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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(4): 295-301

Published online April 30, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.4.295

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Yulmu Herbal Tea Reduces Hepatic Lipid Accumulation by Upregulating p-AMPK Expression in C57BL/6 Mice

Gang Wan Yoo1 , Hae-Jin Park2 , Su-Jung Cho3 , Se Hui Lee4 , Soon-Ae Park5 , and Mi-Lim Kim5

1Department of Herbal Food and Nutrition, 2Bio Convergence Testing Center, 3HCLD,
4Department of Herbology, College of Korean Medicine, and 5Foodcare YAKSUN, Daegu Haany University

Correspondence to:Mi-Lim Kim, Foodcare YAKSUN, Daegu Haany University, 285-10, Eobongji-gil, Gyeongsan, Gyeongbuk 38578, Korea, E-mail: mlk8742@dhu.ac.kr
Author information: Gang Wan Yoo (Graduate student), Hae-Jin Park (Professor), Su-Jung Cho (Researcher), Se Hui Lee (Graduate student), Soon-Ae Park (Professor), Mi-Lim Kim (Professor)

Received: January 14, 2022; Revised: March 8, 2022; Accepted: March 15, 2022

This is Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

The present study investigated the hepatic lipid-lowering effect of Yulmu herbal tea mediated by regulating hepatic protein expressions. C57BL/6 mice were randomly divided into four groups: (1) normal (normal diet), (2) control (60% high-fat diet), (3) control+Garcinia cambogia 200 mg/kg/d (GC), (4) control+Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d (YM200). Serum triglyceride (TG), total cholesterol (TC), and low-density lipoprotein concentrations significantly decreased in the GC and YM200 groups compared to the control group. There was also a significant reduction in the serum malondialdehyde levels in the GC and YM200 groups. The YM200 treatment significantly increased the hepatic phosphorylated-AMP-activated protein kinase (p-AMPK) expression, and inhibited the hepatic sterol regulatory element-binding protein-2 and 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase protein expressions, which are the key regulators of hepatic lipid synthesis. YM200 also significantly upregulated hepatic fatty acid oxidation proteins such as carnitine palmitoyltransferase 1 and uncoupling protein 2. Therefore, hepatic TG and TC levels and lipid droplets were suppressed in the YM200 group. YM200 reduced hepatic lipid accumulation and regulated hepatic lipid-relating protein expressions mediated by upregulating the p-AMPK expression. In conclusion, YM200 may be useful for regulating hepatic lipid metabolism and hepatic steatosis.

Keywords: Yulmu herbal tea, p-AMPK, hepatic lipid metabolism, C57BL/6 mice

전 세계적으로 간질환은 증가하고 있으며 비알코올성 지방간은 간질환에서 가장 흔한 질환이다(Yang 등, 2018; Kim 등, 2019). 비알코올성 지방간에서는 간에 중성지방이 축적되며 간 지질 신생합성이 증가하고 지방산 산화가 감소하며 간으로부터 very-low-density lipoprotein 배출이 증가하게 된다(Kim 등, 2019). 비알코올성 지방간은 또한 비만, 고지혈증, 제2형 당뇨, 인슐린 저항성 등 다양한 대사성 질환을 유발할 수도 있다(Kim 등, 2019).

한편, AMP-activated protein kinase(AMPK) 활성화는 비알코올성 지방간, 간 섬유화, 간암 등에서 중요한 역할을 한다고 알려졌다(Yang 등, 2018). 인산화되어 활성화된 AMPK, 즉 phosphorylated-AMPK(p-AMPK)는 다양한 기전을 조절하는 것으로 보고되었다(Kim 등, 2019). 활성화된 AMPK는 간에서 지방간을 억제한다고 알려졌으며, 간조직에서 유전자 발현을 조절하고 간조직 지방산 합성을 감소시키며 지방산 산화를 촉진한다고 보고되었다(Kim 등, 2019).

다양한 대사성 질환을 조절하는 식이 보충제 phytochemical 등의 효능 연구에서 AMPK 활성화는 대표적 주제이다. 본 연구의 실험식이에서 주요한 소재인 율무(Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf.)는 탄수화물 중에서도 식이섬유 함량이 높고 당질은 적다고 알려졌으며, 영양적으로 우수한 영양소를 함유하고 있다고 보고되었다(Lee 등, 2019; Kim 등, 2000). 율무는 체중조절용 건강보조식품으로서 가치가 있다고도 알려졌으며, 혈액 지질 농도 개선 효과와 간조직 지질축적 억제 효과가 동물실험을 통해 보고된 바 있다(Kim 등, 2000; Chung 등, 1988; Lee 등, 2021). 한편, 율무차는 커피 또는 녹차 시장만큼 수요가 크진 않으나 남녀노소 가장 즐겨 마시는 전통차 중 하나이다(Gwak 등, 2012). 하지만 율무차는 간단히 마실 수 있는 차가 아니라 선식과 같은 건강영양식으로 인식하고 있는 경향이 있으며 연구 또한 커피나 녹차에 비하면 부족한 실정이다(Gwak 등, 2012).

이에 본 연구는 율무에 전통적 한약재들을 혼합해 간단히 마실 수 있는 감비차를 제조하여 간조직 지질 억제 작용을 구체적으로 분석해보고자 하였다. 감비는 한국에서 비만 치료에 사용되었으며 한의학의 태음조위탕을 변형한 소재라고 보고되었다(Park 등, 2021). 제조한 감비차에서 혼합률이 율무 다음으로 높은 구기자는 항산화, 항당뇨, 비알코올성 지방간 개선 등 다양한 생물학적 활성이 보고되었다(Kim 등, 2021). 복령은 항암, 항염증, 항산화, 항당뇨 등의 생리활성을 가지고 있으며 지방간 억제 효능이 알려졌다(Kim 등, 2019). 산사와 진피 등 혼합열수추출물은 이상지질혈증 개선 효과와 항비만 효능이 보고되었으며, 율무, 생강 등 혼합물은 항비만 및 p-AMPK 발현증가에 의한 지방간 개선 효능이 보고된 바 있다(Youn과 Choi, 2015; Park 등, 2021).

본 연구에서는 고지방식이 유도 비만에서 율무, 구기자, 복령, 산사, 진피 및 생강 복합열수추출물(감비차)의 p- AMPK 발현 조절에 의한 간조직 지질대사 조절 작용을 분석하고 간조직 지질축적 억제 효능을 알아보고자 하였다.

시료의 제조

율무혼합물(‘율무감비차’)의 재료인 율무, 구기자, 복령, 산사, 진피, 생강은 제성약업사(Seoul, Korea)에서 구입해 사용하였다. 혼합물의 비율은 각각 율무(Coix lacryma-jobi) 50%, 구기자(Lycium chinesis Mill) 20%, 복령(Poria cocos Wolf) 15%, 산사(Crataegi fructus) 7%, 진피(Citrus unshiu Markovich) 5% 및 생강(Zingiber officinale Roscoe) 3%를 포함하고 있다(Table 1). 제조한 율무감비차 시료 100 g을 15배의 증류수에 넣고 가열 추출(100°C, 5시간)하여 필터로 여과했으며, 농축(Buchi B-480, Flawil, Switzerland)한 후 동결 건조(FD5508, Ilshin, Seoul, Korea)하여 20.56 g의 분말을 얻었다. 율무감비차 열수추출물의 수율은 20.5%였으며 건조 분말은 실온에 보관하였다. 추출물은 Fig. 1에서 보는 바와 같이 고농도(1,000 μg/mL) 수준에서도 세포독성이 나타나지 않았으므로 동물실험에 사용하였다.

