면역은 외부 감염원으로부터 신체를 보호하는 자기방어 체계로, 여러 원인에 의해 면역력이 약화하면 감염의 위험성이 증가하고 암세포 등 이상세포를 제거하는 능력이 저하되어 각종 질병 발생의 가능성이 증가하게 된다(Kim 등, 2014). 최근 들어 건강에 관한 관심이 높아지면서 질병 예방을 목적으로 기능성 식품에 대한 수요가 급증하고 있다(Singh 등, 2020). 이에 따라 부작용이 적고 안전성이 높은 천연물로부터 면역력 증진 소재를 개발하고자 하는 연구들이 이루어지고 있다(Sindhu 등, 2021).

천연물 유래 다당체는 다수의 연구를 통해 면역 증진 및 항종양 활성을 지닌 것으로 보고되어 있으며, 현재까지 면역증강제 또는 항암 치료를 위한 물질로 다양하게 활용되고 있다(Yu 등, 2018). 다당체의 면역 활성 기능은 대식세포, T세포, B세포, NK(natural killer)세포 등 면역세포의 증식 및 활성을 유도하거나 nitric oxide(NO), cytokine 등 면역 매개물질의 분비를 촉진하고 보체계를 활성화하는 것으로 알려져 있다(Yin 등, 2019).

미강은 현미를 도정하는 과정에서 발생하는 부산물로 과피, 종피, 호분층 등의 분쇄 혼합물이다(Gu 등, 2018). 미강에는 arabinoxylan, arabinogalactan, β-glucan 등의 면역 증진 기능을 갖는 다당체 성분들이 함유되어 있다(Park 등, 2021). 그중 arabinoxylan은 곡류의 세포벽에 존재하는 hemicellulose의 일종으로 NK세포의 활성화를 유도하고 대식세포 및 단핵구의 탐식능을 증가시킴으로써 면역증강 및 항암 활성을 나타낸다고 보고되어 있다(Ghoneum 등, 2008). 또한 arabinogalactan은 NK세포의 세포 독성 및 대식세포의 탐식능을 증가시키고 대장암을 유발한 마우스 모델에서 항암 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다(Yang 등, 2019).

그러나 이러한 유용 다당체는 미강 내 cellulose, hemicellulose, lignin 등 인체 소화 효소로 분해되지 않는 식이섬유와 결합해 있어 소화 흡수가 용이하지 못하다(Liu 등, 2021). 따라서 불용성 섬유질로부터 유용 다당체 성분을 분리하기 위해 생물전환(bioconversion), 압출(extrusion) 등의 추출법들이 연구되었다(Hong, 2005). 이들 추출법 중 가장 상업화된 방법은 탄수화물 분해효소를 이용한 효소분해추출법으로 알려져 있으며, 일본에서는 해당 기법을 적용하여 arabinoxylan 복합물인 MGN-3(Biobran)를 개발하여 많은 국가에서 판매하고 있다(Ooi 등, 2021).

본 연구진은 미강 내 유용 다당체를 추출하기 위해 표고버섯(Lentinus edodes) 균사체를 이용한 발효법을 사용하였다. 미강 배지에 균사체를 배양할 경우 균사체는 생육하는 동안 미강을 탄소원으로 사용하기 위해 탄수화물 가수분해효소를 분비하는데, 이 과정에서 유도되는 불용성 식이섬유의 구조적 변화로 arabinoxylan 등의 다당체 성분을 유리시킴으로써 미강 유래 기능성 다당체를 얻고자 하였다. 선행 연구에서 Yu 등(2004)은 미강을 여러 종의 버섯 균사체로 발효하여 조다당체를 제조한 후 대식세포 활성능을 비교 측정하였으며, 표고버섯 균사체를 이용할 때 가장 높은 활성을 나타내는 것으로 보고하였다. 또한 Kim 등(2007)의 연구에서는 미강의 표고버섯 균사체 발효로 제조한 조다당체가 NK세포의 활성을 증가시키고 마우스 종양 성장을 저해하는 등의 면역 증진 기능을 가지는 것으로 보고하였다.

