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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(9): 894-904

Published online September 30, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.9.894

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Effect of Euonymus alatus Extracts on Diabetes Related Markers in Pancreatic β-Cells and C57BL/Ksj-db/db Mice

Ye Rin Kim1 , Eun-young Kim1, Seong Uk Lee1, Young Wan Kim2, and Yoon Hee Kim1

1Department of Food and Nutrition, Daegu University
2DongSung BioPharm Daegu Cancer Center

Correspondence to:Yoon Hee Kim, Department of Food and Nutrition, College of Engineering, Daegu University, 201, Daegudae-ro, Jillyang-eup, Gyeongsan, Gyeongbuk 38453, Korea, E-mail: kimyh0128@daegu.ac.kr

Received: April 22, 2022; Revised: August 12, 2022; Accepted: August 16, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Euonymus alatus (Thunb.) Sieb is known to have anti-cancer and anti-inflammatory effects. This study aimed to reveal the effect of the water extract and 70% ethanol (70% EtOH) extract of Euonymus alaltus in INS-1 cells (pancreatic beta cell line) and C57BL/Ksj-db/db mice (type 2 diabetes models). The water extract significantly increased the proliferation of INS-1 cells. However, the extracts of Euonymus alatus water and 70% EtOH had no effect on increasing the insulin secretion in INS-1 cells. In the animal model of type 2 diabetes, the extracts of Euonymus alatus water and 70% EtOH decreased the water intake and effectively increased the pancreatic insulin concentration. Furthermore, exposure to the 70% EtOH extract resulted in decreasing the plasma triglycerides. These data indicate that the extracts of Euonymus alatus water and 70% EtOH exert a partial anti-diabetic effect.

Keywords: Euonymus alatus (Thunb.) Sieb, type 2 diabetes, INS-1, C57BL/Ksj-db/db

당뇨병은 2020년 사망 원인 6위에 해당하는 질환으로(Statistics Korea, 2021) 국내 30세 이상 성인의 당뇨병 유병률은 13.8%이며, 환자 수는 약 494만 명에 이르는 것으로 보고되었다(Korean Diabetes Association, 2020). 당뇨병은 크게 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병으로 분류된다. 소아 당뇨병이라고 불리는 제1형 당뇨병은 췌장 베타세포의 자가 면역성 파괴로 인한 인슐린 결핍이 특징이다. 당뇨 환자의 약 90~95%에 해당하며(American Diabetes Association, 2009), 성인당뇨병으로 알려진 제2형 당뇨병은 인슐린 저항성과 상대적으로 정상적이지 않은 인슐린 분비가 특징이며 유전적 요인(Park, 2009), 비만, 식습관 등과 같은 환경적 요인들에 의해서 발생한다(Choi, 2018). 제2형 당뇨병은 증상이 지속되면 당뇨병성 합병증을 동반하며, 합병증에 의해 사망에 이르기도 하는 것으로 알려져 있다. 현재 제2형 당뇨병 치료를 위해 주사용 인슐린 제제 외에도 간에서 포도당 합성을 억제하는 메트포민, 인크레틴 활성을 증가시키는 Dipeptidyl Peptidase-Ⅳ(DPP-Ⅳ) 저해제, 췌장 베타세포에서 인슐린 분비를 증가시키는 Sulfonylurea 등의 경구치료제가 이용되고 있다(Choi, 2018). 하지만 기존 사용되고 있는 치료제들은 장기간 복용 시 소화 장애, 비타민 B12 결핍, 기관지염, 관절통 등 여러 부작용을 초래하는 것으로 알려져 항당뇨 효과가 있는 천연물을 이용한 치료제 개발이 필요한 실정이다.

화살나무[Euonymus alatus (Thunb.) Sieb]는 노박덩굴과 낙엽 활엽관목에 속하는 식물로 줄기에 날개 모양의 코르크를 갖고 있어 ‘귀전우’라고도 불린다(Kim 등, 2014; Kyunghyang newspaper, 2004). 한방에서는 혈액순환 개선, 피부병 치료, 정신 불안 치료, 월경 불순 및 자궁 출혈 등에 사용되었으며, 현재 종양 억제효과(Cha 등, 2003), 항염증 작용(Kim 등, 2014; Jeong 등, 2014), 항산화 작용(Oh 등, 2005; Kwon 등, 2007), 신경 보호 작용(Woo 등, 2020), 항당뇨 효과(Lee와 Yoon, 2015; Park 등, 2005a) 등 여러 생리 활성 효과를 갖는다고 보고되었다. 화살나무에는 quercetin, epifriedelanol, fredelin(Zhai 등, 2016), chlorogenic acid(Jin 등, 2005), 3,4-dihydroxycinnamic acid(Park 등, 2005b), naringenin(Zhai 등, 2016) 등의 여러 기능성 물질이 함유된 것으로 보고되었다.

선행연구에 따르면 화살나무의 줄기 및 잎 메탄올 추출물은 시험관 시험에서 α-glucosidase와 α-amylase의 활성을 저해함으로써 항당뇨 효과를 갖는다고 보고되었다(Lee와 Yoon, 2015). 또한, alloxan에 의해 유도된 제1형 당뇨 마우스 동물모델에 ethyl acetate(EtOAc) 분획을 4주 동안 경구 투여한 결과, 혈장 포도당 농도 및 포도당 내성을 감소시키는 등 항당뇨 효과를 갖는다고 보고되었다(Fang 등, 2008). 하지만 췌장 β-세포 및 제2형 당뇨 동물모델에서의 화살나무추출물의 효과는 보고되지 않았다.

제2형 당뇨 동물모델로 주로 사용되는 C57BL/Ksj-db/db 마우스는 시상하부 포만 중추의 렙틴 수용체가 돌연변이 되어 렙틴의 신호전달이 정상적으로 이루어지지 않아 비만해진다는 특징이 있으며, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 고혈당과 같은 제2형 당뇨병의 특징을 보여 제2형 당뇨병 연구에 널리 이용되고 있다(Mohammed-Ali 등, 2017).

따라서 본 연구에서는 인슐린 분비에 관여하는 췌장 베타세포인 INS-1 세포와 제2형 당뇨 동물모델로 많이 이용되는 C57BL/Ksj-db/db 마우스에서 화살나무 물 추출물과 70% 에탄올(EtOH) 추출물의 효과를 검증하고자 하였다.

시료의 추출 및 제조

화살나무는 2018년 9월 한국 아산에서 채집하였으며, 시료를 층류 후드(laminar flow hood)에서 48시간 동안 건조 후 사용 전까지 -20°C에 보관하였다. 건조시킨 화살나무 2 kg을 70% EtOH 40 L로 80°C에서 4시간 동안 2회 추출하였다. 추출물은 여과지를 이용하여 여과한 후 감압 하에 용매를 증발시켜 70% EtOH 추출물 153.6 g을 얻었다. 또한, 건조시킨 화살나무 2 kg을 물 40 L로 100°C에서 4시간 동안 추출하였다. 추출물을 여과지를 이용하여 여과한 후 용매를 감압 하에 증발시켜 화살나무 물 추출물 135.2 g을 얻었다.

실험재료

세포배양에 사용되는 fetal bovine serum(FBS), penicillin, streptomycin, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, 0.5% Trypsin-EDTA는 Hyclone(Logan, UT, USA)에서 구매하였다. CytoTox96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit과 CellTiter96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assasy kit은 Promega(Madison, WI, USA)에서 구입하여 사용하였다. Insulin Human ELISA kit은 Abcam(Carlsbad, CA, USA)에서 구매하여 사용하였다. 동물 마취를 위해 사용한 Avertin(2,2,2-tribromoethanol)과 TERT amyl alcohol은 Sigma-Aldrich Co.(St Louis, MO, USA)로부터 구매하였다. 헤파린(25,000 IU/5 mL)은 중외제약(Seoul, Korea)에서 구매하여 사용하였다. Rat/Mouse Insulin ELISA kit(#EZRMI-13K)과 Glucagon-Like Peptide 96-well plate ELISA kit(#EGLP-35K)은 Millipore(Bedford, MA, USA)에서 구매하여 사용하였다. RIPA buffer(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 2 mM EDTA, pH 7.4, #R4100-010)는 GenDEPOT(Barker, TX, USA)에서 구매하였다. LBIS Mouse Insulin ELISA kit(#AKRIN-011T)은 FUJIFILM Wako shibayagi Corporation(Gunma, Japan)에서 구매하여 사용하였다. 복강 포도당 내당능에 사용된 Glucose와 복강 인슐린 부하능에 사용된 Insulin solution human(#I9278-5ML)은 Sigma-Aldrich Co.로부터 구매하였다. 혈장 중성지질과 총콜레스테롤 함량 측정에 사용된 중성지방 측정용 시액(AM 157S)과 총콜레스테롤 측정용 시액(AM 202)은 아산제약(Asan pharm, Seoul, Korea)에서 구매하여 사용하였다.

세포주 및 세포배양

흰쥐의 인슐린종 세포주인 INS-1 823/13(SCC207)은 Millipore에서 구입하여 실험에 사용하였다. 세포는 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin을 함유하는 RPMI1640 배지로 배양하였다. 세포는 37°C, 5% CO2 조건에서 2~3일에 한 번씩 계대 배양하였다.

세포증식 및 독성 측정

화살나무 물 추출물과 70% EtOH 추출물이 INS-1의 세포증식 및 세포독성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 INS-1 세포를 96 well plate에 1.5×105 cells/200 μL/well의 세포 수가 되도록 분주하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 화살나무추출물을 농도별(0, 0.5, 5, 50 μg/mL)로 처리한 후 24시간 동안 추가 배양한 후 CellTiter96® Aqueous One Solution Assay of cell proliferation(Promega)을 이용해 세포증식능을 micro plate reader(Sunrise, Tecan, Salzburg, Austria)를 사용하여 측정하였다. 또한, CytoTox96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega)를 이용해 화살나무추출물이 INS-1 세포에 독성을 나타내는지를 micro plate reader(Tecan)를 사용하여 측정하였다. 세포증식 및 세포독성은 490 nm에서 측정된 흡광도 값으로 나타내었다.

세포의 인슐린 분비능 측정

화살나무추출물이 INS-1 세포의 인슐린 분비에 미치는 영향을 검토하기 위해 INS-1 세포를 96 well plate에 3×105 cells/200 μL/well의 세포 수가 되도록 분주하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 5 mM 또는 30 mM 포도당을 포함하는 KREB buffer(Kreb’s buffer, 24 mM NaHCO3, 1.2 mM MgCl2, 1mM HEPES, 129 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 2.5 mM CaCl2, pH 7.4)에 화살나무추출물을 5 μg/mL 농도가 되도록 조정한 후 세포에 처리해주었다. 1시간 또는 2시간 후 세포상층액을 인슐린 농도 측정에 사용하였다. 인슐린 분비는 Insulin Human ELISA kit(Abcam)을 사용하여 반응시킨 후 micro plate reader(Tecan)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험동물의 사육 및 시험물질 투여

실험동물은 제2형 당뇨 동물모델인 C57BL/Ksj-db/db 마우스 5주령 수컷 50마리와 정상 동물모델인 5주령 수컷 C57BL/6J Jms Slc 마우스 10마리를 (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 공급받아 사용하였다. 1주간 순화 및 적응 기간을 거친 후 정상군(normal group, NG), 당뇨군(diabetes group, DG), 메트포민 투여군(metformin group, MG), 화살나무 물 추출물 투여군(water extract group, WEG), 화살나무 70% EtOH 추출물 투여군(70% ethanol extract group, EEG)으로 분류하였으며 이때 C57BL/Ksj-db/db 마우스 간 체중과 공복 혈당에 군 간에 차이가 없도록 하였다. 동물 사육실 내 온도는 20~25°C, 습도는 40~50%, 낮/밤 주기는 12시간으로 유지하였으며, 멸균된 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 공급하였다. 실험 기간에 물 추출물과 70% EtOH 추출물은 각각 500 mg/kg이 되도록 여과된 수돗물에 희석하여 하루에 100 μL씩 1일 1회 일정한 시간에 총 4주간 경구 투여하였다. 같은 기간 동안 메트포민은 200 mg/kg이 되도록 경구 투여하였다. NG와 DG에는 여과된 수돗물을 100 μL 경구 투여하였다. 1주일에 한 번씩 일정한 시간에 체중을 측정하였다(Fig. 1). 동물실험은 대구대학교 동물실험윤리위원회의 승인(DUIACC-2020-1-0313-004)을 받아 수행되었다.

