어류 단백질 혹은 부산물 유래 콜라겐의 효소 가수분해물 기능성과 관련하여 항산화 효과(Ahn 등, 2012; 2014; 2015; Cai 등, 2015; Ding 등, 2011; Liang 등, 2014; Sudhakar와 Nazeer, 2015; Mirzapour-Kouhdasht 등, 2021; Wang 등, 2013; 2018), 혈장 중성지질 억제(Saito 등, 2009), 항주름 및 피부개선 효과(Chen 등, 2016; Ito 등, 2018; Kato 등, 2011; Lu 등, 2017; Wang 등, 2018), 항미생물 효과(Mirzapour-Kouhadasht 등, 2021), 기억력 개선(Pei 등, 2010), 항당뇨와 항혈압 효과(Zhu 등, 2010)가 보고되었다. 특히 콜라겐 가수분해효소 저해 활성을 가진 다수의 펩타이드(Chen 등, 2016; Lu 등, 2017)가 발견되어 기능성 식품(Hong 등, 2019) 혹은 화장품 조성물(Gorouhi와 Maibach, 2017)로 활용 가치를 확인하였다. 틸라피아 젤라틴-유래 펩타이드의 한 종류인 LSGYGP는 농도 의존적으로 자외선 조사 손상으로부터 피부 지질과 콜라겐을 보호하고 glycosaminoglycan을 유의적으로 회복한다(Sun 등, 2013). 특히 어류 유래 콜라겐은 종교와 문화적 이유로 인한 식이 제한과 상관이 없고 부가가치가 높아서 어류 부산물은 콜라겐 생산을 위한 유용한 자원이다(Wang 등, 2013). 한국에서는 콜라겐 유래 피부 보습관련 개별인정형 원료로 AP콜라겐 효소분해 펩타이드와 collative 콜라겐 펩타이드가 있다(KFDA, 2016).

항주름과 피부개선 효과는 섬유아세포의 증식, 콜라겐과 엘라스틴 합성능의 개선과 상관이 있다(Frei 등, 1998). 천연물에서 얻은 일부 펩타이드는 단백분해효소 활성을 저해하고 지질과산화와 tyrosinase 및 keratinocyte apoptosis를 저해한다(Gorouhi와 Maibach, 2017). 아무르불가사리(Asterias amurensis)에서 얻은 콜라겐 펩타이드는 UVA로 유도한 인간 섬유아세포의 MMP-1의 발현을 감소시키고(Kwon 등, 2007), 대구껍질 젤라틴 가수분해물 유래 펩타이드, GEIGPSGGRGKPGKDGDAGPK와 GFSGLDGAKGD는 MMP-1, p-ERK와 p-p38을 유의적으로 저해한다(Lu 등, 2017). 그리고 엘라스틴 유래 펩타이드 GLPY와 GPGGVGAL은 쥐 피부의 자외선 손상을 완화한다(Liu 등, 2019).

본 연구는 광어껍질을 pepsin으로 가수분해하여 제조한 저분자 가수분해물의 콜라겐 가수분해효소 억제 펩타이드를 확인할 목적으로 실시하였다. 가수분해물을 이온교환, size-exclusion 및 역상크로마토그래피 collagenase 활성 저해 분획을 정제하고, MALDI-TOF MS와 LC/MS/MS를 사용하여 활성 펩타이드의 아미노산 서열을 분석하였다. 활성 후보 펩타이드의 아미노산 서열은 ADME 특성을 고려하여 아미노산 잔기수 5개 미만으로 제한하였다. 아미노산 잔기수 5개 미만의 펩타이드를 인간 collagenase와 분자도킹을 하여 가장 친화성이 높은 펩타이드를 선정하였다. 선정한 펩타이드는 고상합성법으로 95% 이상의 순도로 합성한 후 이들 펩타이드의 collagenase 저해 활성능을 측정하였다.

재료

실험에 사용한 광어(Paralichthys olivaceus)껍질은 진주시에 소재하는 대형 횟집에서 2020년 11월 9일에서 22일에 걸쳐 수집하여 냉동 보관하였다. 해동한 광어껍질을 잘게 마쇄하고 3배량의 0.1 M NaHCO₃ 용액을 가하여 비콜라겐성 단백질을 제거하고 60°C로 조정한 항온건조기에서 24시간 건조한 후 믹서기(NFM-3561 SN, NUC Co., Ltd., Daegu, Korea)에서 3분 동안 마쇄하여 100 mesh의 체(150 μm)를 통과하는 분말을 콜라겐 추출과 단백질 가수분해를 위한 시료로 사용하였다.