본 연구에서는 미강-표고버섯 균사체 발효법을 이용한 미강발효물(EFR)의 면역 증진 효과를 더욱 구체적으로 밝히기 위해 EFR이 면역세포의 활성과 증식에 미치는 영향을 살펴보고자 하였다. 따라서 RAW264.7 대식세포에 EFR을 처리한 후 NO 생성, inducible nitric oxide synthase(iNOS) mRNA 발현 및 cytokine 생성 정도를 측정하였다. 또한 비장세포의 증식능과 마우스 복강 대식세포의 lysosomal enzyme 활성능을 평가하여 EFR의 면역 활성을 규명하고 기능성 소재로의 가능성을 제시하고자 하였다.

미강발효물 제조

본 연구에 사용된 미강발효물(Erom’s fermented rice bran, EFR)은 (주)에스티알바이오텍(Chuncheon, Korea)으로부터 제공받아 사용하였다. 미강을 전분분해효소로 전처리한 후 표고버섯 균사체를 접종하여 30°C에서 3일간 액상 발효하였다. 미강발효액에 섬유소분해효소(cellulase) 및 전분분해효소(amylase)를 처리한 후 90°C에서 열수 추출 및 동결건조하여 분말화하였다. 실험에 사용된 균사체는 표고버섯의 자실체로부터 분리하였으며, 미생물 동정은 한국미생물보존센터(Seoul, Korea)에 의뢰하여 ITS-5.8S rDNA sequencing을 통해 Lentius edodes임을 확인하였다.

세포배양

실험에 사용한 마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포는 37°C, 5% CO₂ 조건으로 배양하였으며, 세포배양액은 10% fetal bovine serum과 1% penicillin이 함유된 Dulbecco’s modified Eagle media를 사용하였다. 세포 배지 및 관련 시약은 Gibco(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다.

세포 독성시험

96-well plate에 RAW264.7 세포를 5×10⁴ cells/well의 농도로 분주하여 하루 동안 배양한 후 EFR을 0.5~8 μg/mL의 농도로 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 각 well에 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS, Promega, Madison, WI, USA) 용액을 20 μL씩 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 후 microplate reader(Spectrostar^Nano, BMG LABTECH, Ortenberg, Germany)로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군 대비 세포 생존율(% of control)을 계산하였다.

NO 측정

96-well plate에 RAW264.7 세포를 5×10⁴ cells/well의 농도로 분주하여 하루 동안 배양하였다. 양성 대조물질로 사용된 lipopolysaccharide(LPS)는 1 μg/mL, EFR은 0.5~8 μg/mL의 농도로 희석하여 세포에 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포배양액 내의 NO 농도는 NO plus detection kit(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)을 이용하여 측정하였다.

Cytokine 측정

96-well plate에 RAW264.7 세포를 5×10⁴ cells/well의 농도로 분주하여 하루 동안 배양한 후 LPS는 1 μg/mL, EFR은 0.5~8 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포배양액을 회수하여 원심분리한 후 얻어진 상층액 내의 cytokine[interleukin(IL)-6, IL-1β, IL-10, tumor necrosis factor(TNF)-α] 생성량을 측정하였다. 시료는 측정 전까지 -70°C에서 냉동 보관하였으며, cytokine 농도는 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 정량하였다.

Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)

6-well plate에 RAW264.7 세포를 2×10⁵ cells/well의 농도로 분주한 다음 하루 동안 배양하였다. LPS는 1 μg/mL, EFR은 0.5~8 μg/mL의 농도로 세포에 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 세포를 수거한 후 GeneAll^® Hybrid-R^TM kit(Geneall, Seoul, Korea)을 이용하여 total RNA를 추출하였고, GeneAll^® Hyperscrip^TM 2×RT master kit(Geneall)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 대한 PCR을 수행하기 위해 GeneAll^® AmpONETM Taq premix kit(Geneall)과 Table 1의 primer를 이용하였으며, thermal cycler(2720, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 PCR 분석을 수행하였다. PCR 조건은 95°C에서 2분간 initial denaturation, 95°C에서 30초간 denaturation, 55~61°C에서 30초간 annealing, 72°C에서 30초간 extension 하는 과정을 30회 반복한 후 72°C에서 5분간 final extension 과정을 수행하였다. 이때 housekeeping 유전자인 GAPDH를 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산물들은 0.01% GelRed nucleic acid stain(Biotium, Fremont, CA, USA)이 함유된 1% agarose gel을 이용하여 전기영동한 후 UV 하에서 확인하였다.