Fig. 1. Animal experimental schedule. The experiment was conducted by dividing each group into 5 groups. Oral administration was performed in the normal group and diabetic group (tap water), metformin group (metformin 200 mg/kg), and extract (water, 70% EtOH) group (500 mg/kg). IPGTT and IPITT were conducted at the 3rd week of the experiment. Other experiments were performed after dissection. IPGTT: Intraperitoneal glucose tolerance test, IPITT: Intraperitoneal insulin tolerance test.

체중, 식이 및 식수 섭취량 측정

실험기간 동안 주 1회 전자저울을 이용하여 체중을 측정하였으며, 최종 체중에서 실험시작일의 체중을 뺀 값으로 체중증가량(g/d/마리)을 계산하였다. 식이섭취량은 사료를 2~5일마다 교체해줄 때 제공량(150 g)에서 잔량을 제하여 평균섭취량(g/d/마리)을 계산하였다. 식수섭취량은 매일 제공하는 양(200 mL)에서 잔량을 제하여 섭취량(mL/d/마리)을 계산하였다. 식이효율은 다음의 계산식에 의해 계산하였다.

Food efficiency ratio (FER)=Body weight gain (g)÷Food intake (g/d)

혈액 및 장기 채취

실험동물은 희생 전 16시간 절식 후 2.5% avertin 마취제를 10 μL/g으로 복강 투여하여 마취한 후 헤파린 처리된 주사기를 이용하여 심장 및 복부대정맥에서 채혈하였다. 마취에 사용 된 마취제는 Avertin(2,2,2-Tribromoethanol)(Sigma-Aldrich) 30 mg을 50°C 수조에서 30 μL TERT-amyl alcohol(Sigma-Aldrich)에 용해시켜 Stock 용액을 만든 후 Stock 용액과 37°C Ultra pure water를 1:40으로 희석하여 2.5% Avertin working 용액을 제조하였다. 2.5% Avertin 마취제는 0.2 μm 필터를 이용하여 여과 후 사용하였다(Kelley, 2010). 인슐린 및 지질 농도 측정용 혈장은 전혈을 4°C, 2,500×g로 15분간 원심분리하여 얻었다. GLP-1 농도 측정용 혈장은 1.5 mL eppendorf tube에 GLP-1 분해를 막는 저해제인 DPP-Ⅳ 억제제를 전혈 1 mL당 10 μL로 처리해 준 후 4°C, 1,200×g로 10분간 원심분리하여 얻었다. 채혈 후 복부를 절개하여 간, 신장, 근육, 췌장, 지방, 비장을 적출한 뒤 생리식염수로 세척 후 표면의 수분을 제거하고 무게를 측정하였다. 모든 혈장과 장기는 분석 전까지 -80°C에 보관하였다.

혈중 지질 함량 측정

혈장 내 중성지방 농도와 혈장 내 총콜레스테롤 농도는 효소법에 의해 생성되는 적색 색소를 비색 정량법으로 측정하는 중성지방 측정용 시액(AM 157S, Asan pharm)과 총콜레스테롤 측정용 시액(AM202, Asan Pharm)을 이용하여 측정하였다. Micro plate reader(Tecan)로 각각 550 nm, 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.

공복혈당 측정

각 군의 혈당 변화를 측정하기 위해 16시간 절식시킨 후 마우스 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 동물용 혈당계(Vet MateTM, i-SENS, Seoul, Korea)를 이용하여 주 1회 측정하였다.

복강 포도당 부하 검사(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)

각 실험군의 포도당 내당능을 평가하기 위해 실험 3주 차에 복강 포도당 부하검사를 실시하였다. 16시간 절식 후 포도당(Sigma-Aldrich)을 1 g/kg 농도로 100 μL씩 복강 투여하였다. 혈당 농도는 포도당 투여 전과 포도당 투여 후 30, 60, 90, 120분에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 동물용 혈당계(i-SENS)를 이용하여 측정하였다. 포도당 부하에 대한 혈당 변화는 area under the curve(AUC) 값으로 계산하여 비교하였다.

복강 인슐린 내성 검사(intraperitoneal insulin tolerance test, IPITT)

각 실험군의 인슐린 내성을 평가하기 위해 실험 3주 차에 복강 인슐린 내성 검사를 실시하였다. 16시간 절식 후 인슐린(2 U/kg body weight)을 복강에 100 μL 투여하였다. 혈당 농도는 인슐린 투여 전과 인슐린 투여 후 30, 60, 90, 120분에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 동물용 혈당계(i-SENS)를 이용하여 측정하였다. 인슐린 내성에 대한 혈당 변화 정도는 area under the curve(AUC) 값으로 계산하여 비교하였다.

혈장 인슐린 측정 및 인슐린 저항성 지표

혈장 내 인슐린 농도는 Rat/Mouse Insulin ELISA kit(Millipore)을 사용하여 kit 내 매뉴얼에 따라 진행하였다. 실험 진행 후 micro plate reader(Tecan)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 검량선을 이용하여 인슐린 농도를 산출하였다. 또한, 인슐린 저항성 지표로 사용되는 homeostasis model assessment of insulin resistance(HOMA-IR)를 계산하였다(Jo 등, 2018).

HOMA-IR={Fasting plasma glucose (mmol/L)×Fasting insulin (μU/mL)}×22.5

혈장 내 GLP-1 농도 측정

혈장 내 GLP-1 농도는 DPP-Ⅳ 저해제를 처리한 혈장을 이용하여 glucagon-like peptide-1 96-well plate ELISA kit(Millipore)을 사용하여 측정하였다. GLP-1 농도를 측정하기 위해 kit 내 96-well plate에 Assay buffer(100 μL)와 standard, quality control, sample(각각 100 μL)을 넣고 4°C에서 overnight 시켜주었다. Overnight 후 wash buffer로 5회 세척 후 GLP-1 detection conjugate를 200 μL 넣은 뒤 실온에서 2시간 동안 배양해주었다. Wash buffer로 3회 세척한 후 각 well에 기질을 200 μL 넣어 0~15분간 측정하였을 때 형광 값이 표준 검량선 범위에 들어왔을 때 stop solution을 넣고 excitation/emission 각각 355 nm/460 nm에서 형광 값을 측정하였다. 형광 측정은 micro plate reader(Infinite® 200 PRO, Tecan)를 이용하여 측정하였다.

췌장조직의 인슐린 함량 측정

-80°C에 저장해 둔 췌장 조직 20 mg 당 RIPA buffer(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 2 mM EDTA, pH 7.4, #R4100-010, GenDEPOT) 620 μL와 1% Protease Inhibitor를 넣고 균질화하여 2,500×g에서 15분 원심분리하여 얻은 상층액을 인슐린 함량 측정에 사용하였다. 인슐린 함량 측정은 LBIS Mouse Insulin ELISA kit(FUJIFILM Wako Shibayagi Corporation)을 사용하여 측정하였다.

통계분석

실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 SPSS(Statistical Package for the Social Sciences, Version 25.0, IBM Corp., NY, USA)를 이용해 분석하였다. 실험 결과는 mean±standard deviation(SD)로 나타냈으며, 각 그룹 간의 통계적 유의성은 multiple comparison을 통한 Duncan 방법으로 사후 검정하였다. P값은 P<0.05를 통계적 유의차가 있다고 판단하였다.

화살나무추출물이 INS-1 세포증식 및 독성에 미치는 영향

제2형 당뇨병은 췌장 β-세포에서의 인슐린 분비 저하 및 분비된 인슐린의 저항성 증가에 의해 발생한다(Song 등, 2007). 인슐린 분비에 관여하는 췌장 β-세포의 증식에 화살나무추출물이 어떠한 영향을 주는지 평가하기 위하여 췌장 β-세포주인 INS-1 세포에 water 및 70% EtOH 화살나무 추출물을 0, 0.5, 5, 50 μg/mL 농도로 24시간 동안 처리한 뒤 증식 및 독성을 측정하였다. 증식 측정 결과, 대조군(0 μg/mL)의 생존율은 100±9.69%였으며 50 μg/mL 물 추출물 처리군에서는 134.94±26.93%로 유의적으로 증가하였다. 0.5 μg/mL 70% EtOH 추출물 처리군에서 133.77±29.82%, 5 μg/mL 처리군에서는 127.91±15.65%, 50 μg/mL 처리군에서는 115.81±14.78%로 차이를 보이지 않았다. 따라서 물 추출물 처리군은 췌장 β-세포의 증식을 유의적으로 증가시키며, 70% EtOH 추출물은 췌장 β-세포의 증식에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(Fig. 2A). 또한, 독성 측정 결과 대조군(0 μg/mL)은 0.05±0.03이었으며, 0.5 μg/mL 물 추출물 처리군은 0.05±0.02, 5 μg/mL 처리군은 0.05±0.02, 50 μg/mL 처리군은 0.06±0.01로 독성에 영향을 미치지 않았다. 70% EtOH군 또한 0.5 μg/mL 처리군은 0.04±0.02, 5 μg/mL 처리군은 0.06±0.01, 50 μg/mL 처리군은 0.06±0.03으로 세포독성에 영향을 미치지 않았다(Fig. 2B). 이상의 결과로부터 화살나무 물 추출물이 INS-1 세포의 증식을 증가시켰으며, 독성에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 따라서 추후 세포 실험은 췌장 β-세포의 증식 및 독성에 영향을 미치지 않는 농도인 5 μg/mL로 진행하였다.

Fig. 2. Effects of water or 70% EtOH extracts from Euonymus alatus on (A) cell proliferation and (B) cell cytotoxicity in INS-1 cells. INS-1 cells were treated with the indicated concentration (0, 0.5, 5, 50 μg/mL) of each extracts from Euonymus alatus (water, 70% EtOH) for 24 h. Cell proliferation and cell cytotoxicity were determined by CellTiter96 Aqueous One Solution Assay kit or CytoTox Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit. The results were reported as the mean±SD (n=3). The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

화살나무추출물이 INS-1 세포의 인슐린 분비에 미치는 영향

당뇨 발생에 의해 췌장 β-세포가 고농도의 포도당에 장기간 노출되면 β-세포의 기능 이상으로 인슐린 유전자 발현이 감소하여 인슐린 합성 및 분비가 감소하는 것으로 알려져 있다(Robertson 등, 2003). 이에 포도당 자극 하에 화살나무추출물이 췌장 β-세포의 인슐린 분비에 미치는 영향을 평가하였다. 고농도 포도당(30 mM) 및 5 μg/mL 화살나무추출물을 2시간 처리한 결과, 대조군에서의 인슐린 농도는 40.71±6.43 μiU/mL였으며, 화살나무 물 추출물 및 70% EtOH 추출물 처리군의 인슐린 분비량은 각각 53.86±8.77, 60.11±0.8 μiU/mL로 군 간의 차이가 없었다(Fig. 3). Lee(2007)의 연구에 따르면 장기간 고농도 포도당 처리에 의한 인슐린 분비 자극은 β-세포의 인슐린 분비 반응 감소 현상을 유발하며, 이때 Genistein을 처리하면 고농도 포도당에 의한 인슐린 분비 감소를 완화한다고 보고하였다. 또한, University-industry Cooperation Group of Kyung Hee University(2007)의 연구에 따르면 화살나무 50% EtOH 추출물의 에테르 분획에서 정제한 3-O-methylurolic acid는 흰쥐에서 얻은 췌도 세포에서 11.1 mM 포도당과 1시간 동시 처리 시 당뇨병 치료제로서 알려진 Glipizide 대비 인슐린 분비능을 6배 증가시켰다고 보고하였다. 본 연구에서의 결과와 다른 이유는 물 추출물과 70% EtOH 추출물을 시료로 사용하여 효과를 가지는 3-O-methylurolic acid와 같은 단일물질의 농도가 낮았기 때문이라고 생각되나 이에 대한 추가 검토가 필요할 것으로 생각된다.

