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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(5): 483-492

Published online May 31, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.5.483

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Analysis of Microbial Diversity and Amino Acids of Korean-Chungtaejeon and Japanese-Goishicha

Byung-Hyuk Kim1 , Kyung Hwan Moon1, Chankyu Lim1, Chun Hwan Kim2, and Doo-Gyung Moon1

1Agricultural Research Institute for Climate Change and 2Allium Vegetable Research Institute, National Institute of Horticultural and Herbal Science, RDA

Correspondence to:Doo-Gyung Moon, 1285, Ayeon-ro, Jeju-si, Jeju-do 63240, Korea, E-mail: dgmoon@korea.kr

Received: January 25, 2022; Revised: April 13, 2022; Accepted: April 14, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Post-fermented tea is produced by the microbial fermentation process using tea plant leaves (Camellia sinensis (L.) O Kuntze). In this study, the size of the microbial community was analyzed by real-time PCR, to determine the major microorganisms involved in the fermentation process. Also, the bacterial community analysis of East-Asian traditional post-fermented tea (Korean Chungtaejeon and Japanese Goishicha) were investigated using double gradient- denaturing gradient gel electrophoresis and 16S rRNA gene clone library technique through 16S rRNA gene analysis. Our results confirmed that both Chungtaejeon and Goishicha were dominated by the bacterial community. Phylogenetic analysis determined the dominant species in post-fermented tea Cheongtaejeon was γ-proteobacteria Pantoea sp., and those in Goishicha were β-proteobacteria Parburkholderia sp. and γ-proteobacteria Pseudomonas sp. In addition, amino acid analysis revealed that the contents of theanine and aspartic acid were highest in Cheongtaejeon and Goishicha, respectively. We believe that the results of this study will contribute to understanding the fermentation and interaction among microorganisms of post-fermented tea in Korea and Japan.

Keywords: amino acid, Camellia sinensis, Pantoea sp., post-fermented tea, tea plants

차(茶)는 물 다음으로 소비되는 범세계적인 음료이다. 차의 종류는 녹차(green tea), 반발효차(semi-oxidation tea), 완전발효차(oxidation tea) 및 후발효차(post-fermentation) 등으로 제다 방법에 따라 구분되며, 제다시 방법과 발효 정도 및 추출 방법에 따라 추출물 내의 맛과 성분에 차이를 가진다(Shon 등, 2004; Moon 등, 2015). 이러한 분류법에 따라 사용되는 발효는 제다시에 관행적으로 사용되고 있으며, 과학적 의미인 미생물의 작용 여부 및 정도를 의미하는 발효(fermentation)가 아닌 생엽 중에 존재하는 내생 효소(endogenous enzymes)의 산화작용(oxidation)을 발효라 정의하고 있다. 제다에서 사용되는 ‘발효’는 과학적 정의에는 부합하지 않으나 차 분야에서 오랜 시간 사용된 용어로 부정확성을 인지하고 있음에도 불구하고 관용적으로 사용되고 있다(Moon 등, 2015). 미생물의 대사 과정을 통해 제조된 차는 미생물발효차(post-fermented tea, 후발효차 or dark tea, 흑차)로 구분되고 있다(Kim 등, 2017b). 미생물발효차는 미생물의 대사 과정을 통해 gallic acid, methoxy phenolic compound, poly-flavonoids가 증가하여 항균 작용, 혈중 콜레스테롤 감소 효과, 항산화 활성 등이 보고되었다(Lv 등, 2013; Zhang 등, 2013). 또한, 차에 함유된 아미노산(glutamate, alanine, lysine, tyrosine, theanine 등)은 성분과 함량의 차이로 인해 맛에 영향을 주며 품질과 가격에 영향을 준다고 알려져 있다(Horanni와 Engelhardt, 2013; Chen 등, 2020).

대표적 미생물발효차는 중국의 Puerh tea, 일본의 Goishicha와 Awaban-cha, 한국의 청태전 등의 미생물발효차가 생산되고 있으며, 미생물발효차는 동아시아에서 제한적으로 생산되고 있다(Kato 등, 1993; Kato 등, 1994; Lv 등, 2013; Kim 등, 2020). 또한, 각국의 미생물발효차는 환경에 따라 독특하게 발전되어 왔으며, 미생물의 대사 과정을 통해 고유한 차의 특성이 발현되고 발효 미생물의 차이에 의해 독특한 맛, 색, 향을 가지게 된다(Kim 등, 2020). 중국의 Puerh tea는 곰팡이류인 Aspergillus spp.와 Penicillium spp. 등에 의한 발효가 주를 이루고 있다(Abe 등, 2008; Zhao 등, 2010; Tian 등, 2013; Kim 등, 2017a). 이에 반해 청태전과 일본의 Awaban-cha는 박테리아가 우점하며 각각 Pantoea sp.와 Lactobacillus sp.가 우점한다(Kim 등, 2020).

미생물발효차는 제다 방법과 발효 환경에 따라 다른 미생물들과 상호작용을 통해 군집을 형성하고, 미생물 군집의 특성은 개별적으로 존재하는 미생물과는 다른 특성을 가지며, 각 미생물 사이의 대사 작용을 통해 독창적인 발현적 특성을 가진다(Kim 등, 2017a; 2020). 따라서 미생물 각 개체를 분리하여 각각의 특성을 이해하는 것보다 미생물 군집분석을 통해 전체를 이해하는 것이 매우 중요하며, 미생물 간의 상호작용을 통해 고유한 특성을 갖는 미생물발효차에 있어 미생물 군집 구조를 규명하는 것은 미생물발효차의 특성과 품질을 파악하는 데 매우 중요하다고 판단된다. 이에 미생물 군집 구조를 조사하는 방법은 16S rRNA gene 염기서열분석을 통한 분자 생태학적 기법을 이용한 미생물 간 상호적 생태학적인 관계를 규명하기 위해 널리 사용되고 있다(Kim 등, 2010; 2014).

본 연구에서는 한국과 일본의 전통 발효차인 청태전과 Goishicha의 발효 미생물을 규명하고자 하였으며, 이와 함께 차의 맛과 품질에 큰 영향을 미치는 아미노산의 공통점과 차이점을 분석하였다. 한국의 청태전과 일본 Goishicha의 발효 미생물 규명은 미생물발효차 특성과 품질 향상을 위해 필요한 연구로 분자 생태학적 기법을 통해 분석했으며, 미생물의 생태학적 기초 지식은 미생물발효 과정에서 미생물 간의 상호작용을 이해하는 데 기여할 것으로 판단된다.

시료

미생물발효차는 2016년 제조된 청태전(Jangheong, Jeonnam, Korea)과 일본의 Goishicha(Ōtoyo, Japan)를 분석하였다.

DNA extract

Total DNA 추출은 0.5 g의 미생물발효차를 사용했으며, Fast DNA Spin kit for Soil(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)을 이용하여 분리하였고, 분리된 DNA의 농도 및 순도는 NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)을 이용하여 확인하였다.

PCR for microbial diversity(DG-DGGE)

미생물 다양성을 확인하기 위해 시료로부터 분리된 DNA를 1차 PCR과 nested-PCR을 수행하였다(Muyzer 등, 1993; Muyzer, 1999). 1차 PCR은 27F(5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′)와 1541R(5′-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3′)을 이용하였으며, 50 μL 안에 1× PCR buffer, 20 mM MgCl2, 40 mM dNTP mixture, 각 primer(1 μM), template DNA와 0.5 U Taq polymerase를 첨가하였다. PCR 반응조건은 94°C에서 5 min 동안 pre-denaturation 시킨 후, 94°C에서 45 s denaturation, 56°C에서 45 s annealing, 72°C에서 45 s extension을 25 cycles 수행한 후 72°C에서 7 min 동안 final extension을 수행하였다. PCR 산물은 ethidium bromide 염색 후 1% agarose gel에서 확인하였다. Double Gradient-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DG-DGGE) 분석을 위해 1차 PCR의 증폭산물을 주형으로 2차 PCR을 수행하였으며, 이때 16S rDNA를 증폭하기 위해 사용된 primer는 40개의 GC clamp가 붙은 341F-GC(5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′)와 786R(5′-CTA CCA GGG TAT CTA ATC-3′)을 이용하였다(Ishii와 Fukui, 2001; Jaspers 등, 2001; Forney 등, 2004). 2차 PCR을 위한 PCR mixture는 1차 PCR에 사용된 것과 동일하며, 사용된 PCR 반응조건은 94°C에서 5 min 동안 DNA를 pre-denaturation 시켜, 94°C에서 45 s denaturation, 60°C에서 45 s annealing, 72°C에서 45 s extension하고 72°C에서 7 min 동안 final extension을 수행하였다. Annealing 온도는 60°C에서 시작해 1 cycle 당 0.5°C 감소하게 20 cycles 수행하였고, 추가로 50°C에서 15 cycles를 수행하여 touch-down PCR을 완료하였다. 얻어진 2차 PCR의 산물을 이용하여 DG-DGGE를 수행하였다(Muyzer 등, 1993).

DG-DGGE 조건

PCR 산물은 DcodeTM System(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 DG-DGGE를 수행하였다(Muyzer 등, 1993; Kim 등, 2020). DG-denaturing gradient gel은 8~12% polyacrylamide(acrylamide:bisacrylamide=37.5: 1)에 urea와 formamide 변성제를 40~70%까지 농도구배가 형성되도록 제작하였으며, 제작된 DG-DGGE gel에 PCR 증폭산물을 30 μL씩 loading 하여 1× TAE buffer(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA, pH 8.0)에서 60°C, 110 V로 21시간 동안 전기영동 하였다. 전기영동을 마친 DG-DGGE gel은 ethidium bromide(1:10,000)에서 염색한 후 UV illuminator로 확인하였다(Kim 등, 2020).