Table 1 . Sequences of primer used for RT-PCR.

Gene	Direction	Sequence
iNOS	Forward	5′-ATTCGCAACATCAGGTCGGCCATCACT-3′
	Reverse	5′-GCTGTGTGTCACAGAACTCTCGAACTC-3′
IL-6	Forward	5′-GTACTCCAGAAGACCAGAGG-3′
	Reverse	5′-TGCTGGTGACAACCACGGCC-3′
IL-10	Forward	5′-TACCTGGTAGAAGTGATGCC-3′
	Reverse	5′-CATCATGTATGCTTCTATGC-3′
IL-1β	Forward	5′-CAGGATGAGGACATGAGCACC-3′
	Reverse	5′-CTCTGCAGACTCAAACTCCAC-3′
TNF-α	Forward	5′-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3′
	Reverse	5′-CCTGTAGCCCACGTCGTAGC-3′
GAPDH	Forward	5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′
	Reverse	5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′

실험동물

본 실험에는 생후 5~8주령의 수컷 C57/BL6 마우스 10마리를 사용하였다. 마우스는 (주)새론바이오(Uiwang, Korea)로부터 구입하여 온도 23±2°C, 습도 55±5%, 12시간 명암주기가 유지되는 동물실에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물실험은 (주)이롬 동물실험윤리위원회의 승인(ERD-IA01-200301C)을 받았으며, 동물실험 윤리지침을 준수하여 수행하였다.

마우스 비장세포 분리 및 증식능 측정

5~8주령의 C57/BL6 마우스를 경추탈골법으로 희생시킨 후 비장을 적출하였다. 적출한 비장을 분쇄하여 70 μm strainer에 통과시키며 비장세포를 분리하였다. 분리된 세포현탁액을 RPMI-1640 배지로 세척했으며 ACK lysis buffer를 처리하여 적혈구를 제거한 후 사용하였다. 비장세포는 96-well plate에 5×10⁵ cells/well로 분주하여 2시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포에 LPS와 Concanavalin A(Con A)는 1 μg/mL, EFR은 0.5~8 μg/mL의 농도로 각각 처리한 후 72시간 동안 배양하였다. 각 well에 MTS(Promega) 용액을 20 μL씩 첨가하여 1시간 동안 배양하였고 microplate reader(BMG LABTECH)로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 비장세포 증식능을 관찰하였다(Song 등, 2003).

대식세포의 lysosomal phosphatase 활성 측정

5~8주령의 C57/BL6 마우스에 3% thioglycollate 2 mL를 복강주사하고 3일 뒤 RPMI-1640 배지를 마우스 복강에 주입한 후 회수하였다. 회수한 배지를 원심분리한 후 세척하여 대식세포를 분리하였다. 분리된 대식세포를 96-well plate에 1×10⁵ cells/well로 분주한 후 2시간 동안 배양하였다. LPS와 EFR을 각각 1 μg/mL, 0.5~8 μg/mL의 농도로 처리하고 24시간 배양하였다. 세포배양액을 제거한 후 0.1% Triton X-100 25 μL, p-nitrophenyl phosphate 150 μL, 0.1 M citrate buffer(pH 6.0) 50 μL를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 microplate reader(BMG LABTECH)로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 대식세포의 lysosomal phosphatase 활성을 확인하였다(Song 등, 2003).

통계분석

본 실험의 측정값은 평균±표준편차로 나타냈으며, SPSS(ver.18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 통계 분석하였다. 그룹 간의 통계적 유의성을 검정하기 위하여 one-way ANOVA를 실시하였으며, Duncan’s multiple range test를 이용하여 각 군의 유의차를 P<0.05의 수준에서 사후검정하였다.

