방향성 식물은 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 열매 등에 독특한 향과 맛이 있어 향신료 및 약초로 사용되고 있고, 항산화, 항암, 항균 및 항염 등의 활성으로 건강기능식품 및 화장품의 원료로 사용되고 있다(Chung과 Noh, 2000). 방향성 식물 중 하나인 배초향(Agastache spp.)은 꿀풀과(Labiatae)의 다년생 초본으로 일반명으로는 purple giant hyssop, wrinkled giant hyssop, Korean mint 및 Indian mint로 알려져 있다(Kim, 1996). 한국뿐만 아니라 대만, 중국, 일본 및 북미에 걸쳐 약 20여 종의 자원이 서식하고 있고 한국에서는 산야, 계곡 및 약간의 습기가 있는 곳 등에서 자생하고 있다(Fuentes-Granados 등, 1998). 배초향 고유의 독특한 향을 이용하여 예부터 향신료 및 약초로 사용되어 왔으며, 현대에 들어와 에센셜오일로 제조하여 아로마테라피에 사용되고 있기도 하다(Zielinska와 Matkowski, 2014; Charles 등, 1991). 배초향에는 rosmarinic acid와 같은 폴리페놀 화합물과 플라보노이드계 화합물인 tilianin, acacetin 및 agastachin 등이 다량 함유되어있다(Wei 등, 2016; Kim 등, 2001). 배초향의 지하부에서는 diterpenoid 및 triterpenoid에 속하는 성분들이 분리되었으며, 지상부에는 monoterpene, sesquiterpene 및 flavonoid 성분이 함유되어 있다(Zou와 Cong, 1991; Zielinska와 Matkowski, 2014). 배초향의 정유 함량은 재배지역, 재배시기, 재배법, 채취부위 및 추출방법에 따라 0.29~6.92% 정도이며, estragole, limonene 및 trans-isopulegone 등이 주성분으로 알려져 있다(Hong 등, 2020).

배초향에는 생리활성 물질이 다량 함유되어있어 항산화, 항염증, 항암, 항균 및 항바이러스 효과 등의 기능성을 가진다고 보고되어 있다(Desta 등, 2016; Haiyan 등, 2016). Kim과 Hong(2021)은 배초향(A. rugosa) 분획물의 다양한 세포 내 기전 연구를 통해 항산화 활성, 피부미백 및 주름개선 효과가 있음을 확인하였다. Oh 등(2005)은 배초향(A. rugosa) 잎 추출물이 세포 내 inducible nitric oxide synthase 발현 및 nitric oxide 생성을 억제한다고 보고하였다. Desta 등(2016)은 배초향(A. rugosa)의 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리 부분의 항산화 활성을 평가했을 때 잎, 꽃, 뿌리 순으로 항산화 활성이 우수하였다고 하였다. Hashemi 등(2017)은 배초향(A. foeniculum) 에센셜오일의 항균 및 항산화 활성을 평가하였다. Ji 등(2020)은 배초향(A. rugosa) 추출물의 항산화 활성과 항당뇨 활성이 높은 상관관계가 있음을 밝혔다. 최근 배초향 추출물이 피부보습 및 자외선에 의한 피부손상으로부터 피부 건강을 유지하는 데 도움을 줄 수 있어 건강기능식품 기능성 원료로 등록되기도 하였다(Ministry of Food and Drug Safety, 2020). 이처럼 배초향의 다양한 활성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

체내 생화학적 산화반응 생성물인 활성산소는 각종 성인병, 노화 및 대사질환의 주요 원인임에 따라 체내 활성산소를 제거해 주는 천연 항산화제의 개발은 끊임없이 진행되고 있다(Keservani 등, 2010). 생리활성 물질이 풍부하여 항산화 활성이 우수한 식물체들은 그 품종에 따라 항산화 활성 및 함량에 유의한 차이가 있다고 보고되고 있다(Rao와 Ravishankar, 2002). 따라서 본 연구에서는 대표적인 배초향 종(A. foeniculum, A. rugosa 및 A. urticifolia)에 따른 배초향 잎 75% 에탄올 추출물의 항산화 활성 및 함량을 조사하고, 군집분석을 통해 배초향 자원의 항산화 활성 및 함량에 따른 특성을 파악하고자 하였다.