Table 1 . Compositions of Yulmugambi-tea (g)

IngredientYulmugambi tea (total 100 g)
Coix lacryma-jobi50
Lycium chinesis Mill20
Poria cocos Wolf15
Crataegi fructus7
Citrus unshiu Markovich5
Zingiber officinale Roscoe3


Fig. 1. Cytotoxic effect of Yulmugambi water extract on 3T3-L1 cell by MTT assay. Values are mean±SD from three independent experiments.

세포독성 확인

MTT assay를 수행하였으며 3T3-L1(pre-adipocyte cell line)은 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. 96-well cell culture plate에 분화되지 않은 3T3-L1 세포를 5×104/well (100 µL) 밀도로 분주한 후, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 배양 종료 후 현미경으로 지방세포가 바닥에 잘 부착되어 분포되었음을 확인한 후, 각 well의 배양액을 제거하고 율무한방차(율무감비차) 열수추출물을 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 500 μg/mL 및 1,000 μg/mL 농도로 처리하였으며, 37°C 온도와 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 배양 종료 후, 각 well의 배양액을 제거하고 MTT reagent(1 mg/mL)를 50 µL씩 well에 첨가한 후, 호일로 덮어 빛을 차단하고 37°C에서 2시간 반응시켰다. 세포에 보라색 침전물을 확인한 후, 각 well의 MTT reagent를 제거하고 isopropanol을 100 µL씩 well에 첨가하여 잘 섞어준 다음 Microplate reader(M200, TECAN, Victoria, Australia)를 이용하여 570 nm(반응 흡광도) 및 650 nm(참고 흡광도)에서 흡광도를 측정하였다.

시약

실험에 사용된 potassium persulfate, phenyl methyl sulfonyl fluoride는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, protease inhibitor mixture solution, ethylenediaminetetraacetic acid는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)에서 구입하였다. BCA protein assay kit은 Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham, MA, USA), ECL Western Blotting Detection reagents와 pure nitrocellulose membranes는 GE Healthcare(Chicago, IL, USA)로부터 구입해 사용하였다. 1차 항체 carnitine palmitoyltransferase 1(CPT-1; SC-98834), uncoupling protein 2(UCP-2; SC-6526), p-AMPK(SC-33524), AMPK(SC-25792), sterol regulatory element binding protein-2(SREBP-2; SC-5603), 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase(HMGCR; SC-33827), β-actin(SC-4778), histone(SC-8030)을 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(Dallas, TX, USA)로부터 구입하였으며, 2차 항체는 GeneTex, Inc. (Irvine, LA, USA)에서 구입해 사용하였다.

동물사육 실시

C57BL/6 마우스(4-wk-old, male; Daehan Bio Link, Eumseong, Korea)를 물과 고형사료(Samyang Corp., Seoul, Korea)를 공급하는 1주간의 적응 기간을 두고 본 실험에 사용하였다. 본 동물실험은 대구한의대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC))의 승인(승인번호: DHU2021-085)을 받아 수행하였다. 실험군은 난괴법으로 4개군으로 나누어 정상군(Normal)은 일반식이(Samyang Corp.)와 증류수를 급여, 대조군(Control)은 60% high-fat diet(HFD, Diet 12492, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA)와 증류수를 급여, garcinia cambogia(GC)군은 HFD와 가르시니아 캄보지아 추출물 200 mg/kg/d를 급여, Yulmugambi (YM)200군은 HFD에 율무감비차(율무한방차) 열수추출물 200 mg/kg/d를 급여하며 6주간 사육하였다. 약물은 매일 일정한 시각에 증류수에 녹여 존대(zonde)로 경구 투여하였다. 동물 실험실은 conventional system으로 온도는 22±2°C, 습도는 50±5%였으며, 명암주기(light:dark cycle)는 12시간 주기로 유지하였다. 마우스의 체중 및 식이섭취량을 1일 1회 측정하였으며, 부검 전에는 공복시간을 12시간 두고 혈액을 채취하고 간 및 부고환 백색지방조직을 적출하였다.

혈액 및 간조직 지질, 혈액 과산화물 분석

혈액은 마우스의 심장에서 채혈해 4,000 rpm에서 10분간 원심분리해 혈청을 얻었다. 혈청 triglyceride(TG) 및 total cholesterol(TC) 농도는 TG, TC assay kit(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)으로 분석하였다. 혈청 high-density lipoprotein-cholesterol(HDL-C)은 아산제약(Seoul, Korea)에서 구매한 assay kit의 프로토콜에 따라 농도를 측정하였으며, low-density lipoprotein-cholesterol(LDL-C)은 Friedward법으로 계산하였다.

LDL-C=TC-(high-density lipoprotein-cholesterol+TG/5)

혈액 과산화물 측정은 Tarladgis 등(1964)의 방법을 사용하였으며 malondialdehyde(MDA) 농도는 tetramethoxypropane 표준검량선을 이용하였다(Tarladgis 등, 1964).

간조직의 지질 농도는 클로로포름:메탄올(2:1, v/v) 액으로 지질을 추출하고 혈액 TG, TC 측정과 동일한 방법을 사용하였다(Folch 등, 1957).

간 및 지방조직의 형태학적 관찰

간 및 지방조직의 일부를 적출하여 10% 중성 포르말린에 고정시킨 후, 파라핀으로 포매하고 4 μm의 절편을 만들어 hematoxylin과 eosin으로 염색하여 관찰하였다. 간조직 oil red O 염색은 free floating method를 이용하였으며, 조직의 관찰은 광학현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용해 200배에서 변화를 관찰하였다.

간조직 western blot 분석

간조직 단백질은 lysis buffer(20 mM Tris, 1 mM Na3VO4, 1 mM phenymethylsufonyl fluoride, 50 mM NaF)로 추출하였으며 정량에는 BCA protein assay reagent kit을 사용하였다. 단백질 동량을 SDS PAGE gel로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 전이시켰으며 5% skim milk에 blocking을 1시간 동안 시행하였다. 1차 항체는 4°C에서 overnight 시켰으며 2차 항체는 상온에서 1시간 반응시켰다. 단백질 발현은 ECL Western blotting detection reagents, Image Quant LAS 4000 Mini Biomolecular Imager(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)로 확인하였으며 band 정량에는 ATTO Densitograph Software (ATTO Corp., Tokyo, Japan)를 사용하였다.

통계처리

실험 결과는 SPSS package(Version 25.0, IBM, Armonk, NY, USA) 프로그램을 사용하여 평균과 표준오차로 표시하였으며, 통계적 유의성은 Student’s t-test를 실시하여 대조군과 각 실험군 간 P-value가 0.05 미만일 때 유의성이 있는 것으로 나타내었다.

세계적으로 증가하고 있는 간질환에서 비알코올성 간질환이 가장 흔하며 이는 또한 증가하고 있는 대사성 질환을 유발할 수 있다(Kim 등, 2019). 인산화된 AMPK는 지방간을 억제한다고 알려졌으며, 본 연구는 고지방식이 유도 비만 마우스에서 율무한방차의 p-AMPK 발현 조절에 의한 간조직 지질축적 억제작용을 분석하고자 하였다(Kim 등, 2019).

체중, 식이효율 및 조직 무게

최종체중 및 식이효율 결과는 Fig. 2와 같다. 체중은 Control군에서 Normal군보다 유의적으로 증가하였으며 GC 및 YM200 보충군들에서 Control군보다 유의적으로 감소하였다. 식이효율 분석 결과, Control군에서 Normal군에 비해 식이효율이 유의적으로 높았으며 GC군에서 Control군에 비해 유의적으로 낮은 결과를 보였다. 고지방식이에 보충 급여된 율무혼합물의 체중감소 효과는 Park 등(2021)Lee 등(2021) 마우스 연구에서 보고되었으며, Lee 등(2021) 연구에서 율무혼합물의 식이효율 감소 효능 또한 보고되었다(Park 등, 2021; Lee 등, 2021).