가수분해를 위한 단백분해효소로 pepsin(370 units/mg solid; P7000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하였다. 크로마토그래피를 위한 trifluoroacetic acid(302031, Sigma-Aldrich), 증류수 및 acetonitrile은 HPLC급(Burdhck & Jackson, Ulsan, Korea)을 사용하였고 실험에 사용한 모든 시약은 분석급을 사용하였다. 지표물질 펩타이드 Gly-Pro-Hyp(분자량 285.33 Da, 순도 96.77%, Lot No. P210603-MX904274, 이하 GPHyp), collagenase 활성저해 펩타이드 Gly-Pro-Met(분자량 303.37 Da, 순도 95.23%, Lot No. P21603-MX904265, 이하 GPM), Gly-Pro-Lys(분자량 300.35 Da, 순도 95.23%, Lot No. P210603-MX904268, 이하 GPK), Gly-Ser-Ala-Pro-Glu(분자량 459.04 Da, 순도 96.87%, Lot No. P210603-MX 904266, 이하 GSAPE), Val-Asp-Leu(분자량 345.39 Da, 순도 96.55%, Lot No. P210603-MX904273, 이하 VDL), Val-Ile-Cys-Gly(분자량 462.50 Da, 순도 96.49%, Lot No. P210603-MX904267, 이하 VICE) 및 Gly-His-Lys(분자량 340.37 Da, 순도 95.21%, Lot No. P210603-Mx904275)는 A&PEP 사(Cheongju, Korea)에서 고상합성법으로 합성하여 분석에 사용하였다.

광어껍질 가수해물의 제조

광어껍질 분말 10 g을 0.01 N HCl 용액(pH 2.0)에 분산시킨 후 0.01 N HCl 용액을 사용하여 pH 2.0으로 조정한 다음 100 mL로 정용하였다. 250 mL 삼각 플라스크에 옮겨 최종농도가 2%(w/v)가 되도록 pepsin 용액(1 g/10 mL H2O)을 첨가하고 50°C의 항온수조(SB-12L, Benchmark Scientific, Sayreville, NJ, USA)에서 60 rpm으로 흔들어 주면서 2시간 가수분해하였다. 가수분해물은 1 N NaOH 용액으로 pH 5.5로 조정하고 원심분리(2,500×g, 20분, Labogene 1248, Gyrozen Co., Ltd, Gimpo, Korea)하여 상층액을 회수하였다. 상층액은 Acrodisc 0.20 μm 실린지 필터, Supor membrane으로 여과하여 -20°C에서 동결 저장하면서 분석용 시료로 사용하였다. 여과 시료의 단백질 농도와 아미노산 농도는 각각 Biuret법과 ninhydrin법(Spies, 1957)으로 측정하였다. 가수분해도는 Lee 등(2016)의 방법에 따라 계산하였다.

크로마토그래피를 이용한 정제

HiLoad SP Sepharose high performance 칼럼(16×100 mm, GE Healthcare, Chicago, IL, USA)과 HiLoad Q-Sepharose high performance 칼럼(16×100 mm, GE Healthcare)을 장착한 AKTA purifier 시스템(GE Healthcare)으로 양이온과 음이온크로마토그래피를 수행하였다. 크로마토그래피는 시료 용액 2 mL를 주입하여 A와 B 용액으로 농도 균배하면서 유속 4 mL/min의 속도로 용출하고 5 mL로 분획하면서 220 nm와 280 nm에서 펩타이드와 단백질을 검출하였다. 양이온교환크로마토그래피의 A와 B 용액은 25 mM citrate buffer(pH 5.5)와 1 N NaCl을 포함하는 25 mM citrate buffer(pH 5.5)를 사용하였다. 음이온교환크로마토그래피는 각각 25 mM Tris-HCl(pH 7.5)과 1 N NaCl을 포함하는 25 mM Tris-HCl(pH 7.5) 용액을 사용하였다. 이온교환크로마토그래피는 칼럼 부피(20 mL) 4배 용량의 A 용액으로 수지를 평형시키고 50% B 용액까지 칼럼 부피의 10배에 해당하는 용액으로 농도 균배하면서 수지에 결합한 펩타이드 혹은 단백질을 용출하였다. 칼럼 부피 2배 용량의 100% B 용액으로 미용출 화합물을 세척하고 칼럼 부피 5배량의 A 용액으로 칼럼을 cleaning 하였다. 이온교환크로마토그래피에서 얻은 활성 분획물은 50°C 이하에서 회전진공증발기(N-1110, Eyela, Tokyo, Japan)로 농축하고 최소량의 물에 용해시켜 size-exclusion 크로마토그래피용 시료로 사용하였다.

Size-exclusion 크로마토그래피는 Superdex 30 prep grade 칼럼(16×600 mm, GE Healthcare)을 장착한 AKTA purifier 시스템(GE Healthcare)으로 수행하였다. 칼럼 부피 1.5배 용량의 HPLC급 증류수를 사용하여 1 mL/min 유속으로 용출하면서 220 nm와 280 nm에서 펩타이드와 단백질을 검출하였다. 칼럼 평형은 칼럼 부피 1배량의 HPLC급 증류수로 실시하였다. Collagenase 저해 활성을 가진 분획을 모아 50°C 이하에서 회전진공증발기로 농축하여 최소량의 0.1% TFA/water 용매에 용해하여 역상크로마토그래피용 시료로 사용하였다.

