphate receptor(IP3R) 및 vasodilator-stimulated phosphoprotein(VASP)과 같은 인산화 단백질들을 인산화한다고 알려져 있다(Schwarz 등, 2001). IP3R의 인산화는 IP3R의 형태 변화를 통해 비활성화를 일으키고, 이는 dense tubular system에서 세포질 내 동원되는 Ca2+를 저해하는 결과로 이어진다(Quinton과 Dean, 1992; Cavallini 등, 1996). 혈소판의 VASP는 PKA 및 PKG의 기질로 이용되는데, cAMP-의존성인 VASP Ser157이나 cGMP-의존성인 VASP Ser239의 인산화를 유발시키면서 αⅡb/β3 및 actin filament 활성을 억제한다고 보고되었다(Laurent 등, 1999; Sudo 등, 2003). 활성화된 PKA와 PKG는 IP3R의 인산화를 거쳐 Ca2+ 동원을 저해할 뿐 아니라 VASP의 인산화를 거쳐 αⅡb/β3의 저해를 일으킴으로써 혈소판의 활성을 억제하기 때문에 항혈소판 효과를 확인하기 위해서는 이들 단백질의 조절능을 확인하는 것이 필요하다.

Artemether는 Artemisia속의 유효성분으로 알려진 artemisinin의 유도체로서 다양한 Artemisia속을 메탄올로 추출하였을 때 최대 0.34%까지 함유되어 있다고 알려져 있으며(Singh 등, 2021), 기생충의 액포에서 ferriprotoporphyrin Ⅸ(heme)이나 철 이온과 상호 작용을 통해 세포 독성 라디칼을 생성함으로써 말라리아 치료에 효과적 기능한다고 보고된 바 있다(Esu 등, 2019). 제안된 mechanism 중 하나는 artemether가 항산화 및 대사 효소 억제를 억제하면서 세포에 산화 및 대사 스트레스를 가하여 기생충의 병변 및 성장을 감소시킨다는 것이다(Saeed 등, 2016). 그러나 지금까지 혈소판 활성화 및 응집에서 artemether의 역할과 U46619로 유도한 사람 혈소판에서 artemether의 작용기전에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다. 본 연구는 U46619가 유도하는 혈소판 활성화 과정에서 활성화에 영향을 미치는 다양한 요인들에 artemether가 어떻게 작용하는지 규명함으로써 artemether의 항혈소판 기능을 확인하고자 하였다.

시료

Artemether는 Avention Corporation(Siheung, Korea)에서 구입하여 사용하였다(Fig. 1). U46619는 Sigma Aldrich Co.(Saint Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Cayman Chemical(Ann Arbor, Miami, USA)로부터 cAMP와 cGMP Enzyme Immunoassay(EIA) kits 그리고 serotonin 및 ATP assay kits를 제공받았고, Invitrogen(Eugene, OR, USA)으로부터 Fura 2-AM 및 Alexa Fluor 488-conjugate fibrinogen을 구입하여 사용하였다. Cell Signaling(Beverly, MA, USA)으로부터 inositol 3-phosphate receptor type Ⅰ(IP3R), vasodilator-stimulated phosphoprotein(VASP), lysis buffer 그리고 anti-rabbit IgG-HRP-conjugate secondary antibody를 제공받았다. Enhanced chemiluminescence solution(ECL)과 polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane을 General Electric Healthcare(Buckinghamshire, UK)로부터 구입하여 사용하였다.

Fig. 1. The structure of artemether. PIN: Dihydroartemisinin methyl ether, Chemical formula: C16H26O5, Molar mass: 298.379 g/mole.

세척 혈소판 부유액의 제조

대한적십자사 혈액원(Suwon, Korea)으로부터 제공받은 사람의 농축혈소판을 사용하여 연구를 진행하였다. 세척 혈소판은 기존에 수행했던 방법대로 준비하였다(Shin 등, 2019). 농축혈소판을 1,300×g에서 8분 동안 원심분리한 후 하층의 혈소판을 분리하였고, 세척완충액(138 mM NaCl, 12 mM NaHCO3, 2.7 mM KCl, 5.5 mM glucose, 1 mM Na2EDTA 및 0.36 mM NaH2PO4, pH 6.9)으로 2번 세척하고, 현탁완충액(138 mM NaCl, 12 mM NaHCO3, 2.7 mM KCl, 5.5 mM glucose, 0.36 mM NaH2PO4, 0.49 mM MgCl2 및 0.25% gelatin, pH 7.4)으로 최종 108 cells/mL의 부유액이 되게 준비하였다. 저온의 상태에서 일어나는 혈소판의 자발적 응집을 피하기 위해 위의 모든 과정을 실온에서 수행하였으며, 남서울대학교 Institutional Review Board(IRB)의 승인(1041479-HR-201803-003)을 받아서 실험을 수행하였다.

Cyclic nulceotides(cAMP 및 cGMP) 생성량 측정

세척 혈소판 부유액을 여러 농도의 artemether로 전처리하여 37°C에서 3분간 배양하였고, 2 mM의 CaCl2를 첨가한 후 0.5 μM의 U46619로 자극하여 5분 동안 반응하였다. 1 M HCl을 첨가하는 것으로 반응을 종결했고, cAMP 및 cGMP ELISA kits에 의해 반응하여 ELISA reader(Molecular devices, San Jose, CA, USA)로 cAMP 및 cGMP 생성량을 측정하였다.

세포 내 Ca2+ 동원량 측정

우리는 5 μM Fura 2-AM을 PRP에 첨가하여 37°C에서 1시간 동안 배양하고 세척 완충액으로 2회 세척한 다음 현탁완충액을 사용하여 최종 농도 108 cells/mL가 되도록 부유시켰다. 다양한 농도의 artemether를 전처리하고 2 mM의 CaCl2와 0.5 μM의 U46619로 자극하여 5분 동안 반응하였다. BioTek Instrument사(Winooski, VT, USA)에서 구입한 분광 형광광도계(SFM 25)에서 Fura 2가 나타내는 형광을 측정하였다. 여기 파장은 시작 값을 340 nm로 설정하여 0.5초씩 증가해가며 최종 380 nm에 도달되도록 하였다. 510 nm의 파장을 방출 파장으로 설정하였다. 세포질 내로 동원된 Ca2+ 농도는 Grynkiewicz의 방법을 통해 산출하였다(Grynkiewicz 등, 1985).

