급속한 경제 성장과 의료기술의 발달로 고령사회로 진입한 우리나라는 건강에 관한 관심이 급증하고 있다. 특히 건강에 관한 관심이 기존의 건강을 위협하는 질병을 치료하는 것에서 삶의 질을 향상시키기 위한 것으로 변화하고 있으며, 갱년기 증상 개선에 관한 요구도 이런 맥락에서 증가하고 있다.

갱년기 증상은 노화로 인한 성호르몬의 감소로 나타나는 여러 신체적 정신적 증상이다. 일반적으로 갱년기 증상은 폐경으로 인한 여성호르몬 감소로 중년 여성에게만 나타나는 건강 문제로 인식되고 있었다. 그러나 남성들도 남성 호르몬의 감소로 여성 갱년기와 유사한 임상적인 증상이 나타나며 이런 증상들이 여성과는 달리 천천히 나타나는데, 이를 인식하지 못하고 방치하는 경우 노화 및 다양한 질환의 진행을 촉진할 수 있어 갱년기 증상이 남성에게도 중요한 건강 문제로 인식되고 있다(Hofer, 2011; Singh, 2013).

테스토스테론 결핍 증후군(testosterone deficiency syndrome)이라고 불리기도 하는 남성갱년기의 주된 원인은 노화와 생활환경 및 사회적인 스트레스에 의한 남성 호르몬인 테스토스테론의 감소이며, 주된 증상으로는 성욕 감소, 발기부전, 지적 활동 및 인지기능 저하, 우울, 피로 및 성급함을 수반하는 기분의 변화, 수면장애, 근육량 및 근력 감소, 체모 감소, 피부 변화, 골밀도 감소와 이에 따른 골다공증과 골절 위험성 증가 등이 있다(Han 등, 2002; Staerman과 Léon, 2012; Singh, 2013). 남성갱년기 증상을 치료하기 위해 부족한 테스토스테론을 보충하는 호르몬 보충 요법이 활용되고 있으나, 장기간 호르몬 보충에 따른 다양한 부작용이 보고되고 있어(Calof 등, 2005; Bhasin 등, 2010; Cunningham, 2013; Grech 등, 2014) 우수한 개선 효과를 나타내면서 안전하게 사용될 수 있는 남성갱년기 개선 소재 개발이 요구되고 있다. 예로부터 민간요법이나 한방에서 안전하게 섭취되어 온 천연물은 안전한 남성갱년기 개선 소재가 될 수 있으며, 이를 활용한 연구가 다방면으로 수행되고 있다(Jeong 등, 2017; Kim 등, 2015; 2018; Lee 등, 2016; Mo, 2019; Park 등, 2019; Sung 등, 2016).

통캇알리(Eurycoma longofolia)는 말레이시아와 인도네시아 등의 동남아시아에 널리 분포하는 소태나무과(Simaroubaceae)에 속하는 관목으로, 그 뿌리와 껍질은 민간에서 오랫동안 정력증진, 스트레스 해소 및 말라리아열 치료를 위해 사용되어 왔다. 통캇알리 뿌리는 peptides, alkaloids, quassinoids, diterpenoids, eurycomacoside, eurycolactone, laurycolactone 및 eurycomalactone 등 다양한 생리활성 물질을 함유하고 있으며(Ang 등, 2002; Bedir 등, 2003; Rehman 등, 2016), 정자 형성 및 운동능 증진(Low 등, 2013), 항말라리아(Low 등, 2011), 항박테리아(Farouk와 Benafri, 2007), 항암(Thu 등, 2018), 항염(Dang 등, 2016), 항우울(Talbott 등, 2013) 및 안드로겐 결핍에 의한 골다공증 개선(Shuid 등, 2012) 효과가 있는 것이 보고되었다. 또한 통캇알리는 동물과 인체 실험에서 혈중 테스토스테론 수준을 증가시키는 phytoandrogenic 활성을 나타내었고(Chinnappan 등, 2021; George와 Henkel, 2014; Mokhtar 등, 2017; Talbott 등, 2013), 이는 테스토스테론 감소에 의한 남성갱년기 증상을 개선할 수 있음을 제시하고 있다. 그러나 현재까지 통캇알리의 phytoandrogenic 활성 기전에 관해 연구된 바가 없어, 통캇알리를 테스토스테론 보충 요법 대체 천연물로 활용하기 위해서는 기전을 밝히는 연구가 필요하다.

생체에서 테스토스테론은 정소의 사이질 세포(interstitial cells)인 Leydig 세포에서 콜레스테롤을 원료로 하여 여러 스테로이드호르몬 생성 단계를 거쳐 세포 내 미토콘드리아에서 생성되므로(Payne과 Hales, 2004), 테스토스테론 수준을 증가시킴으로써 남성갱년기 개선 효능과 그 기전을 평가하기 위해 생쥐에서 유래한 Leydig 세포인 TM3를 사용하였다(Engeli 등, 2018; Kim 등, 2015; 2018; Lee 등, 2016; Sung 등, 2016). 또한 남성갱년기에 의한 테스토스테론 수준 감소를 유도하기 위해 TM3 세포에 H2O2로 산화스트레스를 유도하여 천연물의 남성갱년기에 미치는 영향을 연구하였다(Kim 등, 2015; 2018; Lee 등, 2016).