16S rRNA gene clone library를 통한 박테리아 군집분석

16S rRNA gene clone library 분석을 위해 27F(5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′)와 1541R(5'-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3')을 사용하여 PCR을 수행하였다(Forney 등, 2004). 각각의 primer를 이용하여 50 μL 안에 10× PCR buffer, 20 mM MgCl2, 40 mM dNTP mixture, 각 primer(1 μM), template DNA와 0.5 U Taq polymerase를 첨가하여 PCR mixture를 만들었다. 반응조건은 94°C에서 5 min 동안 DNA를 pre-denaturation 시켜, 94°C에서 1 min denaturation, 60°C에서 1 min annealing, 72°C에서 1 min 30 s extension하고 72°C에서 5 min 동안 final extension을 수행하였다. 16S rRNA gene clone library 구축을 위해 PCR 증폭산물을 1.5% agarose gel에 loading 한 후 약 1,500 bp 크기의 band를 잘라, HiGeneTM Gel & PCR Purification System(Biofact, Daejeon, Korea)을 이용하여 정제한 후, All-in-one vector(Biofact)에 ligation하고, 이 ligation mixture를 E. coli DH5α(RBC, Taipei, Taiwan)에 넣은 후 LB+kanamycin (50 μg/mL) 배지에서 키워 생성된 colony의 염기서열을 확인하였다.

염기서열 분석

DG-DGGE gel에서 다른 위치에 나타난 DNA 단편들을 회수하였다. 다른 위치의 band를 잘라 3차 DW 50 μL를 첨가하고 4°C에서 하룻밤 동안 보관하여 상등액을 취했다. Band에서 회수한 DNA를 주형으로 nested PCR에 사용한 primer(341F-GC, 786R)를 이용하여 재증폭하였으며, PCR 산물은 agarose gel에서 전기영동 하여 HiGeneTM Gel & PCR Purification System(Biofact)으로 정제한 후 cloning 하였다. Cloning은 All-in-one vector(Biofact)를 이용했으며, 삽입된 16S rRNA 유전자의 염기서열은 3730xl DNA Analyzer(Thermo Scientific)를 이용하여 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)의 GenBank database를 이용하여 BLAST search를 통해 분석하였다. 또한, phylogenetic tree는 ClusterX를 이용하여 미생물 간의 상동성을 분석하고, MEGA 5.0의 neighbor-joining method를 이용하여 유전적 계통분류를 수행하였다(Kim 등, 2020).

미생물발효차 미생물 군집 비교를 위한 정량 real-time PCR

시료별 미생물의 군집 크기를 정량적으로 평가하기 위해 qPCR을 수행하였다. 미생물 군집을 정량하기 위해 27F와 518R(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3') primer를 이용하였고(Murray 등, 1996), E. coil DH5α의 total DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 491 bp의 PCR 산물을 얻었다. 또한, 곰팡이 군집의 정량을 위해 SR-4F(5′-AG CCG CGG TAA TTC CAG CT-3′)와 SR-7R(5′-TCC TTG GGC AAA TGC TTT CGC-3′)을 이용하였고, Aspergillus total DNA를 주형으로 하여 388 bp의 PCR 산물을 얻었다(Nakayama 등, 1996). 고세균 군집의 정량을 위해서는 arch-21F(5′-TCC GGT TGA TCC YGC CGG-3′)와 arch-516R(5′-GGT DTT ACC GCG GCK GCT G-3′)을 이용하였고, 청태전 total DNA를 이용하여 496 bp의 PCR 산물을 확보하였다(Kim 등, 2017b). 각각의 PCR 산물은 All-in-one vector(Biofact)에 cloning 하였으며, plasmid DNA는 HiGeneTM Plasmid Mini Prep Kit(Biofact)을 이용하여 분리하였다. 염기서열분석은 M13-20F and M13-20R(All-in-one Vector Systems manual) primer를 이용하여 분석하였고, BLAST search를 통해 확인하였다. 염기서열이 확인된 plasmid DNA는 real-time PCR을 이용하여 melting curve(Bio-Rad) 분석 후 정량분석을 위한 표준 유전자(artificial standard clone)로 사용하였다. 정량 PCR을 위해 CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)과 iTaqTM SYBR® Green Supermix with ROX(Bio-Rad)를 이용하였다. 미생물 16S rRNA 유전자 정량 PCR은 각각의 primer를 이용했으며, 반응조건은 95°C에서 15 min 동안 pre-denaturation 시켜 95°C에서 30 s denaturation, 67°C에서 30 s annealing, 72°C에서 30 s extension 후 fluorescence를 측정하고 45 cycles를 수행하였다. 그리고 final extension은 72°C에서 5 min 동안 수행하였다. Melting curve 분석은 65°C부터 95°C까지 0.2°C씩 증가시키면서 fluorescence를 측정하였다. 곰팡이 군집과 고세균의 정량을 위해서 앞서 사용된 PCR program을 이용했으며, annealing 온도는 69°C와 68°C에서 각각 수행하였다. 정량을 위해 표준유전자를 serial dilutions 하여 real time-PCR을 수행하였으며, DNA 농도는 NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific)을 이용하여 1 ng/μL를 분석하였다(Kim 등, 2012; 2014).

아미노산 분석

미생물 후발효차를 분쇄기를 이용하여 분쇄한 후 분말 시료 0.5 g에 증류수 10 mL를 가한 다음 고압멸균기에서 90 °C에서 10분 동안 중탕한 뒤 상등액 500 μL를 취하고, 5% trichloroacetic acid 500 μL를 첨가하여 혼합한다. 혼합된 시료를 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액 100 μL를 새로운 EP tube로 옮긴 후 0.02 N HCl을 첨가한 후 0.2 μm syringe filtering하고 amino acid analyzer(High-Speed Amino Acid Analyzer LA8080 Amino SAYA, Hitachi High-Tech, Tokyo, Japan)로 분석하였다. 분석에 사용된 column은 4.6 mm ID×60 mm(Resin: Hitachi custom ion exchange resin)를 사용했으며, 이동물질은 ninhydrin reagent를 사용했고, 유속은 0.3 mL/min, column 온도는 135°C에서 분석하였다. 또한, 분석 시 주입량은 20 μL를 사용하였고 570 nm와 440 nm에서 분석하였다.

통계분석

아미노산 분석은 3회 반복하여 진행하였고 각 시료의 실험 결과는 평균±표준편차로 나타냈으며, 각 실험 결과의 통계적 유의성 검토는 청태전의 아미노산 성분과 비교하여 Student’s t-test에 의해 판정하였으며, P값이 0.05 또는 0.01 미만일 때 유의성이 있다고 판단하였다.

미생물발효차는 동아시아의 한국, 일본, 중국 등에서 생산되고 있으며 녹차와 홍차와는 매우 다른 맛과 향을 낸다. 세계적으로 가장 유명한 중국 보이차의 주요 발효 미생물은 Aspergillus로 곰팡이가 우점하며, 박테리아가 우점하는 한국과 일본의 미생물발효차와는 구분된다(Park 등, 2008; Kim 등, 2017a; 2017b; 2020). 본 연구에서는 중국 미생물발효차와 구분되는 한국과 일본의 미생물발효차의 품질을 결정짓는 미생물 군집 구조를 분석하여 한국 전통 미생물발효차의 독창성을 밝히는 데 기초자료를 제공하고자 한다.

미생물발효차 우점 미생물 군집 크기 분석

동아시아 3개국의 미생물발효차를 시료로 하여 곰팡이, 박테리아, 고세균의 총균수를 측정하여 우점하는 발효 미생물 군집의 크기를 real time PCR을 이용하여 측정하였다(Fig. 1). 박테리아 총균수는 청태전 2.955×108±2.216×107 molecule・copy/μL, Goishicha 2.696×108±2.362×107 molecule・copy/μL, 보이차는 7.355×106±2.858×105 molecule・copy/μL로 분석되었다(Fig. 1A). 청태전과 Goishicha의 박테리아 군집 크기는 2.69×108 molecule・copy/μL 이상으로 분석되어 청태전과 Goishicha 박테리아 군집이 보이차 박테리아 군집에 비해 약 40.1배와 36.6배 큰 것으로 각각 분석되었다. 곰팡이 총균수는 청태전 1.125×104±3.289×103 molecule・copy/μL, Goishicha 1.588×104±2.019×103 molecule・copy/μL, 보이차 8.595×104±1.098×103 molecule・copy/μL로 분석되었다(Fig. 1B). 보이차의 곰팡이 군집의 크기는 청태전 7.64배, Goishicha 5.41배 더 큰 것을 확인할 수 있었다. 또한 고세균 총균수는 청태전 4.892×103±1.752×102 molecule・copy/μL, Goishicha 2.790×103±1.359×102 molecule・copy/μL, 보이차 2.666×103±1.578×102 molecule・copy/μL로 확인되었다(Fig. 1C). 분석한 미생물발효차 3종의 고세균 군집 크기는 Goishicha와 보이차가 비슷한 군집의 크기를 가지며, 청태전 고세균 군집 크기는 Goishicha와 보이차보다 약 1.75~1.84배 크게 분석되었다. 그러나 3종의 미생물발효차에서 모두 103 molecule・copy/μL 수준의 군집 크기가 확인되어 박테리아 총균수와 비교해 매우 적은 군집의 크기를 확인할 수 있었다.

Fig. 1. Comparison of microbial community size in Korean and Japanese post-fermented teas. A: bacterial 16S rRNA gene, B: fungal 18S rRNA gene, C: archaeal 16S rRNA.