Fig. 2. Weight, food efficiency ratio and serum peroxide level. All values are mean±SE (n=8). #P<0.05 and ###P<0.001 compared with Normal group. *P<0.05, **P<0.005, and ***P<0.001 compared with Control group. Control, 60% high-fat diet group; GC, Control with garcinia cambogia 200 mg/kg/d group; YM200, Control with Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d group. MDA, malondialdehyde. (A) body weight; (B) food efficiency ratio; (C) liver weight; (D) white adipose tissue weight; (E) serum MDA.

체중 100 g당 간조직 무게는 고지방식이군인 Control군에서 Normal군보다 유의적으로 증가하였으며, 고지방식이에 GC 및 YM200을 보충한 군들에서는 간조직 무게가 Control군보다 유의적으로 감소하는 효과를 보였다(Fig. 2). 체중 100 g당 부고환 백색지방조직 무게 결과는 고지방식이군에서 정상군보다 유의적으로 증가하였으며 GC 보충군에서 고지방식이군보다 유의적으로 감소하였다(Fig. 2). 고지방식이 유도 비만 마우스에서 율무혼합물 보충에 의한 간 및 지방 무게의 유의적 감소 효과는 Park 등(2021)Lee 등(2021)의 연구에서 보고되었으며, 율무, 복령 등 혼합분말과 산사, 진피 등 혼합열수추출물 각각에서 체중, 복부지방 및 간 무게의 감소 효능이 보고된 바 있다(Park 등, 2021; Lee 등, 2021; Youn과 Choi, 2015).

혈액 지질 및 과산화물 농도

6주간의 사육 기간 후 혈청에서 측정한 TG, TC, HDL-C 및 LDL-C 농도는 Normal군보다 Control군에서 유의적으로 증가하였다(Table 2). GC군 및 YM200군에서는 Control군보다 혈액 TG, TC 및 LDL-C 농도가 모두 유의적으로 감소하는 효과를 보였으며, YM200군에서 Control군에 비해 혈액 HDL-C 농도가 증가하였다. 본 연구의 실험 소재 복합열수추출물에 포함된 약재 중 복령은 흰쥐에서 고지방식이로 인해 높아진 혈액의 TG, TC 및 LDL-C 농도를 감소시켰으며, 구기자는 흰쥐의 혈액 TG 및 TC 농도를 감소시키는 혈액 지질 농도 개선 효과가 보고되었다(Miao 등, 2016; Kim 등, 1994). 율무, 복령 등 혼합분말과 산사, 진피 등 열수추출물 각각은 고지방식이 유도 비만 마우스에서 높아진 혈액 TG, TC 및 LDL-C 농도를 감소시켰으며, 율무, 복령 등 혼합분말은 또한 혈액 HDL-C 농도를 증가시켰다고 보고된 바 있다(Youn과 Choi, 2015).

Table 2 . Serum lipid levels (mg/dL)

GroupTriglycerideTotal cholesterolHDL-CLDL-C
Normal109.23±4.4092.01±4.1854.83±4.339.03±2.85
Control191.83±2.01###177.89±0.96###92.70±2.66###25.58±1.36###
GC169.75±6.67*149.26±6.71***94.57±3.4519.53±3.15*
YM200157.72±5.71**166.53±2.52**119.04±4.79**21.42±0.87*

All values are mean±SE (n=8). ###P<0.001 compared with Normal group. *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001 compared with Control group. Control, 60% high-fat diet group; GC, Control with garcinia cambogia 200 mg/kg/d group; YM200, Control with Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d group. HDL-C, high-density lipoprotein cholesterol; LDL-C, low-density lipoprotein cholesterol.



본 실험 결과 혈액 과산화물 MDA 농도는 고지방식이군에서 정상식이군에 비해 유의적으로 증가하였으며 고지방식이에 GC 및 YM200 보충은 혈액 MDA 농도를 고지방식이에 비해 유의적으로 감소시켰다(Fig. 2). 고지혈증 흰쥐에서 율무의 혈액 지질 개선 및 항산화능을 보고한 연구에서 율무는 혈액 MDA 농도를 감소시켰으며 superoxide dismutase 활성을 증가시켰고 복부지방과 LDL-C 농도를 감소시켰다고 보고되었다(Yu 등, 2011).

간조직 지질 농도, 간 및 지방조직의 형태학적 관찰

간조직에서 측정한 지질 농도 비교는 Table 3과 같다. Control군에서 Normal군에 비해 간조직의 TG 및 TC 농도가 유의적으로 높게 측정되었다. 한편, 고지방식이에 의해 높아진 간조직 TG 및 TC 농도는 GC 및 YM200 보충에 의해 유의적으로 감소하는 효과를 보였다. 간조직의 병리학적 관찰 결과에서는 고지방식이군인 Control군에서 비만이 유도되어 Normal군보다 많은 지방구들이 관찰되었다(Fig. 3). 한편, 약물투여군인 GC군 및 YM200군에서는 간조직 지방구의 수와 크기가 Control군보다 감소한 것으로 나타났다. 율무복합물의 간조직 TG 및 TC 농도 감소 효능은 Lee 등(2021)의 연구에서 보고되었으며, Park 등(2021)의 연구는 율무, 생강 등 복합물의 간조직 p-AMPK 발현증가에 의한 TG, TC 감소와 지방구 감소 효과를 보고하였다(Lee 등, 2021; Park 등, 2021). Kim 등(2019)은 복령추출물이 고지방식이로 인해 지방간이 유도된 마우스의 병리학적 관찰에서 지방간을 억제했으며 간조직 TG 농도를 감소시켰다고 보고하였다(Kim 등, 2019).

Table 3 . Hepatic lipid levels (mg/g)

GroupTriglycerideTotal cholesterol
Normal8.80±0.128.22±0.37
Control11.07±0.20###9.62±0.35###
GC8.28±0.79*8.51±0.25*
YM2007.91±0.42***8.64±0.15*

All values are mean±SE (n=8). ###P<0.001 compared with Normal group. *P<0.05 and ***P<0.001 compared with Control group. Control, 60% high-fat diet group; GC, Control with garcinia cambogia 200 mg/kg/d group; YM200, Control with Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d group.



Fig. 3. Hepatic and white adipose tissue morphology. Control, 60% high-fat diet group; GC, Control with garcinia cambogia 200 mg/kg/d group; YM200, Control with Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d group. ORO, oil red O stain; H&E, hematoxylin and eosin stain.


지방조직의 형태학적 비교 결과에서는 고지방식이로 인해 Control군에서 Normal군보다 부고환 백색 지방세포의 크기가 크게 관찰되었으며, GC군 및 YM200군에서는 Control군보다 지방세포의 크기가 작은 것으로 관찰되었다(Fig. 3). 율무복합물의 지방세포 크기 감소 효능은 Park 등(2021)의 고지방식이 유도 비만 마우스 연구에서 보고된 바 있다(Park 등, 2021).

간조직 단백질 발현

간조직에서 지질대사와 관련된 단백질 발현을 측정한 결과는 Fig. 4와 같다. 고지방식이에 YM200 보충은 p-AMPK 발현을 유의적으로 증가시켰으며, 지질생합성의 주요 인자인 SREBP-2 발현과 콜레스테롤 생합성 인자인 HMGCR 발현을 유의적으로 감소시켰다. 한편, GC 보충은 SREBP-2 및 HMGCR 단백질 발현을 유의적으로 감소시키는 효과를 보였다. 간조직의 지방산 산화 인자인 CPT-1 및 UCP-2 단백질 발현 측정 결과, YM200군에서 Control군보다 CPT-1 및 UCP-2 발현이 유의적으로 증가하였다.