본 연구에서는 H2O2로 산화스트레스를 유도한 TM3 세포에 통캇알리 추출물이 테스토스테론 수준과 테스토스테론의 생성과 분해에 관여하는 효소의 발현을 조사하여 통캇알리 추출물의 남성갱년기 증상 개선 가능성을 조사하고자 하였다.

시료 및 재료

본 연구에서는 통캇알리 뿌리를 물로 추출하여 제조한 표준화된 통캇알리 추출물(Physta^®, Biotropics Malaysia Berhad, Shah Alam, Malalysia)을 시험물질로 사용하였으며, 이 통캇알리 추출물은 기능 성분인 eurycomanone을 0.8~1.5% 함유하고 있다(Mokhtar 등, 2017). 5α-Reductase 억제제인 finasteride(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 양성 대조물질로 사용하였다.

TM3 세포는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입해 사용하였다. 세포배양에 사용한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin 등은 Welgene Inc.(Gyeongsan, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)는 Sigma-Aldrich Co.에서, HyperScript^TM RT master mix kit은 GeneAll Biotechnology (Seoul, Korea)에서, RNeasy^® Plus Mini kit과 Rotor-Gene^TM SYBR Green kit은 Qiagen(Valencia, CA, USA)에서 구입해 사용하였다. 테스토스테론, 3β-hydroxysteroid dehydrogenase(3β-HSD), 17-α-hydroxylase(CYP17A1), aromatase 측정용 enzyme-linked immunosorben assay(ELISA) kit은 MyBio Source(San Diego, CA, USA)에서 구입하였고 5α-reductase ELISA kit은 LSBio(Seattle, WA, USA)에서 구입하여 사용하였다. BCA protein assay kit은 Thermo Scientific(Rockford, IL, USA)에서, LuminataTM Forte Western HRP Substrate는 Millipore Corporation(Billerica, MA, USA)에서, steroidogenic acute regulatory protein(StAR) 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

세포배양 및 산화스트레스 유도

TM3 세포는 DMEM 배지에 10%(v/v) FBS, 100,000 units/L penicillin 및 100 mg/L streptomycin을 첨가한 세포배양액을 사용하여 37°C 습윤한 CO₂ 배양기(5% CO₂/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양접시의 80% 정도 찼을 때 phosphate buffer saline(pH 7.4)으로 세포 단층을 씻어낸 후 0.25% trypsin-2.65 mM EDTA를 처리하여 세포를 계대 배양하였고, 세포배양액은 2일마다 교환하였다.

TM3 세포에 산화스트레스를 유도하기 위해 세포를 일정한 수로 분주하여 24시간 배양한 후 FBS가 함유되지 않은 serum-free DMEM에 50 μM H₂O₂를 첨가한 세포배양액으로 교환하여 세포를 배양하였다.

세포 생존율 측정

TM3 세포를 10% FBS를 함유한 세포배양액으로 희석하여 5×10⁴ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하여 24시간 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 통캇알리 추출물을 다양한 농도(0~400 μg/mL)로 함유한 세포배양액으로 교환하여 세포를 24시간 배양한 후 MTT assay 방법(Denizot과 Lang, 1986)으로 세포 생존율을 측정하였다.

산화스트레스 조건에서 통캇알리 추출물이 TM3 세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 조사하기 위해 세포를 10% FBS를 함유한 세포배양액으로 희석하여 5×10⁴ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하여 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 50 μM H₂O₂를 함유한 serum-free DMEM으로 세포배양액을 교환하여 세포를 4시간 배양하였고, 이후 지속적인 산화스트레스를 유도하기 위해 50 μM H₂O₂와 다양한 농도의 통캇알리 추출물을 함유한 serum-free DMEM으로 세포배양액을 교환하여 세포를 20시간 배양하고 MTT assay 방법(Denizot과 Lang, 1986)으로 세포 생존율을 측정하였다.

테스토스테론 수준 측정

TM3 세포를 1×10⁵ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하여 24시간 배양하였다. 이후 50 μM H₂O₂를 함유한 serum-free DMEM으로 세포배양액을 교환하여 세포를 4시간 배양하고, 지속적인 산화스트레스를 유도하기 위해 50 μM H₂O₂와 다양한 농도의 통캇알리 추출물을 함유한 serum-free DMEM으로 세포배양액을 교환하여 세포를 20시간 배양한 후 세포배양액을 수거하여 5,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 취하였다. 세포배양액 내의 테스토스테론 함량은 testosterone ELISA kit을 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다.