중국 미생물발효차인 보이차 내 발효 미생물은 Aspergillus sp., Penicillium sp.와 Blastobotrys sp. 등의 곰팡이가 우점하며 찻잎의 생물전환에 관여하고 있다(Zhao 등, 2015a; Kim 등, 2017a; Li 등, 2018; Liu 등, 2021). 그러나 한국 미생물발효차인 청태전과 일본의 아와반차는 Pantoea sp., Lactobacillus sp.와 Sphingomonas sp. 등의 박테리아가 우점하는 것으로 보고되었다(Kim 등, 2020). 본 연구를 통해 미생물발효차 3종의 미생물 군집 크기를 분석한 결과, 보이차는 곰팡이 군집이 우점하며 청태전과 Goishicha는 박테리아 군집이 우점하는 것을 확인했다. 이 결과를 통해 보이차는 곰팡이 군집에 의해 발효가 일어나며, 청태전과 Goishicha는 박테리아에 의한 생물전환과정을 통해 고유의 특성을 갖는다고 추론할 수 있다.

DG-DGGE를 통한 미생물 군집분석

박테리아가 우점하는 한국과 일본의 미생물발효차 청태전과 Goishicha를 시료로 미생물 군집 구조 분석 방법의 하나인 DG-DGGE를 이용하여 시료 내의 박테리아 군집을 확인하였다(Muyzer, 1999; Kim 등, 2020)(Fig. 2). 미생물발효차 청태전과 Goishicha의 DG-DGGE gel로부터 각각 11개와 6개의 밴드를 확인하고 이 밴드를 회수하여 염기서열 분석하고 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)의 GenBank database를 이용하여 BLAST search(blastn)를 통해 상동성을 비교 검색하였다(Table 1). 청태전 우점 박테리아는 genus 수준에서 7개의 종으로 Thermobispora(band 1), Pantoea(band 2, 4, 6, 8, 10), uncultured γ-proteobacterium(band 3), Enterobacteriaceae(band 5), Rhizobium(band 7), Klebsiella(band 9), Oryzobacter(band 11)로 확인되었다. Goishicha 우점 박테리아는 5종으로 Paraburkholderia(band 12), Burkholderia(band 13, 15), uncultured Gemmobactor(band 14), Rothia(band 16), Granulicella(band 17)로 분석되었다. 청태전 우점 미생물 분석 결과 Pantoea sp.로 분석된 DG-DGGE band가 5개를 차지하였으며, 이들은 Pantoea cypripedii(NR118857, band 6, 8, 10), Pantoea ananatis(GU339282, band 4), Pantoea sp. ZYJG-2(KX887307, band 2)로 분석되었다. Goishicha에서는 Burkholderia로 분석된 DG-DGGE band가 2개, Paraburkholderia로 분석된 DG-DGGE band가 1개로 β-proteobacteria 미생물이 많이 관찰되었다(Fig. 3). 한국과 일본의 미생물발효차의 DG-DGGE를 통한 박테리아 군집 구조 분석 결과 공통으로 우점하는 미생물을 확인할 수 없었다. 이 결과를 통해 제다 방법에 따라 우점 미생물이 달라지는 것을 확인했다.

Table 1 . Identity of the bands obtained from 16S rRNA gene DG-DGGE bands and those of the closest relatives in the GenBank database, indicating the detected bacteria among Korean & Japanese post-fermented teas

Band No.Accession no.DescriptionSimilarity (%)Post-fermented tea
1NR027583Thermobispora bispora DSM 4383398%Chungtaejeon
2KX887307Pantoea sp. ZYJG-299%
3GU205302Uncultured gamma proteobacterium clone RSC_RRA0999%
4GU339282Pantoea ananatis EH5598%
5FJ357827Enterobacteriaceae bacterium PA298%
6NR118857Pantoea cypripedii ATCC 2926798%
7NR029184Rhizobium etli CFN 4299%
8NR118857Pantoea cypripedii ATCC 2926797%
9NR114152Klebsiella oxytoca NBRC 10259399%
10NR118857Pantoea cypripedii ATCC 2926798%
11NR137270Oryzobacter terrae PSGM2-1696%
12NR114117Paraburkholderia caledonica NBRC 10248891%Goishicha
13NR037064Burkholderia plantarii NIAES 172393%
14LT842611Uncultured Gemmobactor sp.91%
15NR114117Burkholderia caledonica NBRC 10248891%
16NR044873Rothia mucilaginosa DSM 2074693%
17NR115072Granulicella paludicola OB101094%


Fig. 2. DG-DGGE patterns of 16S rRNA gene fragments of bacteria in Korean and Japanese post-fermented teas. The DG-DGGE was electrophoresed on a 8∼12% poly acrylamide gel with a 40∼70% urea formamide gradient. The bright bands on the DGGE were excised and the amplified DNA fragments partially sequenced and compared to known sequences using BLAST. A: Chungtaejeon (Korea), B: Goishicha (Japan). U/F conc.: urea/formamide concentration, Acry/bisacryconc.: acrylamide/bis- acrylamide concentration.

Fig. 3. Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of bacteria in the post-fermented teas using the neighbor-joining methods. Bold: dominant community.

16S rRNA gene clone library를 통한 미생물 군집 다양성 분석

한국 미생물발효차 청태전의 박테리아 16S rRNA gene 군집분석 결과 5종의 박테리아가 분석되고, Pantoea sp.(55.81%), uncultured γ-proteobacterium(25.58%), Klebsiella sp.(11.63%)로 우점하였다(Fig. 3). 일본 미생물발효차 Goishicha에는 9종의 박테리아가 분석되었으며 Paraburkholderia sp.(40.44%), Pseudomonas sp.(22.22%) Ralstonia sp.(15.56%) 순으로 분석되었다(Fig. 4). 청태전에 우점하는 3종의 박테리아는 γ-proteobacteria(Cedecea sp., Pantoea sp., uncultured γ-proteobacterium, Klebsiella sp.)로 95.35%를 차지하고 α-proteobacteria(Rhodobacter sp.)가 4.65%로 분석되었다(Fig. 3) Goishicha에 우점하는 박테리아는 β-proteobacteria(Paraburkholderia sp., Ralstonia sp.)가 55.56%로 가장 우점하며, γ-proteobacteria(Pseudomonas sp., Dyella sp., Acinetobacter sp., Moraxella sp.) 33.33%, actinobacteria(Corynebacterium sp.) 4.44%, firmicues(Streptococcus sp.) 4.44%, spirochaetia(Leptospira sp.) 4.44% 순으로 확인되었다. 청태전은 γ-proteobacteria의 Pantoea sp.가 가장 우점하고 Goishicha는 β-proteobacteria의 Paraburkholderia sp.가 우점하는 것으로 분석되어 한국과 일본 미생물발효차의 발효 미생물 차이를 확인하였다.

Fig. 4. Dominant bacterial OTUs detected in Korean and Japanese post-fermented teas. A: Chungtaejeon (Korea), B: Goishicha (Japan).

Pantoea sp.는 eucalyptus와 차나무(Camellia sinensis) 잎에서 분리되며, Pantoea agglomerans는 저분자 항생제인 pantocin A와 pantocin B를 혐기성 상태에서 생성한다고 알려져 있다(Wright 등, 2006; Xie 등, 2020). 또한 meta-genome을 통해 떡차에서 우점하며, 한국 미생물발효차 청태전을 중국의 보이차와 일본의 아와반차와 구분하는 중요한 박테리아로 알려져 있다(Jin 등, 2003; Baik 등, 2012; Kim 등, 2017a; 2020). Pantoea agglomerans T71의 gallic acid decarboxylase는 polyphenol tannic acid와 gallic acid의 생물전환에 관여하고, gallic acid를 tannic acid로 전환할 수 있다(Zeida 등, 1998). 또한, Pantoea dispersa Y08은 carotenoids를 aroma compound로 전환한다고 보고되었다(Zhao 등, 2015b). 고농도 chloroform을 포함하는 혐기성 조건에서 탈염소화를 통한 성장이 가능하다(Shan 등, 2010). ParaburkholderiaBurkholderia 속으로 분류되었으나, 현재 새로이 분류하고 있다(Sawana 등, 2014). Paraburkolderia sacchari는 자일로스(xylose)를 자일론산(xylonic acid)과 자일리톨(xylitol; XyOH)로 전환할 수 있다. 자일론산(D-xylonic acid; XylAc)은 자연으로부터 얻을 수 있는 상위 30개의 플랫폼 화학물질로 인식되고 있으며, 자일론산은 글루콘산(D-gluconic acid)과 매우 유사한 구조를 가지며 다양한 식품산업에서 이를 대체할 수 있다(Bondar 등, 2021). 또한, pickled tea(lahpet)는 높은 농도의 gallic acid, epigallocatechin gallate와 epigallocatechin을 포함하고 있으며, 여름과 가을의 신선한 잎을 채취해 혐기성발효를 통해 생산되는데, Bacillus, Afipia, Bacteroides, Cutibacterium, Delftia, ShewanellaParaBurkholderia 가 pickled tea의 발효과정 중에 존재하는 것이 분석되었다(Zhang 등, 2020). 1960년대 초반, terpene으로부터 Pseudomonas 생물전환능을 이용한 고부가가치 향미 화합물 생산에 관한 연구가 진행되었다. 또한, 음식과 음료에 사용되는 천연 향미재료인 ethyl butyrate, ethyl hexanoate, perillyl alcohol, verbenol, perillic acid 등의 생산에도 Pseudomonas가 이용되었다(Molina 등, 2013; Li 등, 2019). Fu brick tea 숙성과정에서 초기에는 Klebsiella가 우점했지만, 발효가 진행될수록 Pseudomonas, Lactococcus, Stenotrophomonas, Enterococcus 및 Bacillus sp.로 빠르게 대체되었으며, 제조 공정이 끝날 때까지 안정적으로 유지되었다(Li 등, 2019). 또한, caffeine이 포함된 커피 폐수에서 Pseudomonas sp.가 caffeine을 완전히 분해하는 탁월한 능력을 확인하였다. 또한, 오랜 시간 찻잎을 생산한 농장의 토양미생물을 분석한 결과 catechin 분해 미생물인 PseudomonasBurkholderia가 증가하며, plant promoting bacteria(Bacillus 등)는 감소한다는 것을 확인했다(Arafat 등, 2020; Shanmugam 등, 2021).