Fig. 3. Effect of water or 70% EtOH extracts from Euonymus alatus on insulin secretion in INS-1 cells. Cells were treated with Glucose (5 mM or 30 mM) and each extracts from Euonymus alatus (water, 70% EtOH, 5 μg/mL) for 1 or 2 h. Insulin secretion was determined by Insulin Human ELISA kit. The results were reported as the mean±SD (n=3). The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

화살나무추출물이 체중, 체중 증가량, 식수・식이 섭취량, 식이효율에 미치는 영향

당뇨의 주요한 증상에는 다갈, 다식, 다뇨, 체중 감소 등이 나타나는 것으로 알려져 있다(Yoo, 2007). 따라서 본 연구에서는 체중 및 체중 증가량, 식수, 식이 섭취량 및 식이 효율에 대하여 조사하였다. 체중 및 체중 증가량을 측정한 결과(Table 1), 초기 체중에서 NG에 비해 유의적으로 C57BL/Ksj-db/db 마우스에서 체중이 증가하였으나, 당뇨 모델 군 간의 차이가 없었다. 화살나무추출물 투여 4주 후 체중 측정 결과 DG와 유의적 차이를 보이며 MG 및 EEG의 체중이 증가하였다. 하지만 체중 증가율에서 군 간의 차이는 보이지 않았다. 이와 같은 결과는 C57BL/Ksj-db/db 마우스를 당뇨 대조군으로 이용하였을 때 10주령에 체중 감소를 보인다는 연구 결과와 일치하였다(Jung, 2019). 메트포민 및 화살나무 70% EtOH 추출물을 투여한 C57BL/Ksj-db/db 마우스의 최종 체중이 DG 대비 유의적으로 증가하는 결과는 당뇨로 인한 체중 감소 현상을 물질 투여가 완화하려는 것으로 생각되나 장기적인 사육을 통한 체중 변화를 측정할 필요가 있다. 다음으로 다갈과 관계있는 식수섭취량을 측정하였다. 식수섭취량은 NG는 26.33±10.78 mL인 반면, DG는 40.77±46.90으로 유의적으로 섭취량이 증가하였다. 식수섭취량의 증가는 메트포민 및 화살나무추출물(water, 70% EtOH) 투여에 의해 각각 19.28±12.11, 19.59±6.43, 17.23±5.13 mL로 DG 대비 유의적으로 식수섭취량이 감소하였다. 이와 같은 결과는 C57BL/Ksj-db/db 마우스에 8주간 발아일품벼 추출물을 급여한 연구 결과와 유사하였다(Lee 등, 2012). 따라서 화살나무추출물은 당뇨의 특징적 증상 중 하나인 다갈 증상을 완화하는 것으로 생각된다. 다식 증상과 관련된 식이 섭취량을 측정한 결과, NG 3.44±1.21 g 대비 C57BL/Ksj-db/db 마우스에서 식이 섭취량이 증가하였다. 메트포민 및 화살나무추출물(water, 70% EtOH) 투여에 의한 식이 섭취량의 변화는 없었다. 이와 같은 결과는 C57BL/Ksj-db/db 마우스가 유전적으로 렙틴 수용체의 결함을 가지고 있어 렙틴 저항성을 가져 포만감을 느끼지 못하는 결과로 생각된다(Kim 등, 2015). 또한, 화살나무추출물 투여군(WEG, EEG)에서 DG 대비 식이섭취량에 차이가 없는 결과는 C57BL/Ksj-db/db 마우스에 7주간 부추 추출물과 부추 발효물을 투여한 연구 결과와 일치하였다(Kim 등, 2015). 식이 효율(FER)은 NG 1.04±0.17 대비 DG에서 0.01±0.7로 유의적으로 감소하였다. 하지만 물질 처리 군 간의 차이는 없었다. 이상의 결과로부터 화살나무추출물 투여는 식수섭취량을 감소시켜 다갈 증상을 개선하는 것으로 생각된다.

Table 1 . Body weight, weight gain, water intake, food intake and FER efficiency of experimental groups

Initial weight (g)Final weight (g)Body weight gain (g)Water intake (mL)Food intake (g/d)FER1)
NG2)19.81±0.52a3)23.06±0.59a3.25±0.5426.33±10.78a3.44±1.21a1.04±0.17a
DG28.51±2.30b28.29±2.40b−0.22±4.0940.77±46.90b6.69±1.94b0.01±0.7b
MG28.71±1.37b31.70±3.93c2.99±4.1819.28±12.11a5.79±1.48b0.56±0.75ab
WEG29.03±1.55b30.00±2.79bc0.98±3.9319.59±6.43a6.48±1.85b0.16±0.59b
EEG29.19±1.83b31.82±3.34c2.63±2.4317.23±5.13a6.17±2.22b0.44±0.41ab

1)FER, Food efficiency ratio=Body weight gain (g)/ Food intake (g/d).

2)NG, normal group; DG, diabetic group; MG, metformin group; WEG, water extract group; EEG, 70% EtOH extract group.

3)Values are mean±SD. Different letters for each list of measurements are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05).



화살나무추출물이 혈장 내 지질농도에 미치는 영향

제2형 당뇨병 환자는 이상지질혈증이 동반되는 경우가 많다(Rhee, 2020). 인슐린 저항성에 의해 인슐린이 정상적으로 기능을 하지 못하면 지방세포 내 중성지방이 분해되어 혈중 유리지방산이 증가하게 된다. 유리지방산은 간으로 이동하여 very low density lipoprotein 합성을 증가시켜 혈중 중성지방 농도 증가를 유발하는 것으로 알려져 있다(Choi, 2009). 이외에도 당뇨병성 이상지질혈증은 혈청 총콜레스테롤, small dense low-density lipoprotein(sdLDL) 콜레스테롤 농도가 증가하였으며, high-density lipoprotein(HDL) 콜레스테롤은 감소하였다고 한다(Sadeghi 등, 2020; Park, 2006). 따라서 본 연구에서는 당뇨병에서 증가하는 것으로 알려진 중성지방 및 총콜레스테롤에 화살나무추출물이 미치는 영향을 확인하였다. 혈장 내 중성지방 농도 측정 결과, NG의 중성지방 농도는 90.96±11.80 mg/dL였으며 DG는 184.68±31.97 mg/dL로 증가하였다. WEG는 156.61±45.73 mg/dL로 군간의 차이가 없었으나 MG는 118.17±19.28 mg/dL, EEG는 146.61±20.53 mg/dL로 DG에 비해 유의적으로 혈장 내 중성지방의 농도가 감소하였다(Fig. 4A). 혈장 내 총콜레스테롤 농도를 측정한 결과, MG는 108.41±18.93 mg/dL로 NG 93.28±9.78 mg/dL보다 혈장 내 총콜레스테롤 농도가 증가하였다. 반면 EEG는 92.07±10.49 mg/dL로 MG 대비 유의적으로 혈장 내 총콜레스테롤 농도가 NG 수준으로 감소하였다. DG와 WEG는 군 간의 차이를 보이지 않았다(Fig. 4B). 결과적으로 EEG에서 DG 대비 중성지방 농도가 유의적으로 감소한다는 결과는 고지방식이에 의해 제2형 당뇨병이 유발된 ICR 마우스에서 10주간 화살나무 에탄올 추출물 투여에 의해 혈장 내 중성지방 농도가 유의적으로 감소한다는 연구 보고와 일치하였다(Park 등, 2005a). 동일한 연구에서 화살나무추출물 투여 시 총콜레스테롤 농도가 감소한다고 하였으나(Park 등, 2005a), 본 연구에서는 화살나무추출물 투여에 의한 차이는 보이지 않았다. 이는 Park 등(2005a)의 연구에 비해 화살나무추출물의 투여 농도가 낮고 투여 기간이 짧았기 때문으로 생각되나, 이에 관한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Fig. 4. Effects of oral administration of water or 70% EtOH extracts for 4 weeks on plasma lipid concentration. (A) Triglyceride (TG), (B) Total cholesterol (TC) concentration were measured using plasma obtained from the heart and abdominal vena cava. The results were reported as the mean±SD. The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). NG: normal group, DG: diabetic group, MG: metformin group, WEG: water extract group, EEG: 70% EtOH extract group.

화살나무추출물이 공복혈당 변화에 미치는 영향

2021 당뇨병 진료 지침에 따르면 정상인의 공복혈당은 8시간 이상 공복 후 혈장 포도당 100 mg/dL 미만이며, 126 mg/dL 이상의 경우 당뇨로 진단한다(Hur 등, 2021). 화살나무추출물이 공복혈당에 미치는 영향을 0~4주 차까지 매주 16시간 절식 후 꼬리 정맥에서 혈액을 얻어 동물용 혈당 측정계로 측정하였다. 화살나무추출물을 4주간 투여한 결과, NG는 101.14±15.16 mg/dL인 반면 DG는 488.14±204.54 mg/dL로 공복혈당이 유의적으로 증가하였다. 하지만 DG와 비교하였을 때 MG는 460.43±259.45 mg/dL, 화살나무추출물 투여군(WEG, EEG)은 각각 501.88±103.56 mg/dL, 528.13±84.22 mg/dL로 군 간의 차이가 없었다(Fig. 5).

Fig. 5. Changes in fasting blood glucose by oral treatment with water or 70% EtOH extracts. Fasting blood glucose was measured using tail vein blood once a week after fasting for 16 hours. The results were reported as the mean±SD. The different letters in each experimental group for each week are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). NG: normal group, DG: diabetic group, MG: metformin group, WEG: water extract group, EEG: 70% EtOH extract group.

Lee 등(2012)의 연구에 따르면 0.5%, 1% 발아일품벼 섭취군의 공복혈당이 0주 차 대비 4주 차까지 증가하다가 6주 차부터 서서히 감소하였으며, 8주 차에 당뇨군과 유의적 차이를 보이며 감소하였다. 본 연구에서는 실험 종료 시기인 4주 차에도 DG와 화살나무추출물 투여군(WEG, EEG) 사이 공복혈당에 차이가 없었다. 이는 Lee 등(2012)의 연구에 비해 물질 투여 기간이 짧았기 때문으로 생각되나 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

화살나무추출물이 포도당 내당능, 인슐린 부하능, 인슐린 저항성 지표에 미치는 영향

제2형 당뇨병은 인슐린 저항성이라는 특징을 갖는다(Lee, 2007). 인슐린 저항성 발생 시 인슐린 기능 저하에 의해 당질 및 지질대사가 감소하는 것으로 알려져 있다(Choi, 2009). 따라서 화살나무추출물이 인슐린 저항성 개선에 미치는 영향을 확인하고자 포도당 복강 내당능(IPGTT), 인슐린 부하능(IPITT) 및 인슐린 저항성 지표인 HOMA-IR을 측정하였다. IPGTT를 측정한 결과, 투여 90분 후 NG보다 DG 및 물질 투여군(MG, WEG, EEG) 모두에서 혈당이 유의적으로 증가하였다. DG의 혈당은 985±121.74 mg/dL였으며, 화살나무추출물 투여군(WEG, EEG)은 각각 788.57±160.73 mg/dL, 800±171.80 mg/dL로 군 간의 차이는 보이지 않았다(Fig. 6A). IPITT 측정 결과 DG가 173±16.09 mg/dL인 반면 WEG의 혈당이 112.33±35.16 mg/dL로 유의적으로 감소하였다(Fig. 6B).

Fig. 6. Effects of oral administration of the water or 70% EtOH extracts on intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT), intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT), HOMA-IR. (A) IPGTT graph, IPGTT graph area under the curve (AUC), (B) IPITT graph and IPITT graph area under the curve (AUC) was measured through tail vein blood at 3 weeks of the experiment. (C) HOMA-IR was measured by fasting blood glucose (mmol/L) and fasting plasma insulin (μU/mL) on the last day of the experiment. The results were reported as the mean±SD. The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). NG: normal group, DG: diabetic group, MG: metformin group, WEG: water extract group, EEG: 70% EtOH extract group.

