최근 식생활과 생활환경 등의 변화로 인해 만성 질환이 증가하고 있으며, 이러한 노화 및 성인병 발생의 원인인 활성산소가 주목받고 있다. 활성산소와 유리라디칼은 체내의 산화 스트레스를 유발하여 세포 구성 성분을 파괴하고 당뇨, 암, 동맥경화 등과 같은 질병을 유발한다(Valko 등, 2007). 현대인의 경우 활성산소종의 원인인 흡연, 음주, 스트레스, 환경오염 물질 등에 쉽게 노출되어 있어 이를 저해할 수 있는 항산화제가 필수적이다(Kim 등, 2012). 이에 따라 많은 항산화제가 개발되고 있는데, 합성 항산화제를 장기 복용 시 부작용의 위험이 있어 천연 물질을 이용한 항산화제 연구가 활발히 진행되고 있다(Kang 등, 2017).

식물의 2차 대사산물인 phenolic compound는 채소, 과일, 약초 등 천연소재에 많이 존재하며 항당뇨, 항염증, 항암 등과 같은 생리활성 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Lee와 Lee, 1994). 추출 방법 중 보편적으로 사용되고 있는 방법은 화학적인 방법인데, 이는 유기용매를 이용하여 고온에서 장시간 추출하는 조건을 활용하고 있다. 그중 열수 추출법은 전통적인 방법으로 높은 에너지 및 열에 의해 유용성분이 파괴 또는 변성되는 단점을 가지고 있다(Kwon과 Youn, 2017). 생리활성이 우수한 천연물의 추출 효율을 증가시키기 위하여 초음파 추출, 초임계 추출, 마이크로 추출 등 여러 추출 방법이 시도되고 있다(Shin과 Lee, 2011). 초음파 추출은 식물체로부터 추출공정에서 추출 효율과 속도, 추출온도 저하, 용매 절약 등의 효과를 가지지만 장비 설치가 필요하며, 동시에 추출할 수 있는 양이 적은 단점도 있다(Ma 등, 2009; Shin과 Lee, 2011). 추출 방법에 따른 천연소재의 생리활성 비교 연구들이 진행되고 있으며 같은 재료라도 추출 방법에 따라 생리활성의 차이가 나타난다(Bae 등, 2019). 안전성과 시간을 고려했을 때 효율적인 추출 방법 개발이 필요하며, 천연소재의 특성을 고려한 추출 방법의 선택이 중요하다(Cho 등, 2003).

자색케일(Brassica oleracea L. var. acephala)은 십자화과 속 채소로 적자색을 띠고 있으며 다양한 기후 환경에 견디기 쉽다(Olsen 등, 2012). Zhang 등(2012)의 연구에 따르면 자색케일의 안토시아닌 성분은 온도와 관련이 있는데, 추위에 노출된 자색케일의 안토시아닌 함량이 온실에서 자란 케일보다 50배 더 높다고 보고하였다. 또한 자색케일을 조리할 시 안토시아닌, 비타민 C, 폴리페놀과 β-carotene 등 대사물질이 감소한다고 보고되었다. 케일의 생리활성에 관한 연구로는 UV를 조사한 케일 녹즙의 항산화 활성 및 아질산염 소거 작용의 변화(Choi 등, 2010), 케일 착즙액의 항산화 활성(Kim 등, 2014b), 케일즙의 안정성 및 항돌연변이 효과(Kim 등, 2014a) 등이 보고되었다. 하지만 자색케일의 생리활성 연구와 이를 식품소재로 활용한 연구는 매우 부족한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 추출 방법을 달리하여 자색케일의 기능성 성분의 효율적인 추출법을 찾아내고자 하였으며 이를 통해 산업적인 이용 가능성을 알아보고자 하였다. 또한 자색케일의 페놀 물질 함량, 항산화 효과 및 α-glucosidase 저해 활성 연구를 통해 기능성 소재로의 활용 가능성 및 기초자료를 제공하고자 한다.

실험재료

본 연구에 사용된 자색케일은 전남 해남군에서 2021년 1월에 수확한 것을 구매해 사용하였다. 자색케일은 세척 후 줄기를 제거하고 잎만 분리하여 사용하였다. 자색케일 잎은 동결 건조(MCFD 8508, Ilshin Bio Base, Yangju, Korea)하여 분쇄하였고, 40 mesh로 체를 친 후 분말 상태로 -40 °C에 보관하였다. 실험에 사용된 시약인 Folin & Ciocalteu’s phenol reagent, 2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl(DPPH), 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), α-glucosidase from Saccharomyces cerevisiae, acarbose, gallic acid, ascorbic acid 등은 Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구매하여 사용하였으며, 그 밖에 모든 용매 및 시약은 일급 이상 등급을 사용하였다.

추출물 제조 및 수율 측정

자색케일의 추출 방법은 Kang 등(2012)과 Kim 등(2013)의 연구를 참고하여 환류냉각 추출(RE, reflux extraction), 초음파 추출(USE, ultrasonic extraction), 상온교반 추출(SE, stirrer extraction)로 설정하였다. 자색케일 분말의 20배에 해당하는 70% 에탄올을 첨가하여 총 3가지 종류의 추출물을 제조하였다. 환류냉각 추출은 냉각관이 부착된 환류냉각 추출 장치를 이용하여 60°C의 항온수조(C-WBE-B, Changshin Co., Seoul, Korea)에서 6시간씩 3회 반복 추출하였다. 상온교반 추출은 상온 교반기(BF-35SB, Biofree, Seoul, Korea)를 이용하여 25°C에서 120 rpm으로 12시간 3회 반복 추출하였다. 초음파 추출은 초음파균질기(KUS-650, KBT, Seongnam, Korea)를 이용하여 25°C, 300 W에서 15분간 3회 반복 추출하였다. 각 추출물은 여과지(Whatman No. 2, Whatman International Ltd., Maidstone, England)로 여과한 뒤 회전식 감압 농축기(N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 감압 농축했으며, 동결 건조한 후 분말화하여 -40°C에 보관하면서 시료로 사용하였다. 추출 수율은 추출물을 동결 건조하여 건물 중량을 구한 후 원료 건물량에 대한 백분율로 나타내었다.