Fig. 4. Hepatic protein expression. All values are mean±SE (n=8). #P<0.05, ##P<0.005, and ###P<0.001 compared with Normal group. *P<0.05 and **P<0.005 compared with Control group. Control, 60% high-fat diet group; GC, Control with garcinia cambogia 200 mg/kg/d group; YM200, Control with Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d group. (A) carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT-1); (B) uncoupling protein 2 (UCP2); (C) phosphorylated-AMP-activated protein kinase (p-AMPK); (D) sterol regulatory element binding protein-2 (SREBP-2); (E) 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR).

고지방식이에 의한 비만에서는 정상식이 섭취에 비해 간조직 p-AMPK 발현이 감소한다고 알려졌으며, 본 실험 결과도 이러한 보고와 일관성 있게 나타났고 고지방식이에 YM200 보충은 p-AMPK 발현을 정상식이 패턴과 유사하게 조절하는 효과를 보였다(Lindholm 등, 2013; Park 등, 2021; Kim 등, 2019). 대사 항상성 조절에서 p-AMPK는 중요한 역할을 하며 다양한 작용으로 지방간을 억제한다(Yang 등, 2018; Kim 등, 2019). 지질합성과 지방산 산화 과정에서 주요한 역할을 하는 malonyl-CoA 생성의 촉진 효소인 acetyl CoA를 억제한다고 알려졌다(Morsy, 2021; Kim 등, 2019). p-AMPK는 ATP를 소비하는 지질합성 작용을 억제하여 지질합성의 전사인자를 직접적으로 인산화하며 지질합성 단백질 발현을 억제한다(Kim 등, 2019). 지질합성의 전사인자인 SREBP-2는 p-AMPK에 의해 인산화되어 핵으로의 전위가 억제되며, SREBP-2 발현은 감소하고 HMGCR의 전사도 감소한다(Lee 등, 2020). 콜레스테롤 생합성의 속도조절효소인 HMGCR은 p-AMPK가 직접 인산화하여 발현이 억제되거나 SREBP-2 발현 억제에 의해, 즉 SREBP-2에 의존적으로 발현이 억제된다(Lee 등, 2020). 한편, p-AMPK는 APT를 생성하는 지방산 산화 작용은 촉진하고 지방산 산화 관련 단백질 발현은 증가시켜 간조직 지질축적을 억제한다(Kim 등, 2019). CPT1, UCP-2 및 p-AMPK 단백질 발현은 서로 양의 상관관계에 있으며, 이들 단백질 발현은 간조직 중성지방 및 지질축적과는 음의 상관관계에 있다고 알려졌다(Wang 등, 2020).

간 섬유화 또는 지방간의 발병과 p-AMPK 활성은 역비례 관계라고 알려졌으며, 본 연구 결과에서도 YM200 보충이 p-AMPK 발현을 증가시켰고 간조직 중성지방 및 지질축적을 억제했다(Yang 등, 2018; Kim 등, 2019). 복령은 고지방식이 유도 비만 마우스에서 p-AMPK 단백질 발현을 증가시켜 간조직 TG 축적을 억제했으며, 지질합성 유전자 발현을 감소시키고 지방산 산화 유전자 발현을 증가시켰다고 보고되었다(Kim 등, 2019). 또한 율무와 생강 등 혼합물의 열수추출물은 마우스 간조직 p-AMPK 발현을 증가시켜 간조직 지질축적을 억제했다고 알려져 있으며, Devaraj 등(2020)은 율무가 간조직 지질대사 효소 및 콜레스테롤 합성 조절에서 강력한 효능을 가지고 있다고 보고하였다(Park 등, 2021; Devaraj 등, 2020). 따라서 본 연구에서 율무를 주재료로 한 구기자, 복령, 산사, 진피 및 생강 복합열수추출물은 간조직 p-AMPK 발현을 증가시킴으로써 지질합성 단백질 발현을 감소시키고 지방산 산화 단백질 발현을 증가시켜 간조직 지질축적 억제 효능을 보인 것으로 여겨진다.

본 연구는 율무한방차의 간조직 지질대사 관련 단백질 발현 조절에 의한 지질축적 억제 작용을 알아보고자 하였다. C57BL/6 마우스를 4개군, 즉 Normal(정상식이군), Control(60% 고지방식이군), Control+가르시니아 캄보지아 200 mg/kg/d(GC군), Control+율무감비 열수추출물 200 mg/kg/d(YM200군)로 나누어 실험을 진행하였다. 실험 결과, 혈청 TG, TC 및 LDL-C 농도와 혈청 MDA 농도가 GC 및 YM200군에서 Control군보다 유의적으로 감소하였다. YM200 보충은 간조직 p-AMPK 발현을 증가시키고 간조직 지질합성에 주요한 역할을 하는 SREBP-2 및 HMGCR 단백질 발현을 감소시킨 반면, 간조직 지방산 산화 관련 단백질인 CPT-1 및 UCP-2 발현을 증가시킴으로써 간조직의 TG 및 TC 농도를 감소시키고 지방구 축적을 억제하는 결과를 나타내었다. 결론적으로 YM200은 간조직 p-AMPK 발현을 증가시켜 지질대사 관련 단백질 발현을 조절함으로써 간조직의 지질축적을 억제하였다. 따라서 YM200은 간조직 지질대사를 조절하고 지방간 제어에 효과적이라고 판단된다.

본 연구는 농촌진흥청 연구사업(세부과제번호: PJ01425103)의 지원에 의해 이루어진 것입니다.

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Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(4): 295-301

Published online April 30, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.4.295

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

율무한방차의 p-AMPK 발현증가에 의한 C57BL/6 마우스 간조직 지질축적 억제 효과

유강완1?박해진2?조수정3?이세희4?박순애5?김미림5

1대구한의대학교 한방식품학과, 2대구한의대학교 바이오융복합시험센터 3대구한의대학교 간질환한약융복합활용연구센터, 4대구한의대학교 한의학과 본초약리학교실 5대구한의대학교 푸드케어학부

Received: January 14, 2022; Revised: March 8, 2022; Accepted: March 15, 2022

Yulmu Herbal Tea Reduces Hepatic Lipid Accumulation by Upregulating p-AMPK Expression in C57BL/6 Mice

Gang Wan Yoo1 , Hae-Jin Park2 , Su-Jung Cho3 , Se Hui Lee4 , Soon-Ae Park5 , and Mi-Lim Kim5

1Department of Herbal Food and Nutrition, 2Bio Convergence Testing Center, 3HCLD,
4Department of Herbology, College of Korean Medicine, and 5Foodcare YAKSUN, Daegu Haany University

Correspondence to:Mi-Lim Kim, Foodcare YAKSUN, Daegu Haany University, 285-10, Eobongji-gil, Gyeongsan, Gyeongbuk 38578, Korea, E-mail: mlk8742@dhu.ac.kr
Author information: Gang Wan Yoo (Graduate student), Hae-Jin Park (Professor), Su-Jung Cho (Researcher), Se Hui Lee (Graduate student), Soon-Ae Park (Professor), Mi-Lim Kim (Professor)

Received: January 14, 2022; Revised: March 8, 2022; Accepted: March 15, 2022

This is Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

The present study investigated the hepatic lipid-lowering effect of Yulmu herbal tea mediated by regulating hepatic protein expressions. C57BL/6 mice were randomly divided into four groups: (1) normal (normal diet), (2) control (60% high-fat diet), (3) control+Garcinia cambogia 200 mg/kg/d (GC), (4) control+Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d (YM200). Serum triglyceride (TG), total cholesterol (TC), and low-density lipoprotein concentrations significantly decreased in the GC and YM200 groups compared to the control group. There was also a significant reduction in the serum malondialdehyde levels in the GC and YM200 groups. The YM200 treatment significantly increased the hepatic phosphorylated-AMP-activated protein kinase (p-AMPK) expression, and inhibited the hepatic sterol regulatory element-binding protein-2 and 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase protein expressions, which are the key regulators of hepatic lipid synthesis. YM200 also significantly upregulated hepatic fatty acid oxidation proteins such as carnitine palmitoyltransferase 1 and uncoupling protein 2. Therefore, hepatic TG and TC levels and lipid droplets were suppressed in the YM200 group. YM200 reduced hepatic lipid accumulation and regulated hepatic lipid-relating protein expressions mediated by upregulating the p-AMPK expression. In conclusion, YM200 may be useful for regulating hepatic lipid metabolism and hepatic steatosis.

