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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(4): 302-310

Published online April 30, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.4.302

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Hepatoprotective Effect of Artemisia capillaris Thunb Water Extract in an Animal Model of Liver Fibrosis

Min Ju Kim , Jeong Won Choi, Se Hui Lee , Mi-Rae Shin , and Seong-Soo Roh

Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University

Correspondence to:Seong-Soo Roh, Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, 136, Sincheondong-ro, Suseong-gu, Daegu 42158, Korea, E-mail: ddede@dhu.ac.kr
Author information: Min Ju Kim (Graduate student), Jeong Won Choi (Graduate student), Se Hui Lee (Graduate student), Mi-Rae Shin (Professor), Seong-Soo Roh (Professor)

Received: December 30, 2021; Revised: March 11, 2022; Accepted: March 18, 2022

This is Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

This study investigated the hepatoprotective effect of Artemisia capillaris Thunb water extract (AE) in a thioacetamide (TAA)-induced liver fibrosis model using mice. The animal experiment was conducted with a normal group, a control group, a positive control group (silymarin 50 mg/kg), and an AE group (AE 200 mg/kg). Except for the normal group, hepatic fibrosis was induced by intraperitoneal administration of TAA 3 times a week for 8 weeks in the remaining groups (100 mg/kg for 1 week, 200 mg/kg for 2∼3 weeks, and 400 mg/kg for 4∼8 weeks). Moreover, the AE or silymarin was administered orally daily for 8 weeks. At the end of 8 weeks, ammonia levels and the myeloperoxidase (MPO) activity in the serum were measured. The expression of antioxidant, oxidative stress, inflammation, and fibrosis-related proteins in the liver tissue was measured by western blot test. Serum analysis revealed that the ammonia levels and MPO activity that were increased by the TAA were significantly decreased by the AE treatment. Also, treatment with AE significantly reduced the oxidative stress, increased by TAA by increasing the expression of antioxidant-related proteins in the liver tissue. Our study confirmed that the expression of inflammation and fibrosis-related proteins was significantly reduced due to the reduction of oxidative stress. In conclusion, these results suggest that AE treatment alleviates hepatic fibrosis by reducing oxidative stress through the activation of the NF-E2-related factor 2 (Nrf2) pathway.

Keywords: Artemisia capillaris, liver fibrosis, thioacetamide, antioxidant, oxidative stress

간섬유증은 비알코올성 간질환, 알코올성 간질환, 담즙 정체성 간질환 등과 같은 만성 간질환에서 흔하게 나타나는 증상 중에 하나이며(Lee 등, 2016a; Petta 등, 2019; Moran-Salvador와 Mann, 2017), 간에 일어난 손상에 대한 반응으로 간성상세포(HSCs, hepatic stellate cells)에 의해 세포외기질(extracellular matrix)이 과도하게 생성되는 것을 특징으로 한다(Li 등, 2011). 간이 손상되어 만성적으로 지속되면 산화적 스트레스가 간성상세포의 활성화를 촉진시키며 콜라겐 생성을 증가시키게 된다(Ghatak 등, 2011). 이에 본 실험에서는 간섬유증을 유발하기 위해 thioacetamide(TAA)를 사용하였는데, TAA는 혈중 간세포 효소 수치를 적당량 증가시키면서 만성 독성이 느리게 진행되는 섬유증을 일으켜 인간에게서 나타나는 알코올성 간섬유증과 유사한 병변이 나타나게 한다(Hempel 등, 2019). 많은 연구에서 항산화 관련 전사인자인 nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)가 산화적 스트레스로 인해 간이 손상될 때 세포질에서 핵으로 이동하여 전사 조절을 수행하여 간섬유증을 완화한다고 알려져 있다(Ma 등, 2015).

Silybum marianum의 씨앗에서 추출된 silymarin은 silybin, silydianin 및 silychrisin으로 구성된 플라보노이드 복합체로 손상된 간세포 재생을 촉진하는 강력한 항산화제로 알려져 있다(Latief와 Ahmad, 2018). 이에 본 연구에서는 silymarin을 양성 약물로 사용하여 실험을 진행하였다.

국화과(Compositae)에 속한 인진호(Artemisia capillaris Thunb)는 한의학에서 사철쑥의 전초를 건조하여 사용하며, 생약명으로 인진 또는 인진호라고 불린다(Lee 등, 2018; Kim과 Kim, 2015). 이러한 인진호는 조금 찬 기운이 있으며 독이 없고 맛은 쓰다(Kong 등, 2011). 현재 인진호에 대해 알려진 효능으로는 급성 역류성 식도염 개선 효과(Lee 등, 2016b), 식중독 세균 생육억제 효과(Lee와 Seo, 2003a), 알레르기성 피부염 개선 효과(Kim 등, 2021a), 사염화탄소에 의한 간 손상 개선 효과(Kim과 Park, 1992) 등이 있다. TAA로 유발된 간 손상 및 간섬유증에 미치는 효과에 대해서는 알려진 바가 없다. 이에 앞서 TAA로 유발된 간 손상에 인진호의 간 보호 효능을 연구하였으며, 인진호의 항산화능으로 TAA에 의한 산화적 스트레스를 억제함으로써 간 손상을 유의적으로 억제하는 걸 확인할 수 있었다(Kim 등, 2021b). 이에 본 연구에서는 인진호 열수 추출물의 항산화 효능을 통해 TAA로 유발된 간섬유증 개선 효과를 확인하였으며, 그 기전에 대하여 보고하는 바이다.

시료 추출

본 실험에서 사용한 인진호는 옹기한약국(Daegu, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용하기 위해 인진호 100 g에 증류수 1 L를 가하여 100°C에서 2시간 동안 가열하여 추출하였다. 추출물을 여과한 후 농축하여 파우더 형태(수율 10%)로 만들었으며 실험에 사용하기 직전까지 -80°C에서 보관되었다.

시약

Alfa Aesar(Ward Hill, MA, USA)에서 aluminium chloride를 구입하여 사용하였다. Gallic acid, thioacetamide, quercetin, sodium carbonate, diethylene glycol 및 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 1차 항체인 histone, β-actin, gp91-phox(NOX2), p22phox, Nrf2, heme oxygenase-1(HO-1), catalase, glutathione peroxidase-1/2(GPx-1/2)은 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA), α-SMA와 collagen Ⅰ은 Abcam(Cambridge, UK)으로부터 구입하여 사용하였다. 2차 항체는 GeneTex, Inc.(Irvine, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Protease inhibitor mixture, ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)에서 구입하였으며, nitrocellulose membranes와 ECL Western Blotting Detection Reagents는 Amersham GE Healthcare(Little Chalfont, UK)에서 구입하였다. 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit은 Thermo Scientific(Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

Folin Ciocalteu’s의 방법을 사용하여 인진호 열수 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정하였다(Rama 등, 2013). E-tube에 시료 100 µL와 10% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 500 µL, 7.5% sodium carbonate 400 µL를 넣고 잘 혼합하여 30분간 암소에서 반응 후, UV 분광광도계(Infinite M200, Tecan, Männedorf, Switzerland)를 사용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 gallic acid를 사용하였다(gallic acid equivalents, GAE).

총 플라보노이드 함량 측정

Aluminum chloride 비색법을 사용하여 인진호 열수 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정하였다(Rama 등, 2013). E-tube에 시료 100 µL와 10% aluminium chloride solution 20 µL, 1 M potassium acetate solution 20 µL 및 증류수 560 µL를 넣고 잘 혼합하여 30분간 암소에서 반응 후, UV 분광광도계를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 quercetin을 사용하였다(quercetin equivalents, QE).

간섬유증 실험동물

7주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 대한바이오링크(Eumseong, Korea)에서 구입하여 물과 고형사료(조단백질 18% 이상, 조회분 8.0% 이하, 조지방 5.0% 이상, 조섬유 5.0% 이하, 칼슘 1.0% 이상, 나트륨 0.25% 이상, 인 0.85% 이상, 칼륨 0.55% 이상, 마그네슘 0.15% 이상, NIH-41, Zeigler Bros, Inc., Gardners, PA, USA)를 충분히 공급하며, 일주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실 환경조건은 다음과 같이 conventional system으로 습도는 50±5%, 온도는 22±2°C, 명암주기는 12시간 주기로 조절하였다. 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 대구한의대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인(승인번호: DHU2021-039)을 얻어 실험을 시행하였으며 동물관리 규정을 준수하였다.