총 폴리페놀 함량 측정

자색케일 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu법을 응용한 Hillis와 Swain(1959)의 방법에 따라 측정하였다. 추출물 150 μL에 증류수 2,400 μL와 0.25 N Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 50 μL를 첨가한 후 3분간 반응시켰다. 이 용액에 1 M sodium carbonate(Na₂CO₃) 300 μL를 가하여 2시간 동안 암소에 방치한 다음 725 nm에서 흡광도(T60UV, PG Instruments, Wibtoft, England)를 측정하였다. 표준물질로는 gallic acid를 사용하여 검량선을 작성하였고 시료 g당 mg gallic acid equivalent(mg GAE/g)로 나타내었다. 모든 실험은 3회 반복하였으며 평균값과 표준편차로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량 측정

자색케일 추출물의 총 플라보노이드 함량은 Davis 법(1947)을 변형한 방법에 따라 측정하였다. 추출물 1 mL에 90% diethylenglycol 10 mL와 1 N NaOH 1 mL를 가하여 37°C 항온수조에서 1시간 동안 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 rutin을 사용하여 검량선을 작성하였고 시료 g당 mg rutin equivalent(mg RE/g)로 나타내었다. 모든 실험은 3회 반복하였으며 평균값과 표준편차로 나타내었다.

총 안토시아닌 함량 측정

자색케일 추출물의 총 안토시아닌 함량은 Hosseinian 등(2008)의 pH differential method에 준해 측정하였다. 추출물 0.5 mL에 0.025 M potassium chloride buffer(pH 1.0)와 0.4 M sodium acetate buffer(pH 4.5)를 가하여 최종 부피를 1 mL로 하여 510 nm 및 700 nm에서 반응액의 흡광도를 측정하였다. 총 안토시아닌의 함량은 cyanidin-3-glucoside의 몰 흡광계수(ε＝26,900 M^-1cm^-1)를 이용하여 다음의 식에 따라 산출하였다. 모든 실험은 3회 반복하였으며 평균값과 표준편차로 나타내었다.

Total anthocyanin content (mg/kg)＝A×MW×D×1,000÷ε×V

A (absorbance value)＝(A510 nm－A700 nm)pH 1.0－(A510 nm－A700 nm)pH 4.5

MW (molecular weight of cyanidin-3-glucoside)＝449.2

D (dilution factor)＝dilution ratio of sample

ε (cyanidin-3-glucoside molar absorbance)＝26,900 M^-1cm^-1

V＝final volume of sample

DPPH 라디칼 소거 활성 측정

자색케일 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 Blois (1958)의 방법에 따라 측정하였다. 농도별로 제조한 추출물 900 μL에 DPPH solution(1.5×10^-4 M) 300 μL를 첨가하여 교반한 후 30분간 암소에서 방치하였다. 흡광도는 517 nm에서 측정하였으며, 양성대조군은 ascorbic acid를 사용하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 아래의 식에 따라 계산되었으며 50%의 소거능을 나타내는 시료의 농도(IC₅₀)로 값을 나타내었다. 모든 실험은 3회 반복하였으며 평균값과 표준편차로 나타내었다.

DPPH free radical scavenging activity (%)＝(1－sample absorbance/control absorbance)×100

ABTS⁺ 라디칼 소거 활성 측정

자색케일 추출물의 ABTS⁺ 라디칼 소거 활성은 Re 등(1999)의 방법에 따라 측정하였다. 증류수에 용해한 7 mM ABTS⁺ 용액과 2.4 mM potassium persulfate 용액을 혼합한 후 ABTS⁺ 라디칼을 만들기 위해 암소에서 12~16시간 동안 반응시켰다. 라디칼이 생성된 용액의 흡광도 값이 734 nm에서 0.70±0.02가 되도록 phosphate buffered saline (pH 7.4)으로 희석하였다. ABTS⁺ 용액 900 μL와 추출물 100 μL를 첨가한 후 일정한 시간 간격으로 흡광도를 측정하였으며, 양성대조군은 ascorbic acid를 사용하였다. ABTS⁺ 라디칼 소거 활성은 아래의 식에 따라 계산되었으며 50%의 소거능을 나타내는 시료의 농도(IC₅₀)로 값을 나타내었다. 모든 실험은 3회 반복하였으며 평균값과 표준편차로 나타내었다.

ABTS⁺ radical scavenging activity (%)＝(1－sample absorbance/control absorbance)×100

아질산염 소거 활성 측정

자색케일 추출물의 아질산염 소거 활성은 Kato 등(1987)의 방법에 따라 측정하였다. 1 mM NaNO2 용액 1 mL와 추출물 l mL를 혼합한 후 0.1 N HCl을 가하여 pH 1.2로 조정하였고 총부피를 10 mL로 하였다. 용액을 37°C에서 1시간 동안 반응시킨 후 1 mL를 취하여 2% acetic acid 5 mL와 Griess reagent(1% sulfanilic acid:1% naphthylamine＝1:1) 0.4 mL를 첨가한 후 실온에서 15분간 반응시키고 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 Griess reagent 대신 증류수를 사용하였으며, 양성대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였다. 아질산염 소거 활성은 아래의 식에 따라 계산되었으며 50%의 소거능을 나타내는 시료의 농도(IC₅₀)로 값을 나타내었다. 모든 실험은 3회 반복하였으며 평균값과 표준편차로 나타내었다.