인슐린 저항성 지표인 HOMA-IR은 NG가 6.35±7.64인 것 대비 모든 군에서 유의적으로 증가하였지만 DG와 비교하였을 때 물질 투여군과의 차이는 보이지 않았다(Fig. 6C). Kang과 Kim(2011)의 연구에 따르면 5주간 흑삼 또는 백삼을 투여한 뒤 포도당 내당능을 측정한 결과 시간 경과에 따라 당뇨군 대비 유의적으로 흑삼 투여군에서 혈당이 감소하였다고 보고하였다. 인슐린 내당능의 경우 차이는 보이지 않았으나 흑삼 투여군에서 백삼 투여군에 비해 빠르게 혈당을 제거하였다고 보고하였다. Lee 등(2021)의 연구에서 또한 5주간 Aspergillus awamori로 발효한 황기추출물을 혼합한 식이를 섭취시킨 뒤 포도당 내당능을 측정한 결과, 시간 경과에 따라 당뇨군 대비 물질 투여군에서 혈당이 유의적으로 감소되었다. 인슐린 저항성 지표인 HOMA-IR은 10주간 투여 후 측정하였으며, DG 대비 물질 투여군에서 유의적으로 감소하였다. 본 연구의 결과 DG 대비 화살나무추출물 투여군(WEG, EEG)에서 혈당에 차이가 없는 결과 및 HOMA-IR 값이 군 간의 차이를 보이지 않는 결과는 비교적 짧았던 투여 기간에 의한 것으로 생각되며 장기간 투여 시 포도당 내당능, 인슐린 부하능 및 HOMA-IR을 측정할 필요가 있을 것으로 생각된다.

화살나무추출물이 혈장 GLP-1 수준에 미치는 영향

Glucagon like peptide-1(GLP-1)은 장관 내 L세포에서 분비되는 것으로 알려진 인크레틴 호르몬이다. GLP-1은 글루카곤의 분비를 억제하고, 포도당 의존적으로 인슐린 분비 증가 및 위 배출 속도 지연 등의 기능을 갖는 것으로 알려져 있다(Oh, 2011). 따라서 본 연구에서는 화살나무추출물이 GLP-1 분비에 미치는 영향을 마우스 혈장에서 측정하였다. 그 결과 NG는 9.37±2.25 pg/mL였으나, EEG는 20.30±8.10 pg/mL로 화살나무추출물에 의해 NG보다 유의적으로 혈장 내 GLP-1 수준이 증가하였다. DG는 13.86±3.88 pg/mL으로 DG와 EEG 사이 혈장 내 GLP-1 수준의 차이는 없었다(Fig. 7). Kim 등(2015)의 연구에 따르면 부추 추출물을 7주간 투여한 결과 정상군 대비 당뇨군의 혈청 내 GLP-1 수준이 유의적으로 감소하였으며, 물질 투여에 의해 유의적으로 GLP-1 수준이 회복되었다고 보고하였다. 본 연구의 결과 화살나무 70% EtOH 추출물 투여 시 NG보다 유의적으로 혈장 내 GLP-1 수준이 증가하는 점은 유사한 경향성을 보이지만 DG와는 차이가 없었으며, DG가 NG와도 차이를 보이지 않았다. 현재 제2형 당뇨 환자의 공복 시 GLP-1 수준은 논란의 여지가 있다. Lastya 등(2014)의 연구에 따르면 당뇨 환자의 공복 시 GLP-1 수준이 정상인에 비해 유의적으로 감소하였다고 보고하였다. 하지만 Korani와 Sonbol(2018)의 연구에 따르면 당뇨 환자와 정상인 사이 공복 시 GLP-1의 수준에는 차이가 없다고 보고하였다. 또한 Wang 등(2016)의 연구에 따르면 GLP-1 분비는 인슐린 저항성 및 고혈당증에 반비례하고 췌도 β-세포 기능 및 인슐린 감수성과 양의 상관관계가 있다고 보고하였다. 따라서 장기간의 물질 투여를 통해 DG 및 EEG에서의 혈장 내 GLP-1 수준을 측정할 필요가 있을 것으로 생각된다.

Fig. 7. Effect of water or 70% EtOH extracts from Euonymus alatus on glucagon-like peptide-1 in plasma. GLP-1 concentration in plasma was measured using plasma obtained from the heart and abdominal vena cava. The results were reported as the mean±SD. The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). NG: normal group, DG: diabetic group, MG: metformin group, WEG: water extract group, EEG: 70% EtOH extract group.

화살나무추출물이 혈장 및 췌장 조직 내 인슐린 수준에 미치는 영향

제2형 당뇨 발생 초기 시 인슐린 저항성으로 인해 인슐린이 감지되지 않으며, 체내 항상성 유지를 위해 포도당 대사를 활성화하기 때문에 많은 양의 인슐린이 분비되어 고인슐린혈증이 동반되는 것으로 알려져 있다(Hong, 2005). 따라서 본 연구에서는 화살나무추출물의 경구투여가 혈장 인슐린 분비에 미치는 영향에 대해 측정하였다. 혈장 내 인슐린 농도 측정 결과, NG는 0.71±0.82 ng/mL였으며, DG는 6.04±3.81 ng/mL로 유의적으로 증가하였다. MG 및 WEG, EEG 또한 각각 7.27±6.16, 5.57±3.65, 5.12±2.60 ng/mL로 NG 대비 유의적으로 증가하였다(Fig. 8A). Heo 등(2018)의 연구에 따르면 C57BL/Ksj-db/db 마우스에 6주간 Dendropanax morbifera leaves 추출물을 투여한 결과, 당뇨군의 혈장 인슐린 농도가 정상군 대비 증가하였으며 높은 농도의 물질 투여군의 인슐린 농도는 당뇨군 대비 유의적으로 감소하였다. 본 연구에서 DG의 인슐린 농도가 NG 대비 증가한 결과는 db/db mouse의 고인슐린혈증 특징 및 당뇨에 의해 증가한 포도당을 정상 수준으로 돌리기 위한 보상작용(Cavaghan 등, 2000)으로 보이며, DG와 비교하였을 때 화살나무추출물(WEG, EEG) 처리 시 군 간의 차이가 없는 결과는 짧은 물질 투여 기간에 의한 것으로 추측된다. 따라서 장기간의 추출물 투여를 통한 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.

Fig. 8. Effects of water or 70% EtOH extracts from Euonymus alatus on insulin concentration in plasma and pancreatic tissue. (A) Plasma insulin concentration was measured using a Rat/Mouse Insulin ELISA kit. (B) Insulin concentration in the pancreas was measured using a pancreatic tissue lysate. The results were reported as the mean±SD. The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). NG: normal group, DG: diabetic group, MG: metformin group, WEG: water extract group, EEG: 70% EtOH extract group.

또한 췌장 내 인슐린 함량을 측정한 결과, NG는 2.26±0.32 ng/μg protein이었으나 DG는 0.54±0.26 ng/μg protein으로 NG보다 유의적으로 췌장 내 인슐린 함량이 낮았다. 이에 비해 메트포민 및 화살나무추출물(water, 70% EtOH) 투여에 의해 각각 1.7±0.85, 1.33±0.43, 1.27±1.06 ng/μg protein으로 DG 대비 유의적으로 췌장 인슐린 함량이 증가하였다(Fig. 8B). 이와 같은 결과는 C57BL/Ksj-db/db 마우스에 Dendropanax morbifera leaves 추출물을 농도별로 투여하여 항당뇨 효과를 측정한 연구 결과와 일치하였다(Heo 등, 2018). 따라서 화살나무추출물은 당뇨에 의해 감소한 췌장 내 인슐린 저장량을 증가시킴으로써 항당뇨 효과를 갖는 것으로 사료된다.

화살나무추출물은 항산화, 항염증, 항암 등 여러 생리활성효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 현재 유전적 요인, 비만, 식습관 등의 환경적 요인에 의해 당뇨병 발병률이 증가하고 있다. 당뇨병의 경우 주사용 인슐린 제제 외 메트포민, sulfonylurea 등과 같은 경구 투여제를 이용하여 치료되고 있다. 하지만 기존 치료제들은 장기간 복용 시 여러 부작용을 초래하는 것으로 알려져 천연물을 이용한 부작용 없는 치료제가 필요한 실정이다. 본 연구에서는 화살나무추출물(water, 70% EtOH)이 췌장 β-세포 및 제2형 당뇨 마우스 모델에서 항당뇨 효과를 갖는지 검증하고자 연구를 진행하였다. 화살나무추출물은 췌장 β-세포의 성장에는 영향을 미치지 않았다. 제2형 당뇨 마우스 모델에 투여한 결과 당뇨의 증상 중 하나인 다갈 증상을 유의적으로 감소시켰으며, 70% EtOH 추출물 투여 시 혈장 내 중성지방 농도를 유의적으로 감소시켰다. 또한 물 추출물 및 70% EtOH 추출물 투여 시 췌장 내 인슐린 함량을 유의적으로 증가시켰다. 다음과 같은 결과는 화살나무추출물(water, 70% EtOH)이 당뇨 시 발생할 수 있는 증상 완화에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다. 본 연구에서 여러 측정 항목의 군 간의 차이가 없는 결과는 다소 짧은 물질 투여 기간에 의한 것으로 생각되어 추후 장기간 투여에 대한 항당뇨 효과 검증을 거쳐 치료제로 사용될 가능성이 있을 것으로 사료된다.

이 논문은 2019 중소벤처기업부 맞춤형 기술파트너 지원사업(S2795124)에 의한 논문으로 이에 감사드립니다.

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Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(9): 894-904

Published online September 30, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.9.894

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

화살나무추출물이 췌장 β-세포 및 C57BL/Ksj-db/db 마우스에서 당뇨관련 지표에 미치는 영향

김예린1․김은영1․이성욱1․김용완2․김윤희1

1대구대학교 식품영양학과
2동성제약 대구암센터

Received: April 22, 2022; Revised: August 12, 2022; Accepted: August 16, 2022

Effect of Euonymus alatus Extracts on Diabetes Related Markers in Pancreatic β-Cells and C57BL/Ksj-db/db Mice

Ye Rin Kim1 , Eun-young Kim1, Seong Uk Lee1, Young Wan Kim2, and Yoon Hee Kim1

1Department of Food and Nutrition, Daegu University
2DongSung BioPharm Daegu Cancer Center

Correspondence to:Yoon Hee Kim, Department of Food and Nutrition, College of Engineering, Daegu University, 201, Daegudae-ro, Jillyang-eup, Gyeongsan, Gyeongbuk 38453, Korea, E-mail: kimyh0128@daegu.ac.kr

Received: April 22, 2022; Revised: August 12, 2022; Accepted: August 16, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Euonymus alatus (Thunb.) Sieb is known to have anti-cancer and anti-inflammatory effects. This study aimed to reveal the effect of the water extract and 70% ethanol (70% EtOH) extract of Euonymus alaltus in INS-1 cells (pancreatic beta cell line) and C57BL/Ksj-db/db mice (type 2 diabetes models). The water extract significantly increased the proliferation of INS-1 cells. However, the extracts of Euonymus alatus water and 70% EtOH had no effect on increasing the insulin secretion in INS-1 cells. In the animal model of type 2 diabetes, the extracts of Euonymus alatus water and 70% EtOH decreased the water intake and effectively increased the pancreatic insulin concentration. Furthermore, exposure to the 70% EtOH extract resulted in decreasing the plasma triglycerides. These data indicate that the extracts of Euonymus alatus water and 70% EtOH exert a partial anti-diabetic effect.

