유가공품은 원유를 주원료로 하여 가공한 우유류, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유, 농축유류, 유크림유, 버터류, 치즈류, 분유류, 유청류, 유당, 유단백 가수분해 식품을 말한다(Ministry of Food and Drug Safety, 2021). 유가공품 중 치즈와 버터는 식생활의 서구화로 인해 소비량이 증가하는 추세를 보이고 있는데, 2020년도 기준 치즈의 소비량은 188,231톤, 버터는 17,832톤으로 각각 2016년 대비 1.34%와 1.54% 증가하였다(Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, 2021). 치즈와 버터의 소비량이 증가함에 따라 유통환경에서 안전관리가 중요해지고 있으며, 유제품의 안전성을 위협하는 주요 식중독균으로 Listeria monocytogenes, pathogenic Escherichia coli, Salmonella spp. 등이 보고되고 있다(Lee와 Yoon, 2017). 미국에서는 2007년부터 2012년까지 비살균 원유 및 비살균 원유로 만든 유가공품(아이스크림, 치즈, 발효유, 버터 등)과 관련된 발병 사례 원인균의 17%가 Shiga-toxin producing E. coli(STEC)로 보고되어 병원성 대장균에 대한 안전관리가 중요시되고 있다(Centers for Disease Control and Preven tion, 2017).

병원성 대장균은 발병양식에 따라 5가지로 분류하며, 대표적으로 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic E. coli, EHEC)은 출혈성 대장염의 원인균으로 용혈 빈혈, 혈소판 감소증, 급성신부전 등을 특징으로 하는 용혈성 요독 증후군을 일으키고(Dhaka 등, 2016; Momtaz 등, 2013), 발병을 유발하는 주요 감염경로는 EHEC가 오염된 식품이다. Shiga toxins 생산은 EHEC O157:H7 발병기전의 특성 중 하나이며 용혈성 요독 증후군과 관련된 주요 독성인자이다. EHEC는 선모를 이용하여 장 점막에 밀접하게 부착하여 독성인자를 주입한다. 전이된 독성인자는 부착 소멸적 손상(attaching-effacing, A/E)을 나타내는 eae 유전자를 보유하고 있고 그로 인해 조직학적 변화를 일으킨다(Croxen 등, 2013).

치즈에서 온도에 따른 행동 변화 및 예측모델 개발 연구로는 가염된 가공치즈(Martinez-Rios 등, 2019)에서 L. monocytogenes에 관한 연구와 마스카포네 치즈(Kowalik 등, 2018), 원유로 만든 치즈(Medveďová 등, 2018)에서 비병원성 대장균에 관한 연구가 해외에서 진행되었다. 국내에서는 다양한 치즈(Yoon, 2013)에서 비병원성 대장균에 관한 연구와 가공치즈 및 자연치즈(Kim 등, 2017)에서 non-enterohemorrhagic E. coli에 대하여 예측모델 연구가 진행된 바 있다. 버터에서는 땅콩버터에서 E. coli O157:H7에 대한 사멸예측모델 연구(He 등, 2011)가 보고되었으나 최근의 유통보관환경에서 치즈와 버터의 EHEC에 관한 행동예측모델 연구는 보고된 바 없다.

정량적 미생물 위해성 평가는 특정 병원성 미생물에 의해 오염된 식품을 섭취했을 때 해당 병원성 미생물에 의해 식중독이 일어날 확률을 과학적으로 분석하는 방법으로 위험성 확인, 노출평가, 위험성 결정, 위해도 결정의 단계에 따라 과학적으로 분석하고 평가하는 방법이다(MFDS, 2015). 치즈에 대한 정량적 미생물 위해성 평가 선행연구로는 전통적인 Minas 치즈(Campagnollo 등, 2018), Gouda 치즈(Wemmenhove, 2019), 자연치즈(Lim 등, 2020), 치즈(Ha와 Lee, 2020)에서 L. monocytogenes에 대한 위해성 평가 및 자연치즈와 가공치즈에서 non-enterohemorrhagic E. coli(Kim 등, 2017), Clostridium perfringens(Lee 등, 2016), Staphylococcus aureus(Lee 등, 2015)의 위해성 평가가 보고되었다.

본 연구에서는 치즈 및 버터에서 온도가 병원성 장출혈성 대장균의 행동에 미치는 영향을 분석하고, 판매장에서 가정까지 노출평가 시나리오를 적용하여 정량적 미생물 위해성 평가를 통해 국내에서 치즈와 버터 섭취에 따른 장출혈성 대장균의 식중독 발생 가능성을 평가하여 소비가 급증하고 있는 치즈 및 버터의 안전관리 방안을 모색하고자 하였다.

치즈 및 버터에서 장출혈성 대장균의 오염실태 조사

치즈와 버터 제품에서 장출혈성 대장균의 오염수준(initial contamination level)을 분석하기 위하여 서울 대형마트, 인터넷, 목장 등에서 치즈 355건, 버터 145건의 제품을 구매하여 분석하였다. 치즈와 버터에서의 오염수준은 식품공전(MFDS, 2020)의 장출혈성 대장균의 정성 시험법을 이용하였다. PCR(Veriti® 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 통한 확인시험은 식품공전(MFDS, 2020)의 PCR primer(Table 1)를 참고하여 분리된 병원성 대장균 의심 집락에 대하여 verotoxin 유전자 확인시험을 수행하였다. Prevalence data(PR)의 분포도는 Beta distribution(α, β) 식을 활용하여 α: 양성 시료수＋1, β: 전체 시료수－양성 시료수＋1을 적용하여(Vose, 1996), 치즈와 버터의 장출혈성 대장균의 초기 오염수준은 [Log(-ln(1－PR)/weight)] 식을 이용하여 추정하였다(Sanaa 등, 2004).