세포 독성에 미치는 영향

RAW264.7 세포에 대한 EFR의 세포 독성을 확인하기 위하여 EFR을 0.5~8 μg/mL의 농도로 처리한 후 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과 EFR 처리 시 세포 생존율이 증가하는 것으로 나타나 RAW264.7 세포에 대한 독성은 없는 것으로 확인하였다(Fig. 1). 따라서 EFR 0.5~8 μg/mL 농도 범위에서 후속 실험을 진행하였다.

Fig 1. Effect of EFR on cell cytotoxicity in RAW264.7 cells. The cells were treated with different concentrations (0.5～8 μg/ mL) of EFR. After 24 h, the cell cytotoxicity was measured by MTS assay. The data show mean±SD (n=3). Values with different letters (a,b) are significantly different at P<0.05 according to Duncan’s multiple range test. EFR: Erom’s fermented rice bran (fermented rice bran with Lentinus edodes mycelia).

NO 생성 및 iNOS 발현에 미치는 영향

NO는 대식세포의 활성화 지표로 이용되며, 활성화된 대식세포에서 iNOS에 의해 L-arginine이 L-citrulline으로 전환되는 과정에서 생성된다. 일반적으로 과량 생성된 NO는 과도한 염증 반응을 유발하지만, 적정량의 NO는 외부 병원체에 독소로 작용할 뿐 아니라 면역 활성 매개물질로서의 역할을 수행한다고 알려져 있다(Coleman, 2001).

EFR이 대식세포의 NO 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 RAW264.7 세포에 EFR을 0.5~8 μg/mL의 농도로 처리한 후 세포배양액 내 NO 생성량을 측정하였다. EFR 처리에 의해 NO 생성량은 농도 의존적으로 증가하였으며, 특히 8 μg/mL 농도에서는 양성대조군인 LPS 처리군(1 μg/mL)보다 높은 생성량을 보였다(Fig. 2A). iNOS의 발현을 조사한 결과에서도 NO 생성 경향과 유사하게 EFR 처리에 의해 iNOS의 mRNA 발현이 농도 의존적으로 증가하였다(Fig. 2B).

Fig 2. Effect of EFR on NO production and iNOS mRNA expression in RAW264.7 cells. The cells were treated with LPS (1 μg/mL) or different concentrations (0.5~8 μg/mL) of EFR for 24 h. (A) NO levels were measured using NO plus detection kit. The data show mean±SD (n=3). Values with different letters (a-g) are significantly different at P<0.05 according to Duncan’s multiple range test. (B) The mRNA expression levels of iNOS were analyzed by RT-PCR analysis. LPS: lipopolysaccharide.

Wang 등(2016)은 미강에서 분리한 다당체가 대식세포의 NO 생성을 증가시킨다는 연구 결과를 보고하였다. 또한 Lee 등(2018)은 표고버섯 균사체 발효로 생산된 미강 생물전환 소재가 닭 유래 대식세포(HD-11)에서 iNOS의 발현을 증가시킨다는 유사한 결과를 보고하였다. 이러한 결과로 EFR은 대식세포에서 iNOS 발현을 유도하여 NO의 생성을 증가시킴으로써 면역 활성에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

Cytokine 분비 및 발현에 미치는 영향

대식세포는 활성화되면 다양한 cytokine을 분비하여 전반적인 면역반응을 조절한다. Pro-inflammatory cytokine은 염증 및 면역반응에서 주요 매개 인자로 작용하며, 그중 TNF-α는 감염에 따른 초기 생체 방어에 있어 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 종양 세포의 사멸을 유도함으로써 항암 효과를 나타낸다(Arango Duque와 Descoteaux, 2014). IL-6는 염증, 면역 및 조혈작용에 관여하며, T세포에 작용하여 세포 독성 T세포로의 분화를 촉진하고 B세포를 활성화하여 항체의 생산을 증가시킨다(Tanaka 등, 2014). 또한 IL-1β는 감염에 의한 염증과 면역반응을 조절하는 cytokine으로, 대식세포, NK세포, 림프구를 활성화하고 다른 cytokine의 분비를 유도하여 면역반응을 촉진한다(Wang 등, 2010). 앞선 cytokine들과 달리 IL-10은 대표적인 anti-inflammatory cytokine으로 체내 손상을 최소화하기 위해 면역반응을 조절하며 염증 반응을 제한한다(Saraiva와 O’Garra, 2010).