재료

미국 농무성 농업연구소(USDA-ARS)에서 A. foeniculum 4 자원, A. urticifolia 4 자원, A. rugosa 2 자원을 분양받았으며, 농촌진흥청에서 A. rugosa 2 자원을 분양받아 총 12 자원을 사용하였다(Table 1). 분양받은 자원은 충북대학교(Cheongju, Korea) 내 부속농장의 온실에 2021년 4월에 파종하여 3개월 동안 생육시킨 후 잎을 채취하여 동결 건조하였다. 동결 건조한 잎은 Tissue Lyser Ⅱ(Qiagen Co., Valencia, CA, USA)로 분쇄하여 분말의 형태로 보관 및 사용하였다.

Table 1 . The list of Agastache species used in this study.

Species	Code	Accession	Origin
Agastache foeniculum	AG8	PI 561061	United States
	AG10	PI 561059	United States
	AG11	PI 561058	United States
	AG13	PI 561056	United States
Agastache rugosa	AG29	PI 636371	North Korea
	AG34	PI 593734	South Korea
	AG42	IT 195183	South Korea
	AG43	IT 195184	South Korea
Agastache urticifolia	AG50	Ames 31295	United States
	AG54	Ames 32401	United States
	AG59	Ames 32406	United States
	AG64	Ames 32411	United States

추출물 제조

배초향 분말을 100 mg씩 정량 후 75% 에탄올 1 mL와 혼합하여 1시간 동안 초음파 처리하였다. 4°C, 13,000 rpm에 10분 동안 원심분리 후 상층액을 0.2 μm nylon filter (Bonna-Agela Technologies Inc., Wilmington, NC, USA)에 여과하였다. 여과된 추출물을 증류수와 10배 희석하여 10 mg/mL로 맞춘 후 이후 분석에 사용하였다.

DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성

2,2-Diphenyl-1-picryhydrayl(DPPH) 및 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS) 라디칼 소거 활성은 Lee 등(2016)의 방법을 변형하여 진행하였다. DPPH(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 11.8 mg을 100% 에탄올 150 mL와 혼합하여 0.2 mM의 DPPH 용액을 만들어 사용하였다. 96-well plate에 배초향 추출액 60 μL(추출물 7.5 μL＋증류수 52.5 μL)와 0.2 mM DPPH 용액 240 μL를 30분 동안 암조건에 반응시킨 후, microplate spectrophotometer(Epoch, BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3회 반복으로 진행하였으며, ascorbic acid를 이용하여 표준곡선을 작성한 후 시료의 항산화 활성을 ascorbic acid equivalents(AAE)로 나타내었다. 2.5 mM potassium persulfate와 7 mM ABTS(Sigma-Aldrich Co.)를 혼합하여 4°C에서 12시간 이상 반응시킨 후 증류수와 희석하여 흡광도 값이 0.7±0.02가 나오도록 만들어 사용하였다. 96-well plate에 배초향 추출액 30 μL(추출물 15 μL＋증류수 15 μL)와 희석된 ABTS 용액 270 μL를 6분 동안 암조건에 반응시킨 후, microplate spectrophotometer를 사용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3회 반복으로 진행하였으며, ascorbic acid를 이용하여 표준곡선을 작성한 후 시료의 항산화 활성을 AAE로 나타내었다.

총 플라보노이드 및 폴리페놀 함량 측정

총 플라보노이드 함량 측정은 Złotek 등(2015)의 방법을 변형하여 사용하였다. 96-well plate에 배초향 추출액 100 μL(추출물 15 μL＋증류수 85 μL)와 10% aluminium nitrate 10 μL, 1 M potassium acetate 10 μL, 증류수 180 μL를 30분 동안 암조건에서 반응시킨 후, microplate spectrophotometer를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3회 반복으로 진행하였으며, quercetin을 이용하여 표준곡선을 작성한 후 시료의 총 플라보노이드 함량을 quercetin equivalents(QE)로 나타내었다. 총 폴리페놀 함량 측정은 Lee 등(2016)의 방법을 변형하여 사용하였다. 50% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent와 2% Na2CO3를 사용하였다. 96-well plate에 배초향 추출액 100 μL(추출물 15 μL＋증류수 85 μL)와 50% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 100 μL, 2% Na2CO3 100 μL를 30분 동안 암조건에 반응시킨 후, microplate spectrophotometer를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3회 반복으로 진행하였으며, gallic acid를 이용하여 표준곡선을 작성한 후 시료의 총 폴리페놀 함량을 gallic acid equivalents (GAE)로 나타내었다.