Keywords: Yulmu herbal tea, p-AMPK, hepatic lipid metabolism, C57BL/6 mice

서 론

전 세계적으로 간질환은 증가하고 있으며 비알코올성 지방간은 간질환에서 가장 흔한 질환이다(Yang 등, 2018; Kim 등, 2019). 비알코올성 지방간에서는 간에 중성지방이 축적되며 간 지질 신생합성이 증가하고 지방산 산화가 감소하며 간으로부터 very-low-density lipoprotein 배출이 증가하게 된다(Kim 등, 2019). 비알코올성 지방간은 또한 비만, 고지혈증, 제2형 당뇨, 인슐린 저항성 등 다양한 대사성 질환을 유발할 수도 있다(Kim 등, 2019).

한편, AMP-activated protein kinase(AMPK) 활성화는 비알코올성 지방간, 간 섬유화, 간암 등에서 중요한 역할을 한다고 알려졌다(Yang 등, 2018). 인산화되어 활성화된 AMPK, 즉 phosphorylated-AMPK(p-AMPK)는 다양한 기전을 조절하는 것으로 보고되었다(Kim 등, 2019). 활성화된 AMPK는 간에서 지방간을 억제한다고 알려졌으며, 간조직에서 유전자 발현을 조절하고 간조직 지방산 합성을 감소시키며 지방산 산화를 촉진한다고 보고되었다(Kim 등, 2019).

다양한 대사성 질환을 조절하는 식이 보충제 phytochemical 등의 효능 연구에서 AMPK 활성화는 대표적 주제이다. 본 연구의 실험식이에서 주요한 소재인 율무(Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf.)는 탄수화물 중에서도 식이섬유 함량이 높고 당질은 적다고 알려졌으며, 영양적으로 우수한 영양소를 함유하고 있다고 보고되었다(Lee 등, 2019; Kim 등, 2000). 율무는 체중조절용 건강보조식품으로서 가치가 있다고도 알려졌으며, 혈액 지질 농도 개선 효과와 간조직 지질축적 억제 효과가 동물실험을 통해 보고된 바 있다(Kim 등, 2000; Chung 등, 1988; Lee 등, 2021). 한편, 율무차는 커피 또는 녹차 시장만큼 수요가 크진 않으나 남녀노소 가장 즐겨 마시는 전통차 중 하나이다(Gwak 등, 2012). 하지만 율무차는 간단히 마실 수 있는 차가 아니라 선식과 같은 건강영양식으로 인식하고 있는 경향이 있으며 연구 또한 커피나 녹차에 비하면 부족한 실정이다(Gwak 등, 2012).

이에 본 연구는 율무에 전통적 한약재들을 혼합해 간단히 마실 수 있는 감비차를 제조하여 간조직 지질 억제 작용을 구체적으로 분석해보고자 하였다. 감비는 한국에서 비만 치료에 사용되었으며 한의학의 태음조위탕을 변형한 소재라고 보고되었다(Park 등, 2021). 제조한 감비차에서 혼합률이 율무 다음으로 높은 구기자는 항산화, 항당뇨, 비알코올성 지방간 개선 등 다양한 생물학적 활성이 보고되었다(Kim 등, 2021). 복령은 항암, 항염증, 항산화, 항당뇨 등의 생리활성을 가지고 있으며 지방간 억제 효능이 알려졌다(Kim 등, 2019). 산사와 진피 등 혼합열수추출물은 이상지질혈증 개선 효과와 항비만 효능이 보고되었으며, 율무, 생강 등 혼합물은 항비만 및 p-AMPK 발현증가에 의한 지방간 개선 효능이 보고된 바 있다(Youn과 Choi, 2015; Park 등, 2021).

본 연구에서는 고지방식이 유도 비만에서 율무, 구기자, 복령, 산사, 진피 및 생강 복합열수추출물(감비차)의 p- AMPK 발현 조절에 의한 간조직 지질대사 조절 작용을 분석하고 간조직 지질축적 억제 효능을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

시료의 제조

율무혼합물(‘율무감비차’)의 재료인 율무, 구기자, 복령, 산사, 진피, 생강은 제성약업사(Seoul, Korea)에서 구입해 사용하였다. 혼합물의 비율은 각각 율무(Coix lacryma-jobi) 50%, 구기자(Lycium chinesis Mill) 20%, 복령(Poria cocos Wolf) 15%, 산사(Crataegi fructus) 7%, 진피(Citrus unshiu Markovich) 5% 및 생강(Zingiber officinale Roscoe) 3%를 포함하고 있다(Table 1). 제조한 율무감비차 시료 100 g을 15배의 증류수에 넣고 가열 추출(100°C, 5시간)하여 필터로 여과했으며, 농축(Buchi B-480, Flawil, Switzerland)한 후 동결 건조(FD5508, Ilshin, Seoul, Korea)하여 20.56 g의 분말을 얻었다. 율무감비차 열수추출물의 수율은 20.5%였으며 건조 분말은 실온에 보관하였다. 추출물은 Fig. 1에서 보는 바와 같이 고농도(1,000 μg/mL) 수준에서도 세포독성이 나타나지 않았으므로 동물실험에 사용하였다.

Table 1 . Compositions of Yulmugambi-tea (g).

IngredientYulmugambi tea (total 100 g)
Coix lacryma-jobi50
Lycium chinesis Mill20
Poria cocos Wolf15
Crataegi fructus7
Citrus unshiu Markovich5
Zingiber officinale Roscoe3


Fig 1. Cytotoxic effect of Yulmugambi water extract on 3T3-L1 cell by MTT assay. Values are mean±SD from three independent experiments.

세포독성 확인

MTT assay를 수행하였으며 3T3-L1(pre-adipocyte cell line)은 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. 96-well cell culture plate에 분화되지 않은 3T3-L1 세포를 5×104/well (100 µL) 밀도로 분주한 후, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 배양 종료 후 현미경으로 지방세포가 바닥에 잘 부착되어 분포되었음을 확인한 후, 각 well의 배양액을 제거하고 율무한방차(율무감비차) 열수추출물을 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 500 μg/mL 및 1,000 μg/mL 농도로 처리하였으며, 37°C 온도와 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 배양 종료 후, 각 well의 배양액을 제거하고 MTT reagent(1 mg/mL)를 50 µL씩 well에 첨가한 후, 호일로 덮어 빛을 차단하고 37°C에서 2시간 반응시켰다. 세포에 보라색 침전물을 확인한 후, 각 well의 MTT reagent를 제거하고 isopropanol을 100 µL씩 well에 첨가하여 잘 섞어준 다음 Microplate reader(M200, TECAN, Victoria, Australia)를 이용하여 570 nm(반응 흡광도) 및 650 nm(참고 흡광도)에서 흡광도를 측정하였다.