아미노산 분석

청태전과 Goishicha에 우점 박테리아가 확연하게 차이가 나는 것을 DG-DGGE와 16S rRNA clone library를 통해 확인하였다. 이러한 우점 미생물의 차이는 미생물발효차가 숙성하는 발효과정에 차이를 가질 수 있으며, 최종 대사산물이 차이가 날 수 있음을 예상할 수 있다. 이를 확인하기 위해 차 맛에 영향을 미치는 아미노산을 amino acid analyzer를 이용하여 분석했으며, 청태전과 Goishicha의 발효산물의 차이를 확인하였다(Fig. 5, Table 2).

Table 2 . Amino acid content of the Korean & Japanese post-fermented teas using the amino acid analyzer (unit: mg/kg)

NameCheongtaejeonGoishicha
Theanine200.3±5.0147.14±0.78**
Aspartic acid59.38±1.07108.56±1.18**
Glutamate86.22±0.7335.80±0.05**
Ornithine57.26±0.9556.12±0.59
Phenylalanine31.68±0.3455.78±0.92**
Arginine20.92±0.0364.10±0.70**
Leucine13.40±0.1469.26±0.10**
Lysine17.12±0.1762.64±0.09**
Alanine22.78±0.2456.56±0.60**
Tryptophan24.02±0.0445.02±0.75**
NH332.54±0.3635.88±0.05**
P-Ser9.78±0.0252.26±0.55**
Valine2.80±0.0349.92±0.49**
Serine14.00±0.1419.54±0.21**
Isoleucine9.74±0.1021.70±0.21**
Threonine9.12±0.0921.40±0.23**
γ-Aminobutyric acid11.42±0.1215.92±0.17**
Glycine9.16±0.0915.00±0.15**
Taurine5.52±0.0617.04±0.17**
HistidineND19.40±0.19**
β-Alanine14.50±0.162.30±0.04**

Value are mean±standard deviation of triplications.

**P<0.01.



Fig. 5. Content of amino acids in the post-fermented teas. Asp, aspartic acid; Glu, glutamate; Orn, ornithine; Phe, phenylalanine; Arg, arginine; Leu, leucine; Lys, lysine; Ala, alanine; Tyr, tryptophan; Val, valine; Ser, serine; Ile, isoleucine; Thr, threonine; g-ABA, γ-aminobutyric acid; Gly, glycine; Tau, taurine; His, histidine; b-Ala, β-alanine. **P<0.01.

주요 아미노산인 theanine, aspartic acid, glutamate, γ-aminobutyric acid의 함량은 청태전에서 200.30±5.01 mg/kg, 59.38±1.07 mg/kg, 86.22±0.73 mg/kg, 11.42±0.12 mg/kg으로 확인되고, Goishicha는 47.14±0.78 mg/kg, 108.56±1.18 mg/kg, 35.80±0.05 mg/kg, 56.12±0.59 mg/kg으로 각각 분석되어, theanine과 glutamate는 청태전이 약 4.25배, 2.41배 높고 aspartic acid와 γ-aminobutyric acid는 Goishicha가 1.83배, 1.39배 높으며 통계적 유의성이 확인되었다. Theanine은 찻잎에 함유된 성분으로 안정감을 느끼게 하는 알파파(α-wave)의 발생을 증가시켜 집중력을 강화하며, 긴장 완화를 통한 스트레스 경감에 탁월한 효과가 있고 혈압감소, 신경보호, 차의 감칠맛에 영향을 미치며 차의 품질평가 시 중요한 지표로 활용되고 있다(Sakato, 1949; Moon 등, 2020). 추가로 비발효차인 녹차에서 아미노산 함량 구성은 theanine, arginine, glutamate, histidine, aspartic acid, serine, alanine 순으로 높았다. 청태전은 theanine(200.30±5.01 mg/kg)이 가장 높고, glutamate(86.22±0.73 mg/kg), aspartic acid(59.38±1.07 mg/kg), ornithine(57.26±0.95 mg/kg) 순으로 녹차 아미노산 구성과 유사한 것을 확인할 수 있다. 그러나, Goishicha는 aspartic acid(108.56±1.18 mg/kg)가 가장 높으며, leucine(69.26±0.10 mg/kg), arginine(64.10±0.70 mg/kg), lysine(62.64±0.09 mg/kg)으로 확인되어 녹차 및 청태전과는 다른 아미노산 구성 차이를 확인하였다(Fig. 5, Table 2). 향후 발효과정에 따라 발효 미생물과 아미노산 함량과의 관계 규명에 관한 연구를 수행하여야 할 것이다.

본 연구에서는 한국과 일본의 미생물발효차인 청태전과 Goishicha의 미생물 군집 및 아미노산 함량 분석을 수행하였다. 청태전과 Goishicha는 박테리아가 우점하며, 청태전은 Pantoea sp., Goishicha는 Parburkholderia sp., Pseudomonas sp.가 우점하는 것을 확인하였다. 또한, 아미노산 분석 결과 청태전은 theanine이, Goishicha는 aspartic acid의 함량이 가장 높았다. Pantoea sp., Parburkholderia sp., Pseudomonas sp.는 찻잎 내 다양한 성분의 전환능에 대해 보고되었다. 위 결과로부터 미생물발효차 내에 우점하는 박테리아는 미생물발효차 제다 과정에 따라 특이적 발효 미생물이 우점하며, 차의 품질을 결정짓는 중요한 역할을 한다고 추론할 수 있다. 미생물발효차의 미생물 군집분석을 통해 미생물발효차 최종 품질 특성이 각각 다르게 발현되며, 우점 미생물의 생물전환 대사 과정 및 효능에 관한 연구를 통해 더 많은 지식이 축적되기를 기대한다. 향후 미생물발효차 청태전의 제다 표준화가 필요하며 발효 기간에 따른 미생물 군집 상의 변화와 차의 숙성 정도에 따른 성분분석이 필요할 것으로 판단된다.

미생물발효차는 차나무(Camellia sinensis (L.) O Kuntze)의 잎이 미생물 발효과정을 거쳐 생산된다. 본 연구에서 미생물발효차의 주요 미생물을 확인하기 위해 미생물 군집 크기를 real-time PCR로 분석하였다. 또한, 한국의 청태전, 일본의 Goishicha에 우점하는 박테리아 분석을 위해 double gradient-denaturing gradient gel electrophoresis (DG-DGGE)와 16S rRNA gene clone library 기법으로 분석하였다. 그 결과, 청태전과 Goishicha 모두 박테리아가 우점하는 것을 확인했으며, 청태전에 우점하는 박테리아는 γ-proteobacteria Pantoea sp.였다. 그러나 Goishicha에 우점하는 박테리아는 β-proteobacteria Parburkholderia sp.와 γ-proteobacteria Pseudomonas sp.임을 확인했다. 또한, 아미노산 분석 결과 청태전은 theanine이 가장 높은 함량을 보였고, Goishicha에는 aspartic acid가 가장 높게 분석되었다. 본 연구를 통해 한국과 일본 미생물발효차의 독창성과 미생물 간의 상호작용을 이해하는 데 도움이 될 것으로 기대한다.

본 연구는 2017년도 농촌진흥청 국립원예특작과학원 박사후연수과정지원사업(과제번호: PJ012565012017)에 의해 이루어진 것임.

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Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(5): 483-492

Published online May 31, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.5.483

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

한국의 청태전과 일본 Goishicha의 미생물 군집 및 아미노산 분석

김병혁1․문경환1․임찬규1․김천환2․문두경1

1농촌진흥청 국립원예특작과학원 온난화대응농업연구소
2농촌진흥청 국립원예특작과학원 파속채소연구소

Received: January 25, 2022; Revised: April 13, 2022; Accepted: April 14, 2022

Analysis of Microbial Diversity and Amino Acids of Korean-Chungtaejeon and Japanese-Goishicha

Byung-Hyuk Kim1 , Kyung Hwan Moon1, Chankyu Lim1, Chun Hwan Kim2, and Doo-Gyung Moon1

1Agricultural Research Institute for Climate Change and 2Allium Vegetable Research Institute, National Institute of Horticultural and Herbal Science, RDA

Correspondence to:Doo-Gyung Moon, 1285, Ayeon-ro, Jeju-si, Jeju-do 63240, Korea, E-mail: dgmoon@korea.kr

Received: January 25, 2022; Revised: April 13, 2022; Accepted: April 14, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Post-fermented tea is produced by the microbial fermentation process using tea plant leaves (Camellia sinensis (L.) O Kuntze). In this study, the size of the microbial community was analyzed by real-time PCR, to determine the major microorganisms involved in the fermentation process. Also, the bacterial community analysis of East-Asian traditional post-fermented tea (Korean Chungtaejeon and Japanese Goishicha) were investigated using double gradient- denaturing gradient gel electrophoresis and 16S rRNA gene clone library technique through 16S rRNA gene analysis. Our results confirmed that both Chungtaejeon and Goishicha were dominated by the bacterial community. Phylogenetic analysis determined the dominant species in post-fermented tea Cheongtaejeon was γ-proteobacteria Pantoea sp., and those in Goishicha were β-proteobacteria Parburkholderia sp. and γ-proteobacteria Pseudomonas sp. In addition, amino acid analysis revealed that the contents of theanine and aspartic acid were highest in Cheongtaejeon and Goishicha, respectively. We believe that the results of this study will contribute to understanding the fermentation and interaction among microorganisms of post-fermented tea in Korea and Japan.