Nitrite scavenging activity (%)＝(1－sample absorbance/control absorbance)×100

Superoxide dismutase(SOD) 활성 측정

자색케일 추출물의 SOD 활성은 SOD assay kit(Dojindo Molecular Technologies Inc., Rockville, MD, USA)을 사용하여 측정하였다. Plate에 농도별로 희석한 시료 20 μL를 분주하고 WST working solution 200 μL를 넣어 혼합하였다. Enzyme working solution 20 μL를 가하여 37°C에서 20분간 반응시킨 후 microplate reader(Multiskan FC microplate photometer, Thermo Fisher Scientific Inc., Oslo, Norway)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 enzyme working solution 대신 dilution buffer를 넣어 측정하였다. SOD 활성은 아래의 식에 따라 계산되었으며 50%의 소거능을 나타내는 시료의 농도(IC₅₀)로 값을 나타내었다. 모든 실험은 3회 반복하였으며 평균값과 표준편차로 나타내었다.

SOD activity (inhibition rate %)＝[(A_blank1－A_blank3)－(A_sample－A_blank2)]/ (A_blank1－A_blank3)×100

환원력 측정

자색케일 추출물의 환원력은 Oyaizu(1986)의 방법에 따라 측정하였다. 0.1, 0.5, 1 mg/mL 농도의 추출물 0.5 mL에 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 6.6) 0.5 mL와 1% potassium ferricyanide 0.5 mL를 가한 다음 50°C에서 20분간 반응시켰다. 반응액에 10% trichloroacetic acid 0.5 mL를 첨가한 후 1 mL를 취해 증류수 1 mL와 혼합한 다음 0.1% ferric chloride 0.2 mL를 가하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복하였으며 평균값과 표준편차로 나타내었다.

Oxygen radical absorbance capacity(ORAC) 측정

자색케일 추출물의 ORAC는 Ou(2001)의 방법에 따라 측정하였다. 모든 추출물 및 시약은 10 mM potassium phosphate buffer(pH 7.4)를 이용하여 제조하였다. 96-well microplate에 농도별로 희석한 추출물 25 μL를 분주한 후 10 nM fluorescein 150 μL를 첨가하였다. Fluorescent microplate reader(SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 이용하여 30분간 37°C에서 incubation 하였다. 측정 직전 240 mM AAPH 25 μL를 첨가하였고, 485 nm에 전자가 여기되고 520 nm에서 방출되게 하여 2시간 동안 90초 간격으로 fluorescence의 감소 정도를 측정하였다. 표준물질로는 Trolox를 사용하여 검량선을 작성하였고, 시료 첨가군와 무첨가군의 area under curve(AUC)를 계산하여 시료 g당 μM Trolox equivalent(μM TE/g)로 나타내었다. 모든 실험은 3회 반복하였으며 평균값과 표준편차로 나타내었다.

Area under curve (AUC)＝(R1/R1)＋(R2/R1)＋(R3/R1)＋ .... (Rn/R1)

α-Glucosidase 저해 활성 측정

자색케일 추출물의 α-glucosidase 저해 활성 측정은 Zhu 등(2008)의 방법을 응용하였으며, 효소는 α-glucosidase from Saccharomyces cerevisiae를 사용하였고 기질은 4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside(pNPG)를 사용하여 p-nitrophenol 생성량을 측정하였다. α-Glucosidase 10 μL에 시료 200 μL를 가하여 37°C에서 5분간 반응시킨 후, 1 mM pNPG 200 μL를 가하여 혼합한 다음 37°C에서 20분 동안 반응시켰다. 1 N NaOH 500 μL를 넣어 반응을 중지시키고 0.05 M phosphate buffer(pH 6.8) 590 μL를 첨가한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 acarbose를 사용하였으며 반응 후 p-nitrophenol 생성량의 표준 곡선으로부터 α-glucosidase의 저해 활성을 측정하였다. α-Glucosidase 저해 활성은 아래의 식에 따라 계산되었으며 50%의 소거능을 나타내는 시료의 농도(IC50)로 값을 나타내었다. 모든 실험은 3회 반복하였으며 평균값과 표준편차로 나타내었다.

α-Glucosidase inhibition activity (%)＝(1－반응구의 PNP 생성량/대조군의 PNP 생성량)×100

통계처리

실험 결과의 통계처리는 SPSS package(Statistical Analysis Program, version 25, IBM Co., Armonk, NY, USA)를 이용하였다. 유의성 검증을 위해 각 실험군 간 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)을 이용했으며, 사후 검증으로 Duncan’s multiple range test를 실시하였다(P<0.05). 상관관계 분석은 Pearson’s correlation coefficient로 실시하였다.

수율

추출 방법에 따른 자색케일의 수율은 Table 1과 같다. 자색케일 분말을 추출했을 때 초음파 추출(45.22%), 환류냉각 추출(40.51%), 상온교반 추출(38.56%) 순으로 추출 수율이 높았다(P<0.001). 청나래고사리를 상온교반, 환류냉각, 초음파 추출했을 때 초음파 추출의 수율이 가장 높았으며, 상온교반 추출의 수율이 낮아 본 연구와 유사한 경향을 보였다(Shin과 Lee, 2011). Kang 등(2012)의 개두릅 추출 연구에 따르면 환류냉각 추출과 초음파 추출을 병행하여 추출했을 때 수율이 높았는데, 이는 환류냉각 추출 시 용출되지 않았던 성분들이 초음파 에너지로 인해 용출되었기 때문이라고 보고하였다.

Table 1 . Extraction yield, total polyphenol, total flavonoid, and total anthocyanin contents of red kale extract at different methods.