EFR이 대식세포의 cytokine 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 RAW264.7 세포에 EFR을 0.5~8 μg/mL 농도로 처리한 후 세포배양액 내 cytokine 분비량을 측정하였다. 그 결과, EFR을 처리함에 따라 IL-1β, IL-10, IL-6 및 TNF-α의 분비량이 농도 의존적으로 증가하였으며, 4 μg/mL 이상의 농도에서는 양성대조군인 LPS 처리군(1 μg/mL)보다 높은 분비량을 보였다(Fig. 3). 또한 cytokine 유전자 발현 결과에서도 EFR 처리에 의한 cytokine mRNA 발현의 증가를 확인할 수 있었다(Fig. 4).

Fig 3. Effect of EFR on cytokine secretion in RAW264.7 cells. (A) IL-1β, (B) IL-10, (C) IL-6, (D) TNF-α. The cells were treated with different concentrations (0.5~8 μg/mL) of EFR. LPS (1 μg/mL) was used as a positive control. After 24 h, the cell culture supernatants were collected and analyzed using ELISA kit for the measurement of cytokine secretion. The data show mean±SD (n=3). Values with different letters (a-g) are significantly different at P<0.05 according to Duncan’s multiple range test.

Fig 4. Effect of EFR on cytokine mRNA expression in RAW264.7 cells. (A) IL-1β, (B) IL-10, (C) IL-6, (D) TNF-α. The cells were treated with LPS (1 μg/mL) or EFR (0.5~8 μg/mL) for 24 h and the mRNA expression levels of cytokine (IL-1β, IL-6, IL-10, and TNF-α) were analyzed by RT-PCR analysis. The data show mean±SD (n=3). Values with different letters are significantly different at P<0.05 according to Duncan’s multiple range test.

미강을 비롯한 천연물 유래의 면역 다당체는 대식세포를 활성화하여 cytokine 분비를 촉진함으로써 면역 활성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 기존의 연구에서 Ghoneum과 Matsuura(2004)는 arabinoxylan을 주성분으로 한 효소분해 미강분말(MGN-3)이 인간 및 마우스 대식세포주인 U937 및 RAW264.7 세포의 TNF-α와 IL-6 분비량을 증가시켰음을 보고하였다. 또한 Shin 등(2002)은 인삼에서 분리한 산성 다당체가 마우스 복강 대식세포에서 TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ의 분비를 증가시킨다고 보고하였으며, 알로에에서 분리한 Aloeride도 인간 단핵구 세포주인 THP-1 세포에서 IL-1β와 TNF-α의 mRNA 발현을 유도하는 것으로 보고된 바 있다(Pugh 등, 2001). 이로 미루어볼 때 본 실험에서 확인된 EFR의 cytokine 생성 효과는 다당체 성분에 의한 것으로 보이며, EFR은 면역반응을 증진시킬 수 있을 것으로 사료된다.

이와 관련하여 선행 연구에서는 복수암 및 고형암 유발 마우스에 미강의 표고버섯 균사체 발효로 제조한 조다당체를 투여할 경우 암세포의 성장 저해와 생존율의 증가가 관찰됨을 보고하였다(Kim 등, 2007). 본 실험의 결과를 볼 때 이는 cytokine의 직접적인 독성 작용에 더불어 면역반응에 의한 간접적인 항암 효과가 일부 영향을 미친 결과인 것으로 추정된다(Zhi 등, 2006).

특히 본 실험에서 EFR은 pro-inflammatory cytokine과 anti-inflammatory cytokine의 생성을 모두 증가시키는 것으로 나타났는데, 이것은 pro-inflammatory cytokine이 과다하게 분비되었을 때 발생할 수 있는 염증성 손상을 방지하기 위한 면역 조절 반응인 것으로 보인다. 따라서 EFR은 단순 면역 증진뿐 아니라 면역 조절 기능도 가질 수 있을 것으로 사료된다.