실험군은 정상군(Normal), 대조군(Control), silymarin 50 mg/kg으로 경구 투여한 양성대조군(Silymarin), 인진호 열수 추출물 200 mg/kg으로 경구 투여한 인진호 투여군(AE)으로 각 군당 6마리씩 4개의 그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 정상군을 제외한 나머지 군은 8주간 주 3회 TAA(1주 100 mg/kg, 2~3주 200 mg/kg, 4~8주 400 mg/kg)를 복강 투여하여 간섬유증을 유발하였으며 동시에 해당 약물을 8주간 매일 경구 투여하였다(Thi Thanh Hai 등, 2018). 8주간의 투여 후 isoflurane을 사용해 흡입 마취하여 혈액을 심장에서 채취하였으며 간 조직을 적출하였다. 그 후 채취한 혈액은 10분간 4,000 rpm으로 원심분리기를 사용하여 혈청을 분리하였으며, 혈청과 간 조직은 실험에 사용하기 직전까지 -80°C에 보관하였다.

혈청 내 암모니아 수치 및 myeloperoxidase 활성 측정

혈청 내의 암모니아 수치와 myeloperoxidase(MPO) 활성은 ammonia assay kit(Abcam)과 MPO colorimetric activity assay kit(BioVision, Milpitas, CA, USA)의 프로토콜에 따라 측정되었다.

혈청 내 reactive oxygen species 측정

혈청 내의 reactive oxygen species(ROS)를 측정하기 위하여 25 mM DCFH-DA를 혼합한 후, 형광광도계를 이용하여 emission wavelength 530 nm와 excitation wavelength 485 nm에서 측정하였으며, 그 수치는 정상군 대비로 나타내었다(Ali 등, 1992).

간 조직 western blotting

Western blotting 분석을 위하여 간 조직에 buffer A(100 mM Tris-HCl(pH 7.4), 5 mM Tris–HCl(pH 7.5), 1.5 M sucrose, protease inhibitor cocktail, 0.1 M DTT, 2 mM MgCl2, 15 mM CaCl2)를 넣은 후, tissue grinder(BioSpec Products, Bartlesville, OK, USA)를 사용하여 분쇄하고 30분간 ice 위에서 정치시킨 다음, 10% NP-40 용액을 넣고 12,000 rpm으로 2분간 원심분리하여 세포질을 포함한 상층액을 분리했다. 세포질이 함유된 상층액을 채취하고 남은 조직에 10% NP-40가 포함된 buffer A에 두 번 헹구고 buffer C(0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol, 50 mM KCl, 50 mM HEPES, 0.3 mM NaCl, 0.1 mM PMSF)를 첨가해 재부유시킨 다음에 10분 간격으로 vortex를 3번 시행하였다. 마지막 vortex 후 4°C에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 핵을 분리하였다. 분리된 세포질과 핵은 -80°C에서 냉동 보관하였다. 세포질과 핵 내의 단백질 발현을 측정하기 위해 8~12% SDS-polyacrylamide gel에 8~10 μg의 단백질을 전기영동 시킨 후 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 그다음 membrane에 각각의 1차 antibody(PBS-T를 사용하여 1:1,000으로 희석)를 처리하여 4°C에서 overnight 시킨 다음 PBS-T를 사용하여 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 antibody(PBS-T를 사용하여 1:3,000으로 희석)를 상온에서 2시간 반응시키고 PBS-T로 세척하였다. 그 후 enhanced chemiluminescence(ECL) 용액과 Sensi-Q2000 Chemidoc으로 단백질 발현을 확인한 후, ATTO Densitograph Software(ATTO Corp., Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 해당 단백질의 band를 정량하여 실험군 간에 단백질 발현량을 비교하였다.

조직학적 관찰

간 조직을 10% neutral buffered formalin에 1일간 고정한 다음 graded alcohol을 이용해 탈수시키고 paraffin으로 포매하여 block을 제작하였다. 그다음 microtome으로 조직을 5 µm의 두께로 절편하여 Masson’s trichrome 염색을 하였으며 광학현미경으로 병변의 유무를 관찰하였다.

통계분석

In vitro 수치는 평균과 표준오차로 표시하였으며, in vivo 수치는 평균과 표준편차로 표시하였다. SPSS(Version 26.0, IBM, Armonk, NY, USA)를 사용하여 one-way analysis of variance(ANOVA) test를 사용한 후, least-significant differences(LSD) test로 사후검정을 실시하여 유의수준을 P<0.05, P<0.01, P<0.001에서 검증하였다.

총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

각종 질병의 원인은 다양하지만 가장 주요인으로는 몸속에서 ROS의 생성과 축적으로 인하여 생기는 세포손상이 있다(Chung 등, 2006; Lee 등, 2003b). 이를 예방하기 위해 평소 항산화 물질들을 충분하게 복용하는 것이 좋다고 알려져 있다. 식물계 항산화 물질에는 페놀성 화합물, 플라보노이드, 토코페롤 등이 있는데 이와 같은 물질들은 ROS를 억제하여 노화 및 각종 질병의 예방에 관여한다(Kim 등, 2012). 이에 인진호 열수 추출물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 총 폴리페놀 함량은 240.43±0.85 mg GAE/g으로 측정되었고 총 플라보노이드 함량은 35.24±0.08 mg QE/g으로 측정되었다(Table 1).

Table 1 . Total polyphenol and total flavonoid contents of Artemisia capillaris Thunb water extract

SampleTotal polyphenol (mg GAE1)/g)Total flavonoid (mg QE2)/g)
AE3)240.43±0.8535.24±0.08

1)GAE: gallic acid equivalents.

2)QE: quercetin equivalents.

3)AE: Artemisia capillaris Thunb water extract.

All values are mean±SEM of three replications.



체중 변화 및 식이 섭취량 측정 결과

실험동물들의 실험 기간 중 체중 변화량(g)과 식이 섭취량(g)은 Table 2와 같다. 정상군은 실험 시작 날보다 7.61 ±0.49 증가하였으며, 대조군은 0.44±0.18, 양성대조군은 0.80±0.21, 인진호 투여군은 0.95±0.10 증가하였다. 이 결과, TAA 간섬유증 유발 동물모델들에서 체중 변화량이 정상군에 비해 유의하게 감소하였으며, 대조군보다 양성대조군과 인진호 투여군에서 체중 변화량이 증가하였으나 유의적인 차는 없었다. 식이 섭취량의 결과, 정상군은 매일 3.87±0.14를 섭취하는 것으로 나타났으며, 대조군은 3.21±0.20으로 정상군에 비해 유의적으로 적게 섭취하는 것으로 나타났다(P<0.05). 반면 약물투여군들은 각각 양성대조군 3.23±0.14, 인진호 투여군 3.20±0.18로 대조군과 유의적인 차가 없었다.

Table 2 . Body weight and food intake in liver fibrosis-induced mice

GroupBody weight (g)Food intake (g)
InitialFinalChange
Normal23.46±0.3731.02±0.457.61±0.493.87±0.14
Control23.32±0.3823.88±0.16###0.44±0.18###3.21±0.20#
Silymarin23.41±0.3723.91±0.190.80±0.213.23±0.14
AE23.25±0.1723.97±0.110.95±0.103.20±0.18

Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group.

All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: #P<0.05, ###P<0.001 vs. Normal group.



혈청 내 GOT 및 GPT 수치 측정

혈청 내 간 손상 지표인 GOT와 GPT 수치를 측정하였다. GOT와 GPT는 간세포가 손상된 후 혈액으로 방출되는데 그중 GPT는 간 손상에 더욱 특이적이다(El-Baz 등, 2020). GOT 측정 결과, TAA로 간섬유증이 유발된 대조군의 수치가 정상군 수치의 약 6.9배 유의하게 증가했으며(P<0.001), 양성대조군과 인진호 투여군은 대조군 수치보다 약 0.4배 유의하게 감소하였다(silymarin P<0.001, AE P<0.001). GPT 수치 또한 대조군의 경우 정상군 수치보다 약 3.5배 유의하게 증가했으며(P<0.001),

양성대조군과 인진호 투여군에서 대조군보다 유의하게 감소하는 것(silymarin P<0.001, AE P<0.001)을 확인할 수 있었다(Fig. 1).

Fig. 1. The GOT and GPT levels in serum. (A) GOT, (B) GPT. Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: ###P<0.001 vs. Normal group, ***P<0.001 vs. Control group.

혈청 내 암모니아 수치 측정

여러 간 기능성 장애들은 암모니아와 같은 몸속 유해 물질들을 해독하지 못하게 한다(Jamshidzadeh 등, 2017; Sánchez-Valle 등, 2012). 이에 TAA 간섬유증 유발 동물모델의 혈청 내 암모니아 수치 측정 결과, 간섬유증이 유발된 대조군의 수치는 정상군의 수치에 약 2.7배로 유의하게 증가했으며(P<0.001), 양성대조군과 인진호 투여군은 대조군의 수치에 각각 약 0.7배(P<0.001), 0.8배(P<0.001)로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2A).