Keywords: amino acid, Camellia sinensis, Pantoea sp., post-fermented tea, tea plants

서 론

차(茶)는 물 다음으로 소비되는 범세계적인 음료이다. 차의 종류는 녹차(green tea), 반발효차(semi-oxidation tea), 완전발효차(oxidation tea) 및 후발효차(post-fermentation) 등으로 제다 방법에 따라 구분되며, 제다시 방법과 발효 정도 및 추출 방법에 따라 추출물 내의 맛과 성분에 차이를 가진다(Shon 등, 2004; Moon 등, 2015). 이러한 분류법에 따라 사용되는 발효는 제다시에 관행적으로 사용되고 있으며, 과학적 의미인 미생물의 작용 여부 및 정도를 의미하는 발효(fermentation)가 아닌 생엽 중에 존재하는 내생 효소(endogenous enzymes)의 산화작용(oxidation)을 발효라 정의하고 있다. 제다에서 사용되는 ‘발효’는 과학적 정의에는 부합하지 않으나 차 분야에서 오랜 시간 사용된 용어로 부정확성을 인지하고 있음에도 불구하고 관용적으로 사용되고 있다(Moon 등, 2015). 미생물의 대사 과정을 통해 제조된 차는 미생물발효차(post-fermented tea, 후발효차 or dark tea, 흑차)로 구분되고 있다(Kim 등, 2017b). 미생물발효차는 미생물의 대사 과정을 통해 gallic acid, methoxy phenolic compound, poly-flavonoids가 증가하여 항균 작용, 혈중 콜레스테롤 감소 효과, 항산화 활성 등이 보고되었다(Lv 등, 2013; Zhang 등, 2013). 또한, 차에 함유된 아미노산(glutamate, alanine, lysine, tyrosine, theanine 등)은 성분과 함량의 차이로 인해 맛에 영향을 주며 품질과 가격에 영향을 준다고 알려져 있다(Horanni와 Engelhardt, 2013; Chen 등, 2020).

대표적 미생물발효차는 중국의 Puerh tea, 일본의 Goishicha와 Awaban-cha, 한국의 청태전 등의 미생물발효차가 생산되고 있으며, 미생물발효차는 동아시아에서 제한적으로 생산되고 있다(Kato 등, 1993; Kato 등, 1994; Lv 등, 2013; Kim 등, 2020). 또한, 각국의 미생물발효차는 환경에 따라 독특하게 발전되어 왔으며, 미생물의 대사 과정을 통해 고유한 차의 특성이 발현되고 발효 미생물의 차이에 의해 독특한 맛, 색, 향을 가지게 된다(Kim 등, 2020). 중국의 Puerh tea는 곰팡이류인 Aspergillus spp.와 Penicillium spp. 등에 의한 발효가 주를 이루고 있다(Abe 등, 2008; Zhao 등, 2010; Tian 등, 2013; Kim 등, 2017a). 이에 반해 청태전과 일본의 Awaban-cha는 박테리아가 우점하며 각각 Pantoea sp.와 Lactobacillus sp.가 우점한다(Kim 등, 2020).

미생물발효차는 제다 방법과 발효 환경에 따라 다른 미생물들과 상호작용을 통해 군집을 형성하고, 미생물 군집의 특성은 개별적으로 존재하는 미생물과는 다른 특성을 가지며, 각 미생물 사이의 대사 작용을 통해 독창적인 발현적 특성을 가진다(Kim 등, 2017a; 2020). 따라서 미생물 각 개체를 분리하여 각각의 특성을 이해하는 것보다 미생물 군집분석을 통해 전체를 이해하는 것이 매우 중요하며, 미생물 간의 상호작용을 통해 고유한 특성을 갖는 미생물발효차에 있어 미생물 군집 구조를 규명하는 것은 미생물발효차의 특성과 품질을 파악하는 데 매우 중요하다고 판단된다. 이에 미생물 군집 구조를 조사하는 방법은 16S rRNA gene 염기서열분석을 통한 분자 생태학적 기법을 이용한 미생물 간 상호적 생태학적인 관계를 규명하기 위해 널리 사용되고 있다(Kim 등, 2010; 2014).

본 연구에서는 한국과 일본의 전통 발효차인 청태전과 Goishicha의 발효 미생물을 규명하고자 하였으며, 이와 함께 차의 맛과 품질에 큰 영향을 미치는 아미노산의 공통점과 차이점을 분석하였다. 한국의 청태전과 일본 Goishicha의 발효 미생물 규명은 미생물발효차 특성과 품질 향상을 위해 필요한 연구로 분자 생태학적 기법을 통해 분석했으며, 미생물의 생태학적 기초 지식은 미생물발효 과정에서 미생물 간의 상호작용을 이해하는 데 기여할 것으로 판단된다.

재료 및 방법

시료

미생물발효차는 2016년 제조된 청태전(Jangheong, Jeonnam, Korea)과 일본의 Goishicha(Ōtoyo, Japan)를 분석하였다.

DNA extract

Total DNA 추출은 0.5 g의 미생물발효차를 사용했으며, Fast DNA Spin kit for Soil(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)을 이용하여 분리하였고, 분리된 DNA의 농도 및 순도는 NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)을 이용하여 확인하였다.

PCR for microbial diversity(DG-DGGE)

미생물 다양성을 확인하기 위해 시료로부터 분리된 DNA를 1차 PCR과 nested-PCR을 수행하였다(Muyzer 등, 1993; Muyzer, 1999). 1차 PCR은 27F(5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′)와 1541R(5′-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3′)을 이용하였으며, 50 μL 안에 1× PCR buffer, 20 mM MgCl2, 40 mM dNTP mixture, 각 primer(1 μM), template DNA와 0.5 U Taq polymerase를 첨가하였다. PCR 반응조건은 94°C에서 5 min 동안 pre-denaturation 시킨 후, 94°C에서 45 s denaturation, 56°C에서 45 s annealing, 72°C에서 45 s extension을 25 cycles 수행한 후 72°C에서 7 min 동안 final extension을 수행하였다. PCR 산물은 ethidium bromide 염색 후 1% agarose gel에서 확인하였다. Double Gradient-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DG-DGGE) 분석을 위해 1차 PCR의 증폭산물을 주형으로 2차 PCR을 수행하였으며, 이때 16S rDNA를 증폭하기 위해 사용된 primer는 40개의 GC clamp가 붙은 341F-GC(5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′)와 786R(5′-CTA CCA GGG TAT CTA ATC-3′)을 이용하였다(Ishii와 Fukui, 2001; Jaspers 등, 2001; Forney 등, 2004). 2차 PCR을 위한 PCR mixture는 1차 PCR에 사용된 것과 동일하며, 사용된 PCR 반응조건은 94°C에서 5 min 동안 DNA를 pre-denaturation 시켜, 94°C에서 45 s denaturation, 60°C에서 45 s annealing, 72°C에서 45 s extension하고 72°C에서 7 min 동안 final extension을 수행하였다. Annealing 온도는 60°C에서 시작해 1 cycle 당 0.5°C 감소하게 20 cycles 수행하였고, 추가로 50°C에서 15 cycles를 수행하여 touch-down PCR을 완료하였다. 얻어진 2차 PCR의 산물을 이용하여 DG-DGGE를 수행하였다(Muyzer 등, 1993).

DG-DGGE 조건

PCR 산물은 DcodeTM System(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 DG-DGGE를 수행하였다(Muyzer 등, 1993; Kim 등, 2020). DG-denaturing gradient gel은 8~12% polyacrylamide(acrylamide:bisacrylamide=37.5: 1)에 urea와 formamide 변성제를 40~70%까지 농도구배가 형성되도록 제작하였으며, 제작된 DG-DGGE gel에 PCR 증폭산물을 30 μL씩 loading 하여 1× TAE buffer(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA, pH 8.0)에서 60°C, 110 V로 21시간 동안 전기영동 하였다. 전기영동을 마친 DG-DGGE gel은 ethidium bromide(1:10,000)에서 염색한 후 UV illuminator로 확인하였다(Kim 등, 2020).

16S rRNA gene clone library를 통한 박테리아 군집분석

16S rRNA gene clone library 분석을 위해 27F(5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′)와 1541R(5'-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3')을 사용하여 PCR을 수행하였다(Forney 등, 2004). 각각의 primer를 이용하여 50 μL 안에 10× PCR buffer, 20 mM MgCl2, 40 mM dNTP mixture, 각 primer(1 μM), template DNA와 0.5 U Taq polymerase를 첨가하여 PCR mixture를 만들었다. 반응조건은 94°C에서 5 min 동안 DNA를 pre-denaturation 시켜, 94°C에서 1 min denaturation, 60°C에서 1 min annealing, 72°C에서 1 min 30 s extension하고 72°C에서 5 min 동안 final extension을 수행하였다. 16S rRNA gene clone library 구축을 위해 PCR 증폭산물을 1.5% agarose gel에 loading 한 후 약 1,500 bp 크기의 band를 잘라, HiGeneTM Gel & PCR Purification System(Biofact, Daejeon, Korea)을 이용하여 정제한 후, All-in-one vector(Biofact)에 ligation하고, 이 ligation mixture를 E. coli DH5α(RBC, Taipei, Taiwan)에 넣은 후 LB+kanamycin (50 μg/mL) 배지에서 키워 생성된 colony의 염기서열을 확인하였다.

염기서열 분석

DG-DGGE gel에서 다른 위치에 나타난 DNA 단편들을 회수하였다. 다른 위치의 band를 잘라 3차 DW 50 μL를 첨가하고 4°C에서 하룻밤 동안 보관하여 상등액을 취했다. Band에서 회수한 DNA를 주형으로 nested PCR에 사용한 primer(341F-GC, 786R)를 이용하여 재증폭하였으며, PCR 산물은 agarose gel에서 전기영동 하여 HiGeneTM Gel & PCR Purification System(Biofact)으로 정제한 후 cloning 하였다. Cloning은 All-in-one vector(Biofact)를 이용했으며, 삽입된 16S rRNA 유전자의 염기서열은 3730xl DNA Analyzer(Thermo Scientific)를 이용하여 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)의 GenBank database를 이용하여 BLAST search를 통해 분석하였다. 또한, phylogenetic tree는 ClusterX를 이용하여 미생물 간의 상동성을 분석하고, MEGA 5.0의 neighbor-joining method를 이용하여 유전적 계통분류를 수행하였다(Kim 등, 2020).

