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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2021; 50(9): 950-961

Published online September 30, 2021 https://doi.org/10.3746/jkfn.2021.50.9.950

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Isoflavone Characterization in Soybean Seed and Fermented Products Based on High-Resolution Mass Spectrometry

Ryeong Ha Kwon , Heon-Woong Kim, Suji Lee, So-Jeong Lee, Hyemin Na, Ju Hyung Kim, Chi-Do Wee, Seon Mi Yoo, and Sang Hoon Lee

National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration

Correspondence to:Sang Hoon Lee, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, 166, Nongsaengmyeongro, Iseo-myeon, Wanju-gun, Jeonbuk 55365, Korea, E-mail: spprigan@korea.kr

Received: June 1, 2021; Revised: July 14, 2021; Accepted: July 29, 2021

This is Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

This study conducted an accurate analysis of isoflavone derivatives, including succinylglucosides, which are identified from fermented soybean products using high-resolution mass spectrometry (UPLC-DAD-QTOF/MS). A total of thirty-six isoflavone components were isolated and identified from soybean seeds (raw and steamed) and commercial fermented products (cheonggukjang, cheonggukjang powder, and natto). Among them, ten novel compounds were tentatively identified for the first time (5 daidzein- and 5 genistein derivatives). In particular, eight succinylglucosides newly generated by Bacillus subtilis during fermentation were structures in which succinic acid was combined with the glucose of the corresponding daidzein (new 3 types), genistein (new 2 types), and glycitein, and among them, 6″-O-succinyldaidzin and 6″-O-succinylgenistin were confirmed as the predominant components. The total isoflavone content (mg/100 g, dry weight) of soybean seeds (raw and steamed), cheonggukjang, and natto ranged from 294.95 to 411.93 mg/100 g. The raw soybean seed was composed of malonylglucosides (75.9%)> monoglucosides> aglycone> acetylglucosides (0.1%), whereas the steamed soybean seed presented as monoglycosides (72.5%)> acetylglucosides (13.5%)> malonylglucosides> aglycones. In addition, cheonggukjang, cheonggukjang powder, and natto mainly contained monoglucosides (46.0%, 56.5%, and 70.0%, respectively) and succinylglucosides (20.3%, 22.5%, and 13.6%, respectively). It is considered that the isoflavone profiles including the additional succinylglucosides can be of fundamental use in applied science related to fermented soybean foods.

Keywords: soybean, fermentation, isoflavone, succinylglucoside, UPLC-DAD-QTOF/MS

콩(Glycine max L.)은 전 세계에서 많이 이용되는 주요 작물 중 하나로서 콩나물, 두유, 두부 등 식재료와 된장, 미소, 청국장, 낫또, 템페 등 발표 식품의 원재료로 쓰인다(Frankenfeld, 2017; Messina와 Messina, 2010). 이 중 청국장과 낫또는 각각 한국과 일본의 전통적인 콩 발표 식품으로 콩을 침지하여 증자한 후 서로 다른 Bacillus subtilis 균주 및 발효 조건으로 배양시켜 생산한다(Hu 등, 2010; Jang 등, 2006).

콩은 에스트로겐 유사 활성을 나타내는 이소플라본을 중심으로 사포닌, 안토시아닌 등의 다양한 성분을 포함하고 있다(Ha 등, 2009; Kim 등, 2014; Kim 등, 2006; Ko, 2014). 이소플라본 섭취는 세포손상 방어, 지질 과산화 억제 등 항산화 작용과 더불어 갱년기 증상, 심혈관계 질환, 자가 면역질환 등의 질병을 예방할 수 있다(Barnes, 1998; Tham 등, 1998; Zaheer과 Akhtar, 2017).

콩의 주요 isoflavone malonyl 배당체는 열 또는 발효에 의해 탈카복실화(de-carboxylation) 및 탈에스테르화(deesterification)등의 과정을 거쳐 acetyl 배당체, 배당체 및 아글리콘의 형태로 전환되며, 이는 열처리(온도, 시간 등), 발효(미생물, 시간 등)의 가공 조건에 따라 전환되는 정도의 차이가 있다(Huang과 Chou, 2008; Lim 등, 2020; Wang과 Sporns, 2000). 실제로 콩을 볶는 과정 중 아글리콘 및 배당체 함량은 증가하는 반면, malonyl 배당체의 함량은 감소하는 것으로 나타났다(Lee 등, 2013). 또한 BacillusLentinus 균주 발효 과정을 통해 6″-O-succinyl 배당체(6″-O-succinyldaidzin, 6″-O-succinylgenistin 및 6″-O-succinylglycitin)가 새롭게 생성되었으며, 이들 화합물은 청국장 및 낫또와 같은 발효 식품에서 보고된 바 있다(Park 등, 2010; Park 등, 2012; Toda 등, 2000; Yang 등, 2008; Zhang 등, 2015). 난소 호르몬 결핍 쥐 모델에서 6″-O-succinyldaidzin 및 6″-O-succinylgenistin 섭취 시 기존 daidzin 및 genistin과 유사한 수준으로 골밀도가 향상되었으며(Toda 등, 1999), Bao 등(2020)에 따르면 6″-O-succinyldaidzin은 항산화 효소(SOD, GSHPx) 활성을 증가시킬 뿐만 아니라 우수한 신경 보호 효과를 나타내는 것으로 보고되었다. NMR 기반의 6″-O-succinylglucosides 3종이 최초 동정된 후 지금까지 이들에 대해서만 LC 수준으로 함량이 평가되어왔다(Park 등, 2010; Toda 등, 1999; Yang 등, 2008). 6″-O-succinylgenistin 및 6″-O-succinyldaidzin은 이소플라본 총 함량 중 각각 6.6% 및 4.1%를 차지하여 주요 성분임이 확인되었으며, 발효 시작부터 15시간 동안 급격히 증가하다가 27시간 이후 최대농도에 도달했다(Toda 등, 2000; Zhang 등, 2015). 대부분의 이소플라본 연구는 표준물질 확보가 가능한 아글리콘 및 배당체 12종을 대상으로 품종, 재배 조건, 수확시기, 저장기간, 발아 정도 등에 따른 조성 및 함량 평가였으며(Kim 등, 2014; Kim 등, 2005; Lee 등, 2003; Phommalth 등, 2008), 제시된 12종 이외의 succinyl 배당체, acetyl 및 malonyl 배당체 등 콩 발효에 따른 이소플라본의 전반적인 상세 변화 연구는 아직 부족한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 무처리 콩 및 시판 중인 청국장, 낫또 발효 제품으로부터 고해상도 질량분석(UPLC-DADQTOF/MS)을 이용한 전반적인 이소플라본 유도체 동정을 통해 succinyl 배당체, acetyl 배당체 계열의 신규 화합물이 최초로 확인되었으며, 나아가 이들의 조성 및 함량을 평가하여 추후 다양한 발효 산물로부터 이소플라본 유도체를 정밀하게 평가하는데 도움이 되고자 하였다.