혈소판 막 αⅡb/β3에 대한 fibrinogen 결합도 측정

세척 혈소판 부유액을 여러 농도의 artemether로 전처리하여 37°C에서 3분간 배양하였고, 20 μg/mL의 Alexa Flour 488-human fibrinogen을 첨가한 후, 2 mM CaCl2와 0.5 μM의 U46619로 자극하여 5분 동안 반응하였다. 그리고 0.5% paraformaldehyde를 함유하는 phosphate-buffered saline(pH 7.4)을 첨가해 줌으로써 반응을 종결하였고, BD Bioscience사(San Jose, CA, USA)에서 만들어진 유세포 분석기(FACS)에서 fibrinogen binding을 측정하였다. 형광을 최대한 유지할 수 있도록 모든 과정을 빛이 차단된 환경에서 진행하였으며 Cell-Quest software(BD Biosciences)를 사용하여 결과를 분석하였다.

혈소판 매개의 fibrin clot 형성능 측정

Polyethylene tube로 PRP(400 μL)를 옮겨 여러 농도의 artemether로 전처리하여 37°C에서 3분간 배양하였고, 2 mM CaCl2를 첨가한 후 0.05 U/mL의 thrombin을 넣고 37°C에서 15분 동안 반응시켜 fibrin clot 형성을 유도하였다. Fibrin clot의 이미지를 촬영하여 Image J Software(v1.46, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 통해 fibrin clot이 형성된 면적을 계산하였다.

Immunoblotting

세척 혈소판 부유액을 여러 농도의 artemether로 전처리하여 37°C에서 3분간 배양하였고, 2 mM의 CaCl2와 0.5 μM의 U46619로 자극하여 5분 동안 반응하였다. lysis buffer를 첨가하여 반응을 종결하였고, BCA kit(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)을 이용하여 용해된 혈소판 부유액의 단백질 농도를 확인하였다. 용해된 혈소판 부유액(20 μg 단백질)을 8% SDS-PAGE에서 분리하여 PVDF membrane으로 옮긴 다음 항체 처리하였다. 1차 항체는 1:1,000의 희석배수로 희석하고 2차 항체는 1:2,000의 희석배수로 희석하여 반응하였다. 그리고 ECL 시약(General Electric Healthcare)을 통해 시각화하여 Image J Software(v1.46, National Institutes of Health)를 사용해 면적을 분석하였다.

통계 분석

본 실험 결과들은 반복 실험을 수행한 후 평균±표준편차로 표시하였다. 각 Group 간의 차이는 Student's t-test 또는 ANOVA를 통해 분석하였고, P<0.05인 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다. 분산 분석에 따라 그룹 평균 간에 유의한 차이가 나타나는 경우 Scheffe의 방법을 이용하여 그룹을 비교하였다.

Artemether가 cyclic nucleotides 생성량에 미치는 효과

이전 연구결과에서 cyclic nucleotides(cAMP 또는 cGMP)가 cAMP- 또는 cGMP-의존성 단백질 kinase(PKA 및 PKG)를 활성화하며 혈소판 응집을 억제하는 작용을 하는 신호전달 물질로 확인된 바 있다(Kuo 등, 1980). 본 연구에서 artemether가 cAMP 또는 cGMP 생성에 어떤 영향을 미치는 가를 확인하였다. Fig. 2A에 나타낸 결과를 통해 볼 수 있듯이 artemether는 cAMP 생성을 4.23±0.16 pmoL/108 cells에서 7.93±0.68 pmoL/108 cells까지 강하게 상승시켰다. 그러나 cGMP 생성은 artemether에 의해 유의적인 변화가 나타나지 않았다(Fig. 2B). 이러한 결과로 볼 때 U46619가 유도한 혈소판에서 artemether가 cyclic nucleotides 중 cAMP의 생성만을 유의하게 상승시키면서 혈소판의 기능을 조절하고 있음을 보여준다.

Fig. 2. Effects of artemether on cyclic nucleotides production. (A) Effects of artemether on cAMP production stimulated by U46619. (B) Effects of artemether on cGMP production stimulated by U46619. Data are expressed as means±SD (n=4). *P<0.05, **P<0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.

Artemether가 세포 내 Ca2+ 동원량 및 IP3R 인산화에 미치는 효과

생성이 증가한 cAMP 또는 cGMP는 의존성 효소인 PKA 또는 PKG를 활성화함으로써 관련된 기질 단백질들을 인산화하는 데 이용되는데, 그중 inositol 1, 4, 5-triphosphate receptor(IP3R)의 인산화를 유도하는 것으로 알려져 있다(Schwarz 등, 2001). 혈소판의 dense tubular system에 존재하는 IP3R은 IP 결합할 때 세포질 내로 Ca2+ 동원([Ca2+]i)을 유도하며, [Ca2+]i는 세포골격 단백질로 잘 알려진 myosin light chain 및 pleckstrin의 인산화를 일으킴으로 혈소판 내의 과립 분비와 P-selectin의 발현을 증가시켜 혈소판 활성화 및 응집을 일으키는 역할을 담당한다고 보고되었다(Vargai-Szabo 등, 2009).

본 연구에서 우리는 [Ca2+]i에 미치는 artemether의 효과를 확인하였다. 그 결과, Fig. 3A에 나타낸 결과를 통해 볼 수 있듯이 U46619에 의해 [Ca2+]i 수준이 100.5±1.2 nM에서 697.4±8.8 nM로 상승하였고, artemether는 U46619에 의해 증가한 [Ca2+]i를 농도 의존적으로 강하게 감소시켰다(Fig. 3A). 그리고 [Ca2+]i를 조절하는 단백질인 IP3R이 artemether에 영향을 받는지도 확인하였다. Fig. 3B에 나타낸 결과에서 알 수 있듯이 artemether는 U46619로 유도한 혈소판에서 IP3R의 인산화를 농도 의존적으로 강하게 증가시켰다. 이는 artemether에 의한 cAMP 생성 및 PKA 활성의 증가가 IP3R의 인산화를 일으켜 dense tubular system으로부터 동원되는 [Ca2+]i를 억제하였음을 보여준다.