미생물발효차 미생물 군집 비교를 위한 정량 real-time PCR

시료별 미생물의 군집 크기를 정량적으로 평가하기 위해 qPCR을 수행하였다. 미생물 군집을 정량하기 위해 27F와 518R(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3') primer를 이용하였고(Murray 등, 1996), E. coil DH5α의 total DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 491 bp의 PCR 산물을 얻었다. 또한, 곰팡이 군집의 정량을 위해 SR-4F(5′-AG CCG CGG TAA TTC CAG CT-3′)와 SR-7R(5′-TCC TTG GGC AAA TGC TTT CGC-3′)을 이용하였고, Aspergillus total DNA를 주형으로 하여 388 bp의 PCR 산물을 얻었다(Nakayama 등, 1996). 고세균 군집의 정량을 위해서는 arch-21F(5′-TCC GGT TGA TCC YGC CGG-3′)와 arch-516R(5′-GGT DTT ACC GCG GCK GCT G-3′)을 이용하였고, 청태전 total DNA를 이용하여 496 bp의 PCR 산물을 확보하였다(Kim 등, 2017b). 각각의 PCR 산물은 All-in-one vector(Biofact)에 cloning 하였으며, plasmid DNA는 HiGeneTM Plasmid Mini Prep Kit(Biofact)을 이용하여 분리하였다. 염기서열분석은 M13-20F and M13-20R(All-in-one Vector Systems manual) primer를 이용하여 분석하였고, BLAST search를 통해 확인하였다. 염기서열이 확인된 plasmid DNA는 real-time PCR을 이용하여 melting curve(Bio-Rad) 분석 후 정량분석을 위한 표준 유전자(artificial standard clone)로 사용하였다. 정량 PCR을 위해 CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)과 iTaqTM SYBR® Green Supermix with ROX(Bio-Rad)를 이용하였다. 미생물 16S rRNA 유전자 정량 PCR은 각각의 primer를 이용했으며, 반응조건은 95°C에서 15 min 동안 pre-denaturation 시켜 95°C에서 30 s denaturation, 67°C에서 30 s annealing, 72°C에서 30 s extension 후 fluorescence를 측정하고 45 cycles를 수행하였다. 그리고 final extension은 72°C에서 5 min 동안 수행하였다. Melting curve 분석은 65°C부터 95°C까지 0.2°C씩 증가시키면서 fluorescence를 측정하였다. 곰팡이 군집과 고세균의 정량을 위해서 앞서 사용된 PCR program을 이용했으며, annealing 온도는 69°C와 68°C에서 각각 수행하였다. 정량을 위해 표준유전자를 serial dilutions 하여 real time-PCR을 수행하였으며, DNA 농도는 NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific)을 이용하여 1 ng/μL를 분석하였다(Kim 등, 2012; 2014).

아미노산 분석

미생물 후발효차를 분쇄기를 이용하여 분쇄한 후 분말 시료 0.5 g에 증류수 10 mL를 가한 다음 고압멸균기에서 90 °C에서 10분 동안 중탕한 뒤 상등액 500 μL를 취하고, 5% trichloroacetic acid 500 μL를 첨가하여 혼합한다. 혼합된 시료를 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액 100 μL를 새로운 EP tube로 옮긴 후 0.02 N HCl을 첨가한 후 0.2 μm syringe filtering하고 amino acid analyzer(High-Speed Amino Acid Analyzer LA8080 Amino SAYA, Hitachi High-Tech, Tokyo, Japan)로 분석하였다. 분석에 사용된 column은 4.6 mm ID×60 mm(Resin: Hitachi custom ion exchange resin)를 사용했으며, 이동물질은 ninhydrin reagent를 사용했고, 유속은 0.3 mL/min, column 온도는 135°C에서 분석하였다. 또한, 분석 시 주입량은 20 μL를 사용하였고 570 nm와 440 nm에서 분석하였다.

통계분석

아미노산 분석은 3회 반복하여 진행하였고 각 시료의 실험 결과는 평균±표준편차로 나타냈으며, 각 실험 결과의 통계적 유의성 검토는 청태전의 아미노산 성분과 비교하여 Student’s t-test에 의해 판정하였으며, P값이 0.05 또는 0.01 미만일 때 유의성이 있다고 판단하였다.

결과 및 고찰

미생물발효차는 동아시아의 한국, 일본, 중국 등에서 생산되고 있으며 녹차와 홍차와는 매우 다른 맛과 향을 낸다. 세계적으로 가장 유명한 중국 보이차의 주요 발효 미생물은 Aspergillus로 곰팡이가 우점하며, 박테리아가 우점하는 한국과 일본의 미생물발효차와는 구분된다(Park 등, 2008; Kim 등, 2017a; 2017b; 2020). 본 연구에서는 중국 미생물발효차와 구분되는 한국과 일본의 미생물발효차의 품질을 결정짓는 미생물 군집 구조를 분석하여 한국 전통 미생물발효차의 독창성을 밝히는 데 기초자료를 제공하고자 한다.

미생물발효차 우점 미생물 군집 크기 분석

동아시아 3개국의 미생물발효차를 시료로 하여 곰팡이, 박테리아, 고세균의 총균수를 측정하여 우점하는 발효 미생물 군집의 크기를 real time PCR을 이용하여 측정하였다(Fig. 1). 박테리아 총균수는 청태전 2.955×108±2.216×107 molecule・copy/μL, Goishicha 2.696×108±2.362×107 molecule・copy/μL, 보이차는 7.355×106±2.858×105 molecule・copy/μL로 분석되었다(Fig. 1A). 청태전과 Goishicha의 박테리아 군집 크기는 2.69×108 molecule・copy/μL 이상으로 분석되어 청태전과 Goishicha 박테리아 군집이 보이차 박테리아 군집에 비해 약 40.1배와 36.6배 큰 것으로 각각 분석되었다. 곰팡이 총균수는 청태전 1.125×104±3.289×103 molecule・copy/μL, Goishicha 1.588×104±2.019×103 molecule・copy/μL, 보이차 8.595×104±1.098×103 molecule・copy/μL로 분석되었다(Fig. 1B). 보이차의 곰팡이 군집의 크기는 청태전 7.64배, Goishicha 5.41배 더 큰 것을 확인할 수 있었다. 또한 고세균 총균수는 청태전 4.892×103±1.752×102 molecule・copy/μL, Goishicha 2.790×103±1.359×102 molecule・copy/μL, 보이차 2.666×103±1.578×102 molecule・copy/μL로 확인되었다(Fig. 1C). 분석한 미생물발효차 3종의 고세균 군집 크기는 Goishicha와 보이차가 비슷한 군집의 크기를 가지며, 청태전 고세균 군집 크기는 Goishicha와 보이차보다 약 1.75~1.84배 크게 분석되었다. 그러나 3종의 미생물발효차에서 모두 103 molecule・copy/μL 수준의 군집 크기가 확인되어 박테리아 총균수와 비교해 매우 적은 군집의 크기를 확인할 수 있었다.

Fig 1. Comparison of microbial community size in Korean and Japanese post-fermented teas. A: bacterial 16S rRNA gene, B: fungal 18S rRNA gene, C: archaeal 16S rRNA.

중국 미생물발효차인 보이차 내 발효 미생물은 Aspergillus sp., Penicillium sp.와 Blastobotrys sp. 등의 곰팡이가 우점하며 찻잎의 생물전환에 관여하고 있다(Zhao 등, 2015a; Kim 등, 2017a; Li 등, 2018; Liu 등, 2021). 그러나 한국 미생물발효차인 청태전과 일본의 아와반차는 Pantoea sp., Lactobacillus sp.와 Sphingomonas sp. 등의 박테리아가 우점하는 것으로 보고되었다(Kim 등, 2020). 본 연구를 통해 미생물발효차 3종의 미생물 군집 크기를 분석한 결과, 보이차는 곰팡이 군집이 우점하며 청태전과 Goishicha는 박테리아 군집이 우점하는 것을 확인했다. 이 결과를 통해 보이차는 곰팡이 군집에 의해 발효가 일어나며, 청태전과 Goishicha는 박테리아에 의한 생물전환과정을 통해 고유의 특성을 갖는다고 추론할 수 있다.

DG-DGGE를 통한 미생물 군집분석

박테리아가 우점하는 한국과 일본의 미생물발효차 청태전과 Goishicha를 시료로 미생물 군집 구조 분석 방법의 하나인 DG-DGGE를 이용하여 시료 내의 박테리아 군집을 확인하였다(Muyzer, 1999; Kim 등, 2020)(Fig. 2). 미생물발효차 청태전과 Goishicha의 DG-DGGE gel로부터 각각 11개와 6개의 밴드를 확인하고 이 밴드를 회수하여 염기서열 분석하고 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)의 GenBank database를 이용하여 BLAST search(blastn)를 통해 상동성을 비교 검색하였다(Table 1). 청태전 우점 박테리아는 genus 수준에서 7개의 종으로 Thermobispora(band 1), Pantoea(band 2, 4, 6, 8, 10), uncultured γ-proteobacterium(band 3), Enterobacteriaceae(band 5), Rhizobium(band 7), Klebsiella(band 9), Oryzobacter(band 11)로 확인되었다. Goishicha 우점 박테리아는 5종으로 Paraburkholderia(band 12), Burkholderia(band 13, 15), uncultured Gemmobactor(band 14), Rothia(band 16), Granulicella(band 17)로 분석되었다. 청태전 우점 미생물 분석 결과 Pantoea sp.로 분석된 DG-DGGE band가 5개를 차지하였으며, 이들은 Pantoea cypripedii(NR118857, band 6, 8, 10), Pantoea ananatis(GU339282, band 4), Pantoea sp. ZYJG-2(KX887307, band 2)로 분석되었다. Goishicha에서는 Burkholderia로 분석된 DG-DGGE band가 2개, Paraburkholderia로 분석된 DG-DGGE band가 1개로 β-proteobacteria 미생물이 많이 관찰되었다(Fig. 3). 한국과 일본의 미생물발효차의 DG-DGGE를 통한 박테리아 군집 구조 분석 결과 공통으로 우점하는 미생물을 확인할 수 없었다. 이 결과를 통해 제다 방법에 따라 우점 미생물이 달라지는 것을 확인했다.