실험 재료

콩 종자(대원콩) 및 증자 시료(121°C, 15분)는 2019년도에 수확된 것을 이용하였으며 청국장 및 낫또는 종가집, 청국장 가루는 초록마을(Seoul, Korea)에서 시판되는 제품을 구입하였다. 각 시료는 동결건조 및 분말화하여 -70°C에서 냉동보관 후 분석 시료로 사용하였다. 이소플라본 동정 시 참고한 daidzein, genistein, glycitein, daidzin, genistin, glycitin, sophoricoside는 Extrasynthese(Lyon, France)에서, 6″-O-acetyldaidzin, 6″-O-acetylgenistin, 6″-O-malonyldaidzin, 6″-O-malonylgenistin은 Synthose Inc. (Concord, Canada)에서, 6″-O-acetylglycitin은 MedChem Express(Monmouth Junction, NJ, USA)에서 각각 구입하였다. 정량분석에 사용된 내부표준물질 6-methoxyflavone은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 아세토니트릴, 메탄올 및 물(Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)은 모두 MS 등급을 사용하였으며, 포름산은 Junsei Chemical(Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다.

이소플라본 추출물의 제조

이소플라본 추출은 Lee 등(2018)의 방법을 변형하여 진행되었으며, 균질화된 분말 시료 1 g을 칭량한 후 추출용매(메탄올 : 물 : 포름산=50:45:5, v/v/v) 10 mL와 혼합하여 30분 동안 교반하였다. 3,600 rpm에서 15분 동안 원심분리(Gyrozen Co., Daejeon, Korea)한 후, 해당 상층액을 0.2 μm syringe filter(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 여과하였다. Solid phase extraction(SPE) 과정을 위해 Hypersep C18 카트리지(Thermo Fisher Scientific)에 메탄올 2.5 mL와 물 5 mL를 순차적으로 흘려주어 활성화시킨 후, 희석된 여과액 및 표준물질 6-methoxyflavone(50 ppm) 5 mL를 각각 로딩하였다. 카트리지 내 불순물 제거를 위해 5 mL의 물을 흘려 세척하였으며, 흡착된 이소플라본 성분은 5 mL의 메탄올을 이용하여 용출하였다. 질소 가스로 완전히 농축한 이소플라본 용출물은 0.5 mL의 추출용매로 재용해 하였으며, 0.2 μm syringe filter로 여과한 후 HPLC vial에 담아 UPLC-DAD-QTOF/MS로 분석하였다.

UPLC-DAD-QTOF/MS 분석

개별 이소플라본 유도체를 분리하기 위해 diode array(DAD) detector가 장착된 ACQUITY UPLCTM system(Waters Co., Milford, MA, USA)을 사용하였다. CORTECS UPLC T3(2.1×150 mm I.D., 1.6 μm; Waters, Wexford, Ireland) 분석컬럼 및 CORTECS UPLC T3 VanGuardTM (2.1×50 mm I.D., 1.6 μm; Waters) 보호컬럼이 사용되었으며, 컬럼 오븐의 온도를 30°C로 설정하였다. 검출파장은 210~400 nm(대표 파장, 이소플라본 254 nm) 범위로 지정하였으며, 시료 주입량은 1 μL로 하였다. 이동상 조성은 0.5 % 포름산이 함유된 물을 A, 0.5% 포름산이 함유된 아세토니트릴을 B로 하였으며, 유량은 0.3 mL/min으로 하였다. 이동상 구배 조건은 B를 5%로 시작하여 20분까지 25%, 25분까지 50%, 30분까지 90%로 증가시킨 후 32분까지 2분 동안 유지하였으며, 35분까지 5%로 다시 감소시키고 40분까지 유지하였다. 구조 동정을 위해 Xevo G2-S QTOF-MS(Waters MS Technologies, Manchester, UK) 질량분석기를 사용하였고, positive ion mode로 분석을 수행하였다. 질량분석 조건으로 capillary, sampling cone 및 extraction cone 전압은 각각 3.5 kV, 40 V 및 4.0 V였으며, ion source 및 desolvation 온도는 120 및 500°C로 설정되었다. Desolvation 및 cone 가스는 1,020 및 50 L/h로 흘려주었으며, 질량 스캔 범위는 m/z 100~1,200으로 설정되었다. 검출된 성분은 앞서 구축된 대두 이소플라본 라이브러리(Lee 등, 2020) 및 관련 문헌의 질량 패턴 정보를 참고하여 동정되었으며, 이들의 함량(mg/100 g dry weight)은 SPE 과정에서 투입된 내부표준물질의 면적과 각 성분의 면적을 1:1로 비교하여 산출하였다.

무처리 콩, 증자 콩, 청국장 및 낫또 시료로부터 UPLC-DAD-QTOF/MS를 이용한 고해상도 질량분석 결과와 기존 대두 이소플라본 라이브러리(Lee 등, 2020) 및 이전 문헌에서 제시된(Park 등, 2010; Toda 등, 1999; Yang 등, 2008)발효 콩 연구 자료(질량 이온 및 흡광 패턴, 용출 시간 및 표준품 일치 여부 등)를 비교하여 총 36종의 이소플라본 성분이 분리 및 동정 되었으며, 이들 중 10종이 콩 종자 및 발효 제품에서 신규 화합물로 추정되었다(Table 1). 질량분석에 있어 daidzein(m/z 255) 유도체 13종, genistein(m/z 271) 유도체 17종 및 glycitein(m/z 285) 유도체 6종은 positive ionized MS(m/z, [M+H]+) total ion chromatogram(TIC)에서 각각 아글리콘 기준으로 검출되었다. 분리된 유도체들은 기본적으로 아글리콘의 7-OH 또는 4′-OH 위치에 glucose가 결합한 구조를 가지며(Lee 등, 2020; Yerramsetty 등, 2011; Zhang 등, 2017), 나아가 glucose의 6″-OH 또는 4″-OH 위치에 malonyl, acetyl, succinyl 그룹이 아실화(acylation)되어 있는 구조를 나타냈다(Fig. 1). 또한 배당체 형태의 화합물들은 전체구조로부터 glucose(m/z 162), apiose(m/z 132), malonylglucose(m/z 86+162), acetylglucose(m/z 42+162), succinylglucose(m/z 100+162)가 잘려 나가는 패턴을 나타내며 아실기가 결합 되지 않은 monoglucoside(일배당체), diglucoside(이배당체)와 아실기가 결합된 아실화배당체(acetyl, malonyl 및 succinyl 배당체)로 확인됐다.