시약

실험에 사용된 potassium persulfate, phenyl methyl sulfonyl fluoride는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, protease inhibitor mixture solution, ethylenediaminetetraacetic acid는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)에서 구입하였다. BCA protein assay kit은 Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham, MA, USA), ECL Western Blotting Detection reagents와 pure nitrocellulose membranes는 GE Healthcare(Chicago, IL, USA)로부터 구입해 사용하였다. 1차 항체 carnitine palmitoyltransferase 1(CPT-1; SC-98834), uncoupling protein 2(UCP-2; SC-6526), p-AMPK(SC-33524), AMPK(SC-25792), sterol regulatory element binding protein-2(SREBP-2; SC-5603), 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase(HMGCR; SC-33827), β-actin(SC-4778), histone(SC-8030)을 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(Dallas, TX, USA)로부터 구입하였으며, 2차 항체는 GeneTex, Inc. (Irvine, LA, USA)에서 구입해 사용하였다.

동물사육 실시

C57BL/6 마우스(4-wk-old, male; Daehan Bio Link, Eumseong, Korea)를 물과 고형사료(Samyang Corp., Seoul, Korea)를 공급하는 1주간의 적응 기간을 두고 본 실험에 사용하였다. 본 동물실험은 대구한의대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC))의 승인(승인번호: DHU2021-085)을 받아 수행하였다. 실험군은 난괴법으로 4개군으로 나누어 정상군(Normal)은 일반식이(Samyang Corp.)와 증류수를 급여, 대조군(Control)은 60% high-fat diet(HFD, Diet 12492, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA)와 증류수를 급여, garcinia cambogia(GC)군은 HFD와 가르시니아 캄보지아 추출물 200 mg/kg/d를 급여, Yulmugambi (YM)200군은 HFD에 율무감비차(율무한방차) 열수추출물 200 mg/kg/d를 급여하며 6주간 사육하였다. 약물은 매일 일정한 시각에 증류수에 녹여 존대(zonde)로 경구 투여하였다. 동물 실험실은 conventional system으로 온도는 22±2°C, 습도는 50±5%였으며, 명암주기(light:dark cycle)는 12시간 주기로 유지하였다. 마우스의 체중 및 식이섭취량을 1일 1회 측정하였으며, 부검 전에는 공복시간을 12시간 두고 혈액을 채취하고 간 및 부고환 백색지방조직을 적출하였다.

혈액 및 간조직 지질, 혈액 과산화물 분석

혈액은 마우스의 심장에서 채혈해 4,000 rpm에서 10분간 원심분리해 혈청을 얻었다. 혈청 triglyceride(TG) 및 total cholesterol(TC) 농도는 TG, TC assay kit(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)으로 분석하였다. 혈청 high-density lipoprotein-cholesterol(HDL-C)은 아산제약(Seoul, Korea)에서 구매한 assay kit의 프로토콜에 따라 농도를 측정하였으며, low-density lipoprotein-cholesterol(LDL-C)은 Friedward법으로 계산하였다.

LDL-C=TC-(high-density lipoprotein-cholesterol+TG/5)

혈액 과산화물 측정은 Tarladgis 등(1964)의 방법을 사용하였으며 malondialdehyde(MDA) 농도는 tetramethoxypropane 표준검량선을 이용하였다(Tarladgis 등, 1964).

간조직의 지질 농도는 클로로포름:메탄올(2:1, v/v) 액으로 지질을 추출하고 혈액 TG, TC 측정과 동일한 방법을 사용하였다(Folch 등, 1957).

간 및 지방조직의 형태학적 관찰

간 및 지방조직의 일부를 적출하여 10% 중성 포르말린에 고정시킨 후, 파라핀으로 포매하고 4 μm의 절편을 만들어 hematoxylin과 eosin으로 염색하여 관찰하였다. 간조직 oil red O 염색은 free floating method를 이용하였으며, 조직의 관찰은 광학현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용해 200배에서 변화를 관찰하였다.

간조직 western blot 분석

간조직 단백질은 lysis buffer(20 mM Tris, 1 mM Na3VO4, 1 mM phenymethylsufonyl fluoride, 50 mM NaF)로 추출하였으며 정량에는 BCA protein assay reagent kit을 사용하였다. 단백질 동량을 SDS PAGE gel로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 전이시켰으며 5% skim milk에 blocking을 1시간 동안 시행하였다. 1차 항체는 4°C에서 overnight 시켰으며 2차 항체는 상온에서 1시간 반응시켰다. 단백질 발현은 ECL Western blotting detection reagents, Image Quant LAS 4000 Mini Biomolecular Imager(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)로 확인하였으며 band 정량에는 ATTO Densitograph Software (ATTO Corp., Tokyo, Japan)를 사용하였다.

통계처리

실험 결과는 SPSS package(Version 25.0, IBM, Armonk, NY, USA) 프로그램을 사용하여 평균과 표준오차로 표시하였으며, 통계적 유의성은 Student’s t-test를 실시하여 대조군과 각 실험군 간 P-value가 0.05 미만일 때 유의성이 있는 것으로 나타내었다.

결과 및 고찰

세계적으로 증가하고 있는 간질환에서 비알코올성 간질환이 가장 흔하며 이는 또한 증가하고 있는 대사성 질환을 유발할 수 있다(Kim 등, 2019). 인산화된 AMPK는 지방간을 억제한다고 알려졌으며, 본 연구는 고지방식이 유도 비만 마우스에서 율무한방차의 p-AMPK 발현 조절에 의한 간조직 지질축적 억제작용을 분석하고자 하였다(Kim 등, 2019).

체중, 식이효율 및 조직 무게

최종체중 및 식이효율 결과는 Fig. 2와 같다. 체중은 Control군에서 Normal군보다 유의적으로 증가하였으며 GC 및 YM200 보충군들에서 Control군보다 유의적으로 감소하였다. 식이효율 분석 결과, Control군에서 Normal군에 비해 식이효율이 유의적으로 높았으며 GC군에서 Control군에 비해 유의적으로 낮은 결과를 보였다. 고지방식이에 보충 급여된 율무혼합물의 체중감소 효과는 Park 등(2021)Lee 등(2021) 마우스 연구에서 보고되었으며, Lee 등(2021) 연구에서 율무혼합물의 식이효율 감소 효능 또한 보고되었다(Park 등, 2021; Lee 등, 2021).

Fig 2. Weight, food efficiency ratio and serum peroxide level. All values are mean±SE (n=8). #P<0.05 and ###P<0.001 compared with Normal group. *P<0.05, **P<0.005, and ***P<0.001 compared with Control group. Control, 60% high-fat diet group; GC, Control with garcinia cambogia 200 mg/kg/d group; YM200, Control with Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d group. MDA, malondialdehyde. (A) body weight; (B) food efficiency ratio; (C) liver weight; (D) white adipose tissue weight; (E) serum MDA.

체중 100 g당 간조직 무게는 고지방식이군인 Control군에서 Normal군보다 유의적으로 증가하였으며, 고지방식이에 GC 및 YM200을 보충한 군들에서는 간조직 무게가 Control군보다 유의적으로 감소하는 효과를 보였다(Fig. 2). 체중 100 g당 부고환 백색지방조직 무게 결과는 고지방식이군에서 정상군보다 유의적으로 증가하였으며 GC 보충군에서 고지방식이군보다 유의적으로 감소하였다(Fig. 2). 고지방식이 유도 비만 마우스에서 율무혼합물 보충에 의한 간 및 지방 무게의 유의적 감소 효과는 Park 등(2021)Lee 등(2021)의 연구에서 보고되었으며, 율무, 복령 등 혼합분말과 산사, 진피 등 혼합열수추출물 각각에서 체중, 복부지방 및 간 무게의 감소 효능이 보고된 바 있다(Park 등, 2021; Lee 등, 2021; Youn과 Choi, 2015).

