Paclitaxel은 주목나무(Taxus brevifloia)의 껍질에서 추출하여 만든 항암제로 유방암, 난소암, 결장암 및 폐암을 치료하는 데 사용되는 항암제이다(Rowinsky와 Donehower, 1993; Gotaskie와 Andreassi, 1994). Paclitaxel은 세포분열 과정에서 미세소관이 분리되는 단계를 저해하여 유사분열에 필요한 방추사의 형성을 억제함으로써 후기 세포분열 과정인 G2/M기에서 세포주기를 정체시킨다(Blagosklonny와 Fojo, 1999). 세포마다 시간의 차이가 있으나 일반적으로 약 20~30분 이상 세포주기가 G2기에서 정체될 경우 세포사멸이 발생하며, 이를 mitotic catastrophe라고 한다. 다른 항암제와 마찬가지로 paclitaxel은 암세포뿐만 아니라 정상세포에서도 강한 독성을 나타내기 때문에 설사, 백혈구 감소증, 호중구 감소증, 빈혈, 탈모 등의 부작용을 유발한다(Rowinsky 등, 1993; Walker, 1993). 이러한 부작용을 감소시키면서 그 약효를 증가시킬 수 있는 항암 보조제에 관한 관심이 증가하면서 플라보노이드를 병용처리하는 항암 요법에 관한 연구가 다양한 관점에서 이루어지고 있다.

Quercetin은 양파, 케일, 브로콜리, 사과, 포도 등에 존재하는 플라보노이드로(Miean과 Mohamed, 2001; Mikkonen 등, 2001; Slimestad 등, 2007), 다른 플라보노이드와 마찬가지로 항산화, 항염증 작용을 가진다. 또한 다양한 연구를 통해 유방암 세포(Choi 등, 2008; Chien 등, 2009; Jeong 등, 2009), 간암 세포(Granado-Serrano 등, 2006; Tanigawa 등, 2008; Tan 등, 2009), 전립선암 세포(Lee 등, 2008), 폐암 세포(Yang 등, 2006), 난소암 세포(Chen 등, 2012; Gao 등, 2012)에서 항암효과가 나타난다는 것이 밝혀졌다. Quercetin을 고농도로 처리했을 때 세포주기의 정체 및 세포사멸이 유도됨으로써 암세포의 성장이 억제된 반면 정상세포에서는 독성을 나타내지 않았다(Son 등, 2004). 그뿐만 아니라 실험동물에 paclitaxel과 quercetin을 병용투여 했을 때 paclitaxel의 흡수율이 증가할 뿐 아니라 체내 반감기도 증가했다(Choi 등, 2004a; 2004b). 이러한 결과는 quercetin이 항암제와 병용투여 되는 보조항암제로서의 가능성이 있음을 시사한다.

Paclitaxel은 전이 발생이 높은 유방암 치료에 널리 사용되는 항암제로, 유방암의 특성에 따라 항암효과가 다르게 나타나며 Her2 양성 유방암에서 가장 높은 항암효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다(Hayes 등, 2007). Her2 양성 유방암은 전체 유방암 환자 중 20~25%를 차지하나 Her2를 표적으로 한 항암요법에 높은 효과를 나타낸다. 이에 반해 Her2 음성 유방암은 전이성 유방암 중 큰 비중을 차지함에도 상대적으로 치료에 사용되는 항암제가 다양하지 않으며 이와 관련된 항암제에 관한 연구도 부족한 실정이다. 따라서 Her2 음성 유방암 치료 시 치료 효과를 높이기 위해 paclitaxel의 투여 농도가 높아짐에 따라 항암제로 인한 부작용 또한 증가할 수밖에 없다(Croom과 Dhillon, 2011). 그러나 Her2 음성 유방암에서 paclitaxel의 항암효과를 증가시키는 연구는 매우 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 Her2 음성 유방암 세포주인 MDA-MB-453에 paclitaxel과 quercetin을 병용처리한 후 세포주기와 세포주기 관련 단백질의 발현을 조사하였다.