Table 1 . Characterization of thirty-six isoflavones from soybean seed and fermented products using UPLC-DAD-QTOF/MS

AglyconesAcylations1)Peak No.Identified isoflavonesλmax (nm)MWFragment ions (m/z)
Daidzein (m/z 255)Non323)daidzein249, 302sh254277, 255
Glu23)daidzein 7-O-glucoside (daidzin)249, 302sh416455, 439, 417, 255
4daidzein 4′-O-glucoside (isodaidzin)250, 301sh416455, 439, 417, 255
Ac-Glu132)daidzein 4′-O-(6″-O-acetyl)glucoside
(6″-O-acetylisodaidzin)
249, 302sh458497, 481, 459, 255
142)daidzein 7-O-(4″-O-acetyl)glucoside
(4″-O-acetyldaidzin)
249, 300sh458497, 481, 459, 255
233)daidzein 7-O-(6″-O-acetyl)glucoside
(6″-O-acetyldaidzin)
249, 302sh458497, 481, 459, 255
Mal-Glu8daidzein 4′-O-(6″-O-malonyl)glucoside
(6″-O-malonylisodaidzin)
257, 301sh502541, 525, 503, 255
10daidzein 7-O-(4″-O-malonyl)glucoside
(4″-O-malonyldaidzin)
249, 304sh502541, 525, 503, 255
153)daidzein 7-O-(6″-O-malonyl)glucoside
(6″-O-malonyldaidzin)
249, 301sh502541, 525, 503, 255
Suc-Glu122)daidzein 4′-O-(4″-O-succinyl)glucoside
(4″-O-succinylisodaidzin)
250, 301sh516555, 539, 517, 255
162)daidzein 4′-O-(6″-O-succinyl)glucoside
(6″-O-succinylisodaidzin)
250, 301sh516555, 539, 517, 255
192)daidzein 7-O-(4″-O-succinyl)glucoside
(4″-O-succinyldaidzin)
256, 306sh516555, 539, 517, 255
20daidzein 7-O-(6″-O-succinyl)glucoside
(6″-O-succinyldaidzin)
250, 301sh516555, 539, 517, 255
Genistein (m/z 271)Non363)genistein260, 329sh270293, 271
Non-Glu1genistein 5-O-glucoside256, 322sh432471, 455, 433, 271
73)genistein 7-O-glucoside (genistin)260, 330sh432471, 455, 433, 271
172)3)genistein 4′-O-glucoside (sophoricoside)258, 326sh432471, 455, 433, 271
Ac-Glu212)genistein 5-O-(6″-O-acetyl)glucoside260, 330sh474513, 497, 475, 271
29genistein 4′-O-(6″-O-acetyl)glucoside
(6″-O-acetylsophoricoside)
260, 330sh474513, 497, 475, 271
312)genistein 7-O-(4″-O-acetyl)glucoside
(4″-O-acetylgenistin)
260, 330sh474513, 497, 475, 271
353)genistein 7-O-(6″-O-acetyl)glucoside
(6″-O-acetylgenistin)
260, 327sh474513, 497, 475, 271
Mal-Glu9genistein 5-O-(6″-O-malonyl)glucoside258, 326sh518557, 541, 519, 271
24genistein 4′-O-(6″-O-malonyl)glucoside
(6″-O-malonylsophoricoside)
260, 331sh518557, 541, 519, 271
25genistein 7-O-(4″-O-malonyl)glucoside
(4″-O-malonylgenistin)
260, 331sh518557, 541, 519, 271
283)genistein 7-O-(6″-O-malonyl)glucoside
(6″-O-malonylgenistin)
260, 327sh518557, 541, 519, 271
Suc-Glu272)genistein 4′-O-(6″-O-succinyl)glucoside
(6″-O-succinylsophoricoside)
260, 329sh532571, 555, 533, 271
302)genistein 7-O-(4″-O-succinyl)glucoside
(4″-O-succinylgenistin)
260, 329sh532571, 555, 533, 271
33genistein 7-O-(6″-O-succinyl)glucoside
(6″-O-succinylgenistin)
260, 330sh532571, 555, 533, 271
Api-Glu5genistein 7-O-(6″-O-apiosyl)glucoside (ambocin)260, 327sh564603, 587, 565, 433, 271
6genistein 7-O-(2″-O-apiosyl)glucoside260, 331sh564603, 587, 565, 433, 271
Glycitein (m/z 285)Non343)glycitein257, 320sh284307, 285
Non-Glu33)glycitein 7-O-glucoside (glycitin)258, 319sh446485, 469, 447, 285, 270
Mal-Glu11glycitein 4′-O-(6″-O-malonyl)glucoside258, 326sh532571, 555, 533, 285, 270
18glycitein 7-O-(6″-O-malonyl)glucoside
(6″-O-malonylglycitin)
258, 320sh532571, 555, 533, 285, 270
Suc-Glu22glycitein 7-O-(6″-O-succinyl)glucoside
(6″-O-succinylglycitin)
258, 320sh546585, 569, 547, 285

1)Non, not acylation; Api, apiose; Glu, glucose; Ac, acetyl; Mal, malonyl; Suc, succinyl.

2)New isoflavones tentatively identified in soybean seed and fermented products.

3)Further confirmed in comparison with authentic standards.


Fig. 1. Chemical structure of 36 isoflavone derivatives depending on position of glucoside or functional groups. (A) daidzein, genistein, glycitein three aglycones, and three genistein 5-O-glucosides. (B) Twenty isoflavone 7-O-glucosides. (C) Ten isoflavone 4′-Oglucosides.

Peak 810은 대두의 주요 성분으로 보고된 peak 15(daidzein 7-O-(6″-O-malonyl)glucoside, 6″-O-malonyldaidzin)와 유사하게 541[M+K]+, 525[M+Na]+, 503[M+H]+, 255[daidzein+H]+의 패턴을 나타냈으며(Lee 등, 2020; Wang과 Sporns, 2000), peak 15 앞에 연속으로 용출되는 유사배당체로 추정되었다(Table 1, Fig. 2, Fig. 3). 유사배당체 간의 구조적 차이에 따른 세부 fragment 특징을 relative abundance(RA, %)를 통해 살펴보면, peak 8, 1015 모두 모분자 m/z 503(RA 100%)을 가지며, m/z 255(daidzein)의 RA는 각각 54%, 63% 및 26%로 peak 8 및 10이 peak 15보다 크게 나타났다. 또한 이들 화합물은 peak 8(Rt, 14.44)< peak 10(Rt, 14.92)< peak 15(Rt, 15.82)의 순서로 용출(retention time, Rt, min)되었으며, 이러한 특징은 Yerramsetty 등(2011)Zhang 등(2017)의 결과와 유사하였다(Fig. 4A). 이를 토대로 peak 8 및 10은 daidzein 4′-O-(6″-O-malonyl)glucoside(6″-O-malonylisodaidzin) 및 daidzein 7-O-(4″-O-malonyl)glucoside(4″-O-malonyldaidzin)인 것으로 추정되었다. 마찬가지로 malonyl genistein 배당체 3종(peak 24, 2528) 및 malonyl glycitein 배당체 2종(peak 11 및 18) 역시 위와 유사한 특징을 나타내었으며(Lee 등, 2020; Yerramsetty 등, 2011), peak 24, 2528은 genistein 4′-O-(6″-Omalonyl) glucoside(6″-O-malonylsophoricoside), genistein 7-O-(4″-O-malonyl)glucoside(4″-O-malonylgenistin) 및 genistein 7-O-(6″-O-malonyl)glucoside(6″-O-malonylgenistin)으로, peak 1118은 glycitein 4′-O-(6″-O-malonyl)glucoside 및 glycitein 7-O-(6″-Omalonyl)glucoside(6″-O-malonylglycitin)로 각각 추정되었다(Table 1).