Keywords: Euonymus alatus (Thunb.) Sieb, type 2 diabetes, INS-1, C57BL/Ksj-db/db

서 론

당뇨병은 2020년 사망 원인 6위에 해당하는 질환으로(Statistics Korea, 2021) 국내 30세 이상 성인의 당뇨병 유병률은 13.8%이며, 환자 수는 약 494만 명에 이르는 것으로 보고되었다(Korean Diabetes Association, 2020). 당뇨병은 크게 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병으로 분류된다. 소아 당뇨병이라고 불리는 제1형 당뇨병은 췌장 베타세포의 자가 면역성 파괴로 인한 인슐린 결핍이 특징이다. 당뇨 환자의 약 90~95%에 해당하며(American Diabetes Association, 2009), 성인당뇨병으로 알려진 제2형 당뇨병은 인슐린 저항성과 상대적으로 정상적이지 않은 인슐린 분비가 특징이며 유전적 요인(Park, 2009), 비만, 식습관 등과 같은 환경적 요인들에 의해서 발생한다(Choi, 2018). 제2형 당뇨병은 증상이 지속되면 당뇨병성 합병증을 동반하며, 합병증에 의해 사망에 이르기도 하는 것으로 알려져 있다. 현재 제2형 당뇨병 치료를 위해 주사용 인슐린 제제 외에도 간에서 포도당 합성을 억제하는 메트포민, 인크레틴 활성을 증가시키는 Dipeptidyl Peptidase-Ⅳ(DPP-Ⅳ) 저해제, 췌장 베타세포에서 인슐린 분비를 증가시키는 Sulfonylurea 등의 경구치료제가 이용되고 있다(Choi, 2018). 하지만 기존 사용되고 있는 치료제들은 장기간 복용 시 소화 장애, 비타민 B12 결핍, 기관지염, 관절통 등 여러 부작용을 초래하는 것으로 알려져 항당뇨 효과가 있는 천연물을 이용한 치료제 개발이 필요한 실정이다.

화살나무[Euonymus alatus (Thunb.) Sieb]는 노박덩굴과 낙엽 활엽관목에 속하는 식물로 줄기에 날개 모양의 코르크를 갖고 있어 ‘귀전우’라고도 불린다(Kim 등, 2014; Kyunghyang newspaper, 2004). 한방에서는 혈액순환 개선, 피부병 치료, 정신 불안 치료, 월경 불순 및 자궁 출혈 등에 사용되었으며, 현재 종양 억제효과(Cha 등, 2003), 항염증 작용(Kim 등, 2014; Jeong 등, 2014), 항산화 작용(Oh 등, 2005; Kwon 등, 2007), 신경 보호 작용(Woo 등, 2020), 항당뇨 효과(Lee와 Yoon, 2015; Park 등, 2005a) 등 여러 생리 활성 효과를 갖는다고 보고되었다. 화살나무에는 quercetin, epifriedelanol, fredelin(Zhai 등, 2016), chlorogenic acid(Jin 등, 2005), 3,4-dihydroxycinnamic acid(Park 등, 2005b), naringenin(Zhai 등, 2016) 등의 여러 기능성 물질이 함유된 것으로 보고되었다.

선행연구에 따르면 화살나무의 줄기 및 잎 메탄올 추출물은 시험관 시험에서 α-glucosidase와 α-amylase의 활성을 저해함으로써 항당뇨 효과를 갖는다고 보고되었다(Lee와 Yoon, 2015). 또한, alloxan에 의해 유도된 제1형 당뇨 마우스 동물모델에 ethyl acetate(EtOAc) 분획을 4주 동안 경구 투여한 결과, 혈장 포도당 농도 및 포도당 내성을 감소시키는 등 항당뇨 효과를 갖는다고 보고되었다(Fang 등, 2008). 하지만 췌장 β-세포 및 제2형 당뇨 동물모델에서의 화살나무추출물의 효과는 보고되지 않았다.

제2형 당뇨 동물모델로 주로 사용되는 C57BL/Ksj-db/db 마우스는 시상하부 포만 중추의 렙틴 수용체가 돌연변이 되어 렙틴의 신호전달이 정상적으로 이루어지지 않아 비만해진다는 특징이 있으며, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 고혈당과 같은 제2형 당뇨병의 특징을 보여 제2형 당뇨병 연구에 널리 이용되고 있다(Mohammed-Ali 등, 2017).

따라서 본 연구에서는 인슐린 분비에 관여하는 췌장 베타세포인 INS-1 세포와 제2형 당뇨 동물모델로 많이 이용되는 C57BL/Ksj-db/db 마우스에서 화살나무 물 추출물과 70% 에탄올(EtOH) 추출물의 효과를 검증하고자 하였다.

재료 및 방법

시료의 추출 및 제조

화살나무는 2018년 9월 한국 아산에서 채집하였으며, 시료를 층류 후드(laminar flow hood)에서 48시간 동안 건조 후 사용 전까지 -20°C에 보관하였다. 건조시킨 화살나무 2 kg을 70% EtOH 40 L로 80°C에서 4시간 동안 2회 추출하였다. 추출물은 여과지를 이용하여 여과한 후 감압 하에 용매를 증발시켜 70% EtOH 추출물 153.6 g을 얻었다. 또한, 건조시킨 화살나무 2 kg을 물 40 L로 100°C에서 4시간 동안 추출하였다. 추출물을 여과지를 이용하여 여과한 후 용매를 감압 하에 증발시켜 화살나무 물 추출물 135.2 g을 얻었다.

실험재료

세포배양에 사용되는 fetal bovine serum(FBS), penicillin, streptomycin, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, 0.5% Trypsin-EDTA는 Hyclone(Logan, UT, USA)에서 구매하였다. CytoTox96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit과 CellTiter96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assasy kit은 Promega(Madison, WI, USA)에서 구입하여 사용하였다. Insulin Human ELISA kit은 Abcam(Carlsbad, CA, USA)에서 구매하여 사용하였다. 동물 마취를 위해 사용한 Avertin(2,2,2-tribromoethanol)과 TERT amyl alcohol은 Sigma-Aldrich Co.(St Louis, MO, USA)로부터 구매하였다. 헤파린(25,000 IU/5 mL)은 중외제약(Seoul, Korea)에서 구매하여 사용하였다. Rat/Mouse Insulin ELISA kit(#EZRMI-13K)과 Glucagon-Like Peptide 96-well plate ELISA kit(#EGLP-35K)은 Millipore(Bedford, MA, USA)에서 구매하여 사용하였다. RIPA buffer(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 2 mM EDTA, pH 7.4, #R4100-010)는 GenDEPOT(Barker, TX, USA)에서 구매하였다. LBIS Mouse Insulin ELISA kit(#AKRIN-011T)은 FUJIFILM Wako shibayagi Corporation(Gunma, Japan)에서 구매하여 사용하였다. 복강 포도당 내당능에 사용된 Glucose와 복강 인슐린 부하능에 사용된 Insulin solution human(#I9278-5ML)은 Sigma-Aldrich Co.로부터 구매하였다. 혈장 중성지질과 총콜레스테롤 함량 측정에 사용된 중성지방 측정용 시액(AM 157S)과 총콜레스테롤 측정용 시액(AM 202)은 아산제약(Asan pharm, Seoul, Korea)에서 구매하여 사용하였다.

세포주 및 세포배양

흰쥐의 인슐린종 세포주인 INS-1 823/13(SCC207)은 Millipore에서 구입하여 실험에 사용하였다. 세포는 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin을 함유하는 RPMI1640 배지로 배양하였다. 세포는 37°C, 5% CO2 조건에서 2~3일에 한 번씩 계대 배양하였다.

세포증식 및 독성 측정

화살나무 물 추출물과 70% EtOH 추출물이 INS-1의 세포증식 및 세포독성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 INS-1 세포를 96 well plate에 1.5×105 cells/200 μL/well의 세포 수가 되도록 분주하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 화살나무추출물을 농도별(0, 0.5, 5, 50 μg/mL)로 처리한 후 24시간 동안 추가 배양한 후 CellTiter96® Aqueous One Solution Assay of cell proliferation(Promega)을 이용해 세포증식능을 micro plate reader(Sunrise, Tecan, Salzburg, Austria)를 사용하여 측정하였다. 또한, CytoTox96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega)를 이용해 화살나무추출물이 INS-1 세포에 독성을 나타내는지를 micro plate reader(Tecan)를 사용하여 측정하였다. 세포증식 및 세포독성은 490 nm에서 측정된 흡광도 값으로 나타내었다.

세포의 인슐린 분비능 측정

화살나무추출물이 INS-1 세포의 인슐린 분비에 미치는 영향을 검토하기 위해 INS-1 세포를 96 well plate에 3×105 cells/200 μL/well의 세포 수가 되도록 분주하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 5 mM 또는 30 mM 포도당을 포함하는 KREB buffer(Kreb’s buffer, 24 mM NaHCO3, 1.2 mM MgCl2, 1mM HEPES, 129 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 2.5 mM CaCl2, pH 7.4)에 화살나무추출물을 5 μg/mL 농도가 되도록 조정한 후 세포에 처리해주었다. 1시간 또는 2시간 후 세포상층액을 인슐린 농도 측정에 사용하였다. 인슐린 분비는 Insulin Human ELISA kit(Abcam)을 사용하여 반응시킨 후 micro plate reader(Tecan)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험동물의 사육 및 시험물질 투여

실험동물은 제2형 당뇨 동물모델인 C57BL/Ksj-db/db 마우스 5주령 수컷 50마리와 정상 동물모델인 5주령 수컷 C57BL/6J Jms Slc 마우스 10마리를 (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 공급받아 사용하였다. 1주간 순화 및 적응 기간을 거친 후 정상군(normal group, NG), 당뇨군(diabetes group, DG), 메트포민 투여군(metformin group, MG), 화살나무 물 추출물 투여군(water extract group, WEG), 화살나무 70% EtOH 추출물 투여군(70% ethanol extract group, EEG)으로 분류하였으며 이때 C57BL/Ksj-db/db 마우스 간 체중과 공복 혈당에 군 간에 차이가 없도록 하였다. 동물 사육실 내 온도는 20~25°C, 습도는 40~50%, 낮/밤 주기는 12시간으로 유지하였으며, 멸균된 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 공급하였다. 실험 기간에 물 추출물과 70% EtOH 추출물은 각각 500 mg/kg이 되도록 여과된 수돗물에 희석하여 하루에 100 μL씩 1일 1회 일정한 시간에 총 4주간 경구 투여하였다. 같은 기간 동안 메트포민은 200 mg/kg이 되도록 경구 투여하였다. NG와 DG에는 여과된 수돗물을 100 μL 경구 투여하였다. 1주일에 한 번씩 일정한 시간에 체중을 측정하였다(Fig. 1). 동물실험은 대구대학교 동물실험윤리위원회의 승인(DUIACC-2020-1-0313-004)을 받아 수행되었다.

Fig 1. Animal experimental schedule. The experiment was conducted by dividing each group into 5 groups. Oral administration was performed in the normal group and diabetic group (tap water), metformin group (metformin 200 mg/kg), and extract (water, 70% EtOH) group (500 mg/kg). IPGTT and IPITT were conducted at the 3rd week of the experiment. Other experiments were performed after dissection. IPGTT: Intraperitoneal glucose tolerance test, IPITT: Intraperitoneal insulin tolerance test.

체중, 식이 및 식수 섭취량 측정

실험기간 동안 주 1회 전자저울을 이용하여 체중을 측정하였으며, 최종 체중에서 실험시작일의 체중을 뺀 값으로 체중증가량(g/d/마리)을 계산하였다. 식이섭취량은 사료를 2~5일마다 교체해줄 때 제공량(150 g)에서 잔량을 제하여 평균섭취량(g/d/마리)을 계산하였다. 식수섭취량은 매일 제공하는 양(200 mL)에서 잔량을 제하여 섭취량(mL/d/마리)을 계산하였다. 식이효율은 다음의 계산식에 의해 계산하였다.