Table 1 . Identity of the bands obtained from 16S rRNA gene DG-DGGE bands and those of the closest relatives in the GenBank database, indicating the detected bacteria among Korean & Japanese post-fermented teas.

Band No.Accession no.DescriptionSimilarity (%)Post-fermented tea
1NR027583Thermobispora bispora DSM 4383398%Chungtaejeon
2KX887307Pantoea sp. ZYJG-299%
3GU205302Uncultured gamma proteobacterium clone RSC_RRA0999%
4GU339282Pantoea ananatis EH5598%
5FJ357827Enterobacteriaceae bacterium PA298%
6NR118857Pantoea cypripedii ATCC 2926798%
7NR029184Rhizobium etli CFN 4299%
8NR118857Pantoea cypripedii ATCC 2926797%
9NR114152Klebsiella oxytoca NBRC 10259399%
10NR118857Pantoea cypripedii ATCC 2926798%
11NR137270Oryzobacter terrae PSGM2-1696%
12NR114117Paraburkholderia caledonica NBRC 10248891%Goishicha
13NR037064Burkholderia plantarii NIAES 172393%
14LT842611Uncultured Gemmobactor sp.91%
15NR114117Burkholderia caledonica NBRC 10248891%
16NR044873Rothia mucilaginosa DSM 2074693%
17NR115072Granulicella paludicola OB101094%


Fig 2. DG-DGGE patterns of 16S rRNA gene fragments of bacteria in Korean and Japanese post-fermented teas. The DG-DGGE was electrophoresed on a 8∼12% poly acrylamide gel with a 40∼70% urea formamide gradient. The bright bands on the DGGE were excised and the amplified DNA fragments partially sequenced and compared to known sequences using BLAST. A: Chungtaejeon (Korea), B: Goishicha (Japan). U/F conc.: urea/formamide concentration, Acry/bisacryconc.: acrylamide/bis- acrylamide concentration.

Fig 3. Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of bacteria in the post-fermented teas using the neighbor-joining methods. Bold: dominant community.

16S rRNA gene clone library를 통한 미생물 군집 다양성 분석

한국 미생물발효차 청태전의 박테리아 16S rRNA gene 군집분석 결과 5종의 박테리아가 분석되고, Pantoea sp.(55.81%), uncultured γ-proteobacterium(25.58%), Klebsiella sp.(11.63%)로 우점하였다(Fig. 3). 일본 미생물발효차 Goishicha에는 9종의 박테리아가 분석되었으며 Paraburkholderia sp.(40.44%), Pseudomonas sp.(22.22%) Ralstonia sp.(15.56%) 순으로 분석되었다(Fig. 4). 청태전에 우점하는 3종의 박테리아는 γ-proteobacteria(Cedecea sp., Pantoea sp., uncultured γ-proteobacterium, Klebsiella sp.)로 95.35%를 차지하고 α-proteobacteria(Rhodobacter sp.)가 4.65%로 분석되었다(Fig. 3) Goishicha에 우점하는 박테리아는 β-proteobacteria(Paraburkholderia sp., Ralstonia sp.)가 55.56%로 가장 우점하며, γ-proteobacteria(Pseudomonas sp., Dyella sp., Acinetobacter sp., Moraxella sp.) 33.33%, actinobacteria(Corynebacterium sp.) 4.44%, firmicues(Streptococcus sp.) 4.44%, spirochaetia(Leptospira sp.) 4.44% 순으로 확인되었다. 청태전은 γ-proteobacteria의 Pantoea sp.가 가장 우점하고 Goishicha는 β-proteobacteria의 Paraburkholderia sp.가 우점하는 것으로 분석되어 한국과 일본 미생물발효차의 발효 미생물 차이를 확인하였다.

Fig 4. Dominant bacterial OTUs detected in Korean and Japanese post-fermented teas. A: Chungtaejeon (Korea), B: Goishicha (Japan).

Pantoea sp.는 eucalyptus와 차나무(Camellia sinensis) 잎에서 분리되며, Pantoea agglomerans는 저분자 항생제인 pantocin A와 pantocin B를 혐기성 상태에서 생성한다고 알려져 있다(Wright 등, 2006; Xie 등, 2020). 또한 meta-genome을 통해 떡차에서 우점하며, 한국 미생물발효차 청태전을 중국의 보이차와 일본의 아와반차와 구분하는 중요한 박테리아로 알려져 있다(Jin 등, 2003; Baik 등, 2012; Kim 등, 2017a; 2020). Pantoea agglomerans T71의 gallic acid decarboxylase는 polyphenol tannic acid와 gallic acid의 생물전환에 관여하고, gallic acid를 tannic acid로 전환할 수 있다(Zeida 등, 1998). 또한, Pantoea dispersa Y08은 carotenoids를 aroma compound로 전환한다고 보고되었다(Zhao 등, 2015b). 고농도 chloroform을 포함하는 혐기성 조건에서 탈염소화를 통한 성장이 가능하다(Shan 등, 2010). ParaburkholderiaBurkholderia 속으로 분류되었으나, 현재 새로이 분류하고 있다(Sawana 등, 2014). Paraburkolderia sacchari는 자일로스(xylose)를 자일론산(xylonic acid)과 자일리톨(xylitol; XyOH)로 전환할 수 있다. 자일론산(D-xylonic acid; XylAc)은 자연으로부터 얻을 수 있는 상위 30개의 플랫폼 화학물질로 인식되고 있으며, 자일론산은 글루콘산(D-gluconic acid)과 매우 유사한 구조를 가지며 다양한 식품산업에서 이를 대체할 수 있다(Bondar 등, 2021). 또한, pickled tea(lahpet)는 높은 농도의 gallic acid, epigallocatechin gallate와 epigallocatechin을 포함하고 있으며, 여름과 가을의 신선한 잎을 채취해 혐기성발효를 통해 생산되는데, Bacillus, Afipia, Bacteroides, Cutibacterium, Delftia, ShewanellaParaBurkholderia 가 pickled tea의 발효과정 중에 존재하는 것이 분석되었다(Zhang 등, 2020). 1960년대 초반, terpene으로부터 Pseudomonas 생물전환능을 이용한 고부가가치 향미 화합물 생산에 관한 연구가 진행되었다. 또한, 음식과 음료에 사용되는 천연 향미재료인 ethyl butyrate, ethyl hexanoate, perillyl alcohol, verbenol, perillic acid 등의 생산에도 Pseudomonas가 이용되었다(Molina 등, 2013; Li 등, 2019). Fu brick tea 숙성과정에서 초기에는 Klebsiella가 우점했지만, 발효가 진행될수록 Pseudomonas, Lactococcus, Stenotrophomonas, Enterococcus 및 Bacillus sp.로 빠르게 대체되었으며, 제조 공정이 끝날 때까지 안정적으로 유지되었다(Li 등, 2019). 또한, caffeine이 포함된 커피 폐수에서 Pseudomonas sp.가 caffeine을 완전히 분해하는 탁월한 능력을 확인하였다. 또한, 오랜 시간 찻잎을 생산한 농장의 토양미생물을 분석한 결과 catechin 분해 미생물인 PseudomonasBurkholderia가 증가하며, plant promoting bacteria(Bacillus 등)는 감소한다는 것을 확인했다(Arafat 등, 2020; Shanmugam 등, 2021).

아미노산 분석

청태전과 Goishicha에 우점 박테리아가 확연하게 차이가 나는 것을 DG-DGGE와 16S rRNA clone library를 통해 확인하였다. 이러한 우점 미생물의 차이는 미생물발효차가 숙성하는 발효과정에 차이를 가질 수 있으며, 최종 대사산물이 차이가 날 수 있음을 예상할 수 있다. 이를 확인하기 위해 차 맛에 영향을 미치는 아미노산을 amino acid analyzer를 이용하여 분석했으며, 청태전과 Goishicha의 발효산물의 차이를 확인하였다(Fig. 5, Table 2).

Table 2 . Amino acid content of the Korean & Japanese post-fermented teas using the amino acid analyzer (unit: mg/kg).

NameCheongtaejeonGoishicha
Theanine200.3±5.0147.14±0.78**
Aspartic acid59.38±1.07108.56±1.18**
Glutamate86.22±0.7335.80±0.05**
Ornithine57.26±0.9556.12±0.59
Phenylalanine31.68±0.3455.78±0.92**
Arginine20.92±0.0364.10±0.70**
Leucine13.40±0.1469.26±0.10**
Lysine17.12±0.1762.64±0.09**
Alanine22.78±0.2456.56±0.60**
Tryptophan24.02±0.0445.02±0.75**
NH332.54±0.3635.88±0.05**
P-Ser9.78±0.0252.26±0.55**
Valine2.80±0.0349.92±0.49**
Serine14.00±0.1419.54±0.21**
Isoleucine9.74±0.1021.70±0.21**
Threonine9.12±0.0921.40±0.23**
γ-Aminobutyric acid11.42±0.1215.92±0.17**
Glycine9.16±0.0915.00±0.15**
Taurine5.52±0.0617.04±0.17**
HistidineND19.40±0.19**
β-Alanine14.50±0.162.30±0.04**

Value are mean±standard deviation of triplications..