Fig. 2. The ammonia, MDA, and ROS levels in serum. (A) Ammonia, (B) MPO activity, and (C) ROS. Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: ###P<0.001 vs. Normal group, *P<0.05, ***P<0.001 vs. Control group.


혈청 내 myeloperoxidase 활성 측정

대부분의 만성 간질환은 산화적 스트레스를 동반하며 이는 간섬유증 발병에 핵심적인 역할을 한다고 알려져 있다(Friedman, 2008; Sánchez-Valle 등, 2012). 이에 혈청 내 산화적 스트레스 바이오마커인 MPO의 활성을 측정한 결과, 간섬유증이 유발된 대조군은 정상군보다 약 3.9배로 유의하게 증가했으며(P<0.001), 양성대조군과 인진호 투여군은 대조군보다 약 0.5배(P<0.001), 0.7배(P<0.05)로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2B).

혈청 내 ROS 측정

산화적 스트레스는 간 손상을 진행하는 주요 요소로 ROS는 간염증, 괴사, 담즙 정체 및 간섬유증을 유발한다(Chang 등, 2021). 혈청 내 ROS 측정 결과, 정상군보다 대조군에서 약 1.82배 유의하게 증가했으며, 이렇게 올라간 ROS가 양성대조약물인 silymarin과 인진호 투여로 인하여 유의하게 감소하는 것(silymarin P<0.001, AE P<0.001)을 확인할 수 있었다(Fig. 2C).

Western blotting

간 조직 내 산화적 스트레스 관련 인자 발현량: ROS는 superoxide, hydroxide, singlet oxygen 등과 같은 활성산소 라디칼을 의미하는데, 이러한 ROS는 NADPH oxidase가 주는 다양한 자극들에 의해 반응하여 만들어진다(Liang 등, 2016; De Minicis와 Brenner, 2007). NADPH oxidase는 간섬유증이 진행되는 과정에서 ROS를 생산하여 간섬유증의 진행을 돕는 효소 복합체로도 알려져 있다(Aoyama 등, 2012; Paik 등, 2014). 이에 간 조직 내에서 NADPH oxidase family로 알려진 NOX2와 p22phox의 발현량을 측정하였다. NOX2의 발현량을 측정한 결과, 정상군에 비해 간 섬유화가 유발된 대조군에서 약 42% 유의하게 증가하였다(P<0.001). 대조군과 비교해 양성대조군에서 약 12% 감소하는 경향이 나타났으며, 인진호 투여군은 약 23% 유의하게 감소하였다(P<0.01). p22phox의 발현량을 측정한 결과, 정상군보다 대조군에서 약 39% 유의하게 증가하였다(P<0.01). 반면, 대조군에 비해 양성대조군은 약 21%, 인진호 투여군은 약 30% 유의하게 감소했으며(P<0.05, P<0.01), 특히 인진호 투여군은 정상군 수준까지 감소한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).

Fig. 3. Expressions of NOX2 and p22phox protein in liver tissue. (A) NOX2, (B) p22phox. Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: ##P<0.01, ###P<0.001 vs. Normal group, *P<0.05, **P<0.01 vs. Control group.


간 조직 내 항산화 관련 인자 발현량: Nrf2는 HO-1, catalase, GPx-1/2과 같은 항산화 관련 인자들의 발현을 이끄는 전사인자이다(Yan 등, 2018). 많은 연구에서 Nrf2의 활성화가 산화적 스트레스로 인한 간 손상으로부터 간을 보호할 수 있음을 보여주었다(Wu 등, 2012; Hybertson 등, 2011). 이에 간 조직 내에서 항산화 관련 인자인 Nrf2, HO-1, catalase, GPx-1/2의 발현량 측정 결과, 정상군보다 대조군에서 유의하게 감소하였으며, 대조군보다 양성대조군과 인진호 투여군에서 발현량이 유의하게 증가하였다. 특히, Nrf2와 catalase는 대조군보다 인진호 투여군에서 발현 증가량이 각각 80%(P<0.001), 30%(P<0.001)로 정상군 수준까지 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).

Fig. 4. Expressions of anti-oxidant protein in liver tissue. (A) Nrf2, (B) HO-1, (C) catalase, and (D) GPx-1/2. Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs. Normal group, *P<0.05, ***P<0.001 vs. Control group.


간 조직 내 섬유화 관련 인자 발현량: HSCs는 간섬유증을 일으키는 주요한 영향을 주는 세포이다. TAA의 주입으로 간에 있는 HSCs가 자극을 받아 섬유성 근섬유 아세포를 분화하여 α-SMA와 collagen Ⅰ을 분비해 간섬유증을 유도한다(Zhou 등, 2021). 이에 간 조직 내에서 α-SMA와 collagen Ⅰ의 발현량 측정 결과, 정상군보다 대조군에서 유의하게 증가하였으며, 대조군보다 인진호 투여군에서 각각 24%(P<0.05), 25%(P<0.01)로 유의하게 감소하였다(Fig. 5).

Fig. 5. Expressions of α-SMA and collagen Ⅰ protein in liver tissue. (A) α-SMA, (B) Collagen Ⅰ. Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: ###P<0.001 vs. Normal group, *P<0.05, **P<0.01 vs. Control group.


조직학적 관찰

간 조직에 Masson’s trichrome 염색을 하여 간섬유증의 병변을 관찰하였다. 그 결과 정상군보다 대조군에서 교원질 섬유(collagenous fiber)가 넓은 범위로 침착하였으며, 양성대조군과 인진호 투여군에서 교원질 섬유의 침착이 완화된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6).

Fig. 6. Pathological observation in liver tissue. Masson’s trichrome (MT) staining (A), MT area (blue-stained areas expressed as percentage of total surface area) (B). Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: ###P<0.001 vs. Normal group, ***P<0.001 vs. Control group. (×200, scale bar 100 μm)

본 실험에서는 8주간 thioacetamide(TAA)로 간섬유증 유발과 동시에 인진호 열수 추출물을 경구 투여하여 간섬유증에 미치는 영향에 대하여 실험을 진행하였으며 다음과 같은 결과를 얻었다. 인진호 열수 추출물은 TAA 주입으로 인해 증가한 혈청 내 암모니아 수치와 myeloperoxidase 활성을 유의하게 감소시켰다. 그리고 간 조직 내 항산화 관련 인자인 Nrf2, HO-1, catalase, GPx-1/2의 발현을 증가시켜 산화적 스트레스 관련 인자인 NOX2와 p22phox의 발현을 유의하게 감소시켰으며, 이로 인해 섬유화와 관련된 인자인 α-SMA와 collagen Ⅰ의 발현을 유의하게 감소시켜 간섬유증을 약화했다.

이 논문은 2022년도 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원(No. 2018R1A5A2025272)을 받아 수행된 연구입니다.