Food efficiency ratio (FER)=Body weight gain (g)÷Food intake (g/d)

혈액 및 장기 채취

실험동물은 희생 전 16시간 절식 후 2.5% avertin 마취제를 10 μL/g으로 복강 투여하여 마취한 후 헤파린 처리된 주사기를 이용하여 심장 및 복부대정맥에서 채혈하였다. 마취에 사용 된 마취제는 Avertin(2,2,2-Tribromoethanol)(Sigma-Aldrich) 30 mg을 50°C 수조에서 30 μL TERT-amyl alcohol(Sigma-Aldrich)에 용해시켜 Stock 용액을 만든 후 Stock 용액과 37°C Ultra pure water를 1:40으로 희석하여 2.5% Avertin working 용액을 제조하였다. 2.5% Avertin 마취제는 0.2 μm 필터를 이용하여 여과 후 사용하였다(Kelley, 2010). 인슐린 및 지질 농도 측정용 혈장은 전혈을 4°C, 2,500×g로 15분간 원심분리하여 얻었다. GLP-1 농도 측정용 혈장은 1.5 mL eppendorf tube에 GLP-1 분해를 막는 저해제인 DPP-Ⅳ 억제제를 전혈 1 mL당 10 μL로 처리해 준 후 4°C, 1,200×g로 10분간 원심분리하여 얻었다. 채혈 후 복부를 절개하여 간, 신장, 근육, 췌장, 지방, 비장을 적출한 뒤 생리식염수로 세척 후 표면의 수분을 제거하고 무게를 측정하였다. 모든 혈장과 장기는 분석 전까지 -80°C에 보관하였다.

혈중 지질 함량 측정

혈장 내 중성지방 농도와 혈장 내 총콜레스테롤 농도는 효소법에 의해 생성되는 적색 색소를 비색 정량법으로 측정하는 중성지방 측정용 시액(AM 157S, Asan pharm)과 총콜레스테롤 측정용 시액(AM202, Asan Pharm)을 이용하여 측정하였다. Micro plate reader(Tecan)로 각각 550 nm, 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.

공복혈당 측정

각 군의 혈당 변화를 측정하기 위해 16시간 절식시킨 후 마우스 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 동물용 혈당계(Vet MateTM, i-SENS, Seoul, Korea)를 이용하여 주 1회 측정하였다.

복강 포도당 부하 검사(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)

각 실험군의 포도당 내당능을 평가하기 위해 실험 3주 차에 복강 포도당 부하검사를 실시하였다. 16시간 절식 후 포도당(Sigma-Aldrich)을 1 g/kg 농도로 100 μL씩 복강 투여하였다. 혈당 농도는 포도당 투여 전과 포도당 투여 후 30, 60, 90, 120분에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 동물용 혈당계(i-SENS)를 이용하여 측정하였다. 포도당 부하에 대한 혈당 변화는 area under the curve(AUC) 값으로 계산하여 비교하였다.

복강 인슐린 내성 검사(intraperitoneal insulin tolerance test, IPITT)

각 실험군의 인슐린 내성을 평가하기 위해 실험 3주 차에 복강 인슐린 내성 검사를 실시하였다. 16시간 절식 후 인슐린(2 U/kg body weight)을 복강에 100 μL 투여하였다. 혈당 농도는 인슐린 투여 전과 인슐린 투여 후 30, 60, 90, 120분에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 동물용 혈당계(i-SENS)를 이용하여 측정하였다. 인슐린 내성에 대한 혈당 변화 정도는 area under the curve(AUC) 값으로 계산하여 비교하였다.

혈장 인슐린 측정 및 인슐린 저항성 지표

혈장 내 인슐린 농도는 Rat/Mouse Insulin ELISA kit(Millipore)을 사용하여 kit 내 매뉴얼에 따라 진행하였다. 실험 진행 후 micro plate reader(Tecan)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 검량선을 이용하여 인슐린 농도를 산출하였다. 또한, 인슐린 저항성 지표로 사용되는 homeostasis model assessment of insulin resistance(HOMA-IR)를 계산하였다(Jo 등, 2018).

HOMA-IR={Fasting plasma glucose (mmol/L)×Fasting insulin (μU/mL)}×22.5

혈장 내 GLP-1 농도 측정

혈장 내 GLP-1 농도는 DPP-Ⅳ 저해제를 처리한 혈장을 이용하여 glucagon-like peptide-1 96-well plate ELISA kit(Millipore)을 사용하여 측정하였다. GLP-1 농도를 측정하기 위해 kit 내 96-well plate에 Assay buffer(100 μL)와 standard, quality control, sample(각각 100 μL)을 넣고 4°C에서 overnight 시켜주었다. Overnight 후 wash buffer로 5회 세척 후 GLP-1 detection conjugate를 200 μL 넣은 뒤 실온에서 2시간 동안 배양해주었다. Wash buffer로 3회 세척한 후 각 well에 기질을 200 μL 넣어 0~15분간 측정하였을 때 형광 값이 표준 검량선 범위에 들어왔을 때 stop solution을 넣고 excitation/emission 각각 355 nm/460 nm에서 형광 값을 측정하였다. 형광 측정은 micro plate reader(Infinite® 200 PRO, Tecan)를 이용하여 측정하였다.

췌장조직의 인슐린 함량 측정

-80°C에 저장해 둔 췌장 조직 20 mg 당 RIPA buffer(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 2 mM EDTA, pH 7.4, #R4100-010, GenDEPOT) 620 μL와 1% Protease Inhibitor를 넣고 균질화하여 2,500×g에서 15분 원심분리하여 얻은 상층액을 인슐린 함량 측정에 사용하였다. 인슐린 함량 측정은 LBIS Mouse Insulin ELISA kit(FUJIFILM Wako Shibayagi Corporation)을 사용하여 측정하였다.

통계분석

실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 SPSS(Statistical Package for the Social Sciences, Version 25.0, IBM Corp., NY, USA)를 이용해 분석하였다. 실험 결과는 mean±standard deviation(SD)로 나타냈으며, 각 그룹 간의 통계적 유의성은 multiple comparison을 통한 Duncan 방법으로 사후 검정하였다. P값은 P<0.05를 통계적 유의차가 있다고 판단하였다.

결과 및 고찰

화살나무추출물이 INS-1 세포증식 및 독성에 미치는 영향

제2형 당뇨병은 췌장 β-세포에서의 인슐린 분비 저하 및 분비된 인슐린의 저항성 증가에 의해 발생한다(Song 등, 2007). 인슐린 분비에 관여하는 췌장 β-세포의 증식에 화살나무추출물이 어떠한 영향을 주는지 평가하기 위하여 췌장 β-세포주인 INS-1 세포에 water 및 70% EtOH 화살나무 추출물을 0, 0.5, 5, 50 μg/mL 농도로 24시간 동안 처리한 뒤 증식 및 독성을 측정하였다. 증식 측정 결과, 대조군(0 μg/mL)의 생존율은 100±9.69%였으며 50 μg/mL 물 추출물 처리군에서는 134.94±26.93%로 유의적으로 증가하였다. 0.5 μg/mL 70% EtOH 추출물 처리군에서 133.77±29.82%, 5 μg/mL 처리군에서는 127.91±15.65%, 50 μg/mL 처리군에서는 115.81±14.78%로 차이를 보이지 않았다. 따라서 물 추출물 처리군은 췌장 β-세포의 증식을 유의적으로 증가시키며, 70% EtOH 추출물은 췌장 β-세포의 증식에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(Fig. 2A). 또한, 독성 측정 결과 대조군(0 μg/mL)은 0.05±0.03이었으며, 0.5 μg/mL 물 추출물 처리군은 0.05±0.02, 5 μg/mL 처리군은 0.05±0.02, 50 μg/mL 처리군은 0.06±0.01로 독성에 영향을 미치지 않았다. 70% EtOH군 또한 0.5 μg/mL 처리군은 0.04±0.02, 5 μg/mL 처리군은 0.06±0.01, 50 μg/mL 처리군은 0.06±0.03으로 세포독성에 영향을 미치지 않았다(Fig. 2B). 이상의 결과로부터 화살나무 물 추출물이 INS-1 세포의 증식을 증가시켰으며, 독성에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 따라서 추후 세포 실험은 췌장 β-세포의 증식 및 독성에 영향을 미치지 않는 농도인 5 μg/mL로 진행하였다.

Fig 2. Effects of water or 70% EtOH extracts from Euonymus alatus on (A) cell proliferation and (B) cell cytotoxicity in INS-1 cells. INS-1 cells were treated with the indicated concentration (0, 0.5, 5, 50 μg/mL) of each extracts from Euonymus alatus (water, 70% EtOH) for 24 h. Cell proliferation and cell cytotoxicity were determined by CellTiter96 Aqueous One Solution Assay kit or CytoTox Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit. The results were reported as the mean±SD (n=3). The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

화살나무추출물이 INS-1 세포의 인슐린 분비에 미치는 영향

당뇨 발생에 의해 췌장 β-세포가 고농도의 포도당에 장기간 노출되면 β-세포의 기능 이상으로 인슐린 유전자 발현이 감소하여 인슐린 합성 및 분비가 감소하는 것으로 알려져 있다(Robertson 등, 2003). 이에 포도당 자극 하에 화살나무추출물이 췌장 β-세포의 인슐린 분비에 미치는 영향을 평가하였다. 고농도 포도당(30 mM) 및 5 μg/mL 화살나무추출물을 2시간 처리한 결과, 대조군에서의 인슐린 농도는 40.71±6.43 μiU/mL였으며, 화살나무 물 추출물 및 70% EtOH 추출물 처리군의 인슐린 분비량은 각각 53.86±8.77, 60.11±0.8 μiU/mL로 군 간의 차이가 없었다(Fig. 3). Lee(2007)의 연구에 따르면 장기간 고농도 포도당 처리에 의한 인슐린 분비 자극은 β-세포의 인슐린 분비 반응 감소 현상을 유발하며, 이때 Genistein을 처리하면 고농도 포도당에 의한 인슐린 분비 감소를 완화한다고 보고하였다. 또한, University-industry Cooperation Group of Kyung Hee University(2007)의 연구에 따르면 화살나무 50% EtOH 추출물의 에테르 분획에서 정제한 3-O-methylurolic acid는 흰쥐에서 얻은 췌도 세포에서 11.1 mM 포도당과 1시간 동시 처리 시 당뇨병 치료제로서 알려진 Glipizide 대비 인슐린 분비능을 6배 증가시켰다고 보고하였다. 본 연구에서의 결과와 다른 이유는 물 추출물과 70% EtOH 추출물을 시료로 사용하여 효과를 가지는 3-O-methylurolic acid와 같은 단일물질의 농도가 낮았기 때문이라고 생각되나 이에 대한 추가 검토가 필요할 것으로 생각된다.

Fig 3. Effect of water or 70% EtOH extracts from Euonymus alatus on insulin secretion in INS-1 cells. Cells were treated with Glucose (5 mM or 30 mM) and each extracts from Euonymus alatus (water, 70% EtOH, 5 μg/mL) for 1 or 2 h. Insulin secretion was determined by Insulin Human ELISA kit. The results were reported as the mean±SD (n=3). The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

화살나무추출물이 체중, 체중 증가량, 식수・식이 섭취량, 식이효율에 미치는 영향

당뇨의 주요한 증상에는 다갈, 다식, 다뇨, 체중 감소 등이 나타나는 것으로 알려져 있다(Yoo, 2007). 따라서 본 연구에서는 체중 및 체중 증가량, 식수, 식이 섭취량 및 식이 효율에 대하여 조사하였다. 체중 및 체중 증가량을 측정한 결과(Table 1), 초기 체중에서 NG에 비해 유의적으로 C57BL/Ksj-db/db 마우스에서 체중이 증가하였으나, 당뇨 모델 군 간의 차이가 없었다. 화살나무추출물 투여 4주 후 체중 측정 결과 DG와 유의적 차이를 보이며 MG 및 EEG의 체중이 증가하였다. 하지만 체중 증가율에서 군 간의 차이는 보이지 않았다. 이와 같은 결과는 C57BL/Ksj-db/db 마우스를 당뇨 대조군으로 이용하였을 때 10주령에 체중 감소를 보인다는 연구 결과와 일치하였다(Jung, 2019). 메트포민 및 화살나무 70% EtOH 추출물을 투여한 C57BL/Ksj-db/db 마우스의 최종 체중이 DG 대비 유의적으로 증가하는 결과는 당뇨로 인한 체중 감소 현상을 물질 투여가 완화하려는 것으로 생각되나 장기적인 사육을 통한 체중 변화를 측정할 필요가 있다. 다음으로 다갈과 관계있는 식수섭취량을 측정하였다. 식수섭취량은 NG는 26.33±10.78 mL인 반면, DG는 40.77±46.90으로 유의적으로 섭취량이 증가하였다. 식수섭취량의 증가는 메트포민 및 화살나무추출물(water, 70% EtOH) 투여에 의해 각각 19.28±12.11, 19.59±6.43, 17.23±5.13 mL로 DG 대비 유의적으로 식수섭취량이 감소하였다. 이와 같은 결과는 C57BL/Ksj-db/db 마우스에 8주간 발아일품벼 추출물을 급여한 연구 결과와 유사하였다(Lee 등, 2012). 따라서 화살나무추출물은 당뇨의 특징적 증상 중 하나인 다갈 증상을 완화하는 것으로 생각된다. 다식 증상과 관련된 식이 섭취량을 측정한 결과, NG 3.44±1.21 g 대비 C57BL/Ksj-db/db 마우스에서 식이 섭취량이 증가하였다. 메트포민 및 화살나무추출물(water, 70% EtOH) 투여에 의한 식이 섭취량의 변화는 없었다. 이와 같은 결과는 C57BL/Ksj-db/db 마우스가 유전적으로 렙틴 수용체의 결함을 가지고 있어 렙틴 저항성을 가져 포만감을 느끼지 못하는 결과로 생각된다(Kim 등, 2015). 또한, 화살나무추출물 투여군(WEG, EEG)에서 DG 대비 식이섭취량에 차이가 없는 결과는 C57BL/Ksj-db/db 마우스에 7주간 부추 추출물과 부추 발효물을 투여한 연구 결과와 일치하였다(Kim 등, 2015). 식이 효율(FER)은 NG 1.04±0.17 대비 DG에서 0.01±0.7로 유의적으로 감소하였다. 하지만 물질 처리 군 간의 차이는 없었다. 이상의 결과로부터 화살나무추출물 투여는 식수섭취량을 감소시켜 다갈 증상을 개선하는 것으로 생각된다.