Fig. 2. HPLC chromatogram of 36 isoflavones (wavelength at 254 nm) from soybean seed (raw) (A), soybean seed (steamed) (B), cheonggukjang powder (C), cheonggukjang (D), and natto (E). Compounds names are presented according to peak number in Table 1. Internal standard (ISTD): 6-methoxyflavone 50 ppm.
Fig. 3. Positive mass fragmentations (m/z, [M+H]+) of acylated isoflavone from the soybean seed and fermented products. (A) 6″-O-malonyldaidzin (m/z 503); (B) 6″-O-malonylgenistin (m/z 519); (C) 6″-O-malnoylglycitin (m/z 533); (D) 6″-O-succinyldaidzin (m/z 517); (E) 6″-O-succinylgenistin (m/z 533); (F) 6″-O-succinylglycitin (m/z 547).
Fig. 4. ESI(+)-QTOF/MSS selected ions of m/z 255 (A, 6″-O-malonyldaidzin and its isomers; B, 6′′-O-succinyldaidzin and its isomers), m/z 2715, 16, 19, 20, 27, 30, and 33 (8: 6″-O-malnoyliso-daidzin, 10: 4″-O-malnoyldaidzin, 15: 6″-O-malnoyldaidzin, 16: 6″-O-succinylisodaidzin, 19: 4″-O-: 6″-O-succinyldaidzin, 27: 6″-O-succinylsophoricoside, 30: 4″-O-succinylgenistin, 33: 6″-O-succinylgenistin).

Acetyl daidzein 배당체로서 peak 13(Rt, 15.54) 및 14(Rt, 15.80)는 peak 23(Rt, 17.77)의 daidzein 7-O-(6″-O-acetyl)glucoside(6″-O-acetyldaidzin)와 유사하게 497[M+K]+, 481[M+Na]+, 459[M+H]+, 255[daidzein+H]+의 패턴을 나타내는 유사배당체로 추정되었다(Table 1, Fig. 2). Daidzein(m/z 255)의 RA를 기준으로 Peak 13(81%) 및 14(100%)는 peak 23(34%)보다 더 크게 생성되어 앞서 제시된 malonyl 배당체(peak 8, 1015)와 유사한 경향을 나타내었다. 따라서 peak 1314는 콩 증자 과정에서 신규 생성되는 daidzein 4′-O-(6″-O-acetyl)glucoside(6″-O-acetylisodaidzin) 및 daidzein 7-O-(4″-O-acetyl)glucoside(4″-O-acetyldaidzin)으로 추정되었다. Acetyl genistein 배당체(peak 2931) 역시 acetyl daidzein 배당체와 유사한 특징을 나타내어 peak 2931을 각각 genistein 4′-O-(6″-O-acetyl)glucoside(6″-O-acetylsophoricoside) 및 genistein 7-O-(4″-O-acetyl)glucoside(4″-O-acetylgenistin)으로 추정하였으며, 특히 4″-O-acetylgenistin은 콩 증자 과정에서 생성된 최초 화합물로 확인되었다.

청국장, 낫또와 같은 콩 발효 제품에서만 확인되는 8종의 화합물(peak 12, 16, 19, 20, 22, 27, 3033)은 모두 모분자 이온에서 succinylglucose(m/z 100+162)가 잘려나가는 패턴을 보였으며, malonylglucose 및 acetylglucose와 마찬가지로 positive ionized MS 패턴에서 탈에스테르화가 일어나지 않는 특징을 가지고 있다(Fig. 3). Toda 등(1999)Yang 등(2008)의 보고에 따르면, 이러한 succinyl배당체들은 기존 daidzin, genistin, glycitin 배당체에 succinic acid가 결합한 구조로서, 6″-O-succinyldaidzin, 6″-O-succinylgenistin 및 6″-O-succinylglycitin 3종만이 발효 과정(청국장 및 낫또) 중 B. subtilisB. natto균주에 의해 새롭게 발생하였으며, NMR 및 MS 구조 해석을 통해 확인되었다. 하지만 본 연구에서는 이들 3종을 포함한 succinyl daidzein 배당체 4종(peak 12, 16, 19, 20), succinyl genistein 배당체 3종(peak 27, 30, 33) 및 succinyl glycitein 배당체 1종(peak 22)이 고해상도 질량분석을 통해 확인되었다.

Succinyl daidzein 배당체 4종(peak 12, 16, 19, 20)은 555[M+K]+, 539[M+Na]+, 517[M+H]+, 255[daizein+H]+의 질량 패턴을 가진 유사배당체로 추정되었다(Fig. 3). 이들 중 주요성분인 daidzein 7-O-(6″-O-succinyl)glucoside(6″-O-succinyldaidzin, peak 20)는 기존의 6″-O-malonylglycitin(peak 18) 및 6″-O-acetyldaidzin(peak 23) 사이에서 용출된다고 보고된 바 있다(Toda 등, 1999; Yang 등, 2008). 또한, Zhang 등(2017)에 따르면, 아글리콘(이소플라본) 7-O-glucose에 유기산이 추가적으로 6″-OH 위치에서 아실화 될 경우 정량적 intensity가 높은 경향을 나타내고 있어 peak 20을 6″-O-succinyldaidzin로 확인할 수 있었다. 6″-O-succinyldaidzin를 포함한 유사배당체 4종은 peak 12(Rt, 15.49)< peak 16(Rt, 15.93)< peak 19(Rt, 16.27)< peak 20(Rt, 16.86)의 순서로 용출되었으며, peak 16, 1920에 대한 m/z 255(daidzein)의 RA는 각각 42%, 100% 및 23%였다(Fig. 4B). 이러한 RA 경향은 앞서 제시된 malonyl daidzein 배당체 3종(peak 8, 10, 15) 및 acetyl daidzein 배당체 3종(peak 13, 14, 23)과 유사하므로 peak 1619는 daidzein 4′-O-(6″-O-succinyl)glucoside(6″-O-succinylisodaidzin) 및 daidzein 7-O-(4″-O-succinyl)glucoside(4″-O-succinyldaidzin)로 추정되었으며, 청국장 및 낫또에서 분리된 최초 화합물로 확인되었다. 또한, 용출 시간에 있어 peak 12(4″-OH) 및 16(6″-OH)의 차이를 peak 19(4″-OH) 및 20(6″-OH)의 차이와 비교하여 신규화합물 peak 12를 daidzein 4′-O-(4″-O-succinyl) glucoside(4″-O-succinylisodaidzin)로 추정할 수 있었다(Table 1).

Succinyl genistein 배당체 3종(peak 27, 30, 33)은 571[M+K]+, 555[M+Na]+, 533[M+H]+, 271[genistein+H]+의 패턴을 나타냈으며(Fig. 3), 이들 중 주요성분인 genistein 7-O-(6″-O-succinyl)glucoside(6″-O-succinylgenistin, peak 33)에 대해 Yang 등(2008)이 제시한 533[succinyl genistin+H]+, 433[genistin+H]+, 271[genistein+ H]+의 질량 패턴과 유사하다. Peak 33은 6″-O-succinyldaidzin(peak 20)과 유사하게 높은 정량적 intensity를 나타내므로 6″-O-succinylgenistin으로 확인되었다. 6″-O-succinylgenistin을 포함한 유사배당체 3종은 peak 27(Rt, 18.80)< peak 30(Rt, 19.36)< peak 33(Rt, 20.05)의 순서로 용출되었으며, m/z 271(genistein)의 RA 기준으로 peak 27(100%) 및 30(69%)은 peak 33(22%)보다 높아(Fig. 4C) genistein 4′-O-(6″-O-succinyl)glucoside(6″-O-succinylsophoricoside) 및 genistein 7-O-(4″-O-succinyl)glucoside(4″-O-succinylgenistin)로 추정되었으며 청국장 및 낫또에서 분리된 최초 화합물로 확인할 수 있었다.