Table 1 . PCR primer base sequence of enterohemorrhagic E. coli.

Enterohemorrhagic E. coliverotoxin	PCR primer (5′→3′)
stx1 (180 bp)	(F) ATA AAT CGC CAT TCG TTG ACT AC
	(R) AGA ACG CCC ACT GAG ATC ATC
stx2 (255 bp)	(F) GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC
	(R) TCG CCA GTT ATC TGA CAT TCT G

치즈와 버터의 이화학적 특성 및 위생지표균 오염현황 조사

본 연구에서 온도변화에 따른 장출혈성 대장균의 행동 특성 모델 개발을 위한 대상식품으로 사용할 치즈와 버터를 선정하기 위해 우선 판매량이 높은 치즈(가공치즈, 자연치즈)와 버터(가염버터, 무가염버터)를 구입하여 이화학적 특성 및 위생지표균 오염현황을 분석하였다. 시료는 각각 멸균 백에 10 g씩 넣고 증류수 90 mL를 첨가하여 균질화한 후 pH Benchtop Meter(Orion StarTM A211, ThermoFisher Scientific Co., Waltham, MA, USA)를 이용하여 pH를 측정하였다. 수분활성도는 시료를 용기의 70% 정도 채운 후 수분활성도 측정기(HP-23, Rotronic, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 위생지표균은 시료 25 g에 멸균된 0.1% peptone water(PW, Difco^TM Peptone Water, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) 225 mL를 가하여 희석한 뒤 오염수준을 고려하여 10진 희석액을 준비하였다. 시험용액 및 10진 희석액 1 mL를 일반세균, 대장균군, 대장균 건조필름배지(3M, St. Paul, MN, USA)에 각각 2매 이상을 접종한 후 잘 흡수시키고 35±1°C에서 48±2시 간 동안 배양한 후 생성된 집락을 계수하였다.

장출혈성 대장균의 표준균주 및 시험균액 제조

온도변화에 따라 행동을 예측할 수 있는 예측모델 개발을 위해 장출혈성 대장균(NCCP 13720, 13721)과 E. coli O157:H7(NCTC 12079)은 Triptic soy broth(TSB, MB Cell, Seoul, Korea)에 전배양한 뒤 15% glycerol을 첨가하여 -80°C에서 보관하였다. 실험을 위해 보관된 3가지 균주를 각각 10 µL씩 TSB 10 mL에 접종하여 36°C에서 140 rpm으로 전배양(VS-8480, Vision, Daejeon, Korea)하였다. 각각의 전배양한 균을 원심분리(VS-550, Vision)하여 cell pellet을 취한 후 멸균된 0.1% PW 10 mL를 넣어 재원심분리 하였다. 이후 상층액을 제거하고 각각의 pellet에 0.1% PW 10 mL를 넣은 후 3가지 균주를 혼합하여 10진 희석한 후 사용하였다.

온도가 치즈와 버터에서 장출혈성 대장균의 성장에 미치는 영향

치즈와 버터에서 장출혈성 대장균의 온도에 따른 행동예측모델 개발을 위한 시료를 선택하기 위하여 치즈는 선행연구(Yoon 등, 2019)의 결과를 바탕으로 오염도가 낮고 대중성(대형마트 판매량 순위), 이화학적 특성 분석을 비교하여 구워 먹는 치즈로 시료를 선정하였으며, 버터도 판매량과 pH(7.36±0.02)가 높아 장출혈성 대장균이 가장 잘 자랄 수 있는 가염버터를 선정하였다. 대형마트(서울 동대문구)에서 구매한 구워 먹는 치즈와 가염버터를 무균적으로 각각 10 g씩 채취하여 장출혈성 대장균 혼합 균주를 초기 균수가 약 3~4 log CFU/g이 되도록 접종하였다. 이후 유통환경을 고려하여 치즈는 진공포장 하여(FR-B100WB, CSE Corp., Siheung, Korea) 4, 7, 10, 17, 25, 36°C에 저장하였고, 버터는 호기포장 조건에서 7, 8, 10, 17, 25°C에 저장하여 보관온도가 치즈와 버터에서 장출혈성 대장균의 행동 변화에 미치는 영향을 분석하였다. 치즈는 7°C에서 최대 11.25일, 버터는 8°C에서 최대 19.1일 저장 기간 중 온도별 일정 시간마다 각각의 시료 10 g과 멸균된 0.1% PW 90 mL를 멸균 백에 넣어 Stomacher(Bagmixer 400, Interscience, Saint Nom, France)를 이용하여 2분 동안 균질화한 후 0.1% PW로 10진 희석하여 Eosin Methylene blue agar(EMB, Oxoid, Hampshire, England)에 200 µL를 분주하여 36°C에서 24시간 배양 후 colony counter(Scan 1200, Interscience)로 집락을 계수하였다.

각 온도에서 시간별 장출혈성 대장균의 변화를 보여주는 1차 생장예측모델은 Graph Prism(V7.03 GraphPad Software, San Diego, CA, USA) 프로그램을 사용하여 Modified Gompertz model(Gibson 등, 1987) 공식을 이용하여 유도기(lag time, LT), 최대증식속도(specific growth rate, SGR), 최대개체군밀도(maximum population density, MPD)를 산출하였다.