테스토스테론의 생성 및 분해 관련 효소 함량 측정

TM3 세포를 1×10⁵ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주한 후 위와 동일한 방법으로 H₂O₂와 통캇알리 추출물을 처리하여 세포를 배양한 뒤 세포배양액을 수거하였다. 세포배양액 내의 3β-HSD, CYP17A1, 5α-reductase 및 aromatase 함량은 각각의 ELISA kit을 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다.

Western blot에 의한 단백질 발현 측정

TM3 세포를 1×10⁶ cells/dish가 되도록 100 mm dish에 분주한 후 위와 동일한 방법으로 H₂O₂와 통캇알리 추출물을 처리하여 세포를 배양하였고 세포를 수거하여 Kim 등(2022)의 방법으로 total cell lysates를 만들었다. Total cell lysates의 단백질 함량은 BCA protein assay kit을 사용하여 측정하였다. Western blot analysis는 Kim 등(2022)이 제시한 방법에 따라 수행하였다. 각 단백질 밴드는 Luminata^TM Forte Western HRP Substrate를 사용하여 enhanced chemiluminescence 방법으로 가시화하였다. 각 단백질 밴드의 강도는 ImageQuant^TM LAS 500 imaging system(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden)을 사용하여 정량 분석하였다.

Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)에 의한 mRNA 발현 측정

TM3 세포를 1×10⁵ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주한 후 위와 동일한 방법으로 H₂O₂와 통캇알리 추출물을 처리하여 세포를 배양하였다. 세포를 수거하여 RNeasy^® Plus Mini kit을 사용하여 제조사가 제시한 방법에 따라 total RNA를 추출하였다. Total RNA의 함량과 순도는 micro-volume spectrophotometer(BioSpec-nano, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 측정하였고, OD260/280 값이 1.8 이상인 total RNA를 RT-PCR에 사용하였다. Total RNA(2 μg)로부터 HyperScript^TM RT master mix kit을 사용하여 complementary DNA를 얻은 후 Rotor-Gene^TM SYBR Green kit을 사용하여 Rotor-Gene 3000(Corbett Research, Mortlake, Australia)에서 real-time PCR을 수행하였다. 실험에 사용한 primers sequences는 Table 1에 나타내었다. 유전자 발현의 정량분석은 Rotor-Gene 6000 series System Software program, version 6(Corbett Research)을 이용하여 수행했으며 타겟 유전자의 mRNA 발현 수준은 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) mRNA 발현량으로 보정하여 나타내었다.

Table 1 . Primer sequences used in this study.

Target gene	Forward primer	Reverse primer (5′‒3′)	Genebank No.
3β-HSD	5′-ATGGCCACGAGGAACAGAATCATG-3′	5′-CTGTCCTTGGATGCTTGTAGACTTC-3′	NM_008293
5α-Reductase	5′-TTGGACCTCCGGGGAATGTG-3′	5′-GGCTGGAACAGACCAAGTGG-3′	NM_053188.3
CYP17A1	5′-AGCTCTGTGCTGAACTGGATCC-3′	5′-AGACGGTGTTCGACTGAAGCCT-3′	XM_021216765.2
Aromatase	5′-CTCCTCCTGATTCGGAATTGT-3′	5′-TCTGCCATGGGAAATGAGAG-3′	XM_021208009.1
StAR	5′-TTGGGCATACTCAACAACCA-3′	5′-GAAACACCTTGCCCACATCT-3′	NM_011485.5
GAPDH	5′-TGGGTGTGAACCATGAGAAG-3′	5′-GCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3′	NM_008084.3

3β-HSD, 3β-hydroxysteroid dehydrogenase; CYP17A1, 17-α-hydroxylase; StAR, steroidogenic acute regulatory protein; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase..

통계처리

모든 결과는 mean±SE로 나타내었다. 수집된 결과는 Statistical Analysis System(SAS) Window version 9.4(SAS Institute, Cary, NC, USA)를 이용하여 통계 분석하였다. 각 시험군 간의 유의성 검증은 Student’s t-test 또는 분산분석(analysis of variance, ANOVA)으로 분석하였고, 시험군 간의 다중 비교는 Duncan’s multiple range test로 분석하였다. P<0.05일 때 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

통캇알리 추출물이 TM3 세포의 세포 생존율에 미치는 영향

통캇알리 추출물의 Leydig 세포인 TM3 세포의 세포독성을 조사하기 위해 다양한 농도(0~400 μg/mL)의 통캇알리 추출물을 처리하여 세포를 24시간 배양한 후 세포 생존율을 측정하였다. 통캇알리 추출물을 10, 25, 50 및 100 μg/mL 농도로 처리한 경우 TM3 세포의 세포 생존율은 대조군(0 μg/mL)과 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, 통캇알리 추출물을 200과 400 μg/mL 농도로 처리한 경우 대조군과 비교하여 세포 생존율이 유의적으로 감소하였다(Fig. 1A). 통캇알리 추출물은 200 μg/mL 이상의 농도에서 TM3 세포에 세포독성을 나타내고 100 μg/mL 이하의 농도에서는 세포독성이 없음을 나타내며, 이를 근거로 이후 진행되는 모든 시험은 세포독성의 효과를 배제하기 위해 100 μg/mL 농도 이하로 수행하였다.