통계분석

실험의 결괏값은 각 추출물의 항산화 활성 또는 함량의 평균±표준편차로 나타냈다. 여러 가지 화학적 방법으로 얻은 항산화 활성은 단위와 척도가 다르므로 상대적 항산화 활성 지수(relative antioxidant capacity index, RACI)로 나타내어 배초향의 4가지 항산화 활성 및 함량을 비교하였다(Sun과 Tanumihardjo, 2007). RACI를 구하는 식은 다음과 같다.

Standard score of each experiments＝(raw data－mean)/ standard deviation

RACI＝Sum of standard score/ number of experiments

R 프로그램을 사용하여 결괏값에 one-way analysis of variance(ANOVA)로 분석한 뒤 Duncan’s multiple range test로 5% 수준(P<0.05)에서 유의성 검정을 하였으며, 항산화 활성 및 함량의 상관관계는 Pearson’s correlation 분석을 시행하였다.

배초향 잎 추출물의 항산화 활성

국내외에서 분양받은 배초향 12 자원을 온실에서 파종하여 수확 후 75% 에탄올 추출물을 제조하였다. 배초향 잎 추출물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성과 총 플라보노이드 및 폴리페놀 함량을 측정하였다(Table 2). 배초향 잎 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 43.93~210.40 AAE mg/g으로 나타났으며, ABTS 라디칼 소거 활성은 122.33~399.37 AAE mg/g으로 나타났다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성이 가장 우수했던 배초향은 각각 AG50(A. urticifolia) 및 AG10(A. foeniculum)이었다. 반면, AG43(A. rugosa)은 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성이 가장 낮은 자원이었다. 배초향 잎 추출물의 총 플라보노이드 함량은 92.00~177.71 QE mg/g으로 나타났으며, 총 폴리페놀 함량은 66.62~665.24 GAE mg/g으로 나타났다. 자원에 따라 총 플라보노이드 함량은 약 2배까지 차이를 보였으며, 총 폴리페놀 함량은 약 10배까지 차이를 보였다. Do 등(2020)에 따르면 배초향의 폴리페놀 화합물인 rosmarinic acid의 함량이 종에 따라 37배가량 차이를 보였다고 하였다. Ji 등(2020)은 배초향(A. rugosa) 지상부의 70% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량이 34.51 GAE mg/g이라고 하였으며, 이는 본 연구에서 배초향 12 자원의 총 폴리페놀 함량 평균값인 311.95 GAE mg/g에 약 10배가량 차이를 보였다. 따라서 총 폴리페놀 함량이 배초향 자원 및 종에 따라 차이가 큰 것으로 생각된다. 상대적 항산화 활성 지수(RACI)는 상대지수이며, 여러 가지 화학적 방법으로 얻은 항산화 활성을 종합하여 상대적으로 비교하는 방법이다. 배초향 잎 추출물의 4가지 화학적 방법으로 얻은 항산화 활성 및 함량에 대한 RACI를 구하였다(Fig. 1). AG43(A. rugosa)은 RACI가 -1.49로 가장 낮았고, AG50(A. urticifolia)은 RACI가 0.86으로 가장 높았다. RACI를 종에 따라 나누어 나타내었다(Fig. 2). 앞선 12 자원과 유사하게 A. rugosa에 속하는 자원들의 RACI가 -0.68로 가장 낮았고, A. urticifolia에 속하는 자원들의 RACI가 0.74로 가장 높았다. 배초향의 종에 따라 항산화 활성에 차이가 있음을 알 수 있었다.

Table 2 . Antioxidant activities and contents in different Agastache accessions.