  1. Ali SF, LeBel CP, Bondy SC. Reactive oxygen species formation as a biomarker of methylmercury and trimethyltin neurotoxicity. Neurotoxicology. 1992. 13:637-648.
  2. Aoyama T, Paik YH, Watanabe S, Laleu B, Gaggini F, Fioraso- Cartier L, et al. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NOX) in experimental liver fibrosis: GKT137831 as a novel potential therapeutic agent. Hepatology. 2012. 56: 2316-2327.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  3. Chang GR, Lin WL, Lin TC, Liao HJ, Lu YW. The ameliorative effects of saikosaponin in thioacetamide-induced liver injury and non-alcoholic fatty liver disease in mice. Int J Mol Sci. 2021. 22:11383. https://doi.org/10.3390/ijms222111383
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  4. Chung HY, Sung B, Jung KJ, Zou Y, Yu BP. The molecular inflammatory process in aging. Antioxid Redox Signal. 2006. 8:572-581.
    Pubmed CrossRef
  5. De Minicis S, Brenner DA. NOX in liver fibrosis. Arch Biochem Biophys. 2007. 462:266-272.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  6. El-Baz FK, Salama AAA, Hussein RA. Dunaliella salina microalgae oppose thioacetamide-induced hepatic fibrosis in rats. Toxicol Rep. 2020. 7:36-45.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  7. Friedman SL. Mechanisms of hepatic fibrogenesis. Gastroenterology. 2008. 134:1655-1669.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  8. Ghatak S, Biswas A, Dhali GK, Chowdhury A, Boyer JL, Santra A. Oxidative stress and hepatic stellate cell activation are key events in arsenic induced liver fibrosis in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 2011. 251:59-69.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  9. Hempel F, Roderfeld M, Savai R, Sydykov A, Irungbam K, Schermuly R, et al. Depletion of bone marrow-derived fibrocytes attenuates TAA-induced liver fibrosis in mice. Cells. 2019. 8:1210. https://doi.org/10.3390/cells8101210
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  10. Hybertson BM, Gao B, Bose SK, McCord JM. Oxidative stress in health and disease: The therapeutic potential of Nrf2 activation. Mol Aspects Med. 2011. 32:234-246.
    Pubmed CrossRef
  11. Jamshidzadeh A, Heidari R, Latifpour Z, Ommati MM, Abdoli N, Mousavi S, et al. Carnosine ameliorates liver fibrosis and hyperammonemia in cirrhotic rats. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 2017. 41:424-434.
    Pubmed CrossRef
  12. Kim EJ, Choi JY, Yu M, Kim MY, Lee S, Lee BH. Total polyphenols, total flavonoid contents, and antioxidant activity of Korean natural and medicinal plants. Korean J Food Sci Technol. 2012. 44:337-342.
    CrossRef
  13. Kim JM, Shin YK, Kim BO, Kim JK, Lee SH, Kim YS. Effect of Artemisia capillaris extracts on antioxidant activity and allergic dermatitis. J Life Sci. 2021a. 22:958-963.
    CrossRef
  14. Kim JS, Kim KL. Anti-oxidative and anti-inflammatory effects of Artemisiae Capillaris extract. Kor J Aesthet Cosmetol. 2015. 13:805-812.
  15. Kim KS, Park JH. Effect of Artemisia Iwayomogi water extract on hepatic injury by carbon tetrachloride in rats: Ⅰ. Effect on serum AST, ALT, LDH activities, lipid content and liver peroxide content. Korean J Vet Res. 1992. 32:347-356.
  16. Kim MJ, Lee JA, Shin MR, Park HJ, Roh SS. Protective effect of Artemisiae Capillaris Herba water extract on liver injury induced by thioacetamide. J Nutr Health. 2021b. 54:412-421.
    CrossRef
  17. Kong IP, Lee E, Cha YY. Effect of Artemisia Capillaris Thunberg EtOH ext. on lowering lipid, anti-oxidation and concentration of plasma inflammatory mediators using rats fed on high-oxidized fat. J Oriental Rehab Med. 2011. 21:23-33.
  18. Latief U, Ahmad R. Herbal remedies for liver fibrosis: A review on the mode of action of fifty herbs. J Tradit Complement Med. 2018. 8:352-360.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  19. Lee CK, Seo JJ. Antimicrobial activity of the aerial part of Artemisia capillaris extracts on the food-borne pathogens. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2003a. 32:1227-1232.
    CrossRef
  20. Lee HS, Shin HS, Choi J, Bae SJ, Wee HJ, Son T, et al. AMP-activated protein kinase activator, HL156A reduces thioacetamide-induced liver fibrosis in mice and inhibits the activation of cultured hepatic stellate cells and macrophages. Int J Oncol. 2016a. 49:1407-1414.
    Pubmed CrossRef
  21. Lee JA, Kim MJ, Roh SS. Effect of Artemisia capillaris Thunberg on anti-oxidative and inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 cells. J Appl Orient Med. 2018. 18:75-83.
  22. Lee JY, Seo BI, Roh SS. Improving effect of Artemisiae Capillaris Herba extract in reflux esophagitis rats. Kor J Herbol. 2016b. 31(6):37-44.
    CrossRef
  23. Lee SH, Hong IJ, Park HG, Jew SS, Kim KT. Functional characteristics from the barley leaves and its antioxidant mixture -study on the nitrite scavenging effect-. J Korean Soc Agric Chem Biotechnol. 2003b. 46:333-337.
  24. Li J, Zhang Y, Kuruba R, Gao X, Gandhi CR, Xie W, et al. Roles of microRNA-29a in the antifibrotic effect of farnesoid X receptor in hepatic stellate cells. Mol Pharmacol. 2011. 80:191-200.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  25. Liang S, Kisseleva T, Brenner DA. The role of NADPH oxidases (NOXs) in liver fibrosis and the activation of myofibroblasts. Front Physiol. 2016. 7:17. https://doi.org/10.3389/fphys.2016.00017
    CrossRef
  26. Ma JQ, Ding J, Zhang L, Liu CM. Protective effects of ursolic acid in an experimental model of liver fibrosis through Nrf2/ARE pathway. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 2015. 39:188-197.
    Pubmed CrossRef
  27. Moran-Salvador E, Mann J. Epigenetics and liver fibrosis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2017. 4:125-134.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  28. Paik YH, Kim J, Aoyama T, De Minicis S, Bataller R, Brenner DA. Role of NADPH oxidases in liver fibrosis. Antioxid Redox Signal. 2014. 20:2854-2872.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  29. Petta S, Adinolfi LE, Fracanzani AL, Rini F, Caldarella R, Calvaruso V, et al. Hepatitis C virus eradication by direct-acting antiviral agents improves carotid atherosclerosis in patients with severe liver fibrosis. J Hepatol. 2018. 69:18-24.
    Pubmed CrossRef
  30. Rama P, Vignesh A, Lakshmanan G, Murugesan K. In vitro antioxidant activity of Achyranthes aspera Linn. Int J Med Pharmceut Sci. 2013. 3(2):67-78.
  31. S?nchez-Valle V, Ch?vez-Tapia NC, Uribe M, M?ndez-S?nchez N. Role of oxidative stress and molecular changes in liver fibrosis: a review. Curr Med Chem. 2012. 19:4850-4860.
    Pubmed CrossRef
  32. Thi Thanh Hai N, Thuy LTT, Shiota A, Kadono C, Daikoku A, Hoang DV, et al. Selective overexpression of cytoglobin in stellate cells attenuates thioacetamide-induced liver fibrosis in mice. Sci Rep. 2018. 8:17860. https://doi.org/10.1038/s41598-018-36215-4
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  33. Wu KC, Liu JJ, Klaassen CD. Nrf2 activation prevents cadmium-induced acute liver injury. Toxicol Appl Pharmacol. 2012. 263:14-20.
    Pubmed CrossRef
  34. Yan H, Huang Z, Bai Q, Sheng Y, Hao Z, Wang Z, et al. Natural product andrographolide alleviated APAP-induced liver fibrosis by activating Nrf2 antioxidant pathway. Toxicology. 2018. 396-397:1-12.
    Pubmed CrossRef
  35. Zhou Y, Wu R, Cai FF, Zhou WJ, Lu YY, Zhang H, et al. Xiaoyaosan decoction alleviated rat liver fibrosis via the TGFβ/Smad and Akt/FoxO3 signaling pathways based on network pharmacology analysis. J Ethnopharmacol. 2021. 264:113021. https://doi.org/10.1016/j.jep.2020.113021
    Pubmed CrossRef

Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(4): 302-310

Published online April 30, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.4.302

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

간섬유증 동물모델에서 인진호 열수 추출물의 간 보호 효과

김민주?최정원?이세희?신미래?노성수

대구한의대학교 한의학과 본초학교실

Received: December 30, 2021; Revised: March 11, 2022; Accepted: March 18, 2022

Hepatoprotective Effect of Artemisia capillaris Thunb Water Extract in an Animal Model of Liver Fibrosis

Min Ju Kim , Jeong Won Choi, Se Hui Lee , Mi-Rae Shin , and Seong-Soo Roh

Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University

Correspondence to:Seong-Soo Roh, Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, 136, Sincheondong-ro, Suseong-gu, Daegu 42158, Korea, E-mail: ddede@dhu.ac.kr
Author information: Min Ju Kim (Graduate student), Jeong Won Choi (Graduate student), Se Hui Lee (Graduate student), Mi-Rae Shin (Professor), Seong-Soo Roh (Professor)

Received: December 30, 2021; Revised: March 11, 2022; Accepted: March 18, 2022

This is Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

This study investigated the hepatoprotective effect of Artemisia capillaris Thunb water extract (AE) in a thioacetamide (TAA)-induced liver fibrosis model using mice. The animal experiment was conducted with a normal group, a control group, a positive control group (silymarin 50 mg/kg), and an AE group (AE 200 mg/kg). Except for the normal group, hepatic fibrosis was induced by intraperitoneal administration of TAA 3 times a week for 8 weeks in the remaining groups (100 mg/kg for 1 week, 200 mg/kg for 2∼3 weeks, and 400 mg/kg for 4∼8 weeks). Moreover, the AE or silymarin was administered orally daily for 8 weeks. At the end of 8 weeks, ammonia levels and the myeloperoxidase (MPO) activity in the serum were measured. The expression of antioxidant, oxidative stress, inflammation, and fibrosis-related proteins in the liver tissue was measured by western blot test. Serum analysis revealed that the ammonia levels and MPO activity that were increased by the TAA were significantly decreased by the AE treatment. Also, treatment with AE significantly reduced the oxidative stress, increased by TAA by increasing the expression of antioxidant-related proteins in the liver tissue. Our study confirmed that the expression of inflammation and fibrosis-related proteins was significantly reduced due to the reduction of oxidative stress. In conclusion, these results suggest that AE treatment alleviates hepatic fibrosis by reducing oxidative stress through the activation of the NF-E2-related factor 2 (Nrf2) pathway.