Modified Gompertz model

Y＝N₀＋C*exp(-exp((2.718*SGR/C)*(LT－X)＋1))

N₀: 초기 균 로그수

C: 마지막과 초기 균수의 차이

LT: 유도기(h)

SGR: 최대증식속도(log CFU/h)

X: 시간(h)

Y: 균수(log CFU/mL)

치즈와 버터에서 장출혈성 대장균의 1차 성장예측모델 결과로부터 구해진 LT, SGR, MPD 값을 각각 Davey model(Davey, 1989), Square root model(Ratkowsky 등, 1982), Polynomial second order model(McMeekin 등, 1993) 공식에 적용하여 온도변화에 따른 LT, SGR, MPD 값을 예측할 수 있는 2차 행동예측모델을 개발하였다.

Davey model

Y＝a＋(b/T)＋(c/T²)

Y: LT (h), a, b, c: 상수, T: 온도

Square root model

Y＝{b(T－Tmin)}²

Y: 최대증식속도(log CFU/h), b: 상수, T: 온도

Tmin: theoretical minimum temperature (the temperature below which growth ceases)

Polynomial second order model

Y＝a＋(b×T)＋(c×T)

Y: 최대개체군밀도(log CFU/g), a, b, c: 상수, T: 온도

행동예측모델의 적합성 평가

치즈와 버터에서 장출혈성 대장균에 대해 개발된 모델이 다른 병원성 대장균에 적용 가능한지를 확인하기 위해 성장예측모델에 사용되지 않은 살균 전 원유에서 검출된 장관병원성 대장균을 치즈와 버터에 접종 후 10°C에 보관하여 모델 검증 실험을 진행하였다. 개발된 예측모델 식에 대한 적합성을 평가하기 위하여 통계적 지표인 RMSE(Root Mean Square Error), bias factor(B_f), accuracy factor(A_f)를 산출하였다. RMSE는 실험값과 예측값과의 차이를 통해 얻을 수 있는 수치로 0에 가까울수록 개발된 모델의 적합도가 높아진다(Baranyi 등, 1996). B_f는 실험을 통해 얻은 값과 유도된 2차 모델 식에서 얻은 값의 상대적 편차를 평가하는 수치로 0.7~1.15 사이의 값을 나타내면 모델이 적합하다는 것을 나타내며 성장모델이 사용하기 안전한 모델(fail-safe, B_f<1)인지 위험한 모델(fail-dangerous, B_f>1)인지를 평가하는 척도로 사용된다(Ross, 1996). A_f는 예측된 값이 얼마만큼 실험값과 가까운가를 측정하는 척도로 두 값이 일치했을 때 1을 기준으로 A_f 값이 1에서 멀어질수록 개발된 모델의 부정확성을 나타내나, 안전한 모델(fail-safe)인가에 대한 방향성을 제시하지 않는다(Oscar, 2005).

판매장에서 가정까지의 단계별 노출평가 시나리오

본 연구에서는 치즈, 버터가 판매되고 있는 판매장에서부터 가정까지로 노출평가 시나리오를 구성하였다. 마트 판매대에서 보관 중인 치즈와 버터에서 장출혈성 대장균의 성장 추정을 위해 본 연구에서 마트 판매대 보관 시간과 온도를 실측한 결과를 적용하였다. 치즈의 보관시간은 최소 0시간, 최빈 48시간, 최대 168시간으로 RiskPert(0, 48, 168), 보관온도는 Riskpareto(3.921, 4), 버터의 보관시간은 최소 0시간, 최빈 1,488시간, 최대 4,200시간으로 RiskPert(0, 1,488, 4,200), 보관온도는 RiskExtvalue(4.095, 0.9402)가 본 연구에서 가장 적합한 확률분포모델로 선정되었다.

치즈와 버터에서의 섭취량 및 섭취빈도 조사

치즈와 버터의 섭취량 및 섭취빈도의 적정 확률분포모델은 식품의약품안전처(2015)의 연구에서 1,500명을 대상으로 수행한 ‘50대 주요 축산식품의 섭취량 및 섭취패턴 조사’ 결과를 바탕으로 @RISK 7.5(@RISK, Palisade, Sydney, Australia)로 distribution fitting 하여 도출해낸 확률분포모델 식을 구하였다. 그 결과 치즈는 RiskExpon 확률분포모델로부터 치즈의 1일 평균 섭취량은 18.51 g으로 나타났으며 섭취자 비율은 4%인 것으로 확인되었다. 버터는 Risk Pareto 분포모델로부터 버터의 1일 평균 섭취량과 섭취자 비율이 각각 11 g과 1.4%인 것으로 확인되었다.

위험성 결정(Hazard characterization)

위험성 결정 단계에서 장출혈성 대장균의 용량-반응 모델은 Haas 등(1999)의 Beta passion model을 이용하였다.

P＝(1＋D/β)－α (α: 0.49, β: 1.81×10⁵)

P: 장출혈성 대장균의 질병 가능성, α, β: 변수

D: 장출혈성 대장균의 섭취로 노출된 세포 수

위해도 결정(risk characterization)

치즈와 버터 섭취로 인한 장출혈성 대장균에 의한 식중독 발생확률을 추정하기 위해 수식과 입력 변수는 excel spreadsheet에 작성하여 시나리오를 모델화하였다. 개발된 모델은 @RISK 7.5를 사용하여 Monte Carlo simulation을 활용해 위해도를 산출하기 위해 iteration(반복 시행 횟수)은 10,000번 이상의 결과를 사용하였다. Simulation 결과를 바탕으로 민감도 분석(sensitivity analysis)을 통해 각각의 변수가 최종 식중독 발생 가능성에 미치는 영향력을 보여주는 상관계수를 산출하였다.

통계처리

본 연구는 SAS Software(ver. 9.4, SAS Institute, Cary, NC, USA)를 이용하여 버터와 치즈에서 온도변화에 따른 장출혈성 대장균의 LT, SGR, MPD 값의 유의적인 차이 검증에 대해 One-way ANOVA의 Duncan’s multiple range test로 분석하였으며 P<0.05 수준에서의 유의성을 검정하였다.