역상크로마토그래피는 Resource RPC 3 mL 칼럼을 장착한 AKTA purifier 시스템(GE Healthcare)으로 실시하였다. Size-exclusion 배제크로마토그래피에서 얻은 collagenase 활성 저해 분획물 50 μL를 주입하여 A 용매 0.1% TFA/water와 B 용매 0.1% TFA/50% acetonitrile로 B 용액 20%까지 칼럼 부피(3 mL)의 20배로 농도 균배하면서 1 mL/min의 속도로 용출하였다. 용출액의 펩타이드는 220 nm에서 검출하였다. 칼럼 세척은 칼럼 부피의 5배량에 해당하는 100% B 용매로 수행하였고, 칼럼 평형은 칼럼 부피 2배량의 100% A 용매로 수행하였다.

Collagenase 활성 저해능의 측정

크로마토그래피 분획물의 collagenase 활성 저해능은 Invitrogen사(Waltham, MA, USA)의 EnzChek^® Gelatinase/Collagenase Assay Kit(250~2,000 Assays) 시약을 구입하여 사용하였다. 먼저 1 mg DQ 콜라겐 vial에 1.0 mL의 증류수를 가해 DQ 콜라겐 저장용액(1 mg/mL)을 제조하였다. 10× reaction buffer 2 mL에 증류수 18 mL를 가해 reaction buffer를 희석하고 최종농도가 0.2 U/mL가 되도록 reaction buffer로 희석하였다. 96 well plate에 분획물을 80 μL씩 주입하여 triple로 준비하였다. DQ 콜라겐 20 μL, 시료 blank에는 reaction buffer 50 μL, 시료에는 작업용액 50 μL를 첨가하였다. 빛을 차단한 상태로 실온에서 1시간 동안 방치한 후 excitation wavelength 485 nm 및 emission wavelength 535 nm에서 ELISA plate reader(VICTOR X3^TM, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)로 형광강도를 측정하여 collagenase 활성 저해능은 다음 식에 따라 계산하였다.

Collagenase 활성 저해능(%)＝100－(b－b′/a－a′×100)

a: 공시료액의 반응 후의 흡광도

b: 시료액의 반응 후의 흡광도

a′, b′: collagenase 대신 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도

아미노산 서열분석

Pepsin 가수분해물의 저분자콜라겐 펩타이드를 확인할 목적으로 역상크로마토그래피 분획물을 40°C의 진공원심분리기(VC2200, Gyrozen Co., Ltd., Gimpo, Korea)로 2,000 rpm에서 완전히 건조시킨 후, 0.2% TFA를 포함한 2 μL HPLC급 증류수에 재현탁하여 CHCA matrix 4 μL를 첨가하고 vortex 하였다. 혼합물 2 μL를 스포트하여 공기 건조시킨 후, MALDI-TOF(4700 Proteomics Analyzer 901, Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)를 사용하여 분석을 수행하였다. 300~3,000 m/z의 분자량 범위에 걸쳐 reflector mode, positive polarity, 가속전압 20,000 V, 레이저 강도 25~30%의 조건에서 펩타이드의 주요 스펙트럼을 확인하였다. 질량 검정을 위하여 펩타이드 표준물 Ⅱ(bradykinin 1-7, 757.39916; angiotensin Ⅱ, 1046.54180; angiotensin Ⅰ, 1296.68480; substance P, 1347.73540; bombesin [M+H], 1619.82230; renin substrate, 1758. 93261; ACTH clip 1-17, 2093.08620; ACTH clip 18-32, 2465.190830; somatosatin, 3147.47100)를 사용하였다.

그리고 고분자량 펩타이드의 서열을 확인하기 위해 역상크로마토그래피로 얻은 시료를 진공원심분리기에서 완전히 건조시킨 후 80% MeCN에 녹여 다시 진공원심분리기로 완전히 건조시켰다. 건조시료를 15 μL의 0.1% formic acid에 용해하여 분석시료로 사용하였다. 아미노산 서열분석은 LC와 on-line 연결한 Q-TOF 질량분석기(Framingham, MA, USA)로 수행하였다. 분석프로그램은 protein pilot/peak view(SCIEX)를 사용하였고 1차 아미노산 서열조사 데이터베이스는 Paralichthys and collagen NCBI full sequence를 사용하였다. 검출 질량 범위는 300~2,500 m/z로 설정하였다.

지표물질로서 Gly-Pro-Hyp(GPHyp)의 정량

광어껍질 pepsin 가수분해물의 제조공정관리를 위해 지표물질로 GPHyp를 사용하여 HPLC 시스템(Ultimate 3000, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)에서 정량하였다. 칼럼은 Capcell Pak C18 MG(4.6×250 mm, 5 μm, Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하였다. 시료는 20 μL를 주입하였다. 칼럼 온도 40°C에서 A 용매 0.1% TFA/water, B 용매 0.1% TFA/acetonitrile을 사용하여 B 용매 균배조건 0~10분 3%, 10~20분 100%, 20~28분 0%의 조건으로 유속 1 mL/min을 적용하여 220 nm 파장에서 펩타이드를 검출하였다.