Keywords: Artemisia capillaris, liver fibrosis, thioacetamide, antioxidant, oxidative stress

서 론

간섬유증은 비알코올성 간질환, 알코올성 간질환, 담즙 정체성 간질환 등과 같은 만성 간질환에서 흔하게 나타나는 증상 중에 하나이며(Lee 등, 2016a; Petta 등, 2019; Moran-Salvador와 Mann, 2017), 간에 일어난 손상에 대한 반응으로 간성상세포(HSCs, hepatic stellate cells)에 의해 세포외기질(extracellular matrix)이 과도하게 생성되는 것을 특징으로 한다(Li 등, 2011). 간이 손상되어 만성적으로 지속되면 산화적 스트레스가 간성상세포의 활성화를 촉진시키며 콜라겐 생성을 증가시키게 된다(Ghatak 등, 2011). 이에 본 실험에서는 간섬유증을 유발하기 위해 thioacetamide(TAA)를 사용하였는데, TAA는 혈중 간세포 효소 수치를 적당량 증가시키면서 만성 독성이 느리게 진행되는 섬유증을 일으켜 인간에게서 나타나는 알코올성 간섬유증과 유사한 병변이 나타나게 한다(Hempel 등, 2019). 많은 연구에서 항산화 관련 전사인자인 nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)가 산화적 스트레스로 인해 간이 손상될 때 세포질에서 핵으로 이동하여 전사 조절을 수행하여 간섬유증을 완화한다고 알려져 있다(Ma 등, 2015).

Silybum marianum의 씨앗에서 추출된 silymarin은 silybin, silydianin 및 silychrisin으로 구성된 플라보노이드 복합체로 손상된 간세포 재생을 촉진하는 강력한 항산화제로 알려져 있다(Latief와 Ahmad, 2018). 이에 본 연구에서는 silymarin을 양성 약물로 사용하여 실험을 진행하였다.

국화과(Compositae)에 속한 인진호(Artemisia capillaris Thunb)는 한의학에서 사철쑥의 전초를 건조하여 사용하며, 생약명으로 인진 또는 인진호라고 불린다(Lee 등, 2018; Kim과 Kim, 2015). 이러한 인진호는 조금 찬 기운이 있으며 독이 없고 맛은 쓰다(Kong 등, 2011). 현재 인진호에 대해 알려진 효능으로는 급성 역류성 식도염 개선 효과(Lee 등, 2016b), 식중독 세균 생육억제 효과(Lee와 Seo, 2003a), 알레르기성 피부염 개선 효과(Kim 등, 2021a), 사염화탄소에 의한 간 손상 개선 효과(Kim과 Park, 1992) 등이 있다. TAA로 유발된 간 손상 및 간섬유증에 미치는 효과에 대해서는 알려진 바가 없다. 이에 앞서 TAA로 유발된 간 손상에 인진호의 간 보호 효능을 연구하였으며, 인진호의 항산화능으로 TAA에 의한 산화적 스트레스를 억제함으로써 간 손상을 유의적으로 억제하는 걸 확인할 수 있었다(Kim 등, 2021b). 이에 본 연구에서는 인진호 열수 추출물의 항산화 효능을 통해 TAA로 유발된 간섬유증 개선 효과를 확인하였으며, 그 기전에 대하여 보고하는 바이다.

재료 및 방법

시료 추출

본 실험에서 사용한 인진호는 옹기한약국(Daegu, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용하기 위해 인진호 100 g에 증류수 1 L를 가하여 100°C에서 2시간 동안 가열하여 추출하였다. 추출물을 여과한 후 농축하여 파우더 형태(수율 10%)로 만들었으며 실험에 사용하기 직전까지 -80°C에서 보관되었다.

시약

Alfa Aesar(Ward Hill, MA, USA)에서 aluminium chloride를 구입하여 사용하였다. Gallic acid, thioacetamide, quercetin, sodium carbonate, diethylene glycol 및 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 1차 항체인 histone, β-actin, gp91-phox(NOX2), p22phox, Nrf2, heme oxygenase-1(HO-1), catalase, glutathione peroxidase-1/2(GPx-1/2)은 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA), α-SMA와 collagen Ⅰ은 Abcam(Cambridge, UK)으로부터 구입하여 사용하였다. 2차 항체는 GeneTex, Inc.(Irvine, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Protease inhibitor mixture, ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)에서 구입하였으며, nitrocellulose membranes와 ECL Western Blotting Detection Reagents는 Amersham GE Healthcare(Little Chalfont, UK)에서 구입하였다. 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit은 Thermo Scientific(Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

Folin Ciocalteu’s의 방법을 사용하여 인진호 열수 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정하였다(Rama 등, 2013). E-tube에 시료 100 µL와 10% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 500 µL, 7.5% sodium carbonate 400 µL를 넣고 잘 혼합하여 30분간 암소에서 반응 후, UV 분광광도계(Infinite M200, Tecan, Männedorf, Switzerland)를 사용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 gallic acid를 사용하였다(gallic acid equivalents, GAE).

총 플라보노이드 함량 측정

Aluminum chloride 비색법을 사용하여 인진호 열수 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정하였다(Rama 등, 2013). E-tube에 시료 100 µL와 10% aluminium chloride solution 20 µL, 1 M potassium acetate solution 20 µL 및 증류수 560 µL를 넣고 잘 혼합하여 30분간 암소에서 반응 후, UV 분광광도계를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 quercetin을 사용하였다(quercetin equivalents, QE).

간섬유증 실험동물

7주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 대한바이오링크(Eumseong, Korea)에서 구입하여 물과 고형사료(조단백질 18% 이상, 조회분 8.0% 이하, 조지방 5.0% 이상, 조섬유 5.0% 이하, 칼슘 1.0% 이상, 나트륨 0.25% 이상, 인 0.85% 이상, 칼륨 0.55% 이상, 마그네슘 0.15% 이상, NIH-41, Zeigler Bros, Inc., Gardners, PA, USA)를 충분히 공급하며, 일주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실 환경조건은 다음과 같이 conventional system으로 습도는 50±5%, 온도는 22±2°C, 명암주기는 12시간 주기로 조절하였다. 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 대구한의대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인(승인번호: DHU2021-039)을 얻어 실험을 시행하였으며 동물관리 규정을 준수하였다.

실험군은 정상군(Normal), 대조군(Control), silymarin 50 mg/kg으로 경구 투여한 양성대조군(Silymarin), 인진호 열수 추출물 200 mg/kg으로 경구 투여한 인진호 투여군(AE)으로 각 군당 6마리씩 4개의 그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 정상군을 제외한 나머지 군은 8주간 주 3회 TAA(1주 100 mg/kg, 2~3주 200 mg/kg, 4~8주 400 mg/kg)를 복강 투여하여 간섬유증을 유발하였으며 동시에 해당 약물을 8주간 매일 경구 투여하였다(Thi Thanh Hai 등, 2018). 8주간의 투여 후 isoflurane을 사용해 흡입 마취하여 혈액을 심장에서 채취하였으며 간 조직을 적출하였다. 그 후 채취한 혈액은 10분간 4,000 rpm으로 원심분리기를 사용하여 혈청을 분리하였으며, 혈청과 간 조직은 실험에 사용하기 직전까지 -80°C에 보관하였다.

혈청 내 암모니아 수치 및 myeloperoxidase 활성 측정

혈청 내의 암모니아 수치와 myeloperoxidase(MPO) 활성은 ammonia assay kit(Abcam)과 MPO colorimetric activity assay kit(BioVision, Milpitas, CA, USA)의 프로토콜에 따라 측정되었다.