Fig 1. Effect of Eurycoma longifolia extract (ELE) on the cell viability in TM3 cells. (A) TM3 cells were plated at a density of 5×10⁴ cells/well in 24-well plates with DMEM supplemented with 10% FBS. After 24 h, cells were treated with various concentration of ELE and incubated for 24 h. (B) TM3 cells were plated at a density of 5×10⁴ cells/well in 24-well plates with DMEM supplemented with 10% FBS. After 24 h, cell monolayers were rinsed with serum-free DMEM and incubated for 4 h in serum-free DMEM containing 50 μM H₂O₂. And then the cells were treated various concentration of ELE in serum-free DMEM containing 50 μM H₂O₂ for an additional 20 h. Finasteride (F, 3 μM) was used as positive control and treated in cells in the same way as ELE. At the end of the treatment period, cell viability was measured by the MTT assay. Each bar represents the mean±SEM. ^***P<0.001 significantly different from H₂O₂-untreated group. Mean without a common letter differ significantly at P<0.05.

산화스트레스 조건에서 통캇알리 추출물이 TM3 세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 조사하기 위해 세포에 50 μM H₂O₂를 4시간 처리한 후 다양한 농도(10, 25, 50, 100 μg/mL)의 통캇알리 추출물을 처리하여 20시간 추가 배양한 다음 세포 생존율을 측정하였다. H₂O₂를 처리한 경우는 H₂O₂를 처리하지 않은 군에 비해 17.8% 세포 생존율이 감소하였다. H₂O₂ 처리에 의해 유의적으로 감소한 세포 생존율은 통캇알리 추출물 처리에 의해 유의적인 변화를 나타내지 않았다. 반면 본 실험에서 양성 대조물질로 사용한 finasteride를 3 μM 농도로 처리한 경우는 H₂O₂ 처리에 의해 감소한 세포 생존율이 유의적으로 증가하였다(Fig. 1B).

통캇알리 추출물이 테스토스테론 수준에 미치는 영향

산화스트레스 조건에서 통캇알리 추출물이 TM3 세포의 테스토스테론 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해 세포에 50 μM H₂O₂를 4시간 처리하고 통캇알리 추출물을 처리하여 20시간 추가 배양한 후 세포배양액을 수거하여 테스토스테론 함량을 측정하였다. Fig. 2에 나타난 바와 같이 H₂O₂를 처리하지 않은 군과 H₂O₂를 처리한 군의 테스토스테론 함량은 각각 2.21±0.07 ng/mL와 1.63±0.04 ng/mL로 나타났으며, H₂O₂를 처리하여 산화스트레스를 유도한 경우는 TM3 세포의 테스토스테론 수준이 현저히 감소함을 나타낸다. H₂O₂ 처리로 감소한 테스토스테론 함량은 통캇알리 추출물 처리에 의해 유의적으로 증가하였다. 통캇알리 추출물을 10, 25, 50 및 100 μg/mL 농도로 처리한 경우는 H₂O₂만을 처리한 군보다 각각 1.10배, 1.15배, 1.16배 및 1.16배 테스토스테론 함량이 증가했으며 통캇알리 추출물 처리 농도 간에 유의적인 차이를 나타내지는 않았다. Finasteride(3 μM) 처리군의 테스토스테론 함량은 1.92±0.06 ng/mL로 H₂O₂만을 처리한 군에 비해 유의적으로 증가하였다.

Fig 2. Effect of Eurycoma longifolia extract (ELE) on testosterone levels in TM3 cells oxidative stressed with H₂O₂. TM3 cells were plated at a density of 1×10⁵ cells/well in 24-well plates and treated with H₂O₂, ELE, and finasteride (F, 3 μM) as described in Fig. 1B. The 20 h-conditioned media were collected. The contents of testosterone in 20 h-conditioned media were measured. Each bar represents the mean±SEM. ^***P<0.001 significantly different from H₂O₂-untreated group. Mean without a common letter differ significantly at P<0.05.