정량 표준곡선 작성을 위해 합성 펩타이드 15.5 mg을 HPLC급 증류수 31 mL(0.5 mg/mL)에 녹여 저장용액으로 사용하였고, 저장용액을 0.05~0.5 mg/mL의 농도 범위로 희석하여 분석한 피크의 면적에 대한 농도 값을 plot 하여 표준곡선을 작성하였다. 표준곡선식은 농도(면적)＝0.1972(μg/mL) (r²=0.9984)였다. Pepsin 가수분해물의 분석용 시료는 0.20 μm 필터로 여과한 후 한외여과(cut-off limit, 1,000 Da)하여 사용하였다.

분자도킹

분자도킹 계산은 ligand 도킹을 위한 Genetic Optimization으로 수행하였다(GOLD v5.2.2, The Cambridge Crystallographic Data Centre, Cambridge, UK). GOLD는 genetic 알고리즘으로 ligand 구조 유연성을 예측하는 자동화 도킹 프로그램이다(Jones 등, 1997; Verdonk 등, 2003). 인간 상피세포 collagenase 결정구조(PDB ID: 1HFC)는 RCSB Protein Data Bank(www.rcsb.org)에서 얻었다. 화합물의 3차원 구조는 Discovery Studio(DS) 프로그램(BIOVIA, San Diego, CA, USA)을 사용하여 만들었으며, 화합물의 geometry는 DS에 있는 minimize ligand 도구를 통해 최저에너지로 최적화하였다. GOLD를 이용하기 위해 ligand를 SD 파일로 전환하고 계산을 위해 중심의 10Å 반경 내 모든 활성 부위 잔기들을 포함했다. 각 펩타이드에 대하여 50회의 도킹을 수행하였다. 다른 모든 지표는 default로 설정하였고 펩타이드의 도킹 구조는 데이터베이스 선별에서 얻은 약리단에 mapped pose 일관성에 기초하여 선발하였다.

분자다이나믹 시뮬레이션

펩타이드 안정성과 구조변화를 이해하기 위한 molecular dynamic 시뮬레이션은 모든 원자(OPLS-AA)에 대하여 액상 시뮬레이션을 위한 최적화 포텐셜을 사용하는 GROMACS 5.1.5로 얻었으며 10 ns 동안 수행하였다(Abraham 등, 2015). OPLS-AA force field를 사용하는 molecular dynamic 시뮬레이션을 위해 LigParGen 서버로 ligand 위상을 생성하였다(Dodda 등, 2017). OPLS-AA force field는 산소-금속 결합 정보를 제공하지 못하기 때문에 산소-금속 결합, 각도, 이면각(dihedral angle) 대응을 위해 지표 파일을 변형시켰다. 시스템을 tip3p water 모델을 가진 dodecahedron water box에 용매화하였으며 counter ion들로 중화하였다(Jorgensen 등, 1983). 각각의 용매화된 시스템은 10,000단계 steepest descent 알고리즘과 1,000 kJ/mol 이하의 최대 force로 에너지를 최소화하였다. 두 단계에서 각 시스템의 첫 번째 평형은 Berendsen 정온 알고리즘을 사용하여 300 K, 100 ps에서 입자 수, 부피와 온도(NVT) 평형에 집중하였고(Berendsen 등, 1984), 두 번째 평형은 Parrinello-Rahman barostat을 사용하여 1 bar에서 100 ps 동안 입자 수, 압력과 온도를 처리하였다(Parrinello와 Rahman, 1981). 결합과 heavy atom 결합을 유지하기 위해 Molecula Simulations 알고리즘 linear constraint solver를 사용하였고 물분자의 geometry를 제한하기 위해 settle 알고리즘을 사용하였다(Essmann 등, 1995). Particle Mesh Ewald 알고리즘을 사용하여 long-range 정전기 상호작용과 1.2 nm의 cut-off 거리를 계산하였다(Berendsen 등, 1984). 2 fs를 위한 동등 데이터(coordinate data)를 저장하는 10 ns로 molecular dynamic 시뮬레이션을 처리하였다.

통계처리

표준편차, 분산분석 및 회귀분석의 통계처리는 통계 프로그램 JMP(ver. 12, SAS Institute, Cary, NC, USA)를 사용하여 수행하였다.