세포배양

MDA-MB-453 유방암 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포는 10% FBS(Welgene, Daegu, Korea), 100 unit/mL penicillin(Welgene), 100 μg/mL streptomycin(Welgene)이 함유된 RPMI1640 배지(Welgene)를 사용하여 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

세포 생존율 측정

세포 생존율은 3(4,5-dimethylthiazole-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide assay(MTT, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 통해 측정하였다. 96-well plate에 3,000 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양한 후 paclitaxel과 quercetin을 농도별로 처리하여 12, 24, 48, 72시간 동안 배양하였다. 5 mg/mL 농도로 phosphate-buffered saline(PBS)에 녹인 MTT 용액을 각각의 well에 20 μL 첨가하여 37°C에서 4시간 동안 반응시켰다. 생성된 formazan crystal은 200 μL dimethyl sulfoxide를 분주하여 녹여낸 후 microplate reader(EL800, Bio-TEK Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 540 nm 파장의 흡광도 측정을 통해 세포 생존율을 확인하였다. 세포 생존율은 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

세포주기와 sub-G1 분석

세포주기와 sub-G1은 propidium iodide(PI) 염색을 통해서 측정하였다. 100 mm culture plate에 1×10⁶ cells를 분주한 다음 날 paclitaxel과 quercetin이 포함된 배지로 교체한 후 72시간 동안 배양하였다. 배양한 세포는 trypsin을 처리하여 모은 후 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 세척한 세포는 90% 에탄올로 고정하였으며 분석하기 전까지 -20°C에서 보관하였다. 고정된 세포는 차가운 PBS로 2회 세척한 후에 10 mg/mL 농도로 녹인 PI(Molecular Probes, Sunnyvale, CA, USA) 1 μL와 10 mg/mL 농도로 녹인 RNase A(Sigma) 20 μL가 포함된 500 μL PBS에 현탁하여 37°C에서 30분 동안 반응시켰다. 염색한 세포의 PI 형광은 FACS Calibur instrument(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)로 측정하였으며, FlowJo software(Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA)로 분석하였다.

세포주기 관련 단백질 발현량 측정

60 mm culture plate에 5×10⁵ cells를 분주한 후 72시간 동안 paclitaxel과 quercetin을 처리하였다. 처리한 세포는 200 μL RIPA buffer(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, with 150 mM NaCl, 0.1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 처리하여 단백질을 추출한 후 Bradford protein assay kit Ⅱ(Bio-rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 단백질의 양을 정량하였다. 동량의 단백질을 12% SDS-polyacrylamide gel을 사용하여 전기영동으로 분리한 후 nitrocellulose membrane(0.45 μm)으로 이동시켰다. Membrane은 실온에서 2시간 동안 5% skim milk를 사용하여 blocking 하였다. 1차 항체를 첨가한 후 4°C에서 12시간 이상 반응시킨 후 세척하였다. 세척한 membrane은 실온에서 2시간 동안 2차 항체와 반응시켰으며, ECL advanced detection kit(GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 LAS-3000(Fujifilm, Tokyo, Japan)에서 단백질의 발현을 분석하였다.

통계처리

실험 결과는 평균±표준편차로 표시했으며 통계적 유의성 검증은 SigmaStat(Jandel, San Rafael, CA, USA)을 이용한 Tukey’s multiple comparison test로 하였다. P값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