Samples1)	Yield (%)	Total polyphenol content (mg GAE2)/g)	Total flavonoid content (mg RE3)/g)	Total anthocyanin content (mg/100 g)
RE	40.51	55.35±3.15b4)5)	56.67±2.21c	510.99±18.60c
USE	45.22	76.63±1.35a	64.12±0.40a	787.07±23.16a
SE	38.56	73.17±1.55a	60.26±0.26b	690.78±14.59b

¹⁾RE, reflux extraction; USE, ultrasonic extraction; SE, stirrer extraction..

²⁾GAE, gallic acid equivalent..

³⁾RE, rutin equivalent..

⁴⁾All values are expressed as mean±SD (n=3)..

⁵⁾Values with different letters (a-c) in a column are significantly different by Duncan’s multiple range test at P<0.05..

초음파 추출은 기존의 추출 방법보다 추출 시간이 짧고 추출 속도와 효율을 높이는 효과가 있다. 또한 초음파는 일반적인 용매추출법보다 생리활성 물질의 추출 수율을 6~35% 증가시킨다고 보고되었다(Vilkhu 등, 2008). 초음파 추출은 용매에 공동현상(cavitation)을 발생시켜 기포를 형성하는데, 이 기포가 붕괴하면서 고온과 고압 환경을 형성하여 식물의 세포벽을 파괴한다. 세포벽이 파괴됨에 따라 용매가 식물 조직 내로 침투하기 용이하게 되고, 이에 따라 내부의 유기화합물이 방출되어 추출을 증가시킨다(Sharmila 등, 2016). Lee(2020)의 여주 기능성 성분의 초음파 추출조건 최적화 연구에 따르면 에탄올 농도, 초음파의 세기, 추출 시간에 따라 약 16.5%의 수율 차이가 발생하였다. 따라서 초음파 추출법으로 추출 시 용매의 종류와 초음파의 세기, 추출 시간을 고려하여 조건을 설정하는 것이 중요하다고 생각된다.

총 폴리페놀 함량

폴리페놀계 물질은 한 분자에 2개 이상의 phenolic hydroxyl(OH-)기를 가진 화합물들을 말하는데, 이 폴리페놀 화합물은 phenoxy radical을 형성하여 자유라디칼을 제거하는 생리활성 기능을 가진다(Lee와 Lee, 1994). 추출 방법을 달리한 자색케일 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Table 1과 같다. 환류냉각 추출, 초음파 추출, 상온교반 추출의 총 폴리페놀 함량은 각각 55.35 mg GAE/g, 76.63 mg GAE/g, 73.17 mg GAE/g으로 초음파 추출이 다른 추출 방법에 비해 높은 함량을 나타내었다. 초음파 추출과 상온교반 추출 간의 유의적인 차이는 없었으나 환류냉각 추출이 비교적 낮은 함량을 나타내었다(P<0.001). Lim과 Chin(2017)에 따르면 80°C에 열풍 건조한 케일을 에탄올에 추출한 후 총 페놀 함량을 측정한 결과 2.45 g/100 g의 함량을 보여 자색케일의 총 페놀 함량이 약 2배 정도 더 높음을 확인하였다. Seo 등(2018)에 따르면 자소엽을 초음파 추출, 환류냉각 추출하여 페놀 함량을 비교했을 때 초음파 추출에서 더 높은 함량을 보였으며, 청나래고사리 또한 환류냉각 추출보다 초음파 추출에서 폴리페놀 함량이 더 높게 측정되었다(Shin과 Lee, 2011). 그러나 Kim 등(2013)의 연구에 따르면 돼지감자 잎을 가압가열 추출, 상온교반 추출, 환류냉각 추출했을 때 열을 가한 가압가열 추출이 다른 추출법보다 1.7~2.4배 높은 폴리페놀 함량을 보여 본 연구와 상반된 결과를 보였다. 이러한 결과는 열처리 시 식물체의 결합구조나 종류에 따라 유용성분의 용출이 다르게 나타나기 때문이라고 생각된다(Jiratanan과 Liu, 2004). 따라서 유효성분을 효율적으로 추출하기 위해서는 소재의 특성을 고려하여 추출하는 것이 중요하다고 생각된다.

총 플라보노이드 함량

폴리페놀계 물질인 플라보노이드는 flavonols, cathechins, anthocyanidins 등으로 구성되어 있으며, 그 구조에 따라 항산화, 항염증, 항노화 등 다양한 생리활성을 가지고 있다(Rice-Evans 등, 1995). 추출 방법을 달리한 자색케일 추출물의 총 플라보노이드 함량은 Table 1과 같다. 초음파 추출이 64.12 mg RE/g으로 함량이 가장 높았으며, 상온교반 추출은 60.26 mg RE/g, 환류냉각 추출은 56.67 mg RE/g으로 측정되었다(P<0.01). 여주를 초음파 추출 또는 60°C에서 교반 추출했을 때 초음파 추출물의 플라보노이드 함량이 더 높아 본 연구와 유사한 경향을 보였다(Lee, 2020). Chaaban 등(2017)은 70~130°C의 온도 조건에서 6가지 플라보노이드 구조의 항산화 활성과 열에 대한 안정성을 측정하였는데, 구조에 따른 안정성 차이가 있었으나 모두 열에 민감하다고 주장하였다. 따라서 열에 취약한 플라보노이드를 추출하기 위해서는 낮은 온도에서 단시간 추출하는 초음파 추출법이 최적의 추출법이라 생각된다.