펩타이드 정제와 collagenase 저해 활성

pH 5.5 조정 후 광어껍질 pepsin 가수분해물의 단백질 농도와 L-leucine 표준곡선으로 측정한 α-아미노산 농도는 각각 50.8 mg/mL와 2.84 mg/mL였다. HiLoad SP-Sepharose high performance 칼럼(16×100 mm)에 시료용액 2 mL를 주입하여 1 M NaCl을 포함한 citrate 완충액(pH 5.5)으로 농도 균배하여 220 nm와 280 nm에서 피크를 검출하면서 5 mL씩 분획하였다(Fig. 1A). 양이온교환크로마토그래피에서 분획번호 C3, C10~11, C12~13 및 C14~15의 4개 분획을 분취하였다. 분획물의 단백질 농도는 23.46 mg/mL, 1.98 mg/mL, 5.10 mg/mL 및 1.89 mg/mL였다. 분획물의 collagenase 저해 활성능은 분획번호 C3과 C10~11에서 100%로 나타났으며 양성대조군으로 사용한 1 mM ascorbic acid의 collagenase 저해 활성은 29.5±11.3%였다(Table 1). 그러나 분획 C3은 양이온교환수지에서 염 농도 균배 이전에 용출한 비결합물질로 판단하여 다음 단계의 정제에 사용하지 않았으며, 단백질 농도로 나눈 비활성은 C14~15번 분획물에서 가장 높게 나타나 size-exclusion 크로마토그래피 정제에 사용하였다. 음이온교환수지 분획물의 collagenase 저해 활성능은 양이온교환크로마토그래피에 비하여 현저히 낮아 더 이상의 정제는 수행하지 않았다.

Table 1 . Collagenase inhibition in purification steps of the peptic hydrolysate from flounder skin.

Chromatography	Fraction No	Protein concentration (mg/mL)	Collagenase inhibition (%)	Specific inhibition (%/mg-protein)
Cation	3	23.46±0.01	100.0±1.3	4.37
	10∼11	1.98±0.00	100.0±1.1	50.49
	12∼13	5.10±0.00	98.8±1.2	19.39
	14∼15	1.89±0.00	97.5±1.4	51.84
Size exclusion	C14-S20∼21	0.20±0.00	100.0±0.4	491.04
	C14-S22∼23	0.01±0.00	96.5±3.3	9,188.76
	C14-S24∼25	0.03±0.00	0	0
1 mM Ascorbic acid			29.5±11.3	-

1 mM Ascorbic acid.

Fig 1. Chromatograms of the peptic hydrolysate from flounder skin to purify collagenase inhibitor. Capital letters indicate chromatographic type: A, cation-exchange; B, size exclusion; and C, reversed phase.

분획물 C14~15를 50°C 이하의 온도에서 회전진공증발기로 농축하여 Superdex 30 prep grade 칼럼(16×600 mm)에 2 mL를 주입하여 HPLC급 증류수로 용출하였다(Fig. 1B). 분획번호 C14-S20~21, C14-S22~23과 C14-S24~25의 3개 분획물을 얻었고, 각각의 collagenase 저해 활성능은 100%, 96.5%, 0%로 나타났다. 분획물의 단백질 농도가 다르기 때문에 각 분획물의 단백질 농도로 나누어 비활성을 비교한 결과, 분획물 C14-S20~21과 C14-S22~23의 비활성은 각각 491.04%/mg-protein과 9188.76%/mg-protein이었다. 따라서 역상크로마토그래피는 C14-S22~23 분획물을 사용하였다.

Size-exclusion 크로마토그래피에서 얻은 C14-S22~23 분획물을 Resource RPC 3 mL 칼럼에 50 μL를 주입하여 B 용매, 0.1% TFA/50% acetonitrile로 20%까지 농도 균배하면서 유속 1 mL/min으로 용출하여 220 nm에서 피크를 검출하였고 충분한 분획물을 모으기 위해 3회 실시하였다. 역상크로마토그래피에서 R4, R5 및 R6의 3개 분획물을 얻었다(Fig. 1C). 분획물은 양이 적어 collagenase 저해 활성능은 측정하지 않았으며, 진공원심분리기에서 완전히 건조하여 MALDI-TOF와 LC-Q-TOF를 사용한 펩타이드 서열분석 시료로 사용하였다.