uercetin이 저농도와 고농도의 paclitaxel에 의해 유도된 세포 생존율에 미치는 효과

Paclitaxel과 quercetin을 12, 24, 48, 72시간 동안 처리한 후 세포 생존율을 조사하였다. 항암제는 세포사멸을 유도하는 효과뿐 아니라 세포 증식을 억제하는 효과도 중요하기 때문에 세포 생존율은 항암효과를 조사하기 위한 기본적인 지표로 사용된다. Paclitaxel은 다양한 암세포에서 세포 증식을 효과적으로 억제하는 것으로 알려져 있으며 24시간 동안 처리했을 때의 IC50값은 Hela 세포에서 2.6 nM, MCF-7 세포에서 2.5 nM, PC-Sh 세포에서 7.5 nM, OVG-1 세포에서 4.0 nM이었다(O’Connor와 Kohn, 1992; Gottesman, 1994; Reed, 1999). 따라서 본 연구에서는 IC50값보다 낮거나 높은 농도인 0.5 nM과 5 nM로 paclitaxel을 처리한 후 세포 생존율을 조사하였다. Paclitaxel을 0.5 nM로 단독처리 했을 때 세포 생존율은 유의적인 차이가 없었으나, 25 μM, 50 μM의 quercetin과 병용처리 했을 때 세포 생존율이 감소했다. Paclitaxel과 quercetin을 72시간 동안 병용처리 했을 때 대조군에 비해 76.2%, 70.3% 수준으로 감소하였다(Fig. 1A). 24, 48, 72시간 동안 5 nM paclitaxel을 단독처리 했을 때 처리 시간이 증가함에 따라 세포 생존율이 유의적으로 감소하였으나 72시간 동안 5 nM paclitaxel과 25 μM quercetin을 병용처리 했을 때 paclitaxel의 효과가 유의적으로 감소하였다(Fig. 1B). 이전 연구를 통해 quercetin이 단기간만 paclitaxel의 항암효과를 억제한다는 것이 밝혀진 바 있다. 고농도의 paclitaxel과 quercetin을 12시간 동안 병용투여 했을 때 quercetin에 의해 paclitaxel의 활성이 억제됨을 세포주기 분석을 통해 확인하였으나, 8일 동안 배양한 경우 paclitaxel을 단독처리한 것에 비해 quercetin과 병용처리 했을 때 콜로니 형성이 유의적으로 감소한다는 연구 결과가 보고된 바 있다(Samuel 등, 2010).

Fig 1. Effects of paclitaxel and quercetin on cell proliferation in MDA-MB-453 cells. Cells were treated with different concentration of paclitaxel [0.5 (A) or 5 nM (B)] and quercetin (25 or 50 μM) for 12, 24, 48, and 72 h. Cell proliferation was determined using the MTT assay. All data are expressed mean±SD (n=4). *P<0.05, **P<0.001 compared to the control group and paclitaxel alone.

Quercetin과 paclitaxel의 병용처리가 세포사멸에 미치는 영향

세포 생존율의 억제는 세포주기 억제 또는 세포자연사멸로 인해 발생한다(King과 Cidlowski, 1995). 세포자연사멸(apoptosis)은 약물이나 외부 자극에 의해 세포가 스스로 사멸되는 과정을 말한다. 항암제는 정상세포가 아닌 암세포에서만 세포자연사멸을 유도하며, 이는 항암제의 효과를 높이는 데 필수적이다(Corcoran 등, 1994; Bremer 등, 2006). 다양한 암세포주에 paclitaxel을 2~20 nM 농도로 처리했을 때 세포자연사멸을 유도한다고 보고되어 있다(Liebmann 등, 1993). Paclitaxel을 저농도인 0.5 nM로 72시간 동안 처리했을 때 세포사멸 시 발생하는 sub-G1이 관찰되지 않았으나, quercetin과 병용처리 했을 때 paclitaxel 단독처리에 비해 sub-G1이 증가했다(Fig. 2A). Paclitaxel을 5 nM로 처리한 경우 저농도로 처리한 것에 비해 sub-G1이 증가한 반면 quercetin과 병용처리한 경우 paclitaxel로 인해 증가한 sub-G1을 감소시켰다(Fig 2C). PARP는 DNA가 복제할 때 발생하는 돌연변이를 복구하는 단백질로, 절단될 경우 활성이 억제되어 세포자연사멸을 유도한다. 실험결과 paclitaxel의 단독처리 및 quercetin과의 병용처리에서 절단된 PARP의 변화는 관찰되지 않았다(Fig. 2B 및 2D). 본 실험을 통해 paclitaxel과 quercetin의 병용처리가 자연 사멸된 세포를 증가시킨 반면 PARP의 활성에는 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있다.

Fig 2. Effects of paclitaxel with quercetin on apoptosis. The cells were treated with different concentration of paclitaxel [0.5 (A and B) or 5 nM (C and D)] and quercetin (25 or 50 μM) for 72 h. Apoptosis was analyzed in the sub-G1 fraction using flow cytometry and measured cleaved PARP by western blotting. All data are expressed mean±SD (n=3). ^*P<0.05, ^**P<0.001 compared to the control and paclitaxel alone groups.