치즈 및 버터에서 장출혈성 대장균의 오염실태 조사

노출평가의 첫 단계로 온･오프라인에서 유통 판매되는 치즈와 버터의 장출혈성 대장균의 오염수준을 분석한 결과 355개의 치즈와 145개의 버터에서 장출혈성 대장균은 검출되지 않았다(Table 2). 그러나 목장의 소 유두 표면에서 장관병원성 대장균과 장독소형 대장균이, 살균 전 원유에서 장관병원성 대장균이 검출되어 유가공품에서 병원성 대장균에 대한 오염 가능성을 확인할 수 있었다. 치즈와 버터에서 장출혈성 대장균의 오염수준인 prevalence data(PR)는 치즈와 버터에서 장출혈성 대장균 모니터링 결과를 반영해 Beta distribution을 이용하여 분석한 결과, 평균 오염도는 치즈 -4.20 log CFU/g, 버터 -3.81 log CFU/g으로 확인되었다(Fig. 1).

Table 2 . Microbial contamination level of enterohemorrhagic E. coliin cheese and butter.

Sample	Enterohemorrhagic E. coli
Cheese (n=355)	ND
Butter (n=145)	ND

ND: not detected..

Fig 1. Probability distribution for contamination level of enterohemorrhagic E. coli in cheese (A) and butter (B).

치즈와 버터의 이화학적 특성 및 위생지표균 오염현황 조사

치즈와 버터에서 장출혈성 대장균의 행동예측모델 개발을 위한 시료를 선택하기 위해 치즈는 선행연구(Yoon 등, 2019)의 결과를 참고하여 구워 먹는 치즈로 시료를 선정하였으며, 모델 개발에 사용한 치즈의 수분활성도는 0.92±0.01, pH는 6.93±0.03이었다. 버터는 판매량이 높은 2개의 브랜드로 가염과 무가염버터의 시료에 대해 이화학적 특성과 위생지표 세균을 분석하였다. 가염버터와 비교 시 무가염버터의 경우 Aw와 일반세균의 오염도가 높았으나 pH의 경우 가염버터가 높아 이화학적 특성 및 위생지표균 분석 결과와 판매량이 가장 높은 가염버터를 사용하여 행동예측모델 시료로 사용하였다. 본 연구에 사용한 가염버터의 수분활성도는 0.73±0.00, pH는 7.36±0.02였다.

치즈와 버터에서 온도변화에 따른 장출혈성 대장균의 성장예측모델 개발 및 검증

치즈 및 버터에서 장출혈성 대장균의 보관온도에 따른 행동 변화를 분석한 결과 치즈는 6°C 이하, 버터는 7°C 이하의 온도에서 장출혈성 대장균의 성장이 관찰되지 않았다. 따라서 유통환경과 보관온도를 고려하여 치즈는 7~36°C, 버터는 8~25°C 온도 범위에서 각각의 온도에서 시간변화에 따른 장출혈성 대장균의 행동예측모델을 개발하였다(Table 3, 4).

Table 3 . Observed values for LT, SGR, MPD, and R² of enterohemorrhagic E. coliin cheese.

Storage temperature (°C)	LT (h)	SGR (log CFU/h)	MPD (log CFU/g)	R2
7	52.99±1.57a1)	0.02±0.00e	6.18±0.01e	0.981
10	30.42±0.13b	0.05±0.00d	6.68±0.01d	0.997
17	13.39±0.11c	0.24±0.00c	7.28±0.04c	0.998
25	3.75±0.08d	0.32±0.00b	7.83±0.04b	0.985
36	1.48±0.00e	0.62±0.00a	8.43±0.00a	0.986

LT: lag time (h), SGR: specific growth rate (log CFU/h), MPD: maximum population density (log CFU/g)..

¹⁾Different letters in a same column indicate a significant difference by Duncan’s multiple range test at P<0.05..

Table 4 . Observed values for LT, SGR, MPD, and R² of enterohemorrhagic E. coliin butter.

Storage temperature (°C)	LT (h)	SGR (log CFU/h)	MPD (log CFU/g)	R2
8	130.80±16.42a1)	0.02±0.01d	5.88±0.04c	0.989
10	50.38±0.40b	0.05±0.00c	6.54±0.02b	0.998
17	8.22±0.02c	0.20±0.01b	7.32±0.07a	0.997
25	6.79±0.16c	0.84±0.02a	7.20±0.04a	0.995

LT: lag time (h), SGR: specific growth rate (log CFU/h), MPD: maximum population density (log CFU/g)..

¹⁾Different letters in a same column indicate a significant difference by Duncan’s multiple range test at P<0.05..

치즈를 7, 10, 17, 25, 36°C 저장온도에 보관 시 장출혈성 대장균의 유도기(LT)는 각각 52.99, 30.42, 13.39, 3.75, 1.48시간이었으며, 최대증식속도(SGR)는 0.02, 0.05, 0.24, 0.32, 0.62 log CFU/h로 확인되었다. 치즈의 저장온도가 7°C에서 10°C로 증가함에 따라 장출혈성 대장균의 LT는 약 43% 감소하였고, SGR은 150% 증가하였다. 버터의 경우 8, 10, 17, 25°C 저장온도에 보관 시 장출혈성 대장균의 LT는 각각 130.8, 50.38, 8.216, 6.79시간이었으며, SGR은 0.02, 0.05, 0.197, 0.84 log CFU/h로 확인되었다. 버터의 저장온도가 8°C에서 10°C로 2°C가 증가함에 따라 LT는 약 61% 감소하였고, SGR은 150% 증가하였다.