비장세포 증식에 미치는 영향

비장은 체내에서 가장 큰 2차 림프 기관으로 다양한 면역세포로 구성되어 있으며, 감염원에 대한 방어작용, 조혈작용 및 적혈구 제거 등 전반적인 면역 기능을 담당하고 있다(Lewis 등, 2019). 따라서 비장의 크기나 세포 수는 면역 기능의 지표로 사용되며, 비장세포의 증식은 면역 기능의 증진을 나타낸다(Ryu 등, 2004).

EFR이 비장세포 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 비장세포에 EFR을 0.5~8 μg/mL의 농도로 처리한 후 세포 증식능을 측정하였다. 그 결과 T세포와 B세포의 증식을 선택적으로 유도하는 Con A 및 LPS 처리에 의해서 비장세포의 높은 증식 반응을 확인하였으며, EFR 처리 시 비장세포 증식능은 대조군 대비 1.33~1.74배로 현저히 증가하는 것으로 확인하였다(Fig. 5).

Fig 5. Effect of EFR on cell proliferation in splenocytes separated from mice. The cells were treated with different concentrations (0.5~8 μg/mL) of EFR. Concanavalin A (Con A) and LPS (1 μg/mL) were used as specific mitogen to T- and B-cells. After 72 h, the cell proliferation was measured by MTS assay. The data show mean±SD (n=3). Values with different letters (a-d) are significantly different at P<0.05 according to Duncan’s multiple range test.

미강 유래 다당체에 의한 비장세포의 증식 효과는 앞선 연구들에서도 보고된 바 있다. Wang 등(2016)은 비장세포에 미강 유래 다당체를 500 μg/mL의 농도로 Con A와 병용 처리한 경우 Con A 단독 처리군보다 세포 증식능이 28.9% 증가하는 것으로 보고하였다. Ghoneum과 Abedi(2004)는 C57BL/6 마우스에 효소분해 미강분말(MGN-3)을 50 mg/kg 농도로 복강 투여한 결과 14일째 대조군 대비 비장세포 수가 192%까지 증가한 것으로 보고하였다. 이들 결과로 EFR은 비장세포의 증식을 촉진함으로써 면역 증진에 기여할 수 있을 것으로 보인다.

대식세포 활성에 미치는 영향

대식세포는 외부 항원이 침입하면 이를 탐식한 후 phagosome과 lysosome의 융합을 통해 lysosome 내 enzyme을 이용하여 항원을 분해한다(Elhelu, 1983). 일반적으로 높은 탐식능을 가진 대식세포는 다량의 lysosomal enzyme을 가지고 있으며 활성이 높은 것으로 알려져 있다(Choi 등, 2002). 따라서 본 실험에서는 마우스 복강 대식세포에 EFR을 처리한 후 대표적인 lysosomal enzyme으로 알려진 phosphatase의 활성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 그 결과, 양성 대조물질인 LPS(1 μg/mL) 처리 시 lysosomal enzyme 활성은 대조군 대비 약 135.8%였으며, EFR의 경우 0.5~8 μg/mL 농도에서 134.9~142.2%로 활성이 크게 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 6).

Fig 6. Effect of EFR on lysosomal enzyme activitiy in mouse peritoneal macrophages. The cells were treated with LPS (1 μg/ mL) or different concentrations (0.5~8 μg/mL) of EFR for 24 h. Macrophage lysosomal enzyme activities were measured using p-nitrophenyl phosphate assay. The data show mean±SD (n=3). Values with different letters (a-e) are significantly different at P<0.05 according to Duncan’s multiple range test.

Ghoneum과 Matsuura(2004)의 연구에서는 효소분해 미강분말(MGN-3)을 인간 유래 대식세포인 U937과 마우스 복강 대식세포에 처리한 경우 S. cerevisiae에 대한 대식세포의 탐식능이 증가하는 것으로 보고하였다. 또한 Yang 등(2015)은 쌀 껍질로부터 분리한 다당체 분획물을 3주간 섭취시킨 결과, E. coli에 대한 탐식능이 증가하였다고 보고한 바 있으며, Kim 등(2005)의 선행 연구 결과에서도 마우스에 미강발효물을 50, 250 mg/kg BW의 농도로 5일간 섭취시켰을 때 복강 대식세포의 lysosomal enzyme 활성에 있어 유의적인 증가(대조군 대비 각각 1.41, 1.44배 증가)가 관찰된다고 보고하였다. 실험의 결과에서도 EFR에 의해 대식세포의 lysosomal enzyme 활성이 증가하는 것으로 나타나 유사한 결과를 확인할 수 있었다. 이로부터 EFR은 대식세포를 활성화해 항원의 분해를 촉진할 수 있을 것으로 보이며 이를 통해 면역 활성에 도움을 줄 것으로 사료된다.