Succinyl glycitein 배당체 peak 22는 585[M+K]+, 569[M+Na]+, 547[M+H]+, 285[glycitein+H]+의 패턴을 나타냈으며(Fig. 3), Toda 등(1999)의 결과와 유사하게 6″-O-succinyldaidzin(peak 20)과 6″-O-acetyldaidzin(peak 23) 사이에 용출되어 glycitein 7-O-(6″-O-succinyl)glucoside(6″-O-succinylglycitin)인 것으로 확인할 수 있었다. Succinyl glycitein 배당체는 다른 아글리콘에 비해 생성된 배당체의 수가 적었는데, 이는 glycitein의 methoxy 그룹으로 인한 구조적 안정성 감소로 열처리 시 가장 영향을 많이 받는다고 보고된 바 있다(Lim 등, 2020). 현재까지 6″-O-succinylglycitin에 대한 연구는 거의 되어있지 않으며, 본 연구에서 처음으로 해당 화합물의 양이온 질량 패턴을 제시하였다(Table 1).

무처리 콩, 증자 콩, 청국장 및 낫또의 이소플라본 조성 및 함량 비교

무처리 콩, 증자 콩, 청국장 및 낫또 시료의 이소플라본 함량(mg/100 g, dry weight)은 294.95~411.93 mg/100 g의 분포를 나타냈으며, 아글리콘(daidzein, genistein, glycitein) 별로 제시되어 있다(Table 2). 무처리 콩의 주요 이소플라본 성분은 malonyl 배당체(peak 8-11, 15, 18, 24, 25, 28)가 대부분을 차지했고(75.9%), 일배당체(peak 1-4, 7, 22.5 %), 아글리콘(peak 32, 34, 36, 1.3%) 및 acetyl 배당체(peak 35, 0.1%) 순으로 확인되었다. 콩을 증자하였을 경우, 무처리 콩과 달리 일배당체(peak 1-4, 7, 17, 72.5%) 및 acetyl 배당체(peak 13, 14, 21, 23, 26, 29, 31, 35, 13.5%) 중심으로 확인되었다. 무처리 콩의 malonyl 배당체는 증자 처리를 한 후 약 7배가 감소하는 반면, 일배당체 및 아글리콘은 약 3배 증가하였으며, acetyl 배당체는 약 130 배로 급격히 증가하였다. 이는 가공과정에서 주요성분인 malonyl 배당체로부터 탈에스테르화를 통해 배당체로 전환되고, 이어 탈당화(de-glycosylation)를 거쳐 아글리콘이 되거나 처음부터 탈카복실화를 통해 acetyl 배당체로 전환될 수 있음을 보여주었다(Grün 등, 2001; Wang과 Sporns, 2000). Huang과 Chou(2008)의 연구에 따르면, 검은콩 종자를 증자(autoclave, 121°C, 15분)하였을 경우, 일배당체(68.9%), malonyl 배당체(19.6%), acetyl 배당체(9.1%) 및 아글리콘(2.4%)의 순으로 확인되었는데 이들의 조성 및 함량은 본 연구 결과와 유사하였다.

Table 2 . The contents of individual isoflavones in soybean seed and fermented products (mg/100 g, dry weight)1)

Peak No.Isoflavone
Soybean seed (raw)2)Soybean seed (steamed)2)Cheonggukjang powder3)Cheonggukjang3)Natto3)
228.35±1.25 105.90±3.04   75.23±0.67 40.95±0.61 97.21±1.30 
41.43±0.100.82±0.021.21±0.010.83±0.010.71±0.09
811.40±0.873.56±0.02NDNDND
100.69±0.690.88±0.040.29±0.001.31±0.01ND
12ND4)ND1.87±0.020.78±0.010.57±0.14
13ND0.98±0.01NDNDND
14ND1.50±0.040.95±0.050.51±0.060.68±0.01
1585.66±2.5412.24±0.582.43±0.0512.16±0.200.17±0.02
16NDND2.87±0.035.41±0.06ND
19NDND0.82±0.010.30±0.01ND
20NDND30.12±0.4615.05±0.1719.68±0.10
23ND16.61±0.362.64±0.020.50±0.018.00±0.09
322.57±0.167.20±0.0628.37±0.3019.38±0.2410.23±0.09
Daidzein derivatives130.10±5.61   149.69±4.17   146.79±1.63   97.18±1.37   137.24±1.82
11.25±0.044.86±0.031.94±0.022.61±0.042.73±0.03
50.23±0.000.24±0.000.85±0.01ND0.80±0.01
60.26±0.000.59±0.030.38±0.36ND3.15±0.02
742.02±3.54177.76±3.08112.43±0.8577.42±0.97128.99±0.92
94.03±0.010.42±0.02NDNDND
17ND0.10±0.021.45±0.010.94±0.011.22±0.02
21ND1.20±0.03NDND1.25±0.02
249.00±0.702.99±0.160.54±0.011.75±0.04ND
251.94±0.131.20±0.060.41±0.002.53±0.03ND
27NDND2.26±0.01ND1.07±0.00
28139.95±13.4620.87±0.845.61±0.0532.36±0.360.31±0.01
29ND2.60±0.21NDNDND
30NDND3.52±0.024.66±0.04ND
31ND2.48±1.210.99±0.010.88±0.011.94±0.00
33NDND35.40±0.1028.43±0.3525.37±0.21
350.47±0.0328.74±1.215.77±0.091.75±0.0215.91±0.06
361.96±0.246.44±0.2523.10±0.1618.55±0.4712.99±0.63
Genistein derivatives201.11±18.15   250.47±6.05   194.65±1.69   171.87±2.35 195.74±1.93   
34.52±1.169.10±0.8913.24±0.1513.03±0.1819.74±0.17
110.54±0.17NDNDNDND
187.89±1.510.82±0.050.50±0.013.43±0.05ND
22NDND4.85±0.045.14±0.052.07±0.01
26ND1.31±0.120.53±0.00ND1.51±0.04
340.07±0.020.53±0.003.32±0.024.31±0.051.84±0.02
Glycitein derivatives13.03±2.8711.76±1.0622.44±0.2225.91±0.3325.16±0.24
Total344.24±21.02    411.93±9.02   363.87±2.53   294.95±3.12   358.14±3.69  

1)All data are calculated as means±SD using internal standard (6-methoxyflavone).

2)Soybean seed samples (raw and steamed) were performed in duplicate.

3)Fermented soybean products were performed in triplicate.

4)ND: Not determined.