치즈와 버터 각각에서 1차 모델 변수에 대한 온도의 영향을 나타낸 2차 모델은 Fig. 2와 같다. 두 식품의 유도기는 10°C의 치즈에서는 30.42시간, 버터에서는 50.38시간으로 약 1.7배 정도 버터에서 유도기가 긴 것으로 확인되었으나 최대증식속도는 0.05 log CFU/h로 두 식품 간에 차이가 없었다. 10, 17, 25°C에서 비교해보았을 때 유도기는 상대적으로 치즈에서 짧은 것으로 보여 전반적으로 장출혈성 대장균은 치즈에서 버터보다 더 빠르게 성장하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 치즈와 버터의 내적 요인(intrinsic factor)인 수분활성도와 pH의 차이가 영향을 주었을 것으로 사료된다. 본 연구에 사용한 구워 먹는 치즈와 가염버터의 수분활성도는 각각 0.92±0.01, 0.73±0.00이고, pH는 6.93±0.03, 7.36±0.02로 치즈의 수분활성도가 버터에 비해 장출혈성 대장균이 성장하기 좋은 조건을 가진 것으로 확인되었다. 또한 선행연구에 따르면 유가공품에 있는 지방산과 모노글리세라이드가 그람 음성균 세포벽의 지질다당류를 손상시켜 식중독균 성장을 억제할 수 있으며(Wang 등, 2020), 지방의 유무에 따라 일반 우유보다 무지방 우유에서 장출혈성 대장균의 유도기가 짧았고 최대개체군밀도 또한 높게 나타나는 결과를 보였다(Dong 등, 2021). 본 연구에 사용된 버터가 치즈보다 지방함량이 3.15배가량 더 포함되어 있었는데 선행연구와 같이 버터의 지방함량이 장출혈성 대장균의 성장에 영향을 준 것으로 사료된다. 최대개체군밀도 값은 온도가 증가함에 따라 증가하였으며, 치즈와 버터 최댓값이 각각 8.43 log CFU/g, 7.32 log CFU/g으로 버터에서 장출혈성 대장균의 최대 성장이 저해되는 것으로 확인되었다.

Fig 2. Secondary models for lag time (LT), specific growth rate (SGR), and maximum population density (MPD) of enterohemorrhagic E. coli in cheese and butter as a function of temperature.

치즈와 버터에서의 행동예측모델의 적합성 평가

치즈 및 버터에서 장출혈성 대장균(EHEC)으로 개발된 모델의 적합성 검증을 위하여 성장예측모델에 사용되지 않은 살균 전 원유에서 검출된 장관병원성 대장균(EPEC)을 활용하여 10°C에서 모델 검증 실험을 진행하였다. EHEC로 개발된 모델식을 통해 얻은 예측값과 10°C에서 진행된 EPEC의 생장 실험값을 통해 산출한 Bf, Af, RMSE 값은 치즈가 LT의 경우 0.992, 1.238, 3.203, SGR의 경우 1.433, 1.584, 0.038, MPD의 경우 0.986, 1.02, 0.239였다. 본 연구의 구워 먹는 치즈에서 EHEC로 개발된 2차 성장예측모델 중 특히 SGR 값이 EPEC의 SGR 값을 예측하기에는 적절하지 않은 것으로 확인되었다. 버터의 경우는 LT와 SGR 2차 성장예측모델에 EPEC의 LT와 SGR을 예측하기에는 모두 적절치 않은 것으로 확인되었다(Table 5). 우유에서 장출혈성 대장균에 대한 예측모델이 장관병원성 대장균에도 적용된 선행연구 결과(Dong 등, 2021)나 깻잎에서 장출혈성 대장균 O157:H7에 대한 예측모델 결과에 장출혈성 대장균과 장관병원성 대장균이 모두 적용된 결과(Kim 등, 2013)와는 차이를 보였다.

Table 5 . Extrapolate validation with EPEC model instead of EHEC model for cheese and butter at 10°C.

Sample	Parameter	Bf	Af	RMSE
Cheese	LT	0.99	1.24	3.2
	SGR	1.43	1.58	0.04
	MPD	0.99	1.02	0.24
Butter	LT	0.98	1.75	14.51
	SGR	0.26	3.87	0.02
	MPD	0.99	1.02	0.13

LT: lag time (h), SGR: specific growth rate (log CFU/h), MPD: maximum population density (log CFU/g)..

치즈와 버터에서 유통단계별 장출혈성 대장균 오염도 변화

마트에서 보관 유통되는 단계부터 가정으로 운송, 소비되는 단계까지, 단계별 시나리오에 따라 @RISK를 활용하여 오염도 변화와 최종 오염수준을 추정한 결과는 Fig. 3과 같다. 선행연구 결과(Moon, 2009)에 따르면 치즈와 기타 가공품은 구매 직후 바로 섭취하지 않고 냉장고에서 15일까지 보관한다는 의견이 37.9%로 가장 많았고, 1일(1.6%)에서 최대 한 달 이상(2.3%)까지도 보관하는 것으로 보고되었다. 따라서 본 연구에서는 치즈와 버터에서 마트의 판매대부터 가정에서 섭취할 때까지의 유통 및 보관환경을 고려하여 장출혈성 대장균에 의한 식중독 발생 가능성을 추정하였다.

Fig 3. Cumulative distribution for the contamination level of enterohemorrhagic E. coli in cheese (A) and butter (B) from market to home. IC, initial contamination; C1, market; C2, transportation to home; C3, home.