Fig. 3. Effects of artemether on [Ca2+]i mobilization and IP3R phosphorylation. (A) Inhibitory effects of artemether on U46619- induced [Ca2+]i mobilization. (B) Effects of artemether on U46619-induced IP3R phosphorylation. Measurement of [Ca2+]i mobilization and Western blotting was described in Materials and Methods. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). #P<0.05 compared with no-stimulated platelets, **P<0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.

Artemether가 VASP 인산화에 미치는 효과

이전 연구들에서 VASP가 혈소판 점착능 및 분비능을 조절하면서 혈소판 활성화에 관여하는 cAMP/cGMP-의존성 효소인 PKA/PKG의 주요 기질에 속하며, VASP의 인산화가 증가되면 integrin αⅡb/β3의 활성화가 억제됨으로써 혈소판 응집을 저해한다고 보고된 바 있다(Wangorsch 등, 2011; Napeñas 등, 2013). Artemether가 U46619 유도의 혈소판에서 cAMP 생성을 농도 의존적으로 증가시키는 것을 확인하였고(Fig. 2), 계속해서 artemether가 PKA 및 PKG의 활성 증가를 일으켜 기질 단백질인 cAMP-의존성의 VASP Ser157 및 cGMP- 의존성의 VASP Ser239의 인산화를 조절할 수 있는지 살펴보았다. 그 결과, Fig. 4에 나타낸 결과를 통해 볼 수 있듯이 artemether에 의해 VASP Ser157 인산화가 농도 의존적으로 유의하게 증가한 것을 확인하였고, VASP Ser239 인산화에는 유의적인 변화를 일으키지 않는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 artemether가 cGMP에 영향을 미치지 않고 cAMP 농도를 강하게 증가한다는 결과와 일치한다(Fig. 2). 이는 artemether에 의해 cAMP의 생성량이 증가되었고, 그 결과 VASP의 인산화로 이어졌음을 보여준다.

Fig. 4. Effects of artemether on VASP phosphorylation. Western blotting was determined as described in Materials and Methods. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). #P<0.05 compared with no-stimulated platelets, *P<0.05, **P<0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.

Artemether가 αⅡb/β3에 대한 fibrinogen 결합도에 미치는 효과

신호전달 과정을 통해 일어나는 Integrin αⅡb/β3의 친화력 증가는 혈소판 세포 골격의 변형을 유발하고 혈소판 증식 및 혈전 생성으로 이어지는 것으로 알려져 있다(Topol 등, 1999). Integrin αⅡb/β3는 휴지기 상태의 혈소판에서는 낮은 친화도로 유지되다가, 응집유도제에 의한 inside-out 신호전달 경로가 활성화되면 구조적 변화를 일으킴으로써 친화도 증가가 나타난다(Phillips 등, 2001). Fibrinogen이 그 수용체인 αⅡb/β3에 결합함으로써 추가적인 형태 변화, 점착 과정을 거쳐 혈소판 응집의 증폭으로 이어진다.

본 연구에서 우리는 artemether가 fibrinogen이 αⅡb/β3에 binding 되는 데 영향을 미치는지 확인하였다. Fig. 5에 나타낸 결과를 통해 볼 수 있듯이 U46619를 처리하면 αⅡb/β3에 대한 fibrinogen 결합이 78.5±0.8%까지 증가하는 것을 알 수 있다(Fig. 5A-b, b, 5B). 그러나 artemether(50~500 μM)를 처리하였을 때 fibrinogen 결합 정도가 농도 의존적으로 감소하였고, 특히 500 μM의 artemether에 의해 17.7±0.8%까지 강하게 fibrinogen 결합이 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 5A-c~f, 5B). 이러한 결과는 artemether에 의해 상향 조절된 VASP 인산화에 의해 integrin αⅡb/β3의 활성이 억제된 결과로 해석된다.

Fig. 5. Effects of artemether on U46619-induced fibrinogen binding. (A) The flow cytometry histograms on fibrinogen binding. a, Intact platelets (base); b, U46619 (0.5 µM); c, U46619 (0.5 µM)+artemether (50 µM); d, U46619 (0.5 µM)+artemether (100 µM); e, U46619 (0.5 µM)+artemether (300 µM); f, U46619 (0.5 µM)+artemether (500 µM) (B) Effects of artemether on U46619-induced fibrinogen binding (%). Measurement of fibrinogen binding was described in Materials and Methods. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). #P<0.05 compared with no-stimulated platelets, **P<0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.

Artemether가 혈소판 매개의 fibrin clot 형성에 미치는 효과

우리 몸의 혈전 생성은 손상된 혈관이 회복되는 과정에서 중요한 단계로 여겨지는데, 활성화된 혈소판이 손상 부위에 축적되어 30~60분 동안 수축하기 시작하고 만들어진 plug를 당겨줌으로써 fibrin clot을 형성한다. 이때 αⅡb/β3와 fibrinogen 사이의 결합이 혈소판 매개의 fibrin clot이 형성되는데 중요하게 작용하며, αⅡb/β3 활성을 억제하는 물질이 혈전 형성까지 강하게 억제한다고 알려져 있다(Topol 등, 1999). 혈소판 활성유도제로 αⅡb/β3를 활성화하면 fibrinogen의 결합이 증가하면서 αⅡb/β3 신호 전달 경로를 촉진시켜 fibrin clot 형성으로 이어지는 것이다.