Quercetin과 저농도의 paclitaxel의 병용처리가 세포주기에 미치는 영향

세포 생존율의 감소는 세포주기 억제 및 세포사멸로 인해 유도된다(King과 Cidlowski, 1995). 세포주기는 G1, S, G2, M 단계로 이루어져 있으며(Qu 등, 2003), 주변 영향에 따라 세포주기가 변함으로써 세포 증식이 조절된다. 항암제는 약물의 종류에 따라 G1기 또는 G2/M기에서 세포주기를 정체시킨다고 보고되어 있으며(Pérez-Roger 등, 2000), paclitaxel과 quercetin은 G2/M기에서 세포주기를 억제한다고 보고되었다(Schiff 등, 1979; Choi 등, 2001). 본 연구에서는 항암효과를 나타내지 않는 낮은 농도인 0.5 nM paclitaxel에 quercetin이 미치는 영향을 조사하였다. Quercetin을 단독처리한 경우 정상군의 G2/M기는 20.0%인 반면 25 μM로 처리했을 때 67.7%, 50 μM로 처리했을 때 36.2%로 증가했다(Fig. 3). 이를 통해 quercetin이 G2/M기에서 세포주기를 정체시킴으로써 세포주기를 억제한다는 것을 알 수 있다. 0.5 nM paclitaxel은 세포주기에 영향을 미치지 않은 반면, 25 μM quercetin과 병용처리 했을 때 quercetin의 단독처리와 유사하게 G2/M기에서 세포주기를 정체시켰다(Fig. 3).

Fig 3. Effects of low concentration of paclitaxel with quercetin on the cell cycle population. The cells were treated with paclitaxel (0.5 nM) and quercetin (25 or 50 μM) for 72 h. The cells were stained with propidium iodide and analyzed by flow cytometry. All data are expressed mean±SD (n=4).

세포주기 조절 단백질은 cyclin-dependent kinase(CDK)와 cyclin에 의해 조절된다. CDK는 cyclin과 결합하여 활성화되고, 활성화된 CDK는 세포주기 단계에서 다른 단계로 진행되도록 한다(Pines, 1995). Quercetin과 paclitaxel의 병용처리로 G2/M기에서 세포주기가 정체되었으므로 관련 기전을 살펴보기 위해 G2/M기와 관련된 단백질인 cdc2, cyclin B1, cyclin A의 발현을 조사하였다. Paclitaxel을 0.5 nM 농도로 처리했을 때 인산화된 cdc2와 cyclin B1은 감소하였으나 cyclin A의 발현 변화는 없었다. Quercetin을 단독처리한 경우 인산화된 cdc2, cyclin B1, cyclin A의 발현이 감소하였으며 paclitaxel과 병용처리 했을 때도 감소했다(Fig. 4A). G1기와 관련된 단백질은 CDK4, CDK6, cyclin D, cyclin E가 있다(van den Heuvel, 2005; Suryadinata 등, 2010). Quercetin과 paclitaxel을 단독 또는 병용처리 했을 때 G1기를 조절하는 CDK4, CDK6, cyclin D1, cyclin D3의 발현은 변하지 않았으며, quercetin을 단독 또는 paclitaxel과 병용처리 했을 때만 cyclin E2의 발현이 대조군에 비해 감소했다(Fig. 4B). 본 실험 결과는 quercetin과 paclitaxel을 단독 또는 병용처리로 인해 세포주기 정체가 G2 관련 단백질의 발현 변화로 인한 것임을 시사한다.

Fig 4. Effects of a low concentration of paclitaxel with quercetin on cell cycle-related proteins. The cells were treated with paclitaxel (0.5 nM) and quercetin (25 or 50 μM) for 72 h. Protein expression was measured by western blotting. All data are expressed mean±SD (n=3). ^*P<0.05, ^**P<0.001 compared to the control and paclitaxel alone groups.