치즈의 초기오염도(IC) 결과는 -4.20 log CFU/g이었으나, 판매장에서의 오염수준(C1)은 각각 -3.87 log CFU/g으로 증가하였다. 소비자가 판매장에서 치즈를 구매한 뒤 가정으로 운송하는 시간과 온도는 최소 0.325시간, 최빈 0.984시간, 최대 1.643시간을 적용하여 RiskPert(0.325, 0.984, 1.643) 확률분포 값을 추정하였다. 또한 치즈 구매 후 가정으로 운송할 때까지의 온도는 최소 10°C, 최빈 18°C, 최대 25°C를 반영하여 RiskPert(10, 18, 25)로 추정하였다(Jung, 2011). 그 결과 운송 중인 치즈에서의 평균 오염수준(C2)은 -3.87 log CFU/g으로 유지되었으나, 가정에서 섭취 전까지의 냉장 보관 시 치즈 오염수준(C3)은 -2.13 log CFU/g으로 급격하게 증가하였다. 따라서 치즈를 구매한 후 가정에서의 보관온도와 시간에 따라 치즈에서 장출혈성 대장균의 위해도에 가장 큰 영향을 끼치는 것으로 확인되었다.

버터에서의 초기오염도(IC) 결과는 -3.81 log CFU/g이었으나 판매장에서 보관하는 동안의 오염수준(C1)은 -3.78 log CFU/g으로 증가하였다. 소비자가 판매장에서 버터를 구매한 후 가정까지 운송할 때까지의 시간과 온도는 각각 RiskPert(0.325, 0.984, 1.643), RiskPert(10, 18, 25)로 추정되어(Jung, 2011) 운송 중인 버터에서의 평균 오염수준(C2)은 -3.69 log CFU/g으로 증가하였고, 가정에서 섭취하기 전까지의 평균 오염수준(C3)은 -3.81 log CFU/g으로 다시 감소하였다. 이러한 결과는 소비자가 가정에서 버터를 보관할 때 2.1°C에 보관한다는 의견이 가장 많았고(Moon, 2009), 이는 버터에서 장출혈성 대장균이 성장하지 않는 온도이기 때문인 것으로 사료된다. 치즈의 경우 냉장온도에서 치즈를 한 달까지 보관한다는 의견이 15.2%(Moon, 2009)로 나타났으며, 본 실험에서 냉장온도인 7°C에서 장출혈성 대장균이 2 log CFU/g 이상 성장하는 데 약 10일이 걸리는 것으로 확인되었다. 장출혈성 대장균의 경우 101~103개의 적은 양으로도 감염이 될 수 있기 때문에(MFDS, 2017) 치즈 생산 과정에서 장출혈성 대장균이 오염되지 않도록 원유 관리 등 주의가 요망된다.

@RISK를 활용하여 치즈 및 버터에서 장출혈성 대장균의 정량적 위해성 평가

치즈와 버터에서 장출혈성 대장균의 정량적 위해 평가를 위해 @RISK 프로그램을 사용하여 치즈와 버터의 1일 평균 섭취량과 섭취자 비율의 확률분포 모델식을 구하였다. 그 결과 치즈 평균 섭취량의 확률분포 모델식은 RiskExpon이 가장 적합한 것으로 확인되었고, 1일 평균 섭취량은 18.51 g, 1일 1회 섭취자 비율은 4%인 것으로 확인되었다(Table 6).

Table 6 . Simulation model and formulas in the Excel spreadsheet used to calculate the risk of enterohemorrhagic E. coliin cheese with @RISK.

Symbol	Unit	Definition	Formula	Reference
Product
Pathogens contamination level
PR	CFU/g	Prevalence of E. coliin cheese	＝RiskBeta(1, 356)	This research;
CL	Log CFU/g	Contamination level of EHEC	＝−LN(1−PR)/25	Vose, 1996;
IC		Initial contamination level	＝Log(CL)	Sanna et al., 2004
Market
MTime	h	Storage time in market	＝RiskPert(0, 48, 168)	This research
MTemp	°C	Storage temperature in market	＝RiskPareto(3.921, 4)
Growth
SGR1	Log CFU/h	Specific growth rate	＝{0.01948×(MTemp＋4.621)}2	This research
LT1	h	Lag time	＝−8.054＋(293.4/MTemp)＋(935.9/MTemp2)
C	Fixed	Difference between	Fixed 3.741
G1	Log CFU/g	Growth model	＝IC＋C×EXP[−EXP{(2.718×SGR1/C) ×(LT1−MTime)＋1}]
Transportation to home
TTime	h	Storage time during transportation	＝RiskPert(0.325, 0.984, 1.643)	Jung, 2011
TTemp	°C	Storage temperature during transportation	＝RiskPert(10, 18, 25)
Growth
SGR2	Log CFU/h	Specific growth rate	＝{0.01948×(TTemp＋4.621)}2	This research
LT2	h	Lag time	＝−8.054+(293.4/TTemp)＋(935.9/TTemp2)
C	Fixed	Difference between	Fixed 3.741
G2	Log CFU/g	Growth model	＝IC＋C×EXP[−EXP{(2.718×SGR2/C)×(LT2−TTime)＋1}]
Home
HTime	h	Storage time during transportation	＝RiskPert(0, 360, 720)	Moon, 2009
HTemp	°C	Storage temperature during transportation	＝RiskPert(−0.5, 2.1, 8.4)
Growth
SGR3	Log CFU/h	Specific growth rate	＝{0.01948×(HTemp＋4.621)}2	This research
LT3	h	Lag time	＝−8.054＋(293.4/HTemp)＋(935.9/HTemp2)
C	Fixed	Difference between	Fixed 3.741
G3	Log CFU/g	Growth model	＝IC＋C×EXP[−EXP{(2.718×SGR3/C) ×(LT3−HTime)＋1}]
Consumption
Consume	Fixed	Daily consumption average amount	＝RiskExpon{8.2808, RiskShift(9.9763)}	Park et al., 2016
Intake rate		Intake rate	=0.04
Amount		Daily consumption average amount considered	＝Consume×Intake rate
Dose-Response model
Dose (D)		EHEC amount	＝10G3×Amount	Huertas et al.,
Model		＝1−(1＋D/β)-α	α＝Fixed 0.49	2008
			β＝Fixed 1.81×105
Risk characterization
Risk		Probability of illness/person/d		Haas et al., 1999