본 연구에서 우리는 artemether가 thrombin으로 유도한 fibrin clot 형성에 어떤 효과를 미치는지 확인하였다. Fig. 6A에 나타낸 결과를 통해 볼 수 있듯이 thrombin 처리로 fibrin clot이 강하게 형성되었고, artemether는 100 μM 이상의 농도에서 이를 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인할 수 있다. Artemether(100, 300 및 500 μM)의 억제율을 살펴보면 각각 35.5%, 51.5% 및 85.5%로 나타난다(Fig. 6B). 이러한 결과는 artemether가 cAMP 생성 및 VASP Ser157 인산화를 상향 조절하며 αⅡb/β3의 친화도를 억제시키고, fibrin clot 형성이 감소하고 있음을 보여준다. Artemether는 다양한 Artemisia속을 메탄올로 추출하였을 때 최대 0.34%까지 함유되어 있다고 알려져 있기에, Artemisia속의 식물체를 알콜 추출하여 음용하면 혈전형성을 저해하는 데 유용할 것으로 기대되며, 향후 식이 실험을 통해 규명할 필요성이 있다고 사료된다(Singh 등, 2021).

Fig. 6. Effects of artemether on fibrin clot retraction. (A) Effects of artemether on thrombin-retracted fibrin clot photographs (B) Effects of artemether on thrombin-retracted fibrin clot area. Quantification of fibrin clot retraction was described in Materials and Methods. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). #P<0.05 compared with no-stimulated platelets rich plasma, **P<0.05 compared with the thrombin-stimulated platelets.

혈관이 손상될 때 혈액 손실을 줄이고 정상적인 순환을 유지하기 위해서 빠른 지혈 반응이 일어나야 하는데 이때 혈소판 활성화와 응집이 필수적인 현상이다. 그럼에도 불구하고 비정상적이거나 과도한 혈소판 응집이 일어날 경우, 혈전증, 동맥경화증, 뇌졸중을 비롯한 심혈관계 질환의 원인이 된다고 알려져 있다. 따라서 혈소판 활성화를 조절하고 응집 반응을 저해시킬 수 있는 물질을 발굴하는 것은 심혈관 질환의 치료 및 예방에 있어 매우 중요하다. Artemether는 Artemisia속에서 분리된 artemisinin의 methyl ether 유도체로서 말라리아에 대한 치료에 효과적이라고 알려졌지만 혈소판 응집이나 그 기전에 관한 연구는 전혀 없는 상황이다. U46619로 유도한 사람 혈소판에서 artemether의 효과와 그 작용기전을 확인하였다. 그 결과 artemether가 cyclic adenosine monophosphate(cAMP) 의존성 경로를 상향 조절하고, 세포질 내로의 Ca2+ 동원, 당단백질 Ⅱb/Ⅲa(αⅡb/β3) 매개의 신호 전달 활성화를 하향 조절함으로써 fibrin clot 형성을 저해할 수 있음을 확인하였다. 따라서 artemether가 강력한 항혈소판 및 항혈전 물질로써 기능할 수 있고, 혈소판이 매개하는 혈전증 및 심혈관계 질환을 예방하거나 치료하는 후보 물질이 될 수 있음을 제안한다.

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Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(9): 905-911

Published online September 30, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.9.905

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

U46619-유도의 사람 혈소판에서 혈소판 활성조절을 통한 Artemether의 혈전생성 억제 효과

박창은․이동하

남서울대학교 임상병리학과․분자진단연구소

Received: May 19, 2022; Revised: July 18, 2022; Accepted: August 10, 2022

Artemether Can Attenuate Thrombus Formation by Inhibiting U46619-Induced Platelet Activation

Chang-Eun Park and Dong-Ha Lee

Department of Biomedical Laboratory Science, Molecular Diagnostics Research Institute, Namseoul University

Correspondence to:Dong-Ha Lee, Department of Biomedical Laboratory Science, Namseoul University, 91, Daehak-ro, Seonghwan-eup, Seobuk-gu, Cheonan-si, Chungnam 31020, Korea, E-mail: dhlee@nsu.ac.kr

Received: May 19, 2022; Revised: July 18, 2022; Accepted: August 10, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Department of Biomedical Laboratory Science, Molecular Diagnostics Research Institute, Namseoul UniversityWhen blood vessels are damaged, a prompt hemostatic response follows to lower blood loss and maintain normal circulation, and platelet activation and aggregation are essential components of this response. Nevertheless, abnormal or excessive platelet aggregation underlies the etiologies of cardiovascular diseases such as thrombosis, atherosclerosis, and stroke. Therefore, the identification of substances that regulate platelet activation and suppress platelet aggregation is an important aspect of developments aimed at treating and preventing cardiovascular diseases. Artemether is a methyl ether derivative of artemisinin derived from the antimalarial plant Artemisia genus. We studied the effects of artemether on platelet functions using U46619-induced human platelets and found that artemether upregulated the cyclic adenosine monophosphate-dependent pathway and downregulated intracellular calcium mobilization, glycoprotein IIb/IIIa (αIIb/β3)-mediated signaling, and clot retraction. We suggest that artemether has effective antiplatelet and antithrombotic effects and is a potential therapeutic candidate for the prevention of platelet-induced cardiovascular disease.

Keywords: artemether, cAMP, intracellular Ca2+, fibrin clot

서 론

혈구 세포 중 하나로 알려진 혈소판은 손상된 혈관에 작용하여 지혈의 역할을 담당하지만, 비정상적으로 과도하게 작용하는 경우 혈전증, 심근경색증, 동맥경화증 등의 심혈관계 장애를 일으킬 수 있다. 이런 이유로 혈소판의 활성화를 적절히 저해하는 역할을 할 수 있는 약물들이 개발되고 있지만 여러 부작용과 적용의 한계들로 인하여 심혈관계 질환에 의해 발생하는 사망자의 수는 감소하지 않는 실정이다(Jackson, 2011). 또한 최근 코로나바이러스감염증-19 백신의 사용에 의한 출혈성 뇌졸중, 뇌정맥동 혈전증 등의 부작용 사례가 보고되었고 이런 이유로 EMA에서는 특정 백신의 사용 제한을 권고하기도 하였다(Kantarcioglu 등, 2021). 따라서 부작용이 적으면서 항혈전 예방 및 치료에 효과적이고 안정적인 성분의 지속적인 발굴이 필요하다고 판단된다.