Table 1 . Body weight, weight gain, water intake, food intake and FER efficiency of experimental groups.

Initial weight (g)Final weight (g)Body weight gain (g)Water intake (mL)Food intake (g/d)FER1)
NG2)19.81±0.52a3)23.06±0.59a3.25±0.5426.33±10.78a3.44±1.21a1.04±0.17a
DG28.51±2.30b28.29±2.40b−0.22±4.0940.77±46.90b6.69±1.94b0.01±0.7b
MG28.71±1.37b31.70±3.93c2.99±4.1819.28±12.11a5.79±1.48b0.56±0.75ab
WEG29.03±1.55b30.00±2.79bc0.98±3.9319.59±6.43a6.48±1.85b0.16±0.59b
EEG29.19±1.83b31.82±3.34c2.63±2.4317.23±5.13a6.17±2.22b0.44±0.41ab

1)FER, Food efficiency ratio=Body weight gain (g)/ Food intake (g/d)..

2)NG, normal group; DG, diabetic group; MG, metformin group; WEG, water extract group; EEG, 70% EtOH extract group..

3)Values are mean±SD. Different letters for each list of measurements are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05)..



화살나무추출물이 혈장 내 지질농도에 미치는 영향

제2형 당뇨병 환자는 이상지질혈증이 동반되는 경우가 많다(Rhee, 2020). 인슐린 저항성에 의해 인슐린이 정상적으로 기능을 하지 못하면 지방세포 내 중성지방이 분해되어 혈중 유리지방산이 증가하게 된다. 유리지방산은 간으로 이동하여 very low density lipoprotein 합성을 증가시켜 혈중 중성지방 농도 증가를 유발하는 것으로 알려져 있다(Choi, 2009). 이외에도 당뇨병성 이상지질혈증은 혈청 총콜레스테롤, small dense low-density lipoprotein(sdLDL) 콜레스테롤 농도가 증가하였으며, high-density lipoprotein(HDL) 콜레스테롤은 감소하였다고 한다(Sadeghi 등, 2020; Park, 2006). 따라서 본 연구에서는 당뇨병에서 증가하는 것으로 알려진 중성지방 및 총콜레스테롤에 화살나무추출물이 미치는 영향을 확인하였다. 혈장 내 중성지방 농도 측정 결과, NG의 중성지방 농도는 90.96±11.80 mg/dL였으며 DG는 184.68±31.97 mg/dL로 증가하였다. WEG는 156.61±45.73 mg/dL로 군간의 차이가 없었으나 MG는 118.17±19.28 mg/dL, EEG는 146.61±20.53 mg/dL로 DG에 비해 유의적으로 혈장 내 중성지방의 농도가 감소하였다(Fig. 4A). 혈장 내 총콜레스테롤 농도를 측정한 결과, MG는 108.41±18.93 mg/dL로 NG 93.28±9.78 mg/dL보다 혈장 내 총콜레스테롤 농도가 증가하였다. 반면 EEG는 92.07±10.49 mg/dL로 MG 대비 유의적으로 혈장 내 총콜레스테롤 농도가 NG 수준으로 감소하였다. DG와 WEG는 군 간의 차이를 보이지 않았다(Fig. 4B). 결과적으로 EEG에서 DG 대비 중성지방 농도가 유의적으로 감소한다는 결과는 고지방식이에 의해 제2형 당뇨병이 유발된 ICR 마우스에서 10주간 화살나무 에탄올 추출물 투여에 의해 혈장 내 중성지방 농도가 유의적으로 감소한다는 연구 보고와 일치하였다(Park 등, 2005a). 동일한 연구에서 화살나무추출물 투여 시 총콜레스테롤 농도가 감소한다고 하였으나(Park 등, 2005a), 본 연구에서는 화살나무추출물 투여에 의한 차이는 보이지 않았다. 이는 Park 등(2005a)의 연구에 비해 화살나무추출물의 투여 농도가 낮고 투여 기간이 짧았기 때문으로 생각되나, 이에 관한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Fig 4. Effects of oral administration of water or 70% EtOH extracts for 4 weeks on plasma lipid concentration. (A) Triglyceride (TG), (B) Total cholesterol (TC) concentration were measured using plasma obtained from the heart and abdominal vena cava. The results were reported as the mean±SD. The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). NG: normal group, DG: diabetic group, MG: metformin group, WEG: water extract group, EEG: 70% EtOH extract group.

화살나무추출물이 공복혈당 변화에 미치는 영향

2021 당뇨병 진료 지침에 따르면 정상인의 공복혈당은 8시간 이상 공복 후 혈장 포도당 100 mg/dL 미만이며, 126 mg/dL 이상의 경우 당뇨로 진단한다(Hur 등, 2021). 화살나무추출물이 공복혈당에 미치는 영향을 0~4주 차까지 매주 16시간 절식 후 꼬리 정맥에서 혈액을 얻어 동물용 혈당 측정계로 측정하였다. 화살나무추출물을 4주간 투여한 결과, NG는 101.14±15.16 mg/dL인 반면 DG는 488.14±204.54 mg/dL로 공복혈당이 유의적으로 증가하였다. 하지만 DG와 비교하였을 때 MG는 460.43±259.45 mg/dL, 화살나무추출물 투여군(WEG, EEG)은 각각 501.88±103.56 mg/dL, 528.13±84.22 mg/dL로 군 간의 차이가 없었다(Fig. 5).

Fig 5. Changes in fasting blood glucose by oral treatment with water or 70% EtOH extracts. Fasting blood glucose was measured using tail vein blood once a week after fasting for 16 hours. The results were reported as the mean±SD. The different letters in each experimental group for each week are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). NG: normal group, DG: diabetic group, MG: metformin group, WEG: water extract group, EEG: 70% EtOH extract group.

Lee 등(2012)의 연구에 따르면 0.5%, 1% 발아일품벼 섭취군의 공복혈당이 0주 차 대비 4주 차까지 증가하다가 6주 차부터 서서히 감소하였으며, 8주 차에 당뇨군과 유의적 차이를 보이며 감소하였다. 본 연구에서는 실험 종료 시기인 4주 차에도 DG와 화살나무추출물 투여군(WEG, EEG) 사이 공복혈당에 차이가 없었다. 이는 Lee 등(2012)의 연구에 비해 물질 투여 기간이 짧았기 때문으로 생각되나 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

화살나무추출물이 포도당 내당능, 인슐린 부하능, 인슐린 저항성 지표에 미치는 영향

제2형 당뇨병은 인슐린 저항성이라는 특징을 갖는다(Lee, 2007). 인슐린 저항성 발생 시 인슐린 기능 저하에 의해 당질 및 지질대사가 감소하는 것으로 알려져 있다(Choi, 2009). 따라서 화살나무추출물이 인슐린 저항성 개선에 미치는 영향을 확인하고자 포도당 복강 내당능(IPGTT), 인슐린 부하능(IPITT) 및 인슐린 저항성 지표인 HOMA-IR을 측정하였다. IPGTT를 측정한 결과, 투여 90분 후 NG보다 DG 및 물질 투여군(MG, WEG, EEG) 모두에서 혈당이 유의적으로 증가하였다. DG의 혈당은 985±121.74 mg/dL였으며, 화살나무추출물 투여군(WEG, EEG)은 각각 788.57±160.73 mg/dL, 800±171.80 mg/dL로 군 간의 차이는 보이지 않았다(Fig. 6A). IPITT 측정 결과 DG가 173±16.09 mg/dL인 반면 WEG의 혈당이 112.33±35.16 mg/dL로 유의적으로 감소하였다(Fig. 6B).

Fig 6. Effects of oral administration of the water or 70% EtOH extracts on intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT), intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT), HOMA-IR. (A) IPGTT graph, IPGTT graph area under the curve (AUC), (B) IPITT graph and IPITT graph area under the curve (AUC) was measured through tail vein blood at 3 weeks of the experiment. (C) HOMA-IR was measured by fasting blood glucose (mmol/L) and fasting plasma insulin (μU/mL) on the last day of the experiment. The results were reported as the mean±SD. The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). NG: normal group, DG: diabetic group, MG: metformin group, WEG: water extract group, EEG: 70% EtOH extract group.

인슐린 저항성 지표인 HOMA-IR은 NG가 6.35±7.64인 것 대비 모든 군에서 유의적으로 증가하였지만 DG와 비교하였을 때 물질 투여군과의 차이는 보이지 않았다(Fig. 6C). Kang과 Kim(2011)의 연구에 따르면 5주간 흑삼 또는 백삼을 투여한 뒤 포도당 내당능을 측정한 결과 시간 경과에 따라 당뇨군 대비 유의적으로 흑삼 투여군에서 혈당이 감소하였다고 보고하였다. 인슐린 내당능의 경우 차이는 보이지 않았으나 흑삼 투여군에서 백삼 투여군에 비해 빠르게 혈당을 제거하였다고 보고하였다. Lee 등(2021)의 연구에서 또한 5주간 Aspergillus awamori로 발효한 황기추출물을 혼합한 식이를 섭취시킨 뒤 포도당 내당능을 측정한 결과, 시간 경과에 따라 당뇨군 대비 물질 투여군에서 혈당이 유의적으로 감소되었다. 인슐린 저항성 지표인 HOMA-IR은 10주간 투여 후 측정하였으며, DG 대비 물질 투여군에서 유의적으로 감소하였다. 본 연구의 결과 DG 대비 화살나무추출물 투여군(WEG, EEG)에서 혈당에 차이가 없는 결과 및 HOMA-IR 값이 군 간의 차이를 보이지 않는 결과는 비교적 짧았던 투여 기간에 의한 것으로 생각되며 장기간 투여 시 포도당 내당능, 인슐린 부하능 및 HOMA-IR을 측정할 필요가 있을 것으로 생각된다.