버터 평균 섭취량의 확률분포 모델식은 RiskPareto가 가장 적합한 것으로 확인되었으며, 버터의 1일 평균 섭취량은 11 g으로 1일 1회 섭취자 비율은 1.4%인 것으로 확인되었다(Table 7). 유통 및 저장 단계를 거치면서 균수 변화에 따른 버터 및 치즈에서의 장출혈성 대장균의 최종 오염수준(log CFU/g)에서 치즈와 버터의 1일 섭취량 및 섭취자 비율과 장출혈성 대장균의 Beta-poisson 용량반응모델을 활용하여 최종 위해도를 분석하였다(Table 8). 그 결과 시중에서 판매 중인 치즈와 버터를 마트에서 가정까지의 유통환경 시뮬레이션을 적용하고 1일 1회 섭취하였을 경우 장출혈성 대장균에 의한 치즈와 버터의 식중독 발생확률은 각각 평균 2.92×10^-5, 1.17×10^-10으로 나타나 본 연구에서는 장출혈성 대장균에 의해 버터보다 치즈에 의한 식중독 발생확률이 더 높은 것으로 추정되었다.

Table 7 . Simulation model and formulas in the Excel spreadsheet used to calculate the risk of Enterohemorrhagic E. coli in butter with @RISK.

Symbol	Unit	Definition	Formula	Reference
Product
Pathogens contamination level
PR		Prevalence of E. coli in butter	＝RiskBeta(1, 146)	This research;
CL	CFU/g	Contamination level of EHEC	＝−LN(1−PR)/25	Vose, 1996;
IC	Log CFU/g	Initial contamination level	＝Log(CL)	Sanaa et al., 2004
Market
MTime	h	Storage time in market	＝RiskPert(0, 1488, 4200)	This research
MTemp	°C	Storage temperature in market	＝RiskPareto(4.095, 0.9402)
Growth
SGR1	Log CFU/h	Specific growth rate	＝{0.05691×(MTemp−9.072)}2	This research
LT1	h	Lag time	＝95.68＋(−3,299/MTemp)＋(28,981/MTemp2)
C	Fixed	Difference between	Fixed 3.824
G1	Log CFU/g	Growth model	＝IC＋C×EXP[−EXP{(2.718×SGR1/C)×(LT1−MTime)＋1}]	Mafart et al.,
			＝IF(MTemp≥8, G1, IC)	2002
C1	Log CFU/g
Transportation to home
TTime	h	Storage time during transportation	＝RiskPert(0.325, 0.984, 1.643)	Jung, 2011
TTemp	°C	Storage temperature during transportation	＝RiskPert(10, 18, 25)
Growth
SGR2	Log CFU/h	Specific growth rate	＝{0.05691×(TTemp−9.072)}2	This research
LT2	h	Lag time	＝95.68＋(−3,299/TTemp)＋(28,981/TTemp2)
C	Fixed	Difference between	Fixed 3.741
G2	Log CFU/g	Growth model	＝IC＋C×EXP[−EXP{(2.718×SGR2/C) ×(LT2−TTime)＋1}]
			＝IF(TTemp≥8, G2, C1)
C2	Log CFU/g
Home
HTime	h	Storage time during transportation	＝RiskPert(0, 360, 720)	Moon, 2009
HTemp	°C	Storage temperature during transportation	＝RiskPert(−0.5, 2.1, 8.4)
Growth
SGR3	Log CFU/h	Specific growth rate	＝{0.05691×(HTemp−9.072)}2	This research
LT3	h	Lag time	＝95.68＋(−3,299/HTemp)＋(28,981/HTemp2)
C	Fixed	Difference between	Fixed 3.741
G3	Log CFU/g	Growth model	＝IC＋C×EXP[−EXP{(2.718×SGR3/C)×(LT3−HTime)+1}]
			＝IF(HTemp≥8, G3, C2)
C3	Log CFU/g
Consumption
Consume	Fixed	Daily consumption average amount	＝RiskPareto(2.6685, 7)	Park et al., 2016
Intake rate		Intake rate	0.014
Amount		Daily consumption average amount considered	＝Consume×Intake rate
Dose-Response model
Dose (D)		EHEC amount	＝10G3×Amount	Huertas et al.,
Model		＝1−(1＋D/β)-α	α＝Fixed 0.49	2008
			β＝Fixed 1.81×105
Risk characterization
Risk		Probability of illness/person/day		Haas et al., 1999

Table 8 . Probability of foodborne illness of enterohemorrhagic E. coliper day per one serving of cheese and butter.

Probability of illness/person/d	Min	25%	Mean	95%	Max
Cheese	5.75×10-13	2.62×10-10	2.92×10-5	6.87×10-6	1.91×10-2
Butter	0	2.89×10-11	1.17×10-10	3.69×10-10	4.31×10-9

본 연구에서 버터의 장출혈성 대장균은 7°C 이하에서 성장하지 않았으며 실제로 판매장에서 치즈와 버터의 보관온도는 최빈 4.1°C, 가정에서 보관온도는 최빈 2.1°C로 버터에서 장출혈성 대장균이 증식하지 않는 온도이기 때문에 버터가 치즈보다 위해도가 낮게 나올 수 있었던 것으로 사료된다. 또한 치즈에 비해 버터의 섭취량과 섭취자 비율도 상대적으로 낮아 최종 위해도에 영향을 끼쳤을 것으로 사료된다.