Species	Code	DPPH (AAE mg/g)1)	ABTS (AAE mg/g)2)	TFC (QE mg/g)3)	TPC (GAE mg/g)4)
Agastache foeniculum	AG8	188.00±11.98ab	398.52±4.32a	118.67±3.81f	357.66±11.95f
	AG10	193.73±11.70ab	399.37±2.54a	92.00±0.00h	376.51±17.95e
	AG11	153.67±7.68c	394.92±2.91a	92.63±1.10gh	211.91±4.43h
	AG13	182.13±12.45b	397.67±3.00a	102.16±1.10g	288.23±0.80g
Agastache rugosa	AG29	91.07±5.22d	319.58±17.87b	177.71±18.17a	158.11±7.08i
	AG34	136.47±19.94c	395.13±3.50a	123.11±2.20ef	165.47±5.22i
	AG42	55.40±30.47e	268.36±4.59c	135.17±2.91cd	85.01±2.11j
	AG43	43.93±8.99e	122.33±1.60d	128.19±1.90def	66.62±3.65k
Agastache urticifolia	AG50	210.40±3.86a	398.94±2.40a	130.73±2.91de	665.24±11.03a
	AG54	206.07±1.40ab	398.31±3.00a	142.79±2.20c	462.48±7.30c
	AG59	196.40±4.26ab	398.73±2.77a	164.38±1.90b	422.02±8.43d
	AG64	207.47±5.08a	399.15±2.64a	132.63±2.91de	484.09±16.46b

¹⁾DPPH radical scavenging activity (mg of ascorbic acid equivalents/g dry weight)..

²⁾ABTS radical scavenging activity (mg of ascorbic acid equivalents/g dry weight)..

³⁾Total flavonoid contents (mg of quercetin equivalents/g dry weight)..

⁴⁾Total polyphenolic contents (mg of gallic acid equivalents/g dry weight)..

Different letters (a-k) in the same column indicate a significant difference by Duncan’s multiple range test (P<0.05)..

Fig 1. elative antioxidant capacity index of different Agastache accessions.

Fig 2. Relative antioxidant capacity index of three Agastache species.

항산화 활성과 항산화 성분과의 상관관계

배초향 잎 추출물의 항산화 활성과 함량의 상관관계를 분석하였다(Fig. 3). DPPH 라디칼 소거 활성은 ABTS 라디칼 소거 활성 및 총 폴리페놀 함량과의 상관관계가 P<0.01 수준에서 유의적으로 있었다. 총 폴리페놀 함량과 ABTS 라디칼 소거 활성은 P<0.05 수준에서 유의적으로 상관관계가 있었다. 반면, 총 플라보노이드 함량은 다른 항산화 활성 및 함량 간의 상관관계가 나타나지 않았다. 일반적으로 총 플라보노이드 함량은 라디칼 소거 활성과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려졌지만, 그 종류와 구조에 따라 다른 항산화 활성을 보이고, 따라서 천연물에 함유된 플라보노이드에 따라 각기 다른 항산화 활성을 나타낸다고 해석되고 있다(Yoshida 등, 1989). Oh 등(2006)은 배초향에 함유된 페놀 화합물의 항산화 효과를 조사하여 caffeic acid 유도체와 같은 페놀 화합물들이 항산화능과 heme oxygenase 활성에 관여한다고 보고하였다.

Fig 3. Pearson correlation coefficients between antioxidant activities and contents in different Agastache accessions. ^*P<0.05 and ^**P<0.01.