활성화 물질에 의해 혈소판이 자극받으면 세포질 막에 위치한 인지질이 가수분해되어 방출되어 나오는 arachidonic acid가 TXA2로 전환된다(Morello 등, 2009; Jennings, 2009). 분비가 증가된 TXA2는 주변의 혈소판막 수용체에 결합하고, 이는 혈소판 응집을 지속적으로 일어나게 하는 증폭제로 작용한다고 알려져 있다(Sabatine과 Jang, 2000). 뿐만 아니라 TXA2의 유사체 중 하나로 사용되는 U46619(9, 11-dideoxy 9a,11a-methanoepoxy prostaglandin F2a)가 세포질 내로 동원되는 Ca2+를 증가시킴으로써 myosin light chain 및 pleckstrin과 같은 세포골격 단백질들을 인산화하면서 혈소판 응집을 유도한다고 보고된 바 있다(Cattaneo 등, 1991; Su 등, 1999).

정상적으로 혈액이 순환되는 중에는 nitric oxide나 prostaglandin I2의 ​​혈관 내피세포에서 방출되며 cAMP와 cGMP의 생성 증가를 유도한다. 혈소판 내에서 증가된 cAMP에 의해 protein kinase A(PKA)의 활성화가, cGMP에 의해 protein kinase G(PKG)의 활성화가 유도되고, 활성화된 PKA와 PKG는 inositol triphosphate receptor(IP3R) 및 vasodilator-stimulated phosphoprotein(VASP)과 같은 인산화 단백질들을 인산화한다고 알려져 있다(Schwarz 등, 2001). IP3R의 인산화는 IP3R의 형태 변화를 통해 비활성화를 일으키고, 이는 dense tubular system에서 세포질 내 동원되는 Ca2+를 저해하는 결과로 이어진다(Quinton과 Dean, 1992; Cavallini 등, 1996). 혈소판의 VASP는 PKA 및 PKG의 기질로 이용되는데, cAMP-의존성인 VASP Ser157이나 cGMP-의존성인 VASP Ser239의 인산화를 유발시키면서 αⅡb/β3 및 actin filament 활성을 억제한다고 보고되었다(Laurent 등, 1999; Sudo 등, 2003). 활성화된 PKA와 PKG는 IP3R의 인산화를 거쳐 Ca2+ 동원을 저해할 뿐 아니라 VASP의 인산화를 거쳐 αⅡb/β3의 저해를 일으킴으로써 혈소판의 활성을 억제하기 때문에 항혈소판 효과를 확인하기 위해서는 이들 단백질의 조절능을 확인하는 것이 필요하다.

Artemether는 Artemisia속의 유효성분으로 알려진 artemisinin의 유도체로서 다양한 Artemisia속을 메탄올로 추출하였을 때 최대 0.34%까지 함유되어 있다고 알려져 있으며(Singh 등, 2021), 기생충의 액포에서 ferriprotoporphyrin Ⅸ(heme)이나 철 이온과 상호 작용을 통해 세포 독성 라디칼을 생성함으로써 말라리아 치료에 효과적 기능한다고 보고된 바 있다(Esu 등, 2019). 제안된 mechanism 중 하나는 artemether가 항산화 및 대사 효소 억제를 억제하면서 세포에 산화 및 대사 스트레스를 가하여 기생충의 병변 및 성장을 감소시킨다는 것이다(Saeed 등, 2016). 그러나 지금까지 혈소판 활성화 및 응집에서 artemether의 역할과 U46619로 유도한 사람 혈소판에서 artemether의 작용기전에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다. 본 연구는 U46619가 유도하는 혈소판 활성화 과정에서 활성화에 영향을 미치는 다양한 요인들에 artemether가 어떻게 작용하는지 규명함으로써 artemether의 항혈소판 기능을 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

시료

Artemether는 Avention Corporation(Siheung, Korea)에서 구입하여 사용하였다(Fig. 1). U46619는 Sigma Aldrich Co.(Saint Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Cayman Chemical(Ann Arbor, Miami, USA)로부터 cAMP와 cGMP Enzyme Immunoassay(EIA) kits 그리고 serotonin 및 ATP assay kits를 제공받았고, Invitrogen(Eugene, OR, USA)으로부터 Fura 2-AM 및 Alexa Fluor 488-conjugate fibrinogen을 구입하여 사용하였다. Cell Signaling(Beverly, MA, USA)으로부터 inositol 3-phosphate receptor type Ⅰ(IP3R), vasodilator-stimulated phosphoprotein(VASP), lysis buffer 그리고 anti-rabbit IgG-HRP-conjugate secondary antibody를 제공받았다. Enhanced chemiluminescence solution(ECL)과 polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane을 General Electric Healthcare(Buckinghamshire, UK)로부터 구입하여 사용하였다.

Fig 1. The structure of artemether. PIN: Dihydroartemisinin methyl ether, Chemical formula: C16H26O5, Molar mass: 298.379 g/mole.

세척 혈소판 부유액의 제조

대한적십자사 혈액원(Suwon, Korea)으로부터 제공받은 사람의 농축혈소판을 사용하여 연구를 진행하였다. 세척 혈소판은 기존에 수행했던 방법대로 준비하였다(Shin 등, 2019). 농축혈소판을 1,300×g에서 8분 동안 원심분리한 후 하층의 혈소판을 분리하였고, 세척완충액(138 mM NaCl, 12 mM NaHCO3, 2.7 mM KCl, 5.5 mM glucose, 1 mM Na2EDTA 및 0.36 mM NaH2PO4, pH 6.9)으로 2번 세척하고, 현탁완충액(138 mM NaCl, 12 mM NaHCO3, 2.7 mM KCl, 5.5 mM glucose, 0.36 mM NaH2PO4, 0.49 mM MgCl2 및 0.25% gelatin, pH 7.4)으로 최종 108 cells/mL의 부유액이 되게 준비하였다. 저온의 상태에서 일어나는 혈소판의 자발적 응집을 피하기 위해 위의 모든 과정을 실온에서 수행하였으며, 남서울대학교 Institutional Review Board(IRB)의 승인(1041479-HR-201803-003)을 받아서 실험을 수행하였다.