청국장(294.95 mg) 및 분말(363.87 mg), 낫또(358.14 mg)의 주요 이소플라본은 배당체(청국장 46.0%, 분말 56.5%, 낫또 70.0%) 및 succinyl 배당체(peak 12, 16, 19, 20, 22, 27, 30, 33, 청국장 20.3%, 분말 22.5%, 낫또 13.6%)였으며(Table 2), Lee 등(2015)이 제시한 배당체의 조성 결과(청국장 79.8% 및 분말 51.4%, 낫또 85.4%)와 유사하였다. 본 연구에서 청국장 분말의 succinyl 배당체 중 succinyl daidzein, succinyl genistein 및 succinyl glycitein 배당체는 각각 총 이소플라본 함량의 9.8%, 11.3% 및 1.3%를 나타냈으며, 특히 6″-O-succinyldaidzin(peak 20, 8.3%) 및 6″-O-succinylgenistin(peak 33, 9.7%)은 주요성분으로 Yang 등(2008)에서 제시된 결과와 유사하였다.

발효 시 미생물의 β-glucosidase는 가수분해 작용으로 일배당체를 아글리콘으로 쉽게 전환시키지만, malonyl 또는 acetyl 배당체는 일배당체와 달리 아글리콘 전환이 어려운 상태에서 미생물의 esterase로 인해 malonyl 또는 acetyl 작용기만 분해되어 일배당체를 형성한다(Lim 등, 2020; Park 등, 2012). Park 등(2010)Toda 등(1999)에 따르면 콩 발효 중 타 미생물 대비 β-glucosidase의 활성이 약한 B. subtilis를 이용하였을 경우, malonyl 또는 acetyl 배당체는 일배당체로 전환된 상태에서 B. subtilis 만 보유하고 있는 특정 효소 succinyltransferase에 의해 succinyl 배당체로 생성될 수 있음을 제시하였다. 실제 B. subtilis를 이용하는 청국장 및 낫또의 경우, 발효시간에 있어 낫또의 12~20 시간 대비 청국장은 2~4일로서 길게 진행되기 때문에(Hu 등, 2010; Jang 등, 2006), 이들의 succinyl 배당체(청국장> 낫또) 및 일배당체(청국장< 낫또) 함량은 발효 가공 방법에 따라 유의적인 차이를 나타내는 것으로 판단되었다. 추후 다양한 조건(미생물, 발효시간, 온도 등)에 따른 콩 발표 식품에 대해 succinyl 배당체를 포함한 정밀한 이소플라본 평가가 필요하다. 또한 기존 이소플라본에 대해서는 항에스트로겐, 항산화, 신경보호, 항암, 항골다공증 및 심혈관계 질환개선 등의 다양한 효능이 보고되어 왔지만(Islam 등, 2020; Ko, 2014; Watanabe 등, 2002; Zaheer와 Akhtar, 2017), succinylated isoflavone의 경우 단지 뼈 건강(Toda 등, 1999), 뇌혈관질환 개선(Bao 등, 2020)의 연구에만 국한되어 있어 향후 다양한 질환을 대상으로 기존 이소플라본과 비교하여 이들의 잠재적 가능성을 밝히는 것이 필요할 것이다.

본 연구에서는 고해상도 질량분석(UPLC-DAD-QTOF/MS)을 이용하여 무처리 및 증자 콩, 시판되고 있는 청국장(분말 포함) 및 낫또 시료로부터 총 36종의 이소플라본 성분이 분리 및 동정 되었으며, 이들 중 10종의 화합물이 최초로 확인되었다(daidzein계 5종, genistein계 5종). 특히 발효 과정(청국장 및 낫또)에서 B. subtilis에 의해 새롭게 발생한 succinyl 배당체들은 기존 daidzin, genistin, glycitin 일배당체에 succinic acid가 결합한 구조로서, daidzein계 4종(신규 3종), genistein계 3종(신규 2종) 및 glycitein계 1종이었으며, 6″-O-succinyldaidzin 및 6″-O-succinylge nistin이 주요성분으로 확인되었다. 무처리 콩, 증자 콩, 청국장 및 낫또 시료의 이소플라본 함량(mg/100 g, 건조 중)은 294.95~411.93 mg/100 g의 분포를 나타냈으며, 이들의 조성에 있어 무처리 콩은 malonyl 배당체(75.9%)> 일배당체> 아글리콘> acetyl 배당체(0.1%)의 순인 반면, 증자콩은 일배당체(72.5%)> acetyl 배당체(13.5%)> malonyl배당체> 아글리콘의 순으로 확인되었다. 청국장 및 분말, 낫또의 이소플라본은 일배당체(청국장 46.0%, 분말 56.5%, 낫또 70.0%) 및 succinyl 배당체(청국장 20.3%, 분말 22.5%, 낫또 13.6%) 위주로 구성되어 있으며, 청국장 분말 기준 6″-O-succinyldaidzin, 6″-O-succinylgenistin 및 6″-O-succinylglycitin이 각각 8.3%, 9.7% 및 1.3%를 차지하였다. 본 연구에서 제시된 이소플라본 조성 및 함량은 청국장, 낫또 등 콩 발효 식품의 기초 자료로 활용될 수 있으며, 특히 발효 과정 중 사용되는 B. subtilis 균주는 succinyl 배당체를 생성하는 데 있어 중요한 역할을 하는 것으로 판단되어 미생물 균주별 발효시간, 온도 등 다양한 조건에 따른succinyl 배당체의 생성 비교 연구도 추가적로 필요할 것이다.

본 연구는 농촌진흥청의 국가연구개발사업(과제번호: PJ01417201) 전문연구원 및 학・연협동과정 지원사업에 의해 수행한 결과의 일부이며 지원에 감사드립니다.

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Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2021; 50(9): 950-961

Published online September 30, 2021 https://doi.org/10.3746/jkfn.2021.50.9.950

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Isoflavone Characterization in Soybean Seed and Fermented Products Based on High-Resolution Mass Spectrometry

Ryeong Ha Kwon , Heon-Woong Kim, Suji Lee, So-Jeong Lee, Hyemin Na, Ju Hyung Kim, Chi-Do Wee, Seon Mi Yoo, and Sang Hoon Lee

National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration

Correspondence to:Sang Hoon Lee, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, 166, Nongsaengmyeongro, Iseo-myeon, Wanju-gun, Jeonbuk 55365, Korea, E-mail: spprigan@korea.kr

Received: June 1, 2021; Revised: July 14, 2021; Accepted: July 29, 2021

This is Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

This study conducted an accurate analysis of isoflavone derivatives, including succinylglucosides, which are identified from fermented soybean products using high-resolution mass spectrometry (UPLC-DAD-QTOF/MS). A total of thirty-six isoflavone components were isolated and identified from soybean seeds (raw and steamed) and commercial fermented products (cheonggukjang, cheonggukjang powder, and natto). Among them, ten novel compounds were tentatively identified for the first time (5 daidzein- and 5 genistein derivatives). In particular, eight succinylglucosides newly generated by Bacillus subtilis during fermentation were structures in which succinic acid was combined with the glucose of the corresponding daidzein (new 3 types), genistein (new 2 types), and glycitein, and among them, 6″-O-succinyldaidzin and 6″-O-succinylgenistin were confirmed as the predominant components. The total isoflavone content (mg/100 g, dry weight) of soybean seeds (raw and steamed), cheonggukjang, and natto ranged from 294.95 to 411.93 mg/100 g. The raw soybean seed was composed of malonylglucosides (75.9%)> monoglucosides> aglycone> acetylglucosides (0.1%), whereas the steamed soybean seed presented as monoglycosides (72.5%)> acetylglucosides (13.5%)> malonylglucosides> aglycones. In addition, cheonggukjang, cheonggukjang powder, and natto mainly contained monoglucosides (46.0%, 56.5%, and 70.0%, respectively) and succinylglucosides (20.3%, 22.5%, and 13.6%, respectively). It is considered that the isoflavone profiles including the additional succinylglucosides can be of fundamental use in applied science related to fermented soybean foods.