총 안토시아닌 함량

추출 방법을 달리한 자색케일 추출물의 총 안토시아닌 함량은 Table 1과 같다. 총 안토시아닌 함량은 초음파 추출이 787.07 mg/100 g으로 가장 높았으며, 상온교반 추출이 690.78 mg/100 g, 환류냉각 추출이 510.99 mg/100 g으로 비교적 낮은 함량을 보였다(P<0.001). Zou 등(2011)은 오디를 20°C, 40°C, 60°C 온도에서 초음파 추출하였는데, 40°C에서 60°C로 온도가 상승할 때 안토시아닌이 분해되었다고 보고하였다. 또한 Roobha 등(2011)에 따르면 Musa acuminata의 안토시아닌을 추출하여 5일 동안 0~70°C의 온도에서 색소 안정성을 연구한 결과, 0~20°C에서는 비교적 안정적이었으나 40~70°C에서는 빠른 색소 파괴를 보였다. 이는 높은 온도로 인해 3-glycoside 구조가 가수분해되었거나 pyrilium ring의 가수분해로 인해 갈색 물질을 형성하는 chalcone이 생성되었기 때문이라고 주장하였다(Roobha 등, 2011). 따라서 안토시아닌은 열에 불안정하므로 60°C의 높은 온도에서 장시간 추출되는 환류냉각 추출이 다른 추출 방법에 비해 낮은 안토시아닌 함량을 보인 것으로 생각된다.

DPPH 라디칼 소거 활성

DPPH 라디칼 소거 활성은 항산화 활성 측정 방법의 하나로, 짙은 자색을 띠는 자유라디칼인 DPPH가 항산화제, 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 탈색되는 원리를 이용하는 방법이다(Ancerewicz 등, 1998). 추출 방법에 따른 자색케일의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 IC₅₀으로 나타낸 결과는 Table 2와 같다. 자색케일의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 초음파 추출(39.35 µg/mL), 상온교반 추출(42.54 µg/mL), 환류냉각 추출(55.12 µg/mL) 순으로 높은 소거 활성을 보였으며, 양성대조군인 ascorbic acid의 IC₅₀은 1.77 µg/mL로 나타났다(P<0.001). Kim(2005)에 따르면 적채를 70% 에탄올로 추출했을 때 1,000 µg/mL에서 76%의 DPPH 라디칼 소거 활성을 보여 자색케일 추출물이 비교적 높은 소거 활성을 가졌음을 알 수 있었다. Park 등(2017)은 아가위나무 열매를 상온교반 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출했을 때 초음파 추출물의 DPPH 라디칼 소거능이 가장 높게 측정되었다고 보고하여 본 연구와 유사한 경향을 보였다. 또한 자소엽을 열수 추출, 냉수 추출, 초음파 추출했을 때 초음파 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 가장 높아 본 연구와 같은 경향을 보였다(Seo 등, 2018). 약용식물에서 폴리페놀 함량이 높아질수록 항산화 활성도 높아지는 양의 상관관계를 나타낸다고 보고된 바와 같이, 자색케일 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 또한 페놀류에 기인한 것으로 생각된다(Kim 등, 2004).

Table 2 . DPPH radical, ABTS⁺ radical, nitrite scavenging activity, and SOD activity of red kale extract at different methods.

Samples1)	IC502) value (μg/mL)
	DPPH3)	ABTS	NSA	SOD
RE	55.12±1.52a4)5)	95.69±3.47a	6,039.37±113.65a	981.26±23.95a
USE	39.35±2.02c	86.12±1.89b	4,715.10±168.92b	610.67±49.03c
SE	42.54±1.36b	90.43±3.54b	5,897.75±160.13a	740.38±24.55b
Ascorbic acid	1.77±0.03d	16.27±0.41c	299.27±5.24c	221.39±1.73d

¹⁾RE, reflux extraction; USE, ultrasonic extraction; SE, stirrer extraction..

²⁾Inhibitory concentration required for 50% reduction of scavenging activity..

³⁾DPPH, DPPH radical scavenging activity; ABTS, ABTS+ radical scavenging activity; NSA, nitrite scavenging activity; SOD, superoxide dismutase activity..

⁴⁾All values are expressed as mean±SD (n=3)..

⁵⁾Values with the different letters (a-d) in a column are significantly different at P<0.05 based on Duncan’s multiple range test..

ABTS⁺ 라디칼 소거 활성

ABTS와 potassium persulfate가 반응하면 라디칼 양이온인 ABTS⁺가 생성되어 청록색을 띠는데, 이 물질이 항산화 물질에 의해 탈색되는 것을 이용하여 ABTS⁺ 라디칼 소거 활성을 측정할 수 있다(Park 등, 2013). 추출 방법에 따른 자색케일의 ABTS⁺ 라디칼 소거 활성을 측정하여 IC₅₀으로 나타낸 결과는 Table 2와 같다. 초음파 추출의 IC₅₀은 86.12 µg/mL로 활성이 가장 높았으며 상온교반 추출, 환류냉각 추출이 각각 90.43 µg/mL, 95.69 µg/mL의 값을 보였다(P<0.001). 양성대조군인 ascorbic acid의 IC₅₀은 16.27 µg/mL였다. 초음파 추출 시간을 달리하여 남구절초와 코스모스 지상부를 추출한 결과 15분간 초음파 추출한 추출물의 ABTS⁺ 라디칼 소거능이 가장 높았고, 환류냉각 추출보다 초음파 추출이 약 1.34배 높은 소거 활성을 보여 본 연구와 유사한 경향을 보였다(Woo 등, 2010). ABTS⁺는 양이온 라디칼 소거 활성을 측정하고 DPPH는 음이온 라디칼 소거 활성을 측정한 방법으로, 기질과 반응물질과의 결합 정도가 달라 소거 활성의 차이가 있으나 유사한 경향을 보인다고 보고되었다(Hong 등, 1998). 추출 방법을 달리한 개두릅 추출물의 ABTS⁺ 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 DPPH 라디칼 소거 활성과 유사한 경향을 보였으며, 딸기 추출물 또한 초음파 추출물에서 ABTS⁺와 DPPH 라디칼 소거 활성이 유사하였다(Kang 등, 2012; Bae 등, 2019).