Cyclic nulceotides(cAMP 및 cGMP) 생성량 측정

세척 혈소판 부유액을 여러 농도의 artemether로 전처리하여 37°C에서 3분간 배양하였고, 2 mM의 CaCl2를 첨가한 후 0.5 μM의 U46619로 자극하여 5분 동안 반응하였다. 1 M HCl을 첨가하는 것으로 반응을 종결했고, cAMP 및 cGMP ELISA kits에 의해 반응하여 ELISA reader(Molecular devices, San Jose, CA, USA)로 cAMP 및 cGMP 생성량을 측정하였다.

세포 내 Ca2+ 동원량 측정

우리는 5 μM Fura 2-AM을 PRP에 첨가하여 37°C에서 1시간 동안 배양하고 세척 완충액으로 2회 세척한 다음 현탁완충액을 사용하여 최종 농도 108 cells/mL가 되도록 부유시켰다. 다양한 농도의 artemether를 전처리하고 2 mM의 CaCl2와 0.5 μM의 U46619로 자극하여 5분 동안 반응하였다. BioTek Instrument사(Winooski, VT, USA)에서 구입한 분광 형광광도계(SFM 25)에서 Fura 2가 나타내는 형광을 측정하였다. 여기 파장은 시작 값을 340 nm로 설정하여 0.5초씩 증가해가며 최종 380 nm에 도달되도록 하였다. 510 nm의 파장을 방출 파장으로 설정하였다. 세포질 내로 동원된 Ca2+ 농도는 Grynkiewicz의 방법을 통해 산출하였다(Grynkiewicz 등, 1985).

혈소판 막 αⅡb/β3에 대한 fibrinogen 결합도 측정

세척 혈소판 부유액을 여러 농도의 artemether로 전처리하여 37°C에서 3분간 배양하였고, 20 μg/mL의 Alexa Flour 488-human fibrinogen을 첨가한 후, 2 mM CaCl2와 0.5 μM의 U46619로 자극하여 5분 동안 반응하였다. 그리고 0.5% paraformaldehyde를 함유하는 phosphate-buffered saline(pH 7.4)을 첨가해 줌으로써 반응을 종결하였고, BD Bioscience사(San Jose, CA, USA)에서 만들어진 유세포 분석기(FACS)에서 fibrinogen binding을 측정하였다. 형광을 최대한 유지할 수 있도록 모든 과정을 빛이 차단된 환경에서 진행하였으며 Cell-Quest software(BD Biosciences)를 사용하여 결과를 분석하였다.

혈소판 매개의 fibrin clot 형성능 측정

Polyethylene tube로 PRP(400 μL)를 옮겨 여러 농도의 artemether로 전처리하여 37°C에서 3분간 배양하였고, 2 mM CaCl2를 첨가한 후 0.05 U/mL의 thrombin을 넣고 37°C에서 15분 동안 반응시켜 fibrin clot 형성을 유도하였다. Fibrin clot의 이미지를 촬영하여 Image J Software(v1.46, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 통해 fibrin clot이 형성된 면적을 계산하였다.

Immunoblotting

세척 혈소판 부유액을 여러 농도의 artemether로 전처리하여 37°C에서 3분간 배양하였고, 2 mM의 CaCl2와 0.5 μM의 U46619로 자극하여 5분 동안 반응하였다. lysis buffer를 첨가하여 반응을 종결하였고, BCA kit(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)을 이용하여 용해된 혈소판 부유액의 단백질 농도를 확인하였다. 용해된 혈소판 부유액(20 μg 단백질)을 8% SDS-PAGE에서 분리하여 PVDF membrane으로 옮긴 다음 항체 처리하였다. 1차 항체는 1:1,000의 희석배수로 희석하고 2차 항체는 1:2,000의 희석배수로 희석하여 반응하였다. 그리고 ECL 시약(General Electric Healthcare)을 통해 시각화하여 Image J Software(v1.46, National Institutes of Health)를 사용해 면적을 분석하였다.

통계 분석

본 실험 결과들은 반복 실험을 수행한 후 평균±표준편차로 표시하였다. 각 Group 간의 차이는 Student's t-test 또는 ANOVA를 통해 분석하였고, P<0.05인 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다. 분산 분석에 따라 그룹 평균 간에 유의한 차이가 나타나는 경우 Scheffe의 방법을 이용하여 그룹을 비교하였다.

결과 및 고찰

Artemether가 cyclic nucleotides 생성량에 미치는 효과

이전 연구결과에서 cyclic nucleotides(cAMP 또는 cGMP)가 cAMP- 또는 cGMP-의존성 단백질 kinase(PKA 및 PKG)를 활성화하며 혈소판 응집을 억제하는 작용을 하는 신호전달 물질로 확인된 바 있다(Kuo 등, 1980). 본 연구에서 artemether가 cAMP 또는 cGMP 생성에 어떤 영향을 미치는 가를 확인하였다. Fig. 2A에 나타낸 결과를 통해 볼 수 있듯이 artemether는 cAMP 생성을 4.23±0.16 pmoL/108 cells에서 7.93±0.68 pmoL/108 cells까지 강하게 상승시켰다. 그러나 cGMP 생성은 artemether에 의해 유의적인 변화가 나타나지 않았다(Fig. 2B). 이러한 결과로 볼 때 U46619가 유도한 혈소판에서 artemether가 cyclic nucleotides 중 cAMP의 생성만을 유의하게 상승시키면서 혈소판의 기능을 조절하고 있음을 보여준다.

Fig 2. Effects of artemether on cyclic nucleotides production. (A) Effects of artemether on cAMP production stimulated by U46619. (B) Effects of artemether on cGMP production stimulated by U46619. Data are expressed as means±SD (n=4). *P<0.05, **P<0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.

Artemether가 세포 내 Ca2+ 동원량 및 IP3R 인산화에 미치는 효과

생성이 증가한 cAMP 또는 cGMP는 의존성 효소인 PKA 또는 PKG를 활성화함으로써 관련된 기질 단백질들을 인산화하는 데 이용되는데, 그중 inositol 1, 4, 5-triphosphate receptor(IP3R)의 인산화를 유도하는 것으로 알려져 있다(Schwarz 등, 2001). 혈소판의 dense tubular system에 존재하는 IP3R은 IP 결합할 때 세포질 내로 Ca2+ 동원([Ca2+]i)을 유도하며, [Ca2+]i는 세포골격 단백질로 잘 알려진 myosin light chain 및 pleckstrin의 인산화를 일으킴으로 혈소판 내의 과립 분비와 P-selectin의 발현을 증가시켜 혈소판 활성화 및 응집을 일으키는 역할을 담당한다고 보고되었다(Vargai-Szabo 등, 2009).