통캇알리 추출물이 테스토스테론 생성 및 분해 관련 효소의 생성에 미치는 영향

통캇알리 추출물의 테스토스테론 수준 증가 기전을 조사하기 위해 테스토스테론의 생성과 분해에 작용하는 효소의 함량을 측정하였고 그 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 테스토스테론 생성 과정에 작용하는 효소인 3β-HSD와 CYP17A1 함량은 H₂O₂ 처리에 의해 각각 20.6%와 50.9% 감소하였다. H₂O₂ 처리로 감소한 3β-HSD 함량은 10, 25, 50 및 100 μg/mL 통캇알리 추출물 처리에 의해 유의적으로 증가하였고, H₂O₂ 처리로 감소한 CYP17A1 함량은 25, 50 및 100 μg/mL 통캇알리 추출물 처리에 의해 유의적으로 증가하였으며, 통캇알리 추출물 처리 농도 간에 유의적인 차이를 나타내지는 않았다. Finasteride(3 μM) 처리는 H₂O₂ 처리로 감소한 3β-HSD와 CYP17A1 함량을 유의적으로 증가시켰다. 테스토스테론 분해 과정에 작용하는 효소인 5α-reductase와 aromatase 함량은 H₂O₂ 처리에 의해 유의적으로 증가하였다. H₂O₂ 처리로 증가한 5α-reductase 함량은 10, 25, 50 및 100 μg/mL 통캇알리 추출물 처리에 의해 유의적으로 감소하였다. 또한 H₂O₂ 처리로 증가한 aromatase 함량은 25, 50 및 100 μg/mL 통캇알리 추출물 처리에 의해 유의적으로 감소하였다. H₂O₂ 처리로 증가한 5α-reductase와 aromatase 함량은 3 μM finasteride 처리에 의해 유의적으로 감소하였으며, finasteride 처리에 의한 5α-reductase와 aromatase 함량 감소는 통캇알리 추출물 처리와 동일한 수준으로 나타났다.

Fig 3. Effect of Eurycoma longifolia extract (ELE) on the levels of testosterone-related enzymes in TM3 cells oxidative stressed with H₂O₂. TM3 cells were plated at a density of 1×10⁵ cells/well in 24-well plates and treated with H₂O₂, ELE, and finasteride (F, 3 μM) as described in Fig. 1B. The 20 h-conditioned media were collected. The contents of 3β-HSD (A), CYP17A (B), 5α-reductase (C), and aromatase (D) in 20 h-conditioned media were measured. Each bar represents the mean±SEM. ^*P<0.05, ^**P<0.01 significantly different from H₂O₂-untreated group. Mean without a common letter differ significantly at P<0.05.

통캇알리 추출물이 테스토스테론 생성 및 분해 관련 효소의 mRNA 발현에 미치는 영향

통캇알리 추출물이 테스토스테론의 생성과 분해에 작용하는 효소의 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 H₂O₂와 다양한 농도의 통캇알리 추출물을 처리하여 TM3 세포를 배양한 후 total RNA를 추출하였고 이를 사용하여 real-time RT-PCR을 수행하였다. 3β-HSD와 CYP17A1 mRNA 발현은 H₂O₂를 처리하지 않은 군에 비해 H₂O₂를 처리한 군에서 유의적으로 감소하였다. H₂O₂ 처리로 감소한 3β-HSD와 CYP17A1 mRNA 발현은 25, 50 및 100 μg/mL 통캇알리 추출물 처리에 의해 유의적으로 증가하였다. 5α-reductase mRNA 발현은 H₂O₂를 처리하지 않은 군에 비해 H₂O₂를 처리한 군에서 유의적으로 증가하였고, 이는 50 및 100 μg/mL 통캇알리 추출물 처리에 의해 유의적으로 감소하였다. 5α-reductase mRNA 발현과 마찬가지로 aromatase mRNA 발현도 H₂O₂ 처리에 의해 유의적으로 증가하였고, H₂O₂ 처리로 증가한 aromatase mRNA 발현은 25, 50 및 100 μg/mL 통캇알리 추출물 처리에 의해 유의적으로 감소하였다. Finasteride(3 μM) 처리는 H₂O₂ 처리로 증가한 5α-reductase와 aromatase mRNA 발현을 유의적으로 감소하였다(Fig. 4).

Fig 4. Effect of Eurycoma longifolia extract (ELE) on mRNA expressions of testosterone-related genes in TM3 cells oxidative stressed with H₂O₂. TM3 cells were plated at a density of 1×10⁵ cells/well in 24-well plates and treated with H₂O₂, ELE, and finasteride (F, 3 μM) as described in Fig. 1B. The total RNA in TM3 cells was extracted, reverse transcribed, and real-time PCR was conducted. The expression of each 3β-HSD (A), CYP17A (B), 5α-reductase (C), and aromatase (D) mRNA was normalized to those of GAPDH mRNA and represented relative to H₂O₂-untreated group. Each bar represents the mean±SEM. ^*P<0.05, ^***P<0.001 significantly different from H₂O₂-untreated group. Mean without a common letter differ significantly at P<0.05.