혈청 내 reactive oxygen species 측정

혈청 내의 reactive oxygen species(ROS)를 측정하기 위하여 25 mM DCFH-DA를 혼합한 후, 형광광도계를 이용하여 emission wavelength 530 nm와 excitation wavelength 485 nm에서 측정하였으며, 그 수치는 정상군 대비로 나타내었다(Ali 등, 1992).

간 조직 western blotting

Western blotting 분석을 위하여 간 조직에 buffer A(100 mM Tris-HCl(pH 7.4), 5 mM Tris–HCl(pH 7.5), 1.5 M sucrose, protease inhibitor cocktail, 0.1 M DTT, 2 mM MgCl2, 15 mM CaCl2)를 넣은 후, tissue grinder(BioSpec Products, Bartlesville, OK, USA)를 사용하여 분쇄하고 30분간 ice 위에서 정치시킨 다음, 10% NP-40 용액을 넣고 12,000 rpm으로 2분간 원심분리하여 세포질을 포함한 상층액을 분리했다. 세포질이 함유된 상층액을 채취하고 남은 조직에 10% NP-40가 포함된 buffer A에 두 번 헹구고 buffer C(0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol, 50 mM KCl, 50 mM HEPES, 0.3 mM NaCl, 0.1 mM PMSF)를 첨가해 재부유시킨 다음에 10분 간격으로 vortex를 3번 시행하였다. 마지막 vortex 후 4°C에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 핵을 분리하였다. 분리된 세포질과 핵은 -80°C에서 냉동 보관하였다. 세포질과 핵 내의 단백질 발현을 측정하기 위해 8~12% SDS-polyacrylamide gel에 8~10 μg의 단백질을 전기영동 시킨 후 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 그다음 membrane에 각각의 1차 antibody(PBS-T를 사용하여 1:1,000으로 희석)를 처리하여 4°C에서 overnight 시킨 다음 PBS-T를 사용하여 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 antibody(PBS-T를 사용하여 1:3,000으로 희석)를 상온에서 2시간 반응시키고 PBS-T로 세척하였다. 그 후 enhanced chemiluminescence(ECL) 용액과 Sensi-Q2000 Chemidoc으로 단백질 발현을 확인한 후, ATTO Densitograph Software(ATTO Corp., Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 해당 단백질의 band를 정량하여 실험군 간에 단백질 발현량을 비교하였다.

조직학적 관찰

간 조직을 10% neutral buffered formalin에 1일간 고정한 다음 graded alcohol을 이용해 탈수시키고 paraffin으로 포매하여 block을 제작하였다. 그다음 microtome으로 조직을 5 µm의 두께로 절편하여 Masson’s trichrome 염색을 하였으며 광학현미경으로 병변의 유무를 관찰하였다.

통계분석

In vitro 수치는 평균과 표준오차로 표시하였으며, in vivo 수치는 평균과 표준편차로 표시하였다. SPSS(Version 26.0, IBM, Armonk, NY, USA)를 사용하여 one-way analysis of variance(ANOVA) test를 사용한 후, least-significant differences(LSD) test로 사후검정을 실시하여 유의수준을 P<0.05, P<0.01, P<0.001에서 검증하였다.

결과 및 고찰

총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

각종 질병의 원인은 다양하지만 가장 주요인으로는 몸속에서 ROS의 생성과 축적으로 인하여 생기는 세포손상이 있다(Chung 등, 2006; Lee 등, 2003b). 이를 예방하기 위해 평소 항산화 물질들을 충분하게 복용하는 것이 좋다고 알려져 있다. 식물계 항산화 물질에는 페놀성 화합물, 플라보노이드, 토코페롤 등이 있는데 이와 같은 물질들은 ROS를 억제하여 노화 및 각종 질병의 예방에 관여한다(Kim 등, 2012). 이에 인진호 열수 추출물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 총 폴리페놀 함량은 240.43±0.85 mg GAE/g으로 측정되었고 총 플라보노이드 함량은 35.24±0.08 mg QE/g으로 측정되었다(Table 1).

Table 1 . Total polyphenol and total flavonoid contents of Artemisia capillaris Thunb water extract.

SampleTotal polyphenol (mg GAE1)/g)Total flavonoid (mg QE2)/g)
AE3)240.43±0.8535.24±0.08

1)GAE: gallic acid equivalents..

2)QE: quercetin equivalents..

3)AE: Artemisia capillaris Thunb water extract..

All values are mean±SEM of three replications..



체중 변화 및 식이 섭취량 측정 결과

실험동물들의 실험 기간 중 체중 변화량(g)과 식이 섭취량(g)은 Table 2와 같다. 정상군은 실험 시작 날보다 7.61 ±0.49 증가하였으며, 대조군은 0.44±0.18, 양성대조군은 0.80±0.21, 인진호 투여군은 0.95±0.10 증가하였다. 이 결과, TAA 간섬유증 유발 동물모델들에서 체중 변화량이 정상군에 비해 유의하게 감소하였으며, 대조군보다 양성대조군과 인진호 투여군에서 체중 변화량이 증가하였으나 유의적인 차는 없었다. 식이 섭취량의 결과, 정상군은 매일 3.87±0.14를 섭취하는 것으로 나타났으며, 대조군은 3.21±0.20으로 정상군에 비해 유의적으로 적게 섭취하는 것으로 나타났다(P<0.05). 반면 약물투여군들은 각각 양성대조군 3.23±0.14, 인진호 투여군 3.20±0.18로 대조군과 유의적인 차가 없었다.

Table 2 . Body weight and food intake in liver fibrosis-induced mice.

GroupBody weight (g)Food intake (g)
InitialFinalChange
Normal23.46±0.3731.02±0.457.61±0.493.87±0.14
Control23.32±0.3823.88±0.16###0.44±0.18###3.21±0.20#
Silymarin23.41±0.3723.91±0.190.80±0.213.23±0.14
AE23.25±0.1723.97±0.110.95±0.103.20±0.18

Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group..

All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: #P<0.05, ###P<0.001 vs. Normal group..



혈청 내 GOT 및 GPT 수치 측정

혈청 내 간 손상 지표인 GOT와 GPT 수치를 측정하였다. GOT와 GPT는 간세포가 손상된 후 혈액으로 방출되는데 그중 GPT는 간 손상에 더욱 특이적이다(El-Baz 등, 2020). GOT 측정 결과, TAA로 간섬유증이 유발된 대조군의 수치가 정상군 수치의 약 6.9배 유의하게 증가했으며(P<0.001), 양성대조군과 인진호 투여군은 대조군 수치보다 약 0.4배 유의하게 감소하였다(silymarin P<0.001, AE P<0.001). GPT 수치 또한 대조군의 경우 정상군 수치보다 약 3.5배 유의하게 증가했으며(P<0.001),

양성대조군과 인진호 투여군에서 대조군보다 유의하게 감소하는 것(silymarin P<0.001, AE P<0.001)을 확인할 수 있었다(Fig. 1).

Fig 1. The GOT and GPT levels in serum. (A) GOT, (B) GPT. Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: ###P<0.001 vs. Normal group, ***P<0.001 vs. Control group.

혈청 내 암모니아 수치 측정

여러 간 기능성 장애들은 암모니아와 같은 몸속 유해 물질들을 해독하지 못하게 한다(Jamshidzadeh 등, 2017; Sánchez-Valle 등, 2012). 이에 TAA 간섬유증 유발 동물모델의 혈청 내 암모니아 수치 측정 결과, 간섬유증이 유발된 대조군의 수치는 정상군의 수치에 약 2.7배로 유의하게 증가했으며(P<0.001), 양성대조군과 인진호 투여군은 대조군의 수치에 각각 약 0.7배(P<0.001), 0.8배(P<0.001)로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2A).

Fig 2. The ammonia, MDA, and ROS levels in serum. (A) Ammonia, (B) MPO activity, and (C) ROS. Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: ###P<0.001 vs. Normal group, *P<0.05, ***P<0.001 vs. Control group.


혈청 내 myeloperoxidase 활성 측정

대부분의 만성 간질환은 산화적 스트레스를 동반하며 이는 간섬유증 발병에 핵심적인 역할을 한다고 알려져 있다(Friedman, 2008; Sánchez-Valle 등, 2012). 이에 혈청 내 산화적 스트레스 바이오마커인 MPO의 활성을 측정한 결과, 간섬유증이 유발된 대조군은 정상군보다 약 3.9배로 유의하게 증가했으며(P<0.001), 양성대조군과 인진호 투여군은 대조군보다 약 0.5배(P<0.001), 0.7배(P<0.05)로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2B).