아질산염 소거 활성

아질산염은 식육 제품의 발색 또는 산패방지제로 사용되는 물질이지만 아민류와 반응하게 되면 nitroso화 반응이 일어나 nitrosamine을 생성하게 된다(Choi 등, 1989). 대표적인 항산화 물질인 ascorbic acid, 페놀성 화합물 등은 환원력이 강해 nitroso의 생성을 억제하기 때문에 항산화 활성을 간접적으로 측정하는 데 활용될 수 있다(Byers와 Perry, 1992). 추출 방법에 따른 자색케일의 아질산염 소거 활성을 측정하여 IC₅₀으로 나타낸 결과는 Table 2와 같다. 초음파 추출의 IC₅₀은 4,715.10 µg/mL, 상온교반 추출은 5,897.75 µg/mL, 환류냉각 추출은 6,039.37 µg/mL의 값을 보여 초음파 추출의 아질산염 소거능이 가장 높았고, 대조군인 ascorbic acid는 299.27 µg/mL의 값을 나타내었다(P<0.001). Yamada 등(1978)은 폴리페놀 화합물이 아질산염을 분해하여 nitrosamine의 생성을 억제한다고 보고하였다. Jeong 등(2015)의 양파껍질 추출 방법에 따른 아질산염 소거능을 보았을 때 환류냉각 추출이 상온교반 추출에 비해 소거 활성이 높아 본 연구와 상반되는 결과를 보였으나, 식품소재에 따른 페놀 화합물 함량 차이에 의한 결과라고 판단된다.

SOD 활성

SOD는 활성산소로부터 생물체를 보호하는 항산화 효소로 peroxide를 물과 산소 분자로 전환하여 superoxide를 제거하는 역할을 한다(Donnelly 등, 1989). 추출 방법에 따른 자색케일의 SOD 유사 활성을 측정하여 IC₅₀으로 나타낸 결과는 Table 2와 같다. 초음파 추출은 610.67 µg/mL로 가장 활성이 좋았으며 상온교반 추출은 740.38 µg/mL, 환류냉각 추출 981.26 μg/mL 순으로 활성이 높게 나타났다(P<0.001). 표준물질로는 ascorbic acid를 사용하였고 IC₅₀은 221.39 µg/mL였다(P<0.001). Bae 등(2019)에 따르면 딸기를 50% 에탄올로 초음파 추출했을 때 10 mg/mL에서 35.29%의 SOD 유사 활성을 보였다. Woo 등(2017)에 따르면 곰취를 에탄올 추출 시 1,000 µg/mL에서 44.80%, 물 추출 시 36.87%의 SOD 유사 활성을 보였다. 본 연구 결과 자색케일 추출물은 기존에 보고된 여러 천연물 소재보다 더 높은 SOD 활성을 보였다. 이러한 결과로 보았을 때 우수한 SOD 활성을 나타내는 자색케일은 체내 superoxide를 제거하는 천연 항산화제로 활용 가능할 것으로 생각된다.

환원력

환원력은 항산화 물질이 Fe³⁺(ferric iron)에 수소를 공여하여 Fe²⁺(ferrous iron)로 환원시키는 정도를 흡광도로 나타낸 방법으로, 환원력이 강할수록 녹색에 가깝게 발색되고 흡광도가 증가한다(Oyaizu, 1986). 추출 방법에 따른 자색케일의 환원력을 측정한 결과는 Table 3과 같다. 환류냉각 추출의 경우 100~1,000 µg/mL에서 0.06~0.83의 흡광도 값을 보였고, 초음파 추출은 0.09~1.05, 상온교반 추출은 0.08~1.00의 흡광도 값을 보였으며 모든 추출물에서 농도 의존적으로 증가하였다(P<0.001). 같은 농도에서 ascorbic acid는 1.34~2.14의 흡광도 값을 보였다(P<0.001). 또한 모든 농도에서 초음파 추출이 가장 높은 환원력을 나타내었고 상온교반 추출, 환류냉각 추출 순으로 높은 활성을 보였다(P<0.001). Lim과 Chin(2017)에 따르면 80°C에 열풍 건조한 케일을 에탄올에 추출한 후 환원력을 측정한 결과 1,000 µg/mL에서 0.32의 흡광도를 보여 자색케일의 환원력이 더 높음을 확인하였다. 환원력 또한 폴리페놀, 플라보노이드 함량과 유사한 경향을 보였는데, Osawa(1994)에 따르면 페놀 물질은 다양한 생리적 효능을 나타내어 항산화와 연관이 있으며 페놀 함량과 상관관계가 높다고 보고하였다. Bae 등(2019)의 추출 방법에 따른 딸기의 환원력을 측정한 결과, 고온가압 추출과 초음파 추출 모두 농도 의존적으로 증가하였으며 초음파 추출이 고온가압에 비해 환원력의 값이 높은 결과를 보였다.

Table 3 . Reducing power of red kale extract at different methods.

Samples1)	Reducing power (O.D.)
	100 μg/mL	500 μg/mL	1,000 μg/mL
RE	0.06±0.01dC2)3)	0.41±0.02dB	0.83±0.01dA
USE	0.09±0.01bC	0.56±0.01bB	1.05±0.01bA
SE	0.08±0.01cC	0.52±0.02cB	1.00±0.02cA
Ascorbic acid	1.34±0.03aC	2.04±0.03aB	2.14±0.04aA

¹⁾RE, reflux extraction; USE, ultrasonic extraction; SE, stirrer extraction..

²⁾All values are expressed as mean±SD (n=3)..

³⁾Values with the different letters in a column (a-d) and a row (A-C) are significantly different at P<0.05 based on Duncan’s multiple range test..