본 연구에서 우리는 [Ca2+]i에 미치는 artemether의 효과를 확인하였다. 그 결과, Fig. 3A에 나타낸 결과를 통해 볼 수 있듯이 U46619에 의해 [Ca2+]i 수준이 100.5±1.2 nM에서 697.4±8.8 nM로 상승하였고, artemether는 U46619에 의해 증가한 [Ca2+]i를 농도 의존적으로 강하게 감소시켰다(Fig. 3A). 그리고 [Ca2+]i를 조절하는 단백질인 IP3R이 artemether에 영향을 받는지도 확인하였다. Fig. 3B에 나타낸 결과에서 알 수 있듯이 artemether는 U46619로 유도한 혈소판에서 IP3R의 인산화를 농도 의존적으로 강하게 증가시켰다. 이는 artemether에 의한 cAMP 생성 및 PKA 활성의 증가가 IP3R의 인산화를 일으켜 dense tubular system으로부터 동원되는 [Ca2+]i를 억제하였음을 보여준다.

Fig 3. Effects of artemether on [Ca2+]i mobilization and IP3R phosphorylation. (A) Inhibitory effects of artemether on U46619- induced [Ca2+]i mobilization. (B) Effects of artemether on U46619-induced IP3R phosphorylation. Measurement of [Ca2+]i mobilization and Western blotting was described in Materials and Methods. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). #P<0.05 compared with no-stimulated platelets, **P<0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.

Artemether가 VASP 인산화에 미치는 효과

이전 연구들에서 VASP가 혈소판 점착능 및 분비능을 조절하면서 혈소판 활성화에 관여하는 cAMP/cGMP-의존성 효소인 PKA/PKG의 주요 기질에 속하며, VASP의 인산화가 증가되면 integrin αⅡb/β3의 활성화가 억제됨으로써 혈소판 응집을 저해한다고 보고된 바 있다(Wangorsch 등, 2011; Napeñas 등, 2013). Artemether가 U46619 유도의 혈소판에서 cAMP 생성을 농도 의존적으로 증가시키는 것을 확인하였고(Fig. 2), 계속해서 artemether가 PKA 및 PKG의 활성 증가를 일으켜 기질 단백질인 cAMP-의존성의 VASP Ser157 및 cGMP- 의존성의 VASP Ser239의 인산화를 조절할 수 있는지 살펴보았다. 그 결과, Fig. 4에 나타낸 결과를 통해 볼 수 있듯이 artemether에 의해 VASP Ser157 인산화가 농도 의존적으로 유의하게 증가한 것을 확인하였고, VASP Ser239 인산화에는 유의적인 변화를 일으키지 않는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 artemether가 cGMP에 영향을 미치지 않고 cAMP 농도를 강하게 증가한다는 결과와 일치한다(Fig. 2). 이는 artemether에 의해 cAMP의 생성량이 증가되었고, 그 결과 VASP의 인산화로 이어졌음을 보여준다.

Fig 4. Effects of artemether on VASP phosphorylation. Western blotting was determined as described in Materials and Methods. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). #P<0.05 compared with no-stimulated platelets, *P<0.05, **P<0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.

Artemether가 αⅡb/β3에 대한 fibrinogen 결합도에 미치는 효과

신호전달 과정을 통해 일어나는 Integrin αⅡb/β3의 친화력 증가는 혈소판 세포 골격의 변형을 유발하고 혈소판 증식 및 혈전 생성으로 이어지는 것으로 알려져 있다(Topol 등, 1999). Integrin αⅡb/β3는 휴지기 상태의 혈소판에서는 낮은 친화도로 유지되다가, 응집유도제에 의한 inside-out 신호전달 경로가 활성화되면 구조적 변화를 일으킴으로써 친화도 증가가 나타난다(Phillips 등, 2001). Fibrinogen이 그 수용체인 αⅡb/β3에 결합함으로써 추가적인 형태 변화, 점착 과정을 거쳐 혈소판 응집의 증폭으로 이어진다.

본 연구에서 우리는 artemether가 fibrinogen이 αⅡb/β3에 binding 되는 데 영향을 미치는지 확인하였다. Fig. 5에 나타낸 결과를 통해 볼 수 있듯이 U46619를 처리하면 αⅡb/β3에 대한 fibrinogen 결합이 78.5±0.8%까지 증가하는 것을 알 수 있다(Fig. 5A-b, b, 5B). 그러나 artemether(50~500 μM)를 처리하였을 때 fibrinogen 결합 정도가 농도 의존적으로 감소하였고, 특히 500 μM의 artemether에 의해 17.7±0.8%까지 강하게 fibrinogen 결합이 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 5A-c~f, 5B). 이러한 결과는 artemether에 의해 상향 조절된 VASP 인산화에 의해 integrin αⅡb/β3의 활성이 억제된 결과로 해석된다.

Fig 5. Effects of artemether on U46619-induced fibrinogen binding. (A) The flow cytometry histograms on fibrinogen binding. a, Intact platelets (base); b, U46619 (0.5 µM); c, U46619 (0.5 µM)+artemether (50 µM); d, U46619 (0.5 µM)+artemether (100 µM); e, U46619 (0.5 µM)+artemether (300 µM); f, U46619 (0.5 µM)+artemether (500 µM) (B) Effects of artemether on U46619-induced fibrinogen binding (%). Measurement of fibrinogen binding was described in Materials and Methods. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). #P<0.05 compared with no-stimulated platelets, **P<0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.