Keywords: soybean, fermentation, isoflavone, succinylglucoside, UPLC-DAD-QTOF/MS

서 론

콩(Glycine max L.)은 전 세계에서 많이 이용되는 주요 작물 중 하나로서 콩나물, 두유, 두부 등 식재료와 된장, 미소, 청국장, 낫또, 템페 등 발표 식품의 원재료로 쓰인다(Frankenfeld, 2017; Messina와 Messina, 2010). 이 중 청국장과 낫또는 각각 한국과 일본의 전통적인 콩 발표 식품으로 콩을 침지하여 증자한 후 서로 다른 Bacillus subtilis 균주 및 발효 조건으로 배양시켜 생산한다(Hu 등, 2010; Jang 등, 2006).

콩은 에스트로겐 유사 활성을 나타내는 이소플라본을 중심으로 사포닌, 안토시아닌 등의 다양한 성분을 포함하고 있다(Ha 등, 2009; Kim 등, 2014; Kim 등, 2006; Ko, 2014). 이소플라본 섭취는 세포손상 방어, 지질 과산화 억제 등 항산화 작용과 더불어 갱년기 증상, 심혈관계 질환, 자가 면역질환 등의 질병을 예방할 수 있다(Barnes, 1998; Tham 등, 1998; Zaheer과 Akhtar, 2017).

콩의 주요 isoflavone malonyl 배당체는 열 또는 발효에 의해 탈카복실화(de-carboxylation) 및 탈에스테르화(deesterification)등의 과정을 거쳐 acetyl 배당체, 배당체 및 아글리콘의 형태로 전환되며, 이는 열처리(온도, 시간 등), 발효(미생물, 시간 등)의 가공 조건에 따라 전환되는 정도의 차이가 있다(Huang과 Chou, 2008; Lim 등, 2020; Wang과 Sporns, 2000). 실제로 콩을 볶는 과정 중 아글리콘 및 배당체 함량은 증가하는 반면, malonyl 배당체의 함량은 감소하는 것으로 나타났다(Lee 등, 2013). 또한 BacillusLentinus 균주 발효 과정을 통해 6″-O-succinyl 배당체(6″-O-succinyldaidzin, 6″-O-succinylgenistin 및 6″-O-succinylglycitin)가 새롭게 생성되었으며, 이들 화합물은 청국장 및 낫또와 같은 발효 식품에서 보고된 바 있다(Park 등, 2010; Park 등, 2012; Toda 등, 2000; Yang 등, 2008; Zhang 등, 2015). 난소 호르몬 결핍 쥐 모델에서 6″-O-succinyldaidzin 및 6″-O-succinylgenistin 섭취 시 기존 daidzin 및 genistin과 유사한 수준으로 골밀도가 향상되었으며(Toda 등, 1999), Bao 등(2020)에 따르면 6″-O-succinyldaidzin은 항산화 효소(SOD, GSHPx) 활성을 증가시킬 뿐만 아니라 우수한 신경 보호 효과를 나타내는 것으로 보고되었다. NMR 기반의 6″-O-succinylglucosides 3종이 최초 동정된 후 지금까지 이들에 대해서만 LC 수준으로 함량이 평가되어왔다(Park 등, 2010; Toda 등, 1999; Yang 등, 2008). 6″-O-succinylgenistin 및 6″-O-succinyldaidzin은 이소플라본 총 함량 중 각각 6.6% 및 4.1%를 차지하여 주요 성분임이 확인되었으며, 발효 시작부터 15시간 동안 급격히 증가하다가 27시간 이후 최대농도에 도달했다(Toda 등, 2000; Zhang 등, 2015). 대부분의 이소플라본 연구는 표준물질 확보가 가능한 아글리콘 및 배당체 12종을 대상으로 품종, 재배 조건, 수확시기, 저장기간, 발아 정도 등에 따른 조성 및 함량 평가였으며(Kim 등, 2014; Kim 등, 2005; Lee 등, 2003; Phommalth 등, 2008), 제시된 12종 이외의 succinyl 배당체, acetyl 및 malonyl 배당체 등 콩 발효에 따른 이소플라본의 전반적인 상세 변화 연구는 아직 부족한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 무처리 콩 및 시판 중인 청국장, 낫또 발효 제품으로부터 고해상도 질량분석(UPLC-DADQTOF/MS)을 이용한 전반적인 이소플라본 유도체 동정을 통해 succinyl 배당체, acetyl 배당체 계열의 신규 화합물이 최초로 확인되었으며, 나아가 이들의 조성 및 함량을 평가하여 추후 다양한 발효 산물로부터 이소플라본 유도체를 정밀하게 평가하는데 도움이 되고자 하였다.

재료 및 방법

실험 재료

콩 종자(대원콩) 및 증자 시료(121°C, 15분)는 2019년도에 수확된 것을 이용하였으며 청국장 및 낫또는 종가집, 청국장 가루는 초록마을(Seoul, Korea)에서 시판되는 제품을 구입하였다. 각 시료는 동결건조 및 분말화하여 -70°C에서 냉동보관 후 분석 시료로 사용하였다. 이소플라본 동정 시 참고한 daidzein, genistein, glycitein, daidzin, genistin, glycitin, sophoricoside는 Extrasynthese(Lyon, France)에서, 6″-O-acetyldaidzin, 6″-O-acetylgenistin, 6″-O-malonyldaidzin, 6″-O-malonylgenistin은 Synthose Inc. (Concord, Canada)에서, 6″-O-acetylglycitin은 MedChem Express(Monmouth Junction, NJ, USA)에서 각각 구입하였다. 정량분석에 사용된 내부표준물질 6-methoxyflavone은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 아세토니트릴, 메탄올 및 물(Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)은 모두 MS 등급을 사용하였으며, 포름산은 Junsei Chemical(Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다.