혈액 지질 및 과산화물 농도

6주간의 사육 기간 후 혈청에서 측정한 TG, TC, HDL-C 및 LDL-C 농도는 Normal군보다 Control군에서 유의적으로 증가하였다(Table 2). GC군 및 YM200군에서는 Control군보다 혈액 TG, TC 및 LDL-C 농도가 모두 유의적으로 감소하는 효과를 보였으며, YM200군에서 Control군에 비해 혈액 HDL-C 농도가 증가하였다. 본 연구의 실험 소재 복합열수추출물에 포함된 약재 중 복령은 흰쥐에서 고지방식이로 인해 높아진 혈액의 TG, TC 및 LDL-C 농도를 감소시켰으며, 구기자는 흰쥐의 혈액 TG 및 TC 농도를 감소시키는 혈액 지질 농도 개선 효과가 보고되었다(Miao 등, 2016; Kim 등, 1994). 율무, 복령 등 혼합분말과 산사, 진피 등 열수추출물 각각은 고지방식이 유도 비만 마우스에서 높아진 혈액 TG, TC 및 LDL-C 농도를 감소시켰으며, 율무, 복령 등 혼합분말은 또한 혈액 HDL-C 농도를 증가시켰다고 보고된 바 있다(Youn과 Choi, 2015).

Table 2 . Serum lipid levels (mg/dL).

GroupTriglycerideTotal cholesterolHDL-CLDL-C
Normal109.23±4.4092.01±4.1854.83±4.339.03±2.85
Control191.83±2.01###177.89±0.96###92.70±2.66###25.58±1.36###
GC169.75±6.67*149.26±6.71***94.57±3.4519.53±3.15*
YM200157.72±5.71**166.53±2.52**119.04±4.79**21.42±0.87*

All values are mean±SE (n=8). ###P<0.001 compared with Normal group. *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001 compared with Control group. Control, 60% high-fat diet group; GC, Control with garcinia cambogia 200 mg/kg/d group; YM200, Control with Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d group. HDL-C, high-density lipoprotein cholesterol; LDL-C, low-density lipoprotein cholesterol..



본 실험 결과 혈액 과산화물 MDA 농도는 고지방식이군에서 정상식이군에 비해 유의적으로 증가하였으며 고지방식이에 GC 및 YM200 보충은 혈액 MDA 농도를 고지방식이에 비해 유의적으로 감소시켰다(Fig. 2). 고지혈증 흰쥐에서 율무의 혈액 지질 개선 및 항산화능을 보고한 연구에서 율무는 혈액 MDA 농도를 감소시켰으며 superoxide dismutase 활성을 증가시켰고 복부지방과 LDL-C 농도를 감소시켰다고 보고되었다(Yu 등, 2011).

간조직 지질 농도, 간 및 지방조직의 형태학적 관찰

간조직에서 측정한 지질 농도 비교는 Table 3과 같다. Control군에서 Normal군에 비해 간조직의 TG 및 TC 농도가 유의적으로 높게 측정되었다. 한편, 고지방식이에 의해 높아진 간조직 TG 및 TC 농도는 GC 및 YM200 보충에 의해 유의적으로 감소하는 효과를 보였다. 간조직의 병리학적 관찰 결과에서는 고지방식이군인 Control군에서 비만이 유도되어 Normal군보다 많은 지방구들이 관찰되었다(Fig. 3). 한편, 약물투여군인 GC군 및 YM200군에서는 간조직 지방구의 수와 크기가 Control군보다 감소한 것으로 나타났다. 율무복합물의 간조직 TG 및 TC 농도 감소 효능은 Lee 등(2021)의 연구에서 보고되었으며, Park 등(2021)의 연구는 율무, 생강 등 복합물의 간조직 p-AMPK 발현증가에 의한 TG, TC 감소와 지방구 감소 효과를 보고하였다(Lee 등, 2021; Park 등, 2021). Kim 등(2019)은 복령추출물이 고지방식이로 인해 지방간이 유도된 마우스의 병리학적 관찰에서 지방간을 억제했으며 간조직 TG 농도를 감소시켰다고 보고하였다(Kim 등, 2019).

Table 3 . Hepatic lipid levels (mg/g).

GroupTriglycerideTotal cholesterol
Normal8.80±0.128.22±0.37
Control11.07±0.20###9.62±0.35###
GC8.28±0.79*8.51±0.25*
YM2007.91±0.42***8.64±0.15*

All values are mean±SE (n=8). ###P<0.001 compared with Normal group. *P<0.05 and ***P<0.001 compared with Control group. Control, 60% high-fat diet group; GC, Control with garcinia cambogia 200 mg/kg/d group; YM200, Control with Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d group..



Fig 3. Hepatic and white adipose tissue morphology. Control, 60% high-fat diet group; GC, Control with garcinia cambogia 200 mg/kg/d group; YM200, Control with Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d group. ORO, oil red O stain; H&E, hematoxylin and eosin stain.


지방조직의 형태학적 비교 결과에서는 고지방식이로 인해 Control군에서 Normal군보다 부고환 백색 지방세포의 크기가 크게 관찰되었으며, GC군 및 YM200군에서는 Control군보다 지방세포의 크기가 작은 것으로 관찰되었다(Fig. 3). 율무복합물의 지방세포 크기 감소 효능은 Park 등(2021)의 고지방식이 유도 비만 마우스 연구에서 보고된 바 있다(Park 등, 2021).

간조직 단백질 발현

간조직에서 지질대사와 관련된 단백질 발현을 측정한 결과는 Fig. 4와 같다. 고지방식이에 YM200 보충은 p-AMPK 발현을 유의적으로 증가시켰으며, 지질생합성의 주요 인자인 SREBP-2 발현과 콜레스테롤 생합성 인자인 HMGCR 발현을 유의적으로 감소시켰다. 한편, GC 보충은 SREBP-2 및 HMGCR 단백질 발현을 유의적으로 감소시키는 효과를 보였다. 간조직의 지방산 산화 인자인 CPT-1 및 UCP-2 단백질 발현 측정 결과, YM200군에서 Control군보다 CPT-1 및 UCP-2 발현이 유의적으로 증가하였다.

Fig 4. Hepatic protein expression. All values are mean±SE (n=8). #P<0.05, ##P<0.005, and ###P<0.001 compared with Normal group. *P<0.05 and **P<0.005 compared with Control group. Control, 60% high-fat diet group; GC, Control with garcinia cambogia 200 mg/kg/d group; YM200, Control with Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d group. (A) carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT-1); (B) uncoupling protein 2 (UCP2); (C) phosphorylated-AMP-activated protein kinase (p-AMPK); (D) sterol regulatory element binding protein-2 (SREBP-2); (E) 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR).