화살나무추출물이 혈장 GLP-1 수준에 미치는 영향

Glucagon like peptide-1(GLP-1)은 장관 내 L세포에서 분비되는 것으로 알려진 인크레틴 호르몬이다. GLP-1은 글루카곤의 분비를 억제하고, 포도당 의존적으로 인슐린 분비 증가 및 위 배출 속도 지연 등의 기능을 갖는 것으로 알려져 있다(Oh, 2011). 따라서 본 연구에서는 화살나무추출물이 GLP-1 분비에 미치는 영향을 마우스 혈장에서 측정하였다. 그 결과 NG는 9.37±2.25 pg/mL였으나, EEG는 20.30±8.10 pg/mL로 화살나무추출물에 의해 NG보다 유의적으로 혈장 내 GLP-1 수준이 증가하였다. DG는 13.86±3.88 pg/mL으로 DG와 EEG 사이 혈장 내 GLP-1 수준의 차이는 없었다(Fig. 7). Kim 등(2015)의 연구에 따르면 부추 추출물을 7주간 투여한 결과 정상군 대비 당뇨군의 혈청 내 GLP-1 수준이 유의적으로 감소하였으며, 물질 투여에 의해 유의적으로 GLP-1 수준이 회복되었다고 보고하였다. 본 연구의 결과 화살나무 70% EtOH 추출물 투여 시 NG보다 유의적으로 혈장 내 GLP-1 수준이 증가하는 점은 유사한 경향성을 보이지만 DG와는 차이가 없었으며, DG가 NG와도 차이를 보이지 않았다. 현재 제2형 당뇨 환자의 공복 시 GLP-1 수준은 논란의 여지가 있다. Lastya 등(2014)의 연구에 따르면 당뇨 환자의 공복 시 GLP-1 수준이 정상인에 비해 유의적으로 감소하였다고 보고하였다. 하지만 Korani와 Sonbol(2018)의 연구에 따르면 당뇨 환자와 정상인 사이 공복 시 GLP-1의 수준에는 차이가 없다고 보고하였다. 또한 Wang 등(2016)의 연구에 따르면 GLP-1 분비는 인슐린 저항성 및 고혈당증에 반비례하고 췌도 β-세포 기능 및 인슐린 감수성과 양의 상관관계가 있다고 보고하였다. 따라서 장기간의 물질 투여를 통해 DG 및 EEG에서의 혈장 내 GLP-1 수준을 측정할 필요가 있을 것으로 생각된다.

Fig 7. Effect of water or 70% EtOH extracts from Euonymus alatus on glucagon-like peptide-1 in plasma. GLP-1 concentration in plasma was measured using plasma obtained from the heart and abdominal vena cava. The results were reported as the mean±SD. The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). NG: normal group, DG: diabetic group, MG: metformin group, WEG: water extract group, EEG: 70% EtOH extract group.

화살나무추출물이 혈장 및 췌장 조직 내 인슐린 수준에 미치는 영향

제2형 당뇨 발생 초기 시 인슐린 저항성으로 인해 인슐린이 감지되지 않으며, 체내 항상성 유지를 위해 포도당 대사를 활성화하기 때문에 많은 양의 인슐린이 분비되어 고인슐린혈증이 동반되는 것으로 알려져 있다(Hong, 2005). 따라서 본 연구에서는 화살나무추출물의 경구투여가 혈장 인슐린 분비에 미치는 영향에 대해 측정하였다. 혈장 내 인슐린 농도 측정 결과, NG는 0.71±0.82 ng/mL였으며, DG는 6.04±3.81 ng/mL로 유의적으로 증가하였다. MG 및 WEG, EEG 또한 각각 7.27±6.16, 5.57±3.65, 5.12±2.60 ng/mL로 NG 대비 유의적으로 증가하였다(Fig. 8A). Heo 등(2018)의 연구에 따르면 C57BL/Ksj-db/db 마우스에 6주간 Dendropanax morbifera leaves 추출물을 투여한 결과, 당뇨군의 혈장 인슐린 농도가 정상군 대비 증가하였으며 높은 농도의 물질 투여군의 인슐린 농도는 당뇨군 대비 유의적으로 감소하였다. 본 연구에서 DG의 인슐린 농도가 NG 대비 증가한 결과는 db/db mouse의 고인슐린혈증 특징 및 당뇨에 의해 증가한 포도당을 정상 수준으로 돌리기 위한 보상작용(Cavaghan 등, 2000)으로 보이며, DG와 비교하였을 때 화살나무추출물(WEG, EEG) 처리 시 군 간의 차이가 없는 결과는 짧은 물질 투여 기간에 의한 것으로 추측된다. 따라서 장기간의 추출물 투여를 통한 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.

Fig 8. Effects of water or 70% EtOH extracts from Euonymus alatus on insulin concentration in plasma and pancreatic tissue. (A) Plasma insulin concentration was measured using a Rat/Mouse Insulin ELISA kit. (B) Insulin concentration in the pancreas was measured using a pancreatic tissue lysate. The results were reported as the mean±SD. The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). NG: normal group, DG: diabetic group, MG: metformin group, WEG: water extract group, EEG: 70% EtOH extract group.

또한 췌장 내 인슐린 함량을 측정한 결과, NG는 2.26±0.32 ng/μg protein이었으나 DG는 0.54±0.26 ng/μg protein으로 NG보다 유의적으로 췌장 내 인슐린 함량이 낮았다. 이에 비해 메트포민 및 화살나무추출물(water, 70% EtOH) 투여에 의해 각각 1.7±0.85, 1.33±0.43, 1.27±1.06 ng/μg protein으로 DG 대비 유의적으로 췌장 인슐린 함량이 증가하였다(Fig. 8B). 이와 같은 결과는 C57BL/Ksj-db/db 마우스에 Dendropanax morbifera leaves 추출물을 농도별로 투여하여 항당뇨 효과를 측정한 연구 결과와 일치하였다(Heo 등, 2018). 따라서 화살나무추출물은 당뇨에 의해 감소한 췌장 내 인슐린 저장량을 증가시킴으로써 항당뇨 효과를 갖는 것으로 사료된다.

요 약

화살나무추출물은 항산화, 항염증, 항암 등 여러 생리활성효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 현재 유전적 요인, 비만, 식습관 등의 환경적 요인에 의해 당뇨병 발병률이 증가하고 있다. 당뇨병의 경우 주사용 인슐린 제제 외 메트포민, sulfonylurea 등과 같은 경구 투여제를 이용하여 치료되고 있다. 하지만 기존 치료제들은 장기간 복용 시 여러 부작용을 초래하는 것으로 알려져 천연물을 이용한 부작용 없는 치료제가 필요한 실정이다. 본 연구에서는 화살나무추출물(water, 70% EtOH)이 췌장 β-세포 및 제2형 당뇨 마우스 모델에서 항당뇨 효과를 갖는지 검증하고자 연구를 진행하였다. 화살나무추출물은 췌장 β-세포의 성장에는 영향을 미치지 않았다. 제2형 당뇨 마우스 모델에 투여한 결과 당뇨의 증상 중 하나인 다갈 증상을 유의적으로 감소시켰으며, 70% EtOH 추출물 투여 시 혈장 내 중성지방 농도를 유의적으로 감소시켰다. 또한 물 추출물 및 70% EtOH 추출물 투여 시 췌장 내 인슐린 함량을 유의적으로 증가시켰다. 다음과 같은 결과는 화살나무추출물(water, 70% EtOH)이 당뇨 시 발생할 수 있는 증상 완화에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다. 본 연구에서 여러 측정 항목의 군 간의 차이가 없는 결과는 다소 짧은 물질 투여 기간에 의한 것으로 생각되어 추후 장기간 투여에 대한 항당뇨 효과 검증을 거쳐 치료제로 사용될 가능성이 있을 것으로 사료된다.

감사의 글

이 논문은 2019 중소벤처기업부 맞춤형 기술파트너 지원사업(S2795124)에 의한 논문으로 이에 감사드립니다.

Fig 1.

Fig 1.Animal experimental schedule. The experiment was conducted by dividing each group into 5 groups. Oral administration was performed in the normal group and diabetic group (tap water), metformin group (metformin 200 mg/kg), and extract (water, 70% EtOH) group (500 mg/kg). IPGTT and IPITT were conducted at the 3rd week of the experiment. Other experiments were performed after dissection. IPGTT: Intraperitoneal glucose tolerance test, IPITT: Intraperitoneal insulin tolerance test.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 894-904https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.9.894

Fig 2.

Fig 2.Effects of water or 70% EtOH extracts from Euonymus alatus on (A) cell proliferation and (B) cell cytotoxicity in INS-1 cells. INS-1 cells were treated with the indicated concentration (0, 0.5, 5, 50 μg/mL) of each extracts from Euonymus alatus (water, 70% EtOH) for 24 h. Cell proliferation and cell cytotoxicity were determined by CellTiter96 Aqueous One Solution Assay kit or CytoTox Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit. The results were reported as the mean±SD (n=3). The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05).
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Fig 3.

Fig 3.Effect of water or 70% EtOH extracts from Euonymus alatus on insulin secretion in INS-1 cells. Cells were treated with Glucose (5 mM or 30 mM) and each extracts from Euonymus alatus (water, 70% EtOH, 5 μg/mL) for 1 or 2 h. Insulin secretion was determined by Insulin Human ELISA kit. The results were reported as the mean±SD (n=3). The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05).
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Fig 4.

Fig 4.Effects of oral administration of water or 70% EtOH extracts for 4 weeks on plasma lipid concentration. (A) Triglyceride (TG), (B) Total cholesterol (TC) concentration were measured using plasma obtained from the heart and abdominal vena cava. The results were reported as the mean±SD. The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). NG: normal group, DG: diabetic group, MG: metformin group, WEG: water extract group, EEG: 70% EtOH extract group.
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Fig 5.

Fig 5.Changes in fasting blood glucose by oral treatment with water or 70% EtOH extracts. Fasting blood glucose was measured using tail vein blood once a week after fasting for 16 hours. The results were reported as the mean±SD. The different letters in each experimental group for each week are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). NG: normal group, DG: diabetic group, MG: metformin group, WEG: water extract group, EEG: 70% EtOH extract group.
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Fig 6.

Fig 6.Effects of oral administration of the water or 70% EtOH extracts on intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT), intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT), HOMA-IR. (A) IPGTT graph, IPGTT graph area under the curve (AUC), (B) IPITT graph and IPITT graph area under the curve (AUC) was measured through tail vein blood at 3 weeks of the experiment. (C) HOMA-IR was measured by fasting blood glucose (mmol/L) and fasting plasma insulin (μU/mL) on the last day of the experiment. The results were reported as the mean±SD. The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). NG: normal group, DG: diabetic group, MG: metformin group, WEG: water extract group, EEG: 70% EtOH extract group.
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Fig 7.

Fig 7.Effect of water or 70% EtOH extracts from Euonymus alatus on glucagon-like peptide-1 in plasma. GLP-1 concentration in plasma was measured using plasma obtained from the heart and abdominal vena cava. The results were reported as the mean±SD. The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). NG: normal group, DG: diabetic group, MG: metformin group, WEG: water extract group, EEG: 70% EtOH extract group.
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Fig 8.

Fig 8.Effects of water or 70% EtOH extracts from Euonymus alatus on insulin concentration in plasma and pancreatic tissue. (A) Plasma insulin concentration was measured using a Rat/Mouse Insulin ELISA kit. (B) Insulin concentration in the pancreas was measured using a pancreatic tissue lysate. The results were reported as the mean±SD. The different letters on the bars are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). NG: normal group, DG: diabetic group, MG: metformin group, WEG: water extract group, EEG: 70% EtOH extract group.
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Table 1 . Body weight, weight gain, water intake, food intake and FER efficiency of experimental groups.

Initial weight (g)Final weight (g)Body weight gain (g)Water intake (mL)Food intake (g/d)FER1)
NG2)19.81±0.52a3)23.06±0.59a3.25±0.5426.33±10.78a3.44±1.21a1.04±0.17a
DG28.51±2.30b28.29±2.40b−0.22±4.0940.77±46.90b6.69±1.94b0.01±0.7b
MG28.71±1.37b31.70±3.93c2.99±4.1819.28±12.11a5.79±1.48b0.56±0.75ab
WEG29.03±1.55b30.00±2.79bc0.98±3.9319.59±6.43a6.48±1.85b0.16±0.59b
EEG29.19±1.83b31.82±3.34c2.63±2.4317.23±5.13a6.17±2.22b0.44±0.41ab

1)FER, Food efficiency ratio=Body weight gain (g)/ Food intake (g/d)..

2)NG, normal group; DG, diabetic group; MG, metformin group; WEG, water extract group; EEG, 70% EtOH extract group..

3)Values are mean±SD. Different letters for each list of measurements are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05)..


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