ORAC는 peroxyl radical에 대한 항산화 물질의 저해능을 측정하는 방법으로 fluorescent의 감소율을 측정하여 항산화 활성을 측정하는 원리이다(Kim과 Kim, 2007). 추출 방법을 달리한 자색케일 추출물의 ORAC 측정 결과는 Table 4와 같다. 자색케일의 ORAC 지수는 모든 추출물에서 농도 의존적으로 증가하였다(P<0.001). 125 µg/mL 농도에서 초음파 추출(130.22 μM TE/g), 상온교반 추출(114.14 μM TE/g), 환류냉각 추출(95.58 μM TE/g) 순으로 높은 항산화 활성을 보였다(P<0.01). 250 μg/mL 농도에서 초음파 추출(317.96 μM TE/g), 상온교반 추출(311.07 μM TE/g), 환류냉각 추출(294.61 μM TE/g) 순으로 항산화 활성을 보였고(P<0.01), 500 μg/mL 농도에서 초음파 추출(419.48 μM TE/g), 상온교반 추출(415.92 μM TE/g), 환류냉각 추출(402.78 μM TE/g) 순으로 항산화 활성을 보였다(P<0.01). 갯기름나물 뿌리 추출물의 ORAC 활성을 측정한 결과, 에탄올 추출물이 133.37 μM TE/g, 물 추출물이 58.16 μM TE/g으로 자색케일 추출물의 항산화 활성이 더 높음을 확인하였다(Lim, 2019). 또한 부위별 흰색 느티만가닥버섯 에탄올 추출물의 ORAC 활성을 연구한 결과, 갓 부위는 64.76 μM TE/g, 대 부위는 46.22 μM TE/g의 항산화 활성을 보였다(Kim 등, 2016).

Table 4 . ORAC of red kale extract at different methods.

Samples1)	Concentration (μM TE2)/g)
	125 μg/mL	250 μg/mL	500 μg/mL
RE	0.06±0.01dC2)3)	0.41±0.02dB	0.83±0.01dA
USE	0.09±0.01bC	0.56±0.01bB	1.05±0.01bA
SE	0.08±0.01cC	0.52±0.02cB	1.00±0.02cA
Ascorbic acid	1.34±0.03aC	2.04±0.03aB	2.14±0.04aA

¹⁾RE, reflux extraction; USE, ultrasonic extraction; SE, stirrer extraction..

²⁾TE, Trolox equivalent..

³⁾All values are expressed as mean±SD (n=3)..

⁴⁾Values with the different letters in a column (a,b) and a row (A-C) are significantly different at P<0.05 based on Duncan’s multiple range test..

α-Glucosidase 저해 활성

α-Glucosidase는 소장 점막의 미세융모에 존재하는 효소로 탄수화물을 단당류로 분해하는 소화, 흡수작용에 관여한다. α-Glucosidase 억제제는 이러한 탄수화물 분해를 억제하고 glucose의 흡수를 지연시킴으로써 혈당 상승을 억제한다(Josse 등, 2003). 추출 방법에 따른 자색케일의 α-glucosidase 저해 활성을 측정하여 IC₅₀으로 나타낸 결과는 Table 5와 같다. 자색케일 초음파 추출은 2,772.03 μg/mL의 IC₅₀값을 보여 저해 활성이 가장 높았고, 상온교반 추출은 2,835.47 μg/mL의 IC₅₀값을 보여 유의적인 차이를 보이지 않았다(P<0.001). 환류 추출물은 3,060.41 μg/mL로 낮은 저해 활성을 보였고, 대조군인 acarbose는 727.24 μg/mL의 활성 저해 효과를 보였다(P<0.001). 양파껍질의 추출 방법을 달리하여 α-glucosidase 저해 활성을 비교한 결과, 상온교반 추출이 환류냉각 추출보다 더 높은 저해 효과를 보여 본 연구와 유사한 경향을 보였다(Jeong 등, 2015). Lee와 Lee(1994)에 따르면 페놀성 물질의 함량, 형태, 종류에 따라 α-glucosidase 효소의 활성이 달라진다고 보고되었다. 따라서 추출 방법에 따라 달리 추출된 페놀성 화합물이 α-glucosidase 저해 활성에 영향을 미치는 것으로 생각된다.

Table 5 . α-Glucosidase inhibitory activity of red kale extract at different methods.

Samples1)	IC50) value (μg/mL)
RE	3,060.41±77.84a3)4)
USE	2,772.03±127.47b
SE	2,835.47±12.17b
Acarbose	727.24±2.52c

상관관계

자색케일 추출물의 항산화 활성 및 α-glucosidase 저해 활성 간의 상관관계를 분석한 결과는 Table 6과 같다. 총 폴리페놀 함량은 총 플라보노이드 함량(r=0.903, P<0.01), 총 안토시아닌 함량(r=0.975, P<0.01), 환원력(r=0.985, P<0.01), ORAC(r=0.968, P<0.01)와 강한 양의 상관관계를 보였고, DPPH 라디칼 소거 활성(r=-0.993, P<0.01), ABTS⁺ 라디칼 소거 활성(r=-0.860, P<0.01), 아질산염 소거 활성(r=-0.699, P<0.05), SOD 유사 활성(r=-0.973, P<0.01), α-glucosidase 저해 활성(r=-0.920, P<0.01)과는 강한 음의 상관관계를 보였다. Lee 등(2020)의 곡류와 두류의 항산화 활성 간의 상관관계를 분석한 결과 폴리페놀 함량과 ABTS⁺ 라디칼 소거 활성, DPPH 라디칼 소거 활성, 환원력에서 강한 양의 상관관계를 나타내었다(P<0.01). Park 등 (2017)의 연구에 따르면 아가위 열매를 초음파 추출했을 때 상온교반 추출과 환류냉각 추출보다 총 플라보노이드 함량이 높았는데, 이는 총 폴리페놀 함량과 연관 지을 수 있으며 회귀분석 결과 R2이 0.87로 높은 연관성을 보였다(P<0.05). 자색케일에는 페놀 화합물인 disinapoyl-diglucoside와 benzoyl-sinapoyl-triglucoside 등이 많이 함유되어 있어 항산화 활성에 기여 하는 것으로 보인다(Olsen 등, 2010). 이는 폴리페놀이 수소를 공여하여 라디칼들을 안정화할 수 있는 구조로 되어 있어 항산화와 연관이 있다고 보고되었다(Park 등, 2015).