선행연구에 따르면 치즈에서 L. monocytogenes에 의한 식중독 발생 가능성은 5.09×10^-7으로 보고되었으며(Ha, 2020), S. aureus에 의한 식중독 발생 가능성은 가공치즈(2.24×10^-9)에서 자연치즈(7.84×10^-10)보다 더 높은 것으로 보고되었다(Lee 등, 2015). 또한 Lee 등(2016)의 연구에서도 C. perfringens에 의한 식중독 발생 가능성이 가공치즈(3.58×10-14), 자연치즈(9.57×10^-14)에서 모두 매우 낮은 것으로 보고되었다. 이처럼 치즈에서 다양한 병원성 식중독균에 의한 위해성 평가 결과를 종합했을 때, 본 연구 결과에서 얻어진 치즈에서 장출혈성 대장균에 의한 식중독 발생확률(2.92×10-5)이 다소 높은 것을 확인할 수 있었다. 위해성 평가 결과의 경우 연구대상 치즈의 종류, 섭취량, 병원성 식중독균의 행동 특성 등 노출평가의 시나리오가 모두 다르기 때문에 단순 비교하는 것은 적절치 못하나, 본 연구에서 사용한 구워 먹는 치즈의 경우 7°C 냉장온도에서 보관 시 장출혈성 대장균의 증식이 관찰되어 식중독 발생 가능성을 높이는 데 영향을 주어 치즈의 유통온도 재설정이 필요할 것으로 사료된다.

민감도 분석

@RISK에 입력한 변수(초기오염도, 유통환경, 섭취량 등)가 추정된 위해도에 미치는 영향에 대해 상관성을 분석한 결과는 Fig. 4와 같다. 치즈의 경우 가정에서의 보관온도가 0.71로 가장 높은 양의 상관관계를 나타냈다. 그다음으로 가정에서의 보관시간(0.33), 초기오염수준(0.32), 판매장 보관온도(0.19), 판매장 보관시간(0.15), 섭취량(0.12) 순으로 양의 상관관계를 보였다. Lee 등(2015)과 Ha와 Lee(2020)의 연구 결과에 따르면 치즈에서 S. aureus는 섭취빈도와 가정 보관시간이 가장 높은 양의 상관관계를 보였고, L. monocytogenes에서는 섭취량과 가정 보관시간이 가장 높은 양의 상관관계를 보인 것으로 보고하였다. 본 연구와 선행연구에서 모두 섭취량과 가정에서의 보관시간이 위해도 평가에서 높은 양의 상관관계를 보였다. 버터의 경우는 초기오염수준이 0.95로 가장 높은 양의 상관관계를 나타냈고, 그다음으로 섭취량(0.28), 판매장 보관온도(0.03)로 양의 상관관계를 보였다. 최근 치즈와 버터의 섭취량이 증가함을 고려할 때 특히 치즈와 버터에서 장출혈성 대장균 식중독 발생 위험성을 감소시키기 위해서는 치즈 및 버터제조에 사용되는 원유의 오염도를 예방 및 공정 과정에서의 교차오염을 방지하고 유통과정 중 가정에서의 보관시간 및 온도 관리가 가장 핵심적인 역할을 할 것으로 사료된다.

Fig 4. The correlation coefficient for sensitivity risk factor affecting probability of foodborne illness of enterohemorrhagic E. coli by consumption of cheese (A) and butter (B).

본 연구는 구워 먹는 치즈와 가염버터에서 온도변화에 따른 장출혈성 대장균의 행동예측모델을 개발하고, 소비자의 안전을 위해 미생물학적 안전관리를 위한 기준의 적절성 평가를 위해 정량적 위해성 평가를 수행하였다. 대형마트나 온라인에서 유통, 판매되고 있는 치즈(n=355)와 버터(n=145)에서 장출혈성 대장균의 오염현황을 모니터링한 결과, 모든 제품에서 장출혈성 대장균은 검출되지 않아 초기오염도는 각각 평균 -4.20 log CFU/g, -3.81 log CFU/g으로 추정되었다. 냉장 유통환경에서 구워 먹는 치즈 및 버터의 장출혈성 대장균은 성장하는 양상을 보였으나, 치즈에서는 6°C 이하에서, 버터에서는 7°C 이하에서 성장하지 않았다. 치즈 및 버터의 장출혈성 대장균에 대해 시간과 온도변화에 따른 성장예측모델을 개발하고 치즈와 버터에서의 섭취량과 섭취자 비율 결과를 바탕으로 @RISK 프로그램을 활용하여 치즈와 버터를 1일 1회 섭취하여 장출혈성 대장균에 의한 식중독 발생확률을 추정하였다. 추정 결과 1일 1회 치즈와 버터 섭취로 인한 식중독 발생확률은 각각 평균 2.92×10^-5, 1.17×10^-10으로 확인되어 본 연구에서 사용한 유통환경에서는 치즈 섭취로 장출혈성 대장균에 의한 식중독 발생 가능성이 높은 것으로 확인되었다. 민감도 분석 결과 가정에서의 치즈 보관온도 및 시간과 초기오염 관리가 필요한 것을 알 수 있었다. 치즈에서 장출혈성 대장균의 경우 냉장 유통온도인 7°C에서도 증식이 관찰되어 원유가 오염되지 않도록 목장에서의 철저한 위생관리 및 유통, 판매, 섭취 과정에서 적절한 시간과 온도관리가 필요할 것으로 사료된다.

본 연구는 2020년도 식품의약품안전처 용역연구개발과제의 연구개발비 지원(20162위생안027)에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.