가수분해절편의 아미노산 서열

MALDI-TOF로 분석한 pepsin 가수분해물의 m/z 값에서 얻은 분자량과 Paralichthys olivaceus의 type-1 collagen α-1 아미노산 서열(분자량 136,740 Da)을 사용하여 pepsin 기질 특이성에 의한 콜라겐 절단 부위에 따른 fragments의 분자량을 비교하고 아미노산 서열을 추정하였다(Fig. 2). Pepsin은 비특이적 절단 특성을 가지나 phenylalanine, leucine과 glutamic acid의 N-말단을 절단하는 약간의 특이성이 있으며, valine, alanine 혹은 glycine 잔기는 절단하지 않는다(Ham, 2005). 그리고 Grant 등(2005)은 pH 2.0(0.1% TFA), 37°C에서 1~3시간 처리한 단백질 가수분해물의 기질 특이성이 phenylalanine> leucine> tryptophan> 기타 아미노산-X의 순위로 절단한다고 보고하였다. 한편 돼지 위에서 유래한 pepsin은 leucine, phenylalanine, tryptophan과 tyrosine의 N-말단을 절단하고(Nelson과 Cox, 2014), 소수성 잔기가 인접할 때 leucine, phenylalanine, tryptophan과 methionine의 C-말단을 절단한다고 보고하였다(Snyder, 2000). 이상의 보고들은 pepsin의 기질 특이성이 trypsin만큼 특이적이지 않음을 제시한다. 본 연구에서는 pepsin이 valine, alanine 및 glycine은 절단하지 않고, leucine, phenylalanine, tryptophan, glutamic acid 및 methionine의 C-말단을 절단하며 절단 부위의 뒤에 proline이 있을 경우 절단하지 않는 것을 기준으로 설정하였다. C14-S22-R4는 QF(293 Da), GSAPE(459 Da)에 해당하는 펩타이드, C14-S22-R5는 RGE(360 Da), VDL(345 Da), VICE(462 Da)의 펩타이드, C14-S22-R6는 RL(287 Da), GPM(303 Da), VDL(345 Da)의 펩타이드가 있음을 확인하였다(Fig. 2). 특히 C14-S22-R5 분획물에서 m/z 286.2723으로 분자량 285 Da에 해당하는 GPHyp와 동일한 분자량의 스펙트럼을 확인하였다. 이 같은 결과는 pepsin 가수분해물 중에 GPHyp의 존재를 지적하여 제조공정 품질관리를 위한 지표물질로 사용 가능함을 제시한다. MALDI-TOF로 확인한 펩타이드의 서열 존재는 uniprot. org/uniprot/Q5NT96의 Paralichthys olivaceus type Ⅰ collagen alpha-1 사슬의 아미노산 서열에서 확인하였다.

Fig 2. MALDI/TOF mass spectrum of peaks from reversed phase fractions for identification of peptides from the peptic hydrolysate of skin flounder.

UHPLC와 one-line으로 연결한 Q-TOF를 사용하여 m/z 범위 300~2,500에 걸쳐 2개의 분획물에서 6개의 펩타이드, GFKGEK, GPPGFPGLPGKPGLPGIP, GPPGPPGPPGPPI, GPPGPPGPPGPPIP, GDKGPK, NTLLPPLVSPR을 확인하였으며(Table 2), 이들 펩타이드는 서열 확인을 위해 데이터베이스로 사용한 콜라겐 단백질 1차 서열에서 존재를 확인하였다. 그러나 예측 분자량의 범위가 600~1,654 Da 범위에 해당하여 collagenase 활성 부위에 결합하기에는 분자가 클 뿐 아니라 세포 내 투과를 위한 수송체가 없다면 세포 투과도가 현저히 떨어질 것으로 예측하였다. 그리고 장쇄의 펩타이드 특성은 Lipinski의 rule of 5와 lead-like 화합물의 범위를 현저히 벗어나 collagenase 활성 저해 유효성 확인을 위한 분자토킹에서 제외하였다.

Table 2 . Typical sequence of peptides in the fractions of reversed phase chromatography from the peptic hydrolysate of flounder skin using LC/Q-TOF mass-spectrometry.

Fraction	Prec MW	Prec m/z	Prez z	Best sequence
C14-S22-R4	664.47	333.24	2	GFKGEK
C14-S22-R5	1,654.04	552.35	3	GPPGFPGLPGKPGLPGIP
	1,135.69	568.85	2	GPPGPPGPPGPPI
	1,232.85	617.43	2	GPPGPPGPPGPPIP
	600.26	301.14	2	GDKGPK
	1,108.69	555.35	2	NTLLPPLVSPR

분자도킹

MALDI-TOF와 LC/MS/MS에서 확인한 저분자 펩타이드 및 북태평양 명태껍질 가수분해물에서 얻은 펩타이드 GPM(Byun과 Kim, 2002)과 collagenase(PDB ID: 1HFC)의 분자도킹 계산을 50회씩 수행하였다. Collagenase와 펩타이드 간의 결합력을 확인하기 위해 clustering 수와 GOLD score를 측정하여 결합모드를 분석하고 collagenase 저해 활성능을 측정하였다(Table 3). 각 펩타이드의 ligand clustering은 50회 수행 시에 펩타이드 VICE가 29회 일치하여 가장 높았다. Clustering이 낮을 경우 기하학적 pose의 차이가 크기 때문에 결합력이 약해질 것으로 판단하였다.

Table 3 . Gold score and in vitro collagenase inhibition of peptides from the peptic hydrolysate of flounder skin for collagenase (PDB ID: 1HFC) inhibition using molecular docking.

Peptide	GOLD score	Cluster (×/50)	Collagenase inhibition (%)1)	Remark
GPHyp2)	49.9	35	0	Collagen hydrolysate
GPM	66.9	22	3.92±0.04	Alaska pollack skin
GPK	70	27	19.07±3.01	Oyster hydrolysate
GSAPE	75.1	21	7.12±3.87	Novel
VDL	75.1	9	13.46±4.24	Novel
VICE	83.9	29	83.25±14.03	Novel
Delta-GHK	75.4	16	6.03±1.24	Commercial product as Cu-GHK
Epsilon-GHK	78.4	12

¹⁾Collagenase inhibitory activities are measured in the concentration of 1 mg/mL..