Table 6 . Pearson correlation between the antioxidant contents and antioxidant activity of red kale extract.

Factors1)	TPC	TFC	TAC	DPPH2)	ABTS	NSA	SOD	RP3)	ORAC4)	α-Glucosidase
TPC	1
TFC	0.903**	1
TAC	0.975**	0.946*	1
DPPH	−0.993**	−0.900**	−0.985**	1
ABTS	−0.860**	−0.931**	−0.890**	0.874**	1
NSA	−0.699*	−0.890**	−0.827**	0.733*	0.830**	1
SOD	−0.973**	−0.942**	−0.999**	0.984**	0.883**	0.827**	1
RP	0.985**	0.912**	0.990**	−0.991**	−0.875**	−0.760*	−0.990**	1
ORAC	0.968**	0.920**	0.945**	−0.958**	−0.916**	−0.712*	−0.935**	0.947**	1
α-Glucosidase	−0.920**	−0.875**	−0.907**	0.931**	0.864**	0.704*	0.910**	−0.893**	−0.895**	1

¹⁾TPC, total phenolic content; TFC, total flavonoid content; TAC, total anthocyanin content; NSA, nitrate scavenging activity; SOD, superoxide dismutase activity; RP, reducing power; ORAC, oxygen radical absorbance capacity; α-Glucosidase, α-glucosidase inhibitory activity..

²⁾DPPH, ABTS, NSA, SOD, α-glucosidase inhibition was analyzed by IC50 value..

³⁾Reducing power was analyzed at 1 mg/mL..

⁴⁾ORAC was analyzed at 0.5 mg/mL..

*P<0.05, **P<0.01; Significance was determined using SPSS by Pearson’s correlation coefficient..

α-Glucosidase 저해 활성은 총 폴리페놀 함량(r=-0.920, P<0.01), 총 플라보노이드 함량(r=-0.875, P<0.01), 총 안토시아닌 함량(r=-0.907, P<0.01), 환원력(r=-0.893, P<0.01), ORAC(r=-0.893, P<0.01)와는 강한 음의 상관관계를 보였으며, DPPH 라디칼 소거 활성(r=0.931, P<0.01), ABTS⁺ 라디칼 소거 활성(r=0.864, P<0.01), 아질산염 소거 활성(r=0.704, P<0.05)과는 강한 양의 상관관계를 나타내었다. Ramkumar 등(2010)의 연구에 따르면 페놀 물질은 α-glucosidase 저해 활성을 증가시킨다고 보고하였으며, Ji 등(2020)에 따르면 배초향 추출물의 총 페놀, 총 플라보노이드 함량이 α-glucosidase 저해 활성과 강한 상관관계가 존재한다고 보고되어 본 연구와 유사한 경향을 보였다. 따라서 상관관계의 결과를 통해 추출 방법에 따른 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량이 항산화 활성과 관련이 있으며, α-glucosidase 저해 활성과도 직접적인 관계가 있음을 확인할 수 있었다.

본 연구에서는 자색케일의 식품산업 활용도를 높이고자 추출 방법(환류냉각 추출, 초음파 추출, 상온교반 추출)을 달리하여 항산화 활성 및 α-glucosidase 저해 활성을 측정하였다. 추출 방법을 달리한 자색케일의 수율을 측정한 결과 초음파 추출의 수율이 가장 높았고 상온교반 추출이 가장 낮았다. 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, 총 안토시아닌 함량은 초음파 추출물에서 각각 76.63 mg GAE/g, 64.12 mg RE/g, 787.07 mg/100 g으로 가장 높은 함량을 나타내었다. DPPH 라디칼 소거 활성, ABTS⁺ 라디칼 소거 활성, 아질산염 소거 활성, SOD 활성을 IC₅₀으로 나타내었을 때 초음파 추출물이 각각 39.35 μg/mL, 86.12 μg/mL, 4715.10 μg/mL, 610.67 μg/mL로 가장 높은 항산화 활성을 보였다. 환원력은 추출물의 농도가 증가함에 따라 흡광도가 비례하여 증가하였으며, 100~1,000 μg/mL의 농도에서 초음파 추출이 0.09~1.05의 흡광도를 보여 항산화 활성이 가장 좋았다. ORAC 활성은 125~500 μg/mL의 농도에서 초음파 추출이 130.22~419.48 μM TE/g으로 가장 높은 항산화 활성을 보였다. 자색케일 추출물의 α-glucosidase 저해 활성을 측정한 결과, 초음파 추출물의 IC₅₀이 2,772.03 μg/mL로 저해 활성이 가장 높았다. 항산화 활성과 α-glucosidase 저해 활성 간의 상관관계를 분석한 결과 상관계수가 0.704~0.990으로 강한 양의 상관관계를 나타내었다. 결과적으로 초음파 추출법으로 자색케일을 추출했을 때 가장 높은 항산화 활성과 α-glucosidase 저해 활성을 보였으며, 우수한 생리활성을 지닌 천연 기능성 물질로 이용 가능할 것으로 생각된다.