혈청 내 ROS 측정

산화적 스트레스는 간 손상을 진행하는 주요 요소로 ROS는 간염증, 괴사, 담즙 정체 및 간섬유증을 유발한다(Chang 등, 2021). 혈청 내 ROS 측정 결과, 정상군보다 대조군에서 약 1.82배 유의하게 증가했으며, 이렇게 올라간 ROS가 양성대조약물인 silymarin과 인진호 투여로 인하여 유의하게 감소하는 것(silymarin P<0.001, AE P<0.001)을 확인할 수 있었다(Fig. 2C).

Western blotting

간 조직 내 산화적 스트레스 관련 인자 발현량: ROS는 superoxide, hydroxide, singlet oxygen 등과 같은 활성산소 라디칼을 의미하는데, 이러한 ROS는 NADPH oxidase가 주는 다양한 자극들에 의해 반응하여 만들어진다(Liang 등, 2016; De Minicis와 Brenner, 2007). NADPH oxidase는 간섬유증이 진행되는 과정에서 ROS를 생산하여 간섬유증의 진행을 돕는 효소 복합체로도 알려져 있다(Aoyama 등, 2012; Paik 등, 2014). 이에 간 조직 내에서 NADPH oxidase family로 알려진 NOX2와 p22phox의 발현량을 측정하였다. NOX2의 발현량을 측정한 결과, 정상군에 비해 간 섬유화가 유발된 대조군에서 약 42% 유의하게 증가하였다(P<0.001). 대조군과 비교해 양성대조군에서 약 12% 감소하는 경향이 나타났으며, 인진호 투여군은 약 23% 유의하게 감소하였다(P<0.01). p22phox의 발현량을 측정한 결과, 정상군보다 대조군에서 약 39% 유의하게 증가하였다(P<0.01). 반면, 대조군에 비해 양성대조군은 약 21%, 인진호 투여군은 약 30% 유의하게 감소했으며(P<0.05, P<0.01), 특히 인진호 투여군은 정상군 수준까지 감소한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).

Fig 3. Expressions of NOX2 and p22phox protein in liver tissue. (A) NOX2, (B) p22phox. Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: ##P<0.01, ###P<0.001 vs. Normal group, *P<0.05, **P<0.01 vs. Control group.


간 조직 내 항산화 관련 인자 발현량: Nrf2는 HO-1, catalase, GPx-1/2과 같은 항산화 관련 인자들의 발현을 이끄는 전사인자이다(Yan 등, 2018). 많은 연구에서 Nrf2의 활성화가 산화적 스트레스로 인한 간 손상으로부터 간을 보호할 수 있음을 보여주었다(Wu 등, 2012; Hybertson 등, 2011). 이에 간 조직 내에서 항산화 관련 인자인 Nrf2, HO-1, catalase, GPx-1/2의 발현량 측정 결과, 정상군보다 대조군에서 유의하게 감소하였으며, 대조군보다 양성대조군과 인진호 투여군에서 발현량이 유의하게 증가하였다. 특히, Nrf2와 catalase는 대조군보다 인진호 투여군에서 발현 증가량이 각각 80%(P<0.001), 30%(P<0.001)로 정상군 수준까지 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).

Fig 4. Expressions of anti-oxidant protein in liver tissue. (A) Nrf2, (B) HO-1, (C) catalase, and (D) GPx-1/2. Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs. Normal group, *P<0.05, ***P<0.001 vs. Control group.


간 조직 내 섬유화 관련 인자 발현량: HSCs는 간섬유증을 일으키는 주요한 영향을 주는 세포이다. TAA의 주입으로 간에 있는 HSCs가 자극을 받아 섬유성 근섬유 아세포를 분화하여 α-SMA와 collagen Ⅰ을 분비해 간섬유증을 유도한다(Zhou 등, 2021). 이에 간 조직 내에서 α-SMA와 collagen Ⅰ의 발현량 측정 결과, 정상군보다 대조군에서 유의하게 증가하였으며, 대조군보다 인진호 투여군에서 각각 24%(P<0.05), 25%(P<0.01)로 유의하게 감소하였다(Fig. 5).

Fig 5. Expressions of α-SMA and collagen Ⅰ protein in liver tissue. (A) α-SMA, (B) Collagen Ⅰ. Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: ###P<0.001 vs. Normal group, *P<0.05, **P<0.01 vs. Control group.


조직학적 관찰

간 조직에 Masson’s trichrome 염색을 하여 간섬유증의 병변을 관찰하였다. 그 결과 정상군보다 대조군에서 교원질 섬유(collagenous fiber)가 넓은 범위로 침착하였으며, 양성대조군과 인진호 투여군에서 교원질 섬유의 침착이 완화된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6).

Fig 6. Pathological observation in liver tissue. Masson’s trichrome (MT) staining (A), MT area (blue-stained areas expressed as percentage of total surface area) (B). Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: ###P<0.001 vs. Normal group, ***P<0.001 vs. Control group. (×200, scale bar 100 μm)

요 약

본 실험에서는 8주간 thioacetamide(TAA)로 간섬유증 유발과 동시에 인진호 열수 추출물을 경구 투여하여 간섬유증에 미치는 영향에 대하여 실험을 진행하였으며 다음과 같은 결과를 얻었다. 인진호 열수 추출물은 TAA 주입으로 인해 증가한 혈청 내 암모니아 수치와 myeloperoxidase 활성을 유의하게 감소시켰다. 그리고 간 조직 내 항산화 관련 인자인 Nrf2, HO-1, catalase, GPx-1/2의 발현을 증가시켜 산화적 스트레스 관련 인자인 NOX2와 p22phox의 발현을 유의하게 감소시켰으며, 이로 인해 섬유화와 관련된 인자인 α-SMA와 collagen Ⅰ의 발현을 유의하게 감소시켜 간섬유증을 약화했다.

감사의 글

이 논문은 2022년도 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원(No. 2018R1A5A2025272)을 받아 수행된 연구입니다.

Fig 1.

Fig 1.The GOT and GPT levels in serum. (A) GOT, (B) GPT. Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: ###P<0.001 vs. Normal group, ***P<0.001 vs. Control group.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 302-310https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.4.302

Fig 2.

Fig 2.The ammonia, MDA, and ROS levels in serum. (A) Ammonia, (B) MPO activity, and (C) ROS. Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: ###P<0.001 vs. Normal group, *P<0.05, ***P<0.001 vs. Control group.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 302-310https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.4.302

Fig 3.

Fig 3.Expressions of NOX2 and p22phox protein in liver tissue. (A) NOX2, (B) p22phox. Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: ##P<0.01, ###P<0.001 vs. Normal group, *P<0.05, **P<0.01 vs. Control group.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 302-310https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.4.302

Fig 4.

Fig 4.Expressions of anti-oxidant protein in liver tissue. (A) Nrf2, (B) HO-1, (C) catalase, and (D) GPx-1/2. Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs. Normal group, *P<0.05, ***P<0.001 vs. Control group.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 302-310https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.4.302

Fig 5.

Fig 5.Expressions of α-SMA and collagen Ⅰ protein in liver tissue. (A) α-SMA, (B) Collagen Ⅰ. Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: ###P<0.001 vs. Normal group, *P<0.05, **P<0.01 vs. Control group.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 302-310https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.4.302

Fig 6.

Fig 6.Pathological observation in liver tissue. Masson’s trichrome (MT) staining (A), MT area (blue-stained areas expressed as percentage of total surface area) (B). Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group. All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: ###P<0.001 vs. Normal group, ***P<0.001 vs. Control group. (×200, scale bar 100 μm)
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 302-310https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.4.302

Table 1 . Total polyphenol and total flavonoid contents of Artemisia capillaris Thunb water extract.

SampleTotal polyphenol (mg GAE1)/g)Total flavonoid (mg QE2)/g)
AE3)240.43±0.8535.24±0.08

1)GAE: gallic acid equivalents..

2)QE: quercetin equivalents..

3)AE: Artemisia capillaris Thunb water extract..

All values are mean±SEM of three replications..


Table 2 . Body weight and food intake in liver fibrosis-induced mice.

GroupBody weight (g)Food intake (g)
InitialFinalChange
Normal23.46±0.3731.02±0.457.61±0.493.87±0.14
Control23.32±0.3823.88±0.16###0.44±0.18###3.21±0.20#
Silymarin23.41±0.3723.91±0.190.80±0.213.23±0.14
AE23.25±0.1723.97±0.110.95±0.103.20±0.18

Normal, normal group; Control, liver fibrosis-induced with distilled water group; Silymarin, liver fibrosis-induced with silymarin 50 mg/kg group; AE, liver fibrosis-induced with Artemisia capillaris Thunb water extract 200 mg/kg group..

All date are expressed mean±SD (n=6 mice per group). Significance: #P<0.05, ###P<0.001 vs. Normal group..