미강에는 면역증강 기능이 있는 다당체들이 함유되어 있으나 비소화성 식이섬유와 결합한 형태로 존재하고 있기 때문에 소화 흡수가 어려워 체내 이용률이 낮은 것으로 알려져 있다(Jung과 Choi, 2008). 따라서 본 연구진은 표고버섯 균사체 발효를 통해 미강 내 유용 다당체의 이용률을 높이고 면역 활성을 강화하고자 하였다. 본 연구에서는 미강의 표고버섯 균사체 발효를 통해 제조된 EFR을 대상으로 면역 활성을 평가하였으며, 그 결과 EFR은 대식세포를 활성화해 면역매개물질의 생성을 증가시키고 비장세포의 증식을 유도하는 등의 면역 활성이 있는 것으로 나타났다. EFR의 면역 활성에 기여하는 성분에 대해서는 아직 정확히 밝혀지지 않았지만, 선행 연구를 통해 다당체가 면역 활성에 기여하는 주요 물질임을 추정할 수 있었다. Kim 등(2007)은 미강의 표고버섯 균사체 발효로 제조한 조다당체가 면역세포를 활성화하고 마우스 모델에서 항암 효과를 가지는 것으로 보고한 바 있다. 또한 Yu 등(2004)의 연구에서는 미강-표고버섯 균사체 발효물에서 분리한 조다당체 분획에 당 구조를 파괴하는 periodate를 처리했을 때 원래의 대식세포 활성능이 크게 감소하는 것으로 보고하였으며, 이로부터 미강발효물 내 면역 활성을 갖는 다당체 성분이 존재함을 보고하였다. 더불어 해당 조다당체 분획에는 arabinose, galactose, glucose, mannose 및 xylose가 주요 구성당으로 함유된 것으로 나타나, arabinoxylan 등 미강 유래의 유용 다당체가 포함되어 있을 것으로 보고하였다. 위 결과를 종합해볼 때 본 연구에서 EFR의 면역 활성은 미강으로부터 유래된 다당체 성분에 기인한 것으로 판단되나, 활성 물질을 명확히 규명하기 위해 활성 다당체의 분리, 정제 및 구조 분석 등의 후속 연구가 필요할 것으로 사료된다.

본 연구진은 미강 내 유용 다당체 추출을 목적으로 미강을 표고버섯 균사체로 발효하여 미강발효물(EFR)을 제조하였다. 본 연구에서는 미강발효물의 면역 활성에 대한 기존 연구를 바탕으로 EFR이 면역 기능에 미치는 영향을 보다 구체적으로 규명하고자 하였다. 실험에는 마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포와 마우스에서 분리한 복강 대식세포 및 비장세포를 사용하였으며, EFR 처리에 따른 면역세포의 증식 및 활성 지표 물질들의 변화를 조사하였다. EFR은 RAW 264.7 세포에서 NO 생성 및 iNOS 발현을 증가시켰으며, IL-6, IL-1β, IL-10, TNF-α와 같은 cytokine의 분비 및 발현을 유도하였다. 또한 복강 대식세포의 lysosomal enzyme 활성을 증가시킬 뿐 아니라 비장세포의 증식도 유도하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과로 미루어볼 때 EFR은 대식세포를 활성화해 면역매개물질의 생성을 촉진하고 면역세포의 증식에 관여함으로써 인체 내 면역반응을 증진시킬 수 있을 것으로 사료된다. 이상의 결과를 통해 EFR은 면역 기능 개선 소재로서의 가능성이 있는 것으로 보이며, 해당 결과는 소재 개발을 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.