배초향 잎 추출물의 군집분석

군집분석(cluster analysis)은 측정값들을 유사하거나 관련 있는 항목끼리 묶어 집단으로 그룹화하고, 각 집단의 특성을 파악함으로써 측정값들의 전체적인 이해를 돕는 통계 분석이다(Ng 등, 2001). 배초향 잎 추출물의 항산화 활성 및 함량을 바탕으로 계층적 군집분석(hierarchical cluster analysis) 결과를 heatmap으로 나타내었으며(Fig. 4), 그 결과를 정리하여 Table 3에 나타내었다. 3개의 군집으로 나누어 차례로 1, 2 및 3번 군집으로 명명하였다. 1번 군집의 경우 AG34(A. rugosa)를 제외하고 모두 A. foeniculum 종이었고, 2번 군집은 모두 A. urticifolia, 3번 군집은 모두 A. rugosa 종이었다. 따라서 AG34(A. rugosa)를 제외하고 모두 종에 따라 군집이 형성되는 것으로 보아, 종에 따라 항산화 특성에 차이가 있는 것으로 보인다. 1번 군집은 ABTS 라디칼 소거 활성이 다른 군집에 비해 우수하였고, 총 플라보노이드 함량은 전반적으로 낮은 것으로 나타났다. 2번 군집은 항산화 활성 및 함량이 다른 군집에 비해 전반적으로 우수하였다. 3번 군집은 항산화 활성 및 총 폴리페놀 함량이 낮지만 총 플라보노이드 함량이 높았다. A. urticifolia 종으로 이루어졌던 2번 군집의 항산화 활성 및 함량이 모두 유의적으로 가장 우수하였다. 반면 A. rugosa 종으로 이루어졌던 3번 군집의 항산화 활성 및 함량이 가장 낮은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 Fig. 2에서 종에 따른 RACI 값과 유사한 경향을 보였다. 배초향 12 자원은 종에 따라 항산화 활성 및 함량의 특성이 구분 지어짐을 알 수 있다. 하지만 식물체는 재배지역과 환경에 따라 기능성 물질의 조성과 양에 영향을 주어 항산화 활성 및 함량 또한 일관된 함량을 보이기 어려우므로 종의 차이가 유일한 변수는 아니라는 것을 고려해야 한다(Rao와 Ravishankar, 2002).

Table 3 . Average of antioxidant activities and contents in Agastache depending on hierarchical cluster groups.

		DPPH (AAE mg/g)1)	ABTS (AAE mg/g)2)	TFC (QE mg/g)3)	TPC (GAE mg/g)4)
Cluster groups	1	170.80±24.61b	397.12±2.01a	105.71±14.51b	279.95±91.06b
	2	205.08±6.06a	398.78±0.36a	142.63±15.43a	508.46±107.64a
	3	63.47±24.58c	236.76±102.35b	147.03±26.80a	103.25±48.39c

¹⁾DPPH radical scavenging activity (mg of ascorbic acid equivalents/g dry weight)..

²⁾ABTS radical scavenging activity (mg of ascorbic acid equivalents/g dry weight)..

³⁾Total flavonoid contents (mg of quercetin equivalents/g dry weight)..

⁴⁾Total polyphenolic contents (mg of gallic acid equivalents/g dry weight)..

Different letters (a-c) in the same column indicate a significant difference by Duncan’s multiple range test (P<0.05)..

Fig 4. Hierarchical cluster analysis of antioxidant activities and contents in different Agastache accessions.

본 연구에서는 다양한 배초향(Agastach spp.) 자원의 잎 추출물의 항산화 활성 및 함량을 분석하고 자원 간의 상관관계에 대하여 평가하였다. 3가지 배초향 종(A. foeniculum, A. rugosa 및 A. urticifolia)의 각 4 자원을 분양받아 총 12 자원을 온실에서 파종하여 잎을 채취하고 75% 에탄올 추출물을 제조하였다. 배초향 잎 추출물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성과 총 플라보노이드 및 폴리페놀 함량을 측정하였다. 다양한 항산화 활성 및 함량에 대한 결괏값을 표준화하기 위해 상대적 항산화 활성 지수(RACI)로 나타내어 비교하였다. A. rugosa에 속하는 자원들이 항산화 활성 및 함량이 가장 낮았고, A. urticifolia에 속하는 자원들의 항산화 활성 및 함량이 우수하였다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성과 총 폴리페놀 함량은 서로 유의적으로 양의 상관관계를 보였다. 항산화 활성 및 함량 결과를 바탕으로 계층적 군집분석을 수행하였고, 12 자원 중 AG34(A. rugosa)를 제외하고 모두 종에 따라 군집을 이루는 것을 알 수 있었다. A. urticifolia 종으로 이루어졌던 군집의 항산화 활성 및 함량이 모두 유의적으로 가장 우수하였다. 본 연구에서는 3가지 배초향 종에 따른 배초향 잎 추출물의 항산화 활성 및 함량을 조사하고 군집분석을 통해 평가하여 배초향 종의 개발 및 탐색에 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.

본 연구는 2021년도 교육부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 지자체-대학 협력기반 지역혁신사업(재단관리번호 2021RIS-001, 과제고유번호 1345341783)의 결과입니다.