Quercetin이 고농도의 paclitaxel에 의해 유도된 세포주기 억제에 미치는 효과

Paclitaxel을 5 nM로 단독처리하거나 quercetin과 병용처리 했을 때 세포주기를 분석했다. Paclitaxel을 5 nM로 처리했을 때 S기와 G2/M기에서 세포주기가 억제되었으며, quercetin과 병용처리 시 G2/M기의 세포 비율이 증가했지만 quercetin의 농도 차이로 인한 변화는 없었다(Fig. 5). 또한 세포주기와 관련된 단백질의 발현을 살펴본 결과 paclitaxel의 단독처리는 cdc2의 인산화와 cyclin B1의 발현에 영향을 미치지 않았으나, quercetin과 병용처리 했을 때 인산화된 cdc2가 유의적으로 감소했으며 cyclin B1의 발현 또한 감소했다. 반면 cyclin A는 paclitaxel의 단독처리에서도 감소했으며 quercetin과 병용처리 시 더욱 감소함이 관찰되었다(Fig. 6A). 반면 G1기와 관련된 단백질인 CDK4, CDK6, cyclin D1, cyclin D3의 발현은 paclitaxel의 단독처리 또는 quercetin과의 병용처리 시 대조군과 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 본 실험을 통하여 quercetin의 처리는 G2/M기에서 세포주기의 억제를 유도하며, 이러한 효과는 항암제인 paclitaxel의 세포주기 억제 효과를 더욱 강화하는 것을 알 수 있었다. 그러나 quercetin이 고농도의 paclitaxel로 인해 유도된 세포사멸 효과를 억제하기 때문에 이 부분에 관한 연구가 차후에 이루어져야 할 것이다.

Fig 5. Effects of a high concentration of paclitaxel with quercetin on the cell cycle population. Cells were treated with paclitaxel (5 nM) and quercetin (25 or 50 μM) for 72 h. Then, the cells were stained with propidium iodide and analyzed by flow cytometry. All data are expressed mean± SD (n=4).

Fig 6. Effects of a low concentration of paclitaxel with quercetin on cell cycle-related proteins. Cells were treated with paclitaxel (5 nM) and quercetin (25 or 50 μM) for 72 h. Protein expression was measured by western blotting. All data are expressed mean±SD (n=3). ^*P<0.05, ^**P<0.001 compared to the control and paclitaxel alone groups.

Paclitaxel은 높은 항암효과를 나타내는 항암제이나 암세포뿐 아니라 정상세포에서도 세포독성을 나타낸다. 따라서 부작용을 줄이기 위해 플라보노이드와 같은 천연물의 병용투여를 통해 paclitaxel의 농도를 줄이면서 항암효과를 높이는 연구가 지속해서 진행되고 있다. 본 연구에서는 유방암 세포주인 MDA-MB-453 세포에 저농도와 고농도의 paclitaxel과 플라보노이드인 quercetin을 병용처리한 후 세포 증식, 세포사멸, 세포주기를 분석하였다. Quercetin은 저농도의 paclitaxel의 세포 증식 억제 효과와 세포사멸을 더욱 증가시켰으나, 고농도의 paclitaxel에서는 quercetin이 paclitaxel로 인한 세포사멸을 감소시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 이는 고농도의 paclitaxel로 인해 증가한 활성산소로 인해 세포사멸이 발생하나, 강력한 항산화제인 quercetin이 활성산소를 소거하기 때문이라고 유추할 수 있다. 세포 증식은 세포주기와 밀접한 관련이 있으므로 세포주기를 분석한 결과 quercetin과 paclitaxel을 병용처리 했을 때 palitaxel의 농도에 상관없이 G2/M기에서 세포주기를 억제한다. 세포주기의 억제는 G2/M기와 관련된 단백질인 cdc2, cyclin B, cyclin A 발현 억제로 인한 것으로 확인된다. 본 연구 결과는 paclitaxel과 quercetin의 병용처리는 암세포에서 세포주기 관련 단백질의 조절을 통해 세포주기를 억제함으로써 paclitaxel의 항암효과를 증가시킬 수 있다는 것을 시사한다.

이 논문은 2014년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임(NRF-2014R1A6A1029617).