통캇알리 추출물이 StAR 발현에 미치는 영향

테스토스테론의 기질인 콜레스테롤을 미토콘드리아 내로 운반하는 운반체로 테스토스테론 생성을 조절하는 StAR의 발현에 통캇알리 추출물이 미치는 영향을 조사하여 Fig. 5에 나타내었다. H₂O₂를 처리한 경우는 StAR 단백질과 mRNA 발현이 현저히 감소하였다. H₂O₂ 처리로 감소한 StAR 단백질과 mRNA 발현은 10, 25, 50 및 100 μg/mL 통캇알리 추출물 처리에 의해 유의적으로 증가하였다. Finasteride(3 μM)를 처리한 경우는 H₂O₂만을 처리한 군에 비해 StAR 단백질과 mRNA 발현이 현저히 증가하였다.

Fig 5. Effect of Eurycoma longifolia extract (ELE) on StAR expressions in TM3 cells oxidative stressed with H₂O₂. (A) TM3 cells were plated at a density of 1×10⁶ cells/dish in 100 mm dishes and treated with H₂O₂, ELE, and finasteride (F, 3 μM) as described in Fig. 1B. The total lysates were prepared and subjected to western blotting with StAR antibody. Photographs of chemiluminescent detection of blots, which are representative of 4 independent experiments, are shown. (B) Quantitative analysis of the blots. The relative abundance of each band to its own β-actin was quantified, and the control levels were set at 100. (C) TM3 cells were plated at a density of 1×10⁵ cells/well in 24-well plates and treated with H₂O₂, ELE, and finasteride (F, 3 μM) as described in Fig. 1B. The total RNA in TM3 cells was extracted, reverse transcribed, and real-time PCR was conducted. The expression of StAR mRNA was normalized to those of GAPDH mRNA and represented relative to H₂O₂-untreated group. Each bar represents the mean±SEM. ^***P<0.001 significantly different from H₂O₂-untreated group. Mean without a common letter differ significantly at P<0.05.

천연물을 활용하여 건강기능식품을 개발하기 위해서는 안전성이 최우선으로 되어야 한다. 통캇알리는 동남아시아에서 민간요법으로 오랫동안 사용되어 오고 있는 천연물 중의 하나이다. 다양한 통캇알리 추출물 및 이를 사용한 제품들이 통용되고 있으나 안전성에 대한 과학적인 근거는 미흡한 실정이다. 본 연구에서 사용한 통캇알리 추출물(Physta^®)은 통캇알리 뿌리를 물 추출한 표준화된 추출물로 Wistar rat에서 실시한 급성, 아급성 및 90일 만성 독성시험에서 독성을 나타내지 않았고, 경구로 투여 시 부작용이 관찰되지 않은 최대량(No observed adverse effect level)은 1,000 mg/kg body weight(BW) 이상으로 나타났다(Choudhary 등, 2012).

또한 인체적용시험에서 통캇알리 추출물을 200 mg/kg BW 용량으로 1개월 경구 투여한 경우(Tambi 등, 2012)와 400 mg/kg BW 용량으로 5주간 경구 투여한 경우(Henkel 등, 2014) 독성이나 부작용을 나타내지 않았다. 이는 본 연구에서 사용한 통캇알리 추출물이 안전성을 확보한 건강기능식품 소재가 될 수 있음을 제시한다.

통캇알리는 다양한 생리활성 물질을 함유하고 있으며(Ang 등, 2002; Bedir 등, 2003; Rehman 등, 2016), 본 연구에 사용한 통캇알리 추출물은 quassinoids 일종인 eurycomanone을 0.8~1.5% 함유하고 있다(Mokhtar 등, 2017). Ahmad 등(2018)은 설치류에서 통캇알리 추출물 내 eurycomanone의 반감기는 0.30시간이고 흰쥐와 생쥐에서 생체이용률은 각각 11.8%, 54.9%이며, eurycomanone은 생체막을 통해 흡수가 쉽지는 않으나, 일단 흡수되면 쉽게 대사되지 않고 안정되게 유지되어 다양한 생리활성 효과를 발휘한다고 보고하였다. Phytoandrogenic 활성은 통캇알리 추출물이 나타내는 대표적인 생리활성 중의 하나이다(Chinnappan 등, 2021; George와 Henkel, 2014; Mokhtar 등, 2017; Talbott 등, 2013). 최근에 Mokhtar 등(2017)은 SD rat에 통캇알리 추출물(15 mg/kg BW/day)을 투여한 경우 6주 이후부터 혈청 테스토스테론이 유의적으로 증가하였다고 보고하였으며, Chinnappan 등(2021)은 50~70세의 중년 남성을 대상으로 한

인체적용시험에서 통캇알리 추출물을 투여(200 mg/day)한 경우는 2주 이후부터 혈청 테스토스테론 수준이 증가하고 피로가 감소하며 삶의 질이 개선되었다고 보고하였다. 그러나 현재까지 통캇알리 추출물이 어떤 작용 기전을 통해 테스토스테론 수준을 증가하는지에 대해 밝혀진 바가 없다. 본 연구에서는 TM3 세포에서 통캇알리 추출물이 테스토스테론 수준에 미치는 영향과 그 작용 기전을 조사하고자 하였다.