²⁾GPHyp has been used as index for quality control of collagen hydrolysate..

GOLD score는 VICE가 83.9점으로 가장 높았으며, GSAPE와 GPK는 각각 75.1과 70.0점이었다. 콜라겐 효소 가수분해물의 지표물질로 사용하고 있는 GPHyp의 경우 GLOD score는 가장 낮은 49.9로서 친화도 점수가 낮아 collagenase 저해 활성능을 보이지 않을 것으로 예상하였다. 실제로 collagenase 저해 활성능이 검출되지 않아 분자도킹 계산 결과와 일치하였다. 신규 저분자 펩타이드 중 GSAPE와 VICE가 비교적 안정적인 clustering 형성과 높은 GOLD score를 보였다.

Collagenase 활성 부위와 펩타이드들의 결합모드를 확인한 결과, GPM, GPK, GSAPE와 VICE 펩타이드 모두 결합 부위의 포켓에 정확히 있었다(Fig. 3). 특히 VICE는 collagenase 저해 활성능이 83.25%로 가장 높아서 분자도킹의 결과와 거의 일치하였다(Table 3). GPM, GSAPE와 VICE 펩타이드는 Zn 이온과 histidine 잔기로 이루어진 활성 잔기와 상호 작용함을 확인하였다(Table 4). GSAPE, VICE 펩타이드는 활성 부위의 포켓에 존재하는 아미노산들과 수소결합을 생성하여 collagenase와 결합력을 높일 것으로 예측된다. GPK의 경우 라이신의 작용기가 포켓 외부로 돌출된 형태로 존재하며(Fig. 3), 포켓 외부로 돌출된 lysine은 collagenase의 아미노산과 상호결합을 생성하지 않기 때문에 결합력에 영향을 미칠 것으로 판단하였다.

 Table 4 . Interaction residues between collagenase (PDB ID: 1HFC) and peptides via hydrogen bond, hydrophobic and electrostatic interaction.

Peptide	Hydrogen bond	Hydrophobic interaction	Electrostatic interaction
GPM	Asn180, Leu235, Tyr237, Ser239	Leu181, Val215, His218	Pro238, Zn2+
GSAPE	Gly179, Asn180, Leu181, Ala182, Ala184, His218, Tyr240	Val215	His222, Zn2+
VICE	Gly179, Asn180, Leu181, Ala182, Pro238, Tyr240	Val215, His218, His222	Glu219, Zn2+

Fig 3. Binding mode comparison of GPM, GPK, GSAPE, and VICE. The stick models of GPM (A), GPK (B), GSAPE (C), and VICE (D) are shown in dark-orange, yellow, cyan and green, respectively. Hydrogen bond, hydrophobic, and electrostatic interaction are shown as yellow-green, pink, and orange, respectively.

시판하고 있는 펩타이드인 GHK의 분자도킹 계산 결과(Fig. 4), GHK의 가운데 서열인 histidine은 tautomer 반응으로 인하여 수소의 위치에 따라 2가지의 형태로 존재하였다. 두 가지 형태인 delta-GHK(이하 D-GHK)와 epsilon-GHK(이하 E-GHK)의 분자도킹을 수행한 결과, D-GHK와 E-GHK 모두 clustering 개수는 각각 16, 12개로 20개 이하의 낮은 값을 보였다(Table 3).

Fig 4. Binding mode comparison of delta-GHK and epsilon-GHK. The stick models of delta-GHK (A and B) and epsilon-GHK (C and D) are shown in violet and gray, respectively. Hydrogen bond, hydrophobic, and electrostatic interaction are shown as yellow-green, pink, and orange, respectively.

그러나 D-GHK와 E-GHK의 GOLD score는 각각 75.4, 78.4점으로 GPK, GSAPE와 VDL과 거의 비슷하거나 다소 높은 점수를 보였다. 결합모드를 확인해본 결과 GHK 펩타이드는 delta(D)와 epsilon(E)형 모두 histidine의 imidazole기 회전으로 인해 다양한 결합 형태를 보였다. D-GHK의 경우 골격의 결합모드는 동일하기 때문에 cluster 개수에는 포함되었으나, histidine의 imidazole기가 회전하여 Y237, P238, Y240 아미노산과 상호작용이 변함을 확인하였다(Fig. 4A, B). E-GHK 결합모드도 골격의 결합모드는 D-GHK와 동일하나 histidine의 imidazole기로 인해 S239 잔기와의 상호작용을 생성하거나 혹은 생성하지 않았다(Fig. 4C, D). GHK 펩타이드의 순간적인 결합력은 신규 펩타이드보다 강할 수는 있으나 histidine의 imidazole기 회전으로 인해 신규 펩타이드보다 안정적인 결합에 부적절할 것으로 판단하였다. 분자도킹의 결과에 미루어 신규 펩타이드 VICE는 수소결합 및 클러스터 개수가 많아 collagenase를 저해하는 후보 펩타이드로서의 입체구조가 안정적이고 collagenase 결합 부위의 아미노산과 많은 수의 수소결합, 소수적 상호작용 및 Zn 이온과 정전기적 상호작용을 통해 collagenase를 억제할 가능성을 보였을 뿐 아니라 분자도킹을 실시한 펩타이드 중에서 가장 높은 collagenase 저해 활성능을 보였다.