References

  1. Ali SF, LeBel CP, Bondy SC. Reactive oxygen species formation as a biomarker of methylmercury and trimethyltin neurotoxicity. Neurotoxicology. 1992. 13:637-648.
  2. Aoyama T, Paik YH, Watanabe S, Laleu B, Gaggini F, Fioraso- Cartier L, et al. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NOX) in experimental liver fibrosis: GKT137831 as a novel potential therapeutic agent. Hepatology. 2012. 56: 2316-2327.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  3. Chang GR, Lin WL, Lin TC, Liao HJ, Lu YW. The ameliorative effects of saikosaponin in thioacetamide-induced liver injury and non-alcoholic fatty liver disease in mice. Int J Mol Sci. 2021. 22:11383. https://doi.org/10.3390/ijms222111383
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  4. Chung HY, Sung B, Jung KJ, Zou Y, Yu BP. The molecular inflammatory process in aging. Antioxid Redox Signal. 2006. 8:572-581.
    Pubmed CrossRef
  5. De Minicis S, Brenner DA. NOX in liver fibrosis. Arch Biochem Biophys. 2007. 462:266-272.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  6. El-Baz FK, Salama AAA, Hussein RA. Dunaliella salina microalgae oppose thioacetamide-induced hepatic fibrosis in rats. Toxicol Rep. 2020. 7:36-45.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  7. Friedman SL. Mechanisms of hepatic fibrogenesis. Gastroenterology. 2008. 134:1655-1669.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  8. Ghatak S, Biswas A, Dhali GK, Chowdhury A, Boyer JL, Santra A. Oxidative stress and hepatic stellate cell activation are key events in arsenic induced liver fibrosis in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 2011. 251:59-69.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  9. Hempel F, Roderfeld M, Savai R, Sydykov A, Irungbam K, Schermuly R, et al. Depletion of bone marrow-derived fibrocytes attenuates TAA-induced liver fibrosis in mice. Cells. 2019. 8:1210. https://doi.org/10.3390/cells8101210
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  10. Hybertson BM, Gao B, Bose SK, McCord JM. Oxidative stress in health and disease: The therapeutic potential of Nrf2 activation. Mol Aspects Med. 2011. 32:234-246.
    Pubmed CrossRef
  11. Jamshidzadeh A, Heidari R, Latifpour Z, Ommati MM, Abdoli N, Mousavi S, et al. Carnosine ameliorates liver fibrosis and hyperammonemia in cirrhotic rats. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 2017. 41:424-434.
    Pubmed CrossRef
  12. Kim EJ, Choi JY, Yu M, Kim MY, Lee S, Lee BH. Total polyphenols, total flavonoid contents, and antioxidant activity of Korean natural and medicinal plants. Korean J Food Sci Technol. 2012. 44:337-342.
    CrossRef
  13. Kim JM, Shin YK, Kim BO, Kim JK, Lee SH, Kim YS. Effect of Artemisia capillaris extracts on antioxidant activity and allergic dermatitis. J Life Sci. 2021a. 22:958-963.
    CrossRef
  14. Kim JS, Kim KL. Anti-oxidative and anti-inflammatory effects of Artemisiae Capillaris extract. Kor J Aesthet Cosmetol. 2015. 13:805-812.
  15. Kim KS, Park JH. Effect of Artemisia Iwayomogi water extract on hepatic injury by carbon tetrachloride in rats: Ⅰ. Effect on serum AST, ALT, LDH activities, lipid content and liver peroxide content. Korean J Vet Res. 1992. 32:347-356.
  16. Kim MJ, Lee JA, Shin MR, Park HJ, Roh SS. Protective effect of Artemisiae Capillaris Herba water extract on liver injury induced by thioacetamide. J Nutr Health. 2021b. 54:412-421.
    CrossRef
  17. Kong IP, Lee E, Cha YY. Effect of Artemisia Capillaris Thunberg EtOH ext. on lowering lipid, anti-oxidation and concentration of plasma inflammatory mediators using rats fed on high-oxidized fat. J Oriental Rehab Med. 2011. 21:23-33.
  18. Latief U, Ahmad R. Herbal remedies for liver fibrosis: A review on the mode of action of fifty herbs. J Tradit Complement Med. 2018. 8:352-360.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  19. Lee CK, Seo JJ. Antimicrobial activity of the aerial part of Artemisia capillaris extracts on the food-borne pathogens. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2003a. 32:1227-1232.
    CrossRef
  20. Lee HS, Shin HS, Choi J, Bae SJ, Wee HJ, Son T, et al. AMP-activated protein kinase activator, HL156A reduces thioacetamide-induced liver fibrosis in mice and inhibits the activation of cultured hepatic stellate cells and macrophages. Int J Oncol. 2016a. 49:1407-1414.
    Pubmed CrossRef
  21. Lee JA, Kim MJ, Roh SS. Effect of Artemisia capillaris Thunberg on anti-oxidative and inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 cells. J Appl Orient Med. 2018. 18:75-83.
  22. Lee JY, Seo BI, Roh SS. Improving effect of Artemisiae Capillaris Herba extract in reflux esophagitis rats. Kor J Herbol. 2016b. 31(6):37-44.
    CrossRef
  23. Lee SH, Hong IJ, Park HG, Jew SS, Kim KT. Functional characteristics from the barley leaves and its antioxidant mixture -study on the nitrite scavenging effect-. J Korean Soc Agric Chem Biotechnol. 2003b. 46:333-337.
  24. Li J, Zhang Y, Kuruba R, Gao X, Gandhi CR, Xie W, et al. Roles of microRNA-29a in the antifibrotic effect of farnesoid X receptor in hepatic stellate cells. Mol Pharmacol. 2011. 80:191-200.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  25. Liang S, Kisseleva T, Brenner DA. The role of NADPH oxidases (NOXs) in liver fibrosis and the activation of myofibroblasts. Front Physiol. 2016. 7:17. https://doi.org/10.3389/fphys.2016.00017
    CrossRef
  26. Ma JQ, Ding J, Zhang L, Liu CM. Protective effects of ursolic acid in an experimental model of liver fibrosis through Nrf2/ARE pathway. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 2015. 39:188-197.
    Pubmed CrossRef
  27. Moran-Salvador E, Mann J. Epigenetics and liver fibrosis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2017. 4:125-134.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  28. Paik YH, Kim J, Aoyama T, De Minicis S, Bataller R, Brenner DA. Role of NADPH oxidases in liver fibrosis. Antioxid Redox Signal. 2014. 20:2854-2872.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  29. Petta S, Adinolfi LE, Fracanzani AL, Rini F, Caldarella R, Calvaruso V, et al. Hepatitis C virus eradication by direct-acting antiviral agents improves carotid atherosclerosis in patients with severe liver fibrosis. J Hepatol. 2018. 69:18-24.
    Pubmed CrossRef
  30. Rama P, Vignesh A, Lakshmanan G, Murugesan K. In vitro antioxidant activity of Achyranthes aspera Linn. Int J Med Pharmceut Sci. 2013. 3(2):67-78.
  31. S?nchez-Valle V, Ch?vez-Tapia NC, Uribe M, M?ndez-S?nchez N. Role of oxidative stress and molecular changes in liver fibrosis: a review. Curr Med Chem. 2012. 19:4850-4860.
    Pubmed CrossRef
  32. Thi Thanh Hai N, Thuy LTT, Shiota A, Kadono C, Daikoku A, Hoang DV, et al. Selective overexpression of cytoglobin in stellate cells attenuates thioacetamide-induced liver fibrosis in mice. Sci Rep. 2018. 8:17860. https://doi.org/10.1038/s41598-018-36215-4
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  33. Wu KC, Liu JJ, Klaassen CD. Nrf2 activation prevents cadmium-induced acute liver injury. Toxicol Appl Pharmacol. 2012. 263:14-20.
    Pubmed CrossRef
  34. Yan H, Huang Z, Bai Q, Sheng Y, Hao Z, Wang Z, et al. Natural product andrographolide alleviated APAP-induced liver fibrosis by activating Nrf2 antioxidant pathway. Toxicology. 2018. 396-397:1-12.
    Pubmed CrossRef
  35. Zhou Y, Wu R, Cai FF, Zhou WJ, Lu YY, Zhang H, et al. Xiaoyaosan decoction alleviated rat liver fibrosis via the TGFβ/Smad and Akt/FoxO3 signaling pathways based on network pharmacology analysis. J Ethnopharmacol. 2021. 264:113021. https://doi.org/10.1016/j.jep.2020.113021
    Pubmed CrossRef