TM3 세포는 생쥐에서 유래한 Leydig 세포로 테스토스테론 생성 조절을 통한 남성갱년기 개선 효능 연구에 널리 사용되고 있다(Engeli 등, 2018; Kim 등, 2015; 2018; Lee 등, 2016; Sung 등, 2016). 먼저 TM3 세포에서 통캇알리 추출물의 세포독성을 조사하였고 100 μg/mL 이하 농도에서 세포독성이 관찰되지 않아(Fig. 1A) 이후 시험에서는 세포독성의 효과를 배제하기 위해 100 μg/mL 농도 이하로 수행하였다. In vitro 체계에서 남성갱년기의 주요한 원인 중의 하나인 산화스트레스를 유도하기 위해 TM3 세포에 H₂O₂를 처리하여 산화스트레스를 유도한 몇몇 연구(Kim 등, 2015; 2018; Lee 등, 2016)와 같이 본 연구에서도 TM3 세포에 50 μM H₂O₂를 처리하여 산화스트레스를 유도하였다. TM3 세포에 50 μM H₂O₂를 24시간 처리한 경우 세포 생존율이 17.8% 감소하였고 이는 50 μM H₂O₂에 의해 TM3 세포에 산화스트레스가 유도됨을 간접적으로 나타낸다. 산화스트레스 조건에서 통캇알리 추출물은 TM3 세포의 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다(Fig. 1B). 이는 TM3 세포에 미치는 통캇알리 추출물의 영향이 단지 산화스트레스에 의한 세포사 보호에 의한 것이 아님을 나타낸다.

노화나 스트레스에 의한 테스토스테론 감소가 남성갱년기 증상의 주요한 원인이므로 테스토스테론 증가가 남성갱년기 증상 개선의 중요한 타겟이다(Han 등, 2002; Staerman과 Léon, 2012; Singh, 2013). H₂O₂로 산화스트레스를 유도한 경우 동물(Noh 등, 2012)과 TM3 세포(Kim 등, 2015; 2018; Lee 등, 2016)에서 테스토스테론 수준이 감소하였다. 타 연구에서와 같은 경향으로 TM3 세포에 50 μM H₂O₂를 24시간 처리한 경우 테스토스테론 수준이 현저히 감소하였다(Fig. 2). 통캇알리 추출물은 H₂O₂로 산화스트레스를 유도한 조건에서 테스토스테론 수준을 유의적으로 증가하였다. 5α-Reductase의 선택적 억제제로 테스토스테론의 dihydrotestosterone으로의 전환을 감소하여 테스토스테론 수준을 증가하는 finasteride를 양성 대조물질로 사용하였다(Roehrborn 등, 2003). 통캇알리 추출물(10, 25, 50, 100 μg/mL)의 테스토스테론 수준 증가 정도는 양성 대조물질인 finasteride(3 μM)와 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이는 통캇알리 추출물이 산화스트레스 조건에서 매우 효과적으로 테스토스테론 수준을 증가함을 나타내며, 테스토스테론 감소에 의한 남성갱년기 증상 개선 가능성을 제시한다.

테스토스테론은 황체형성호르몬의 조절에 의해 정소의 Leydig 세포에서 콜레스테롤을 기질로 하여 다양한 효소가 관여하는 스테로이드호르몬 생성 단계를 거쳐 생합성되어 혈액으로 방출된다(Miller, 1988; Payne과 Hales, 2004). 황체형성호르몬이 수용체에 결합하면 adenylyl cyclase가 활성화되어 cAMP와 cAMP-dependent protein kinase 생성이 증가해 StAR을 활성화한다(Beattie 등, 2015). StAR은 콜레스테롤을 미토콘드리아 외막에서 내막으로 이동시키는 콜레스테롤 운반체로 스테로이드호르몬 생성 속도를 조절한다(Christenson과 Strauss Ⅲ, 2001). StAR에 의해 미토콘드리아 내막으로 유입된 콜레스테롤은 cytochrome P450 cholesterol side-chain cleavage enzyme에 의해 pregnenolone으로 전환되고, pregnenolone은 3β-HSD에 의해 progesterone으로 전환되고, CYP17A1 및 17β-HSD에 의해 테스토스테론이 생성된다(Beattie 등, 2015; Wang 등, 2017; Zhong 등, 2013). 통캇알리 추출물의 테스토스테론 수준 증가 기전을 조사하기 위해 통캇알리 추출물이 미토콘드리아로의 콜레스테롤 이동에 관여하는 StAR과 생합성에 관여하는 효소인 3β-HSD와 CYP17A1에 미치는 영향을 조사하였다. H₂O₂ 처리로 현저히 감소한 StAR, 3β-HSD 및 CYP17A1의 mRNA 발현과 단백질 발현이 통캇알리 추출물 처리에 의해 유의적으로 증가함을 관찰하였다(Fig. 3A,B, Fig. 4A,B, Fig 5). 이는 산화스트레스 조건에서 통캇알리 추출물이 콜레스테롤 이동에 관여하는 StAR과 테스토스테론 생합성에 관여하는 3β-HSD와 CYP17A1 발현을 증가시켜 테스토스테론 수준을 증가시킴을 나타낸다.