지표물질 함량

콜라겐 저분자 가수분해물 소재의 피부 건강기능성 식품의 지표물질로 사용하고 있는 GPHyp를 Capcell Pak C18 MG 칼럼을 장착한 HPLC를 사용하여 정량하였다. 농도별 표준물질 GPHyp로 수행한 retention time(RT)은 8.506±0.042분이고 %RSD는 0.49%로 validation 기준인 5% 미만에 해당하였다. 그리고 한외여과(cut-off limit, 1,000 Da)한 pepsin 가수분해물의 RT 평균과 RSD값은 각각 8.437±0.035분과 0.41%로 역시 validation 기준 RSD 5%를 만족하였다. GPHyp와 pepsin 가수분해물의 RT값은 유의적인 차이를 보이지 않아(P<0.05) HPLC에서 확인한 가수분해물의 피크는 표준물질의 피크와 동일한 피크임을 확인하였다. Pepsin 가수분해물의 지표물질 GPHyp 함량은 156.12 μg/g으로 최종제품의 소재에 적용하는 함량 범위를 80~120%로 설정할 때 124~187 μg/g의 범위를 가진다(Table 5). 표준곡선의 검출한계(LOD)는 LOD＝3σ/s(σ=감응의 표준편차, s=검정곡선의 기울기) 식으로 계산하였으며 0.33 μg/g이었다. 지표물질 GPHyp와 가수분해물에 있는 GPHyp의 정량을 위한 대표적인 역상크로마토그램을 제시하였다(Fig. 5).

Table 5  . Retention time and area of standard Gly-Pro-Hyp, and the content of Gly-Pro-Hyp in the peptic hydrolysate using HPLC analysis.

Sample	Concentration (μg)	Retention time (min)	Area (mAU×min)
Standard GPHyp	1	8.506±0.042	7.86±0.17
	2		15.86±0.15
	3		31.79±0.63
	4		47.51±0.17
	5		63.09±0.43
	6		78.80±0.22
Hydrolysates	Concentration (μg/g)	Retention time (min)	RSD (%)
GPHyp	156.12±2.59	8.437±0.035	1.66

Fig 5. Reversed phase-chromatogram for the determination of Gly-Pro-Hyp as quality indicator in the peptic hydrolysates from flounder skin. A (top) and B (bottom) indicate the standard Gly- Pro-Hyp and the peptic hydrolysate, respectively.

본 연구는 광어껍질 pepsin 가수분해물의 collagenase 활성을 제해하는 펩타이드를 확인하고 collagenase 활성 저해능을 평가할 목적으로 수행하였다. Collagenase 저해 펩타이드는 이온교환, 겔 여과 및 역상크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. MALDI-TOF 질량분석 스펙트럼에서 7개의 펩타이드 Gln-Phe(293 Da), Val-Ile-Cys-Glu(462 Da), Arg-Gly-Glu(360 Da), Val-Asp-Leu(345 Da), Gly-Pro-Met(303 Da), Gly-Ser-Ala-Pro-Glu(459 Da) 및 Arg-Leu(287 Da)를 확인하였다. LC-Q-TOF 질량분광계를 사용한 서열분석에서 6개의 비교적 긴 아미노산 서열의 펩타이드를 확인하였다. 펩타이드의 아미노산 서열은 Ⅰ형 콜라겐 알파-1 사슬(UniProtKB-Q5NT96)에서 확인하여 광어껍질에서 유래함을 검증하였다. 펩타이드 Val-Ile-Cys-Glu는 in silico 분자토킹에서 가장 높은 83.9의 GOLD score와 83.25±14.03%의 collagenase 저해 활성능을 보였다. 광어껍질 가수분해 제조공정 관리를 위한 지표물질로 Gly-Pro-Hyp의 정량법을 검정하였다. Pepsin 가수분해물 3 lot의 Gly-Pro-Hyp 평균 함량은 156 μg/g이었다. 이 같은 결과는 광어껍질 유래 pepsin 가수분해물이 저분자 펩타이드에 기인한 높은 collagenase 활성 저해능을 보이며 항주름 기능을 위한 식품첨가제와 기능성 식품 조성물로 사용될 수 있음을 제시한다.

본 연구는 중소벤처기업부와 한국산업기술진흥원의 “지역특화산업육성(R&D, 과제번호 P0015257)” 사업의 지원을 받아 수행된 연구결과임.