Artemether가 혈소판 매개의 fibrin clot 형성에 미치는 효과

우리 몸의 혈전 생성은 손상된 혈관이 회복되는 과정에서 중요한 단계로 여겨지는데, 활성화된 혈소판이 손상 부위에 축적되어 30~60분 동안 수축하기 시작하고 만들어진 plug를 당겨줌으로써 fibrin clot을 형성한다. 이때 αⅡb/β3와 fibrinogen 사이의 결합이 혈소판 매개의 fibrin clot이 형성되는데 중요하게 작용하며, αⅡb/β3 활성을 억제하는 물질이 혈전 형성까지 강하게 억제한다고 알려져 있다(Topol 등, 1999). 혈소판 활성유도제로 αⅡb/β3를 활성화하면 fibrinogen의 결합이 증가하면서 αⅡb/β3 신호 전달 경로를 촉진시켜 fibrin clot 형성으로 이어지는 것이다.

본 연구에서 우리는 artemether가 thrombin으로 유도한 fibrin clot 형성에 어떤 효과를 미치는지 확인하였다. Fig. 6A에 나타낸 결과를 통해 볼 수 있듯이 thrombin 처리로 fibrin clot이 강하게 형성되었고, artemether는 100 μM 이상의 농도에서 이를 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인할 수 있다. Artemether(100, 300 및 500 μM)의 억제율을 살펴보면 각각 35.5%, 51.5% 및 85.5%로 나타난다(Fig. 6B). 이러한 결과는 artemether가 cAMP 생성 및 VASP Ser157 인산화를 상향 조절하며 αⅡb/β3의 친화도를 억제시키고, fibrin clot 형성이 감소하고 있음을 보여준다. Artemether는 다양한 Artemisia속을 메탄올로 추출하였을 때 최대 0.34%까지 함유되어 있다고 알려져 있기에, Artemisia속의 식물체를 알콜 추출하여 음용하면 혈전형성을 저해하는 데 유용할 것으로 기대되며, 향후 식이 실험을 통해 규명할 필요성이 있다고 사료된다(Singh 등, 2021).

Fig 6. Effects of artemether on fibrin clot retraction. (A) Effects of artemether on thrombin-retracted fibrin clot photographs (B) Effects of artemether on thrombin-retracted fibrin clot area. Quantification of fibrin clot retraction was described in Materials and Methods. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). #P<0.05 compared with no-stimulated platelets rich plasma, **P<0.05 compared with the thrombin-stimulated platelets.

요 약

혈관이 손상될 때 혈액 손실을 줄이고 정상적인 순환을 유지하기 위해서 빠른 지혈 반응이 일어나야 하는데 이때 혈소판 활성화와 응집이 필수적인 현상이다. 그럼에도 불구하고 비정상적이거나 과도한 혈소판 응집이 일어날 경우, 혈전증, 동맥경화증, 뇌졸중을 비롯한 심혈관계 질환의 원인이 된다고 알려져 있다. 따라서 혈소판 활성화를 조절하고 응집 반응을 저해시킬 수 있는 물질을 발굴하는 것은 심혈관 질환의 치료 및 예방에 있어 매우 중요하다. Artemether는 Artemisia속에서 분리된 artemisinin의 methyl ether 유도체로서 말라리아에 대한 치료에 효과적이라고 알려졌지만 혈소판 응집이나 그 기전에 관한 연구는 전혀 없는 상황이다. U46619로 유도한 사람 혈소판에서 artemether의 효과와 그 작용기전을 확인하였다. 그 결과 artemether가 cyclic adenosine monophosphate(cAMP) 의존성 경로를 상향 조절하고, 세포질 내로의 Ca2+ 동원, 당단백질 Ⅱb/Ⅲa(αⅡb/β3) 매개의 신호 전달 활성화를 하향 조절함으로써 fibrin clot 형성을 저해할 수 있음을 확인하였다. 따라서 artemether가 강력한 항혈소판 및 항혈전 물질로써 기능할 수 있고, 혈소판이 매개하는 혈전증 및 심혈관계 질환을 예방하거나 치료하는 후보 물질이 될 수 있음을 제안한다.

Fig 1.

Fig 1.The structure of artemether. PIN: Dihydroartemisinin methyl ether, Chemical formula: C16H26O5, Molar mass: 298.379 g/mole.
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Fig 2.

Fig 2.Effects of artemether on cyclic nucleotides production. (A) Effects of artemether on cAMP production stimulated by U46619. (B) Effects of artemether on cGMP production stimulated by U46619. Data are expressed as means±SD (n=4). *P<0.05, **P<0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.
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Fig 3.

Fig 3.Effects of artemether on [Ca2+]i mobilization and IP3R phosphorylation. (A) Inhibitory effects of artemether on U46619- induced [Ca2+]i mobilization. (B) Effects of artemether on U46619-induced IP3R phosphorylation. Measurement of [Ca2+]i mobilization and Western blotting was described in Materials and Methods. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). #P<0.05 compared with no-stimulated platelets, **P<0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.
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Fig 4.

Fig 4.Effects of artemether on VASP phosphorylation. Western blotting was determined as described in Materials and Methods. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). #P<0.05 compared with no-stimulated platelets, *P<0.05, **P<0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.
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Fig 5.

Fig 5.Effects of artemether on U46619-induced fibrinogen binding. (A) The flow cytometry histograms on fibrinogen binding. a, Intact platelets (base); b, U46619 (0.5 µM); c, U46619 (0.5 µM)+artemether (50 µM); d, U46619 (0.5 µM)+artemether (100 µM); e, U46619 (0.5 µM)+artemether (300 µM); f, U46619 (0.5 µM)+artemether (500 µM) (B) Effects of artemether on U46619-induced fibrinogen binding (%). Measurement of fibrinogen binding was described in Materials and Methods. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). #P<0.05 compared with no-stimulated platelets, **P<0.001 compared with the U46619-stimulated platelets.
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Fig 6.

Fig 6.Effects of artemether on fibrin clot retraction. (A) Effects of artemether on thrombin-retracted fibrin clot photographs (B) Effects of artemether on thrombin-retracted fibrin clot area. Quantification of fibrin clot retraction was described in Materials and Methods. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=4). #P<0.05 compared with no-stimulated platelets rich plasma, **P<0.05 compared with the thrombin-stimulated platelets.
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