고지방식이에 의한 비만에서는 정상식이 섭취에 비해 간조직 p-AMPK 발현이 감소한다고 알려졌으며, 본 실험 결과도 이러한 보고와 일관성 있게 나타났고 고지방식이에 YM200 보충은 p-AMPK 발현을 정상식이 패턴과 유사하게 조절하는 효과를 보였다(Lindholm 등, 2013; Park 등, 2021; Kim 등, 2019). 대사 항상성 조절에서 p-AMPK는 중요한 역할을 하며 다양한 작용으로 지방간을 억제한다(Yang 등, 2018; Kim 등, 2019). 지질합성과 지방산 산화 과정에서 주요한 역할을 하는 malonyl-CoA 생성의 촉진 효소인 acetyl CoA를 억제한다고 알려졌다(Morsy, 2021; Kim 등, 2019). p-AMPK는 ATP를 소비하는 지질합성 작용을 억제하여 지질합성의 전사인자를 직접적으로 인산화하며 지질합성 단백질 발현을 억제한다(Kim 등, 2019). 지질합성의 전사인자인 SREBP-2는 p-AMPK에 의해 인산화되어 핵으로의 전위가 억제되며, SREBP-2 발현은 감소하고 HMGCR의 전사도 감소한다(Lee 등, 2020). 콜레스테롤 생합성의 속도조절효소인 HMGCR은 p-AMPK가 직접 인산화하여 발현이 억제되거나 SREBP-2 발현 억제에 의해, 즉 SREBP-2에 의존적으로 발현이 억제된다(Lee 등, 2020). 한편, p-AMPK는 APT를 생성하는 지방산 산화 작용은 촉진하고 지방산 산화 관련 단백질 발현은 증가시켜 간조직 지질축적을 억제한다(Kim 등, 2019). CPT1, UCP-2 및 p-AMPK 단백질 발현은 서로 양의 상관관계에 있으며, 이들 단백질 발현은 간조직 중성지방 및 지질축적과는 음의 상관관계에 있다고 알려졌다(Wang 등, 2020).

간 섬유화 또는 지방간의 발병과 p-AMPK 활성은 역비례 관계라고 알려졌으며, 본 연구 결과에서도 YM200 보충이 p-AMPK 발현을 증가시켰고 간조직 중성지방 및 지질축적을 억제했다(Yang 등, 2018; Kim 등, 2019). 복령은 고지방식이 유도 비만 마우스에서 p-AMPK 단백질 발현을 증가시켜 간조직 TG 축적을 억제했으며, 지질합성 유전자 발현을 감소시키고 지방산 산화 유전자 발현을 증가시켰다고 보고되었다(Kim 등, 2019). 또한 율무와 생강 등 혼합물의 열수추출물은 마우스 간조직 p-AMPK 발현을 증가시켜 간조직 지질축적을 억제했다고 알려져 있으며, Devaraj 등(2020)은 율무가 간조직 지질대사 효소 및 콜레스테롤 합성 조절에서 강력한 효능을 가지고 있다고 보고하였다(Park 등, 2021; Devaraj 등, 2020). 따라서 본 연구에서 율무를 주재료로 한 구기자, 복령, 산사, 진피 및 생강 복합열수추출물은 간조직 p-AMPK 발현을 증가시킴으로써 지질합성 단백질 발현을 감소시키고 지방산 산화 단백질 발현을 증가시켜 간조직 지질축적 억제 효능을 보인 것으로 여겨진다.

요 약

본 연구는 율무한방차의 간조직 지질대사 관련 단백질 발현 조절에 의한 지질축적 억제 작용을 알아보고자 하였다. C57BL/6 마우스를 4개군, 즉 Normal(정상식이군), Control(60% 고지방식이군), Control+가르시니아 캄보지아 200 mg/kg/d(GC군), Control+율무감비 열수추출물 200 mg/kg/d(YM200군)로 나누어 실험을 진행하였다. 실험 결과, 혈청 TG, TC 및 LDL-C 농도와 혈청 MDA 농도가 GC 및 YM200군에서 Control군보다 유의적으로 감소하였다. YM200 보충은 간조직 p-AMPK 발현을 증가시키고 간조직 지질합성에 주요한 역할을 하는 SREBP-2 및 HMGCR 단백질 발현을 감소시킨 반면, 간조직 지방산 산화 관련 단백질인 CPT-1 및 UCP-2 발현을 증가시킴으로써 간조직의 TG 및 TC 농도를 감소시키고 지방구 축적을 억제하는 결과를 나타내었다. 결론적으로 YM200은 간조직 p-AMPK 발현을 증가시켜 지질대사 관련 단백질 발현을 조절함으로써 간조직의 지질축적을 억제하였다. 따라서 YM200은 간조직 지질대사를 조절하고 지방간 제어에 효과적이라고 판단된다.

감사의 글

본 연구는 농촌진흥청 연구사업(세부과제번호: PJ01425103)의 지원에 의해 이루어진 것입니다.

Fig 1.

Fig 1.Cytotoxic effect of Yulmugambi water extract on 3T3-L1 cell by MTT assay. Values are mean±SD from three independent experiments.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 295-301https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.4.295

Fig 2.

Fig 2.Weight, food efficiency ratio and serum peroxide level. All values are mean±SE (n=8). #P<0.05 and ###P<0.001 compared with Normal group. *P<0.05, **P<0.005, and ***P<0.001 compared with Control group. Control, 60% high-fat diet group; GC, Control with garcinia cambogia 200 mg/kg/d group; YM200, Control with Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d group. MDA, malondialdehyde. (A) body weight; (B) food efficiency ratio; (C) liver weight; (D) white adipose tissue weight; (E) serum MDA.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 295-301https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.4.295

Fig 3.

Fig 3.Hepatic and white adipose tissue morphology. Control, 60% high-fat diet group; GC, Control with garcinia cambogia 200 mg/kg/d group; YM200, Control with Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d group. ORO, oil red O stain; H&E, hematoxylin and eosin stain.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 295-301https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.4.295

Fig 4.

Fig 4.Hepatic protein expression. All values are mean±SE (n=8). #P<0.05, ##P<0.005, and ###P<0.001 compared with Normal group. *P<0.05 and **P<0.005 compared with Control group. Control, 60% high-fat diet group; GC, Control with garcinia cambogia 200 mg/kg/d group; YM200, Control with Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d group. (A) carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT-1); (B) uncoupling protein 2 (UCP2); (C) phosphorylated-AMP-activated protein kinase (p-AMPK); (D) sterol regulatory element binding protein-2 (SREBP-2); (E) 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR).
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Table 1 . Compositions of Yulmugambi-tea (g).

IngredientYulmugambi tea (total 100 g)
Coix lacryma-jobi50
Lycium chinesis Mill20
Poria cocos Wolf15
Crataegi fructus7
Citrus unshiu Markovich5
Zingiber officinale Roscoe3

Table 2 . Serum lipid levels (mg/dL).

GroupTriglycerideTotal cholesterolHDL-CLDL-C
Normal109.23±4.4092.01±4.1854.83±4.339.03±2.85
Control191.83±2.01###177.89±0.96###92.70±2.66###25.58±1.36###
GC169.75±6.67*149.26±6.71***94.57±3.4519.53±3.15*
YM200157.72±5.71**166.53±2.52**119.04±4.79**21.42±0.87*

All values are mean±SE (n=8). ###P<0.001 compared with Normal group. *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001 compared with Control group. Control, 60% high-fat diet group; GC, Control with garcinia cambogia 200 mg/kg/d group; YM200, Control with Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d group. HDL-C, high-density lipoprotein cholesterol; LDL-C, low-density lipoprotein cholesterol..


Table 3 . Hepatic lipid levels (mg/g).

GroupTriglycerideTotal cholesterol
Normal8.80±0.128.22±0.37
Control11.07±0.20###9.62±0.35###
GC8.28±0.79*8.51±0.25*
YM2007.91±0.42***8.64±0.15*

All values are mean±SE (n=8). ###P<0.001 compared with Normal group. *P<0.05 and ***P<0.001 compared with Control group. Control, 60% high-fat diet group; GC, Control with garcinia cambogia 200 mg/kg/d group; YM200, Control with Yulmugambi water extract 200 mg/kg/d group..


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