**P<0.01..



Fig 5. Content of amino acids in the post-fermented teas. Asp, aspartic acid; Glu, glutamate; Orn, ornithine; Phe, phenylalanine; Arg, arginine; Leu, leucine; Lys, lysine; Ala, alanine; Tyr, tryptophan; Val, valine; Ser, serine; Ile, isoleucine; Thr, threonine; g-ABA, γ-aminobutyric acid; Gly, glycine; Tau, taurine; His, histidine; b-Ala, β-alanine. **P<0.01.

주요 아미노산인 theanine, aspartic acid, glutamate, γ-aminobutyric acid의 함량은 청태전에서 200.30±5.01 mg/kg, 59.38±1.07 mg/kg, 86.22±0.73 mg/kg, 11.42±0.12 mg/kg으로 확인되고, Goishicha는 47.14±0.78 mg/kg, 108.56±1.18 mg/kg, 35.80±0.05 mg/kg, 56.12±0.59 mg/kg으로 각각 분석되어, theanine과 glutamate는 청태전이 약 4.25배, 2.41배 높고 aspartic acid와 γ-aminobutyric acid는 Goishicha가 1.83배, 1.39배 높으며 통계적 유의성이 확인되었다. Theanine은 찻잎에 함유된 성분으로 안정감을 느끼게 하는 알파파(α-wave)의 발생을 증가시켜 집중력을 강화하며, 긴장 완화를 통한 스트레스 경감에 탁월한 효과가 있고 혈압감소, 신경보호, 차의 감칠맛에 영향을 미치며 차의 품질평가 시 중요한 지표로 활용되고 있다(Sakato, 1949; Moon 등, 2020). 추가로 비발효차인 녹차에서 아미노산 함량 구성은 theanine, arginine, glutamate, histidine, aspartic acid, serine, alanine 순으로 높았다. 청태전은 theanine(200.30±5.01 mg/kg)이 가장 높고, glutamate(86.22±0.73 mg/kg), aspartic acid(59.38±1.07 mg/kg), ornithine(57.26±0.95 mg/kg) 순으로 녹차 아미노산 구성과 유사한 것을 확인할 수 있다. 그러나, Goishicha는 aspartic acid(108.56±1.18 mg/kg)가 가장 높으며, leucine(69.26±0.10 mg/kg), arginine(64.10±0.70 mg/kg), lysine(62.64±0.09 mg/kg)으로 확인되어 녹차 및 청태전과는 다른 아미노산 구성 차이를 확인하였다(Fig. 5, Table 2). 향후 발효과정에 따라 발효 미생물과 아미노산 함량과의 관계 규명에 관한 연구를 수행하여야 할 것이다.

본 연구에서는 한국과 일본의 미생물발효차인 청태전과 Goishicha의 미생물 군집 및 아미노산 함량 분석을 수행하였다. 청태전과 Goishicha는 박테리아가 우점하며, 청태전은 Pantoea sp., Goishicha는 Parburkholderia sp., Pseudomonas sp.가 우점하는 것을 확인하였다. 또한, 아미노산 분석 결과 청태전은 theanine이, Goishicha는 aspartic acid의 함량이 가장 높았다. Pantoea sp., Parburkholderia sp., Pseudomonas sp.는 찻잎 내 다양한 성분의 전환능에 대해 보고되었다. 위 결과로부터 미생물발효차 내에 우점하는 박테리아는 미생물발효차 제다 과정에 따라 특이적 발효 미생물이 우점하며, 차의 품질을 결정짓는 중요한 역할을 한다고 추론할 수 있다. 미생물발효차의 미생물 군집분석을 통해 미생물발효차 최종 품질 특성이 각각 다르게 발현되며, 우점 미생물의 생물전환 대사 과정 및 효능에 관한 연구를 통해 더 많은 지식이 축적되기를 기대한다. 향후 미생물발효차 청태전의 제다 표준화가 필요하며 발효 기간에 따른 미생물 군집 상의 변화와 차의 숙성 정도에 따른 성분분석이 필요할 것으로 판단된다.

요 약

미생물발효차는 차나무(Camellia sinensis (L.) O Kuntze)의 잎이 미생물 발효과정을 거쳐 생산된다. 본 연구에서 미생물발효차의 주요 미생물을 확인하기 위해 미생물 군집 크기를 real-time PCR로 분석하였다. 또한, 한국의 청태전, 일본의 Goishicha에 우점하는 박테리아 분석을 위해 double gradient-denaturing gradient gel electrophoresis (DG-DGGE)와 16S rRNA gene clone library 기법으로 분석하였다. 그 결과, 청태전과 Goishicha 모두 박테리아가 우점하는 것을 확인했으며, 청태전에 우점하는 박테리아는 γ-proteobacteria Pantoea sp.였다. 그러나 Goishicha에 우점하는 박테리아는 β-proteobacteria Parburkholderia sp.와 γ-proteobacteria Pseudomonas sp.임을 확인했다. 또한, 아미노산 분석 결과 청태전은 theanine이 가장 높은 함량을 보였고, Goishicha에는 aspartic acid가 가장 높게 분석되었다. 본 연구를 통해 한국과 일본 미생물발효차의 독창성과 미생물 간의 상호작용을 이해하는 데 도움이 될 것으로 기대한다.

감사의 글

본 연구는 2017년도 농촌진흥청 국립원예특작과학원 박사후연수과정지원사업(과제번호: PJ012565012017)에 의해 이루어진 것임.

Fig 1.

Fig 1.Comparison of microbial community size in Korean and Japanese post-fermented teas. A: bacterial 16S rRNA gene, B: fungal 18S rRNA gene, C: archaeal 16S rRNA.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 483-492https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.5.483

Fig 2.

Fig 2.DG-DGGE patterns of 16S rRNA gene fragments of bacteria in Korean and Japanese post-fermented teas. The DG-DGGE was electrophoresed on a 8∼12% poly acrylamide gel with a 40∼70% urea formamide gradient. The bright bands on the DGGE were excised and the amplified DNA fragments partially sequenced and compared to known sequences using BLAST. A: Chungtaejeon (Korea), B: Goishicha (Japan). U/F conc.: urea/formamide concentration, Acry/bisacryconc.: acrylamide/bis- acrylamide concentration.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 483-492https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.5.483

Fig 3.

Fig 3.Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of bacteria in the post-fermented teas using the neighbor-joining methods. Bold: dominant community.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 483-492https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.5.483

Fig 4.

Fig 4.Dominant bacterial OTUs detected in Korean and Japanese post-fermented teas. A: Chungtaejeon (Korea), B: Goishicha (Japan).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 483-492https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.5.483

Fig 5.

Fig 5.Content of amino acids in the post-fermented teas. Asp, aspartic acid; Glu, glutamate; Orn, ornithine; Phe, phenylalanine; Arg, arginine; Leu, leucine; Lys, lysine; Ala, alanine; Tyr, tryptophan; Val, valine; Ser, serine; Ile, isoleucine; Thr, threonine; g-ABA, γ-aminobutyric acid; Gly, glycine; Tau, taurine; His, histidine; b-Ala, β-alanine. **P<0.01.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 483-492https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.5.483

Table 1 . Identity of the bands obtained from 16S rRNA gene DG-DGGE bands and those of the closest relatives in the GenBank database, indicating the detected bacteria among Korean & Japanese post-fermented teas.

Band No.Accession no.DescriptionSimilarity (%)Post-fermented tea
1NR027583Thermobispora bispora DSM 4383398%Chungtaejeon
2KX887307Pantoea sp. ZYJG-299%
3GU205302Uncultured gamma proteobacterium clone RSC_RRA0999%
4GU339282Pantoea ananatis EH5598%
5FJ357827Enterobacteriaceae bacterium PA298%
6NR118857Pantoea cypripedii ATCC 2926798%
7NR029184Rhizobium etli CFN 4299%
8NR118857Pantoea cypripedii ATCC 2926797%
9NR114152Klebsiella oxytoca NBRC 10259399%
10NR118857Pantoea cypripedii ATCC 2926798%
11NR137270Oryzobacter terrae PSGM2-1696%
12NR114117Paraburkholderia caledonica NBRC 10248891%Goishicha
13NR037064Burkholderia plantarii NIAES 172393%
14LT842611Uncultured Gemmobactor sp.91%
15NR114117Burkholderia caledonica NBRC 10248891%
16NR044873Rothia mucilaginosa DSM 2074693%
17NR115072Granulicella paludicola OB101094%

Table 2 . Amino acid content of the Korean & Japanese post-fermented teas using the amino acid analyzer (unit: mg/kg).

NameCheongtaejeonGoishicha
Theanine200.3±5.0147.14±0.78**
Aspartic acid59.38±1.07108.56±1.18**
Glutamate86.22±0.7335.80±0.05**
Ornithine57.26±0.9556.12±0.59
Phenylalanine31.68±0.3455.78±0.92**
Arginine20.92±0.0364.10±0.70**
Leucine13.40±0.1469.26±0.10**
Lysine17.12±0.1762.64±0.09**
Alanine22.78±0.2456.56±0.60**
Tryptophan24.02±0.0445.02±0.75**
NH332.54±0.3635.88±0.05**
P-Ser9.78±0.0252.26±0.55**
Valine2.80±0.0349.92±0.49**
Serine14.00±0.1419.54±0.21**
Isoleucine9.74±0.1021.70±0.21**
Threonine9.12±0.0921.40±0.23**
γ-Aminobutyric acid11.42±0.1215.92±0.17**
Glycine9.16±0.0915.00±0.15**
Taurine5.52±0.0617.04±0.17**
HistidineND19.40±0.19**
β-Alanine14.50±0.162.30±0.04**

Value are mean±standard deviation of triplications..

**P<0.01..


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