정소에서 생합성된 테스토스테론은 간, 뇌 및 전립선과 같은 테스토스테론이 작용하는 말초조직에서 5α-reductase에 의해 dihydrotestosterone으로 전환되고, aromatase에 의해 estradiol로 전환되어 대사된다(Shen과 Shi, 2015). 5α-Reductase와 aromatase의 과발현 시 테스토스테론의 대사가 활성화되어 혈액 내 테스토스테론 수준이 감소하게 된다(Aloisi 등, 2010; Khazali와 Mahmoudi, 2019). Lee 등(2016)은 TM3 세포에 H₂O₂로 산화스트레스를 유도한 경우 테스토스테론 수준이 감소하고 5α-reductase와 aromatase 발현이 증가함을 보고하였으며, 호로파와 야관문 복합추출물은 산화스트레스로 증가한 5α-reductase와 aromatase 발현을 감소하여 테스토스테론 수준은 증가함을 제시하였다. Lee 등(2016)의 결과와 마찬가지로 본 연구에서 TM3 세포에 H₂O₂ 처리에 의해 5α-reductase와 aromatase 발현이 증가함이 관찰되었다. H₂O₂ 처리로 증가한 5α-reductase와 aromatase 발현이 통캇알리 추출물에 의해 유의적으로 감소하였다(Fig. 3C,D, Fig. 4C,D). 이는 5α-reductase와 aromatase 발현 증가가 통캇알리 추출물에 의한 테스토스테론 수준 증가 기전 중의 하나임을 제시한다.

이상의 결과들은 H₂O₂에 의해 산화스트레스가 유도된 TM3 세포에서 통캇알리 추출물은 미토콘드리아 내로 콜레스테롤을 운반하는 StAR 발현을 증가하고 테스토스테론 생성에 관여하는 3β-HSD와 CYP17A1의 발현을 증가하며, 또한 테스토스테론 전환에 관여하는 5α-reductase와 aromatase의 발현을 감소함으로써 테스토스테론 수준은 증가함을 나타낸다(Fig. 6). 동물실험(Mokhtar 등, 2017)과 인체적용시험(Chinnappan 등, 2021)에서 통캇알리 추출물이 테스토스테론 수준을 증가시킴으로써 남성갱년기 개선 가능성을 제시하였고, 본 연구에서 통캇알리 추출물의 테스토스테론 수준 증가 작용 기전을 나타내었다. 이는 통캇알리 추출물이 테스토스테론 수준 감소에 의한 남성갱년기 증상을 개선할 수 있는 가능성을 제시한다.

Fig 6. Tentative mechanisms by which Eurycoma longifolia extract (ELE) increases testosterone levels in TM3 cells oxidative stressed with H₂O₂.

통캇알리 추출물은 선행 동물시험과 인체적용시험에서 테스토스테론을 증가시킴으로써 남성갱년기 증상 개선 가능성이 제시되었으나 테스토스테론 증가 기전에 대해 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 H₂O₂로 산화스트레스를 유도한 TM3 세포에 통캇알리 추출물이 테스토스테론 수준과 테스토스테론의 생성과 전환에 관여하는 효소의 발현을 조사함으로써 테스토스테론 증가 기전을 밝히고자 하였다. TM3 세포에 50 μM H₂O₂로 산화스트레스를 유도한 경우는 테스토스테론 수준이 유의적으로 감소하였고, 콜레스테롤 운반체로 작용하는 StAR 발현과 테스토스테론 생성에 관여하는 3β-HSD와 CYP17A1 발현이 유의적으로 감소하였다. 반면 테스토스테론 전환에 관여하는 5α-reductase와 aromatase의 발현은 50 μM H₂O₂ 처리에 의해 유의적으로 증가하였다. H₂O₂로 산화스트레스를 유도한 TM3 세포에 통캇알리 추출물을 여러 농도(10, 25, 50 및 100 μg/mL)로 처리한 경우 테스토스테론 수준이 유의적으로 증가하였다. 통캇알리 추출물 처리에 의해 StAR, 3β-HSD 및 CYP17A1 발현이 유의적으로 증가하였으나 5α-reductase와 aromatase 발현이 유의적으로 감소하였다. 이는 통캇알리 추출물이 미토콘드리아 내로의 콜레스테롤 이동과 테스토스테론 생성을 증가하고 테스토스테론 전환을 감소함으로써 산화스트레스에 의한 테스토스테론 감소를 개선함을 나타내며, 테스토스테론 감소에 의한 남성갱년기 증상을 개선할 수 있는 가능성을 제시한다.