이소플라본 추출물의 제조

이소플라본 추출은 Lee 등(2018)의 방법을 변형하여 진행되었으며, 균질화된 분말 시료 1 g을 칭량한 후 추출용매(메탄올 : 물 : 포름산=50:45:5, v/v/v) 10 mL와 혼합하여 30분 동안 교반하였다. 3,600 rpm에서 15분 동안 원심분리(Gyrozen Co., Daejeon, Korea)한 후, 해당 상층액을 0.2 μm syringe filter(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 여과하였다. Solid phase extraction(SPE) 과정을 위해 Hypersep C18 카트리지(Thermo Fisher Scientific)에 메탄올 2.5 mL와 물 5 mL를 순차적으로 흘려주어 활성화시킨 후, 희석된 여과액 및 표준물질 6-methoxyflavone(50 ppm) 5 mL를 각각 로딩하였다. 카트리지 내 불순물 제거를 위해 5 mL의 물을 흘려 세척하였으며, 흡착된 이소플라본 성분은 5 mL의 메탄올을 이용하여 용출하였다. 질소 가스로 완전히 농축한 이소플라본 용출물은 0.5 mL의 추출용매로 재용해 하였으며, 0.2 μm syringe filter로 여과한 후 HPLC vial에 담아 UPLC-DAD-QTOF/MS로 분석하였다.

UPLC-DAD-QTOF/MS 분석

개별 이소플라본 유도체를 분리하기 위해 diode array(DAD) detector가 장착된 ACQUITY UPLCTM system(Waters Co., Milford, MA, USA)을 사용하였다. CORTECS UPLC T3(2.1×150 mm I.D., 1.6 μm; Waters, Wexford, Ireland) 분석컬럼 및 CORTECS UPLC T3 VanGuardTM (2.1×50 mm I.D., 1.6 μm; Waters) 보호컬럼이 사용되었으며, 컬럼 오븐의 온도를 30°C로 설정하였다. 검출파장은 210~400 nm(대표 파장, 이소플라본 254 nm) 범위로 지정하였으며, 시료 주입량은 1 μL로 하였다. 이동상 조성은 0.5 % 포름산이 함유된 물을 A, 0.5% 포름산이 함유된 아세토니트릴을 B로 하였으며, 유량은 0.3 mL/min으로 하였다. 이동상 구배 조건은 B를 5%로 시작하여 20분까지 25%, 25분까지 50%, 30분까지 90%로 증가시킨 후 32분까지 2분 동안 유지하였으며, 35분까지 5%로 다시 감소시키고 40분까지 유지하였다. 구조 동정을 위해 Xevo G2-S QTOF-MS(Waters MS Technologies, Manchester, UK) 질량분석기를 사용하였고, positive ion mode로 분석을 수행하였다. 질량분석 조건으로 capillary, sampling cone 및 extraction cone 전압은 각각 3.5 kV, 40 V 및 4.0 V였으며, ion source 및 desolvation 온도는 120 및 500°C로 설정되었다. Desolvation 및 cone 가스는 1,020 및 50 L/h로 흘려주었으며, 질량 스캔 범위는 m/z 100~1,200으로 설정되었다. 검출된 성분은 앞서 구축된 대두 이소플라본 라이브러리(Lee 등, 2020) 및 관련 문헌의 질량 패턴 정보를 참고하여 동정되었으며, 이들의 함량(mg/100 g dry weight)은 SPE 과정에서 투입된 내부표준물질의 면적과 각 성분의 면적을 1:1로 비교하여 산출하였다.

결과 및 고찰

무처리 콩, 증자 콩, 청국장 및 낫또 시료로부터 UPLC-DAD-QTOF/MS를 이용한 고해상도 질량분석 결과와 기존 대두 이소플라본 라이브러리(Lee 등, 2020) 및 이전 문헌에서 제시된(Park 등, 2010; Toda 등, 1999; Yang 등, 2008)발효 콩 연구 자료(질량 이온 및 흡광 패턴, 용출 시간 및 표준품 일치 여부 등)를 비교하여 총 36종의 이소플라본 성분이 분리 및 동정 되었으며, 이들 중 10종이 콩 종자 및 발효 제품에서 신규 화합물로 추정되었다(Table 1). 질량분석에 있어 daidzein(m/z 255) 유도체 13종, genistein(m/z 271) 유도체 17종 및 glycitein(m/z 285) 유도체 6종은 positive ionized MS(m/z, [M+H]+) total ion chromatogram(TIC)에서 각각 아글리콘 기준으로 검출되었다. 분리된 유도체들은 기본적으로 아글리콘의 7-OH 또는 4′-OH 위치에 glucose가 결합한 구조를 가지며(Lee 등, 2020; Yerramsetty 등, 2011; Zhang 등, 2017), 나아가 glucose의 6″-OH 또는 4″-OH 위치에 malonyl, acetyl, succinyl 그룹이 아실화(acylation)되어 있는 구조를 나타냈다(Fig. 1). 또한 배당체 형태의 화합물들은 전체구조로부터 glucose(m/z 162), apiose(m/z 132), malonylglucose(m/z 86+162), acetylglucose(m/z 42+162), succinylglucose(m/z 100+162)가 잘려 나가는 패턴을 나타내며 아실기가 결합 되지 않은 monoglucoside(일배당체), diglucoside(이배당체)와 아실기가 결합된 아실화배당체(acetyl, malonyl 및 succinyl 배당체)로 확인됐다.

Table 1 . Characterization of thirty-six isoflavones from soybean seed and fermented products using UPLC-DAD-QTOF/MS.

AglyconesAcylations1)Peak No.Identified isoflavonesλmax (nm)MWFragment ions (m/z)
Daidzein (m/z 255)Non323)daidzein249, 302sh254277, 255
Glu23)daidzein 7-O-glucoside (daidzin)249, 302sh416455, 439, 417, 255
4daidzein 4′-O-glucoside (isodaidzin)250, 301sh416455, 439, 417, 255
Ac-Glu132)daidzein 4′-O-(6″-O-acetyl)glucoside
(6″-O-acetylisodaidzin)
249, 302sh458497, 481, 459, 255
142)daidzein 7-O-(4″-O-acetyl)glucoside
(4″-O-acetyldaidzin)
249, 300sh458497, 481, 459, 255
233)daidzein 7-O-(6″-O-acetyl)glucoside
(6″-O-acetyldaidzin)
249, 302sh458497, 481, 459, 255
Mal-Glu8daidzein 4′-O-(6″-O-malonyl)glucoside
(6″-O-malonylisodaidzin)
257, 301sh502541, 525, 503, 255
10daidzein 7-O-(4″-O-malonyl)glucoside
(4″-O-malonyldaidzin)
249, 304sh502541, 525, 503, 255
153)daidzein 7-O-(6″-O-malonyl)glucoside
(6″-O-malonyldaidzin)
249, 301sh502541, 525, 503, 255
Suc-Glu122)daidzein 4′-O-(4″-O-succinyl)glucoside
(4″-O-succinylisodaidzin)
250, 301sh516555, 539, 517, 255
162)daidzein 4′-O-(6″-O-succinyl)glucoside
(6″-O-succinylisodaidzin)
250, 301sh516555, 539, 517, 255
192)daidzein 7-O-(4″-O-succinyl)glucoside
(4″-O-succinyldaidzin)
256, 306sh516555, 539, 517, 255
20daidzein 7-O-(6″-O-succinyl)glucoside
(6″-O-succinyldaidzin)
250, 301sh516555, 539, 517, 255
Genistein (m/z 271)Non363)genistein260, 329sh270293, 271
Non-Glu1genistein 5-O-glucoside256, 322sh432471, 455, 433, 271
73)genistein 7-O-glucoside (genistin)260, 330sh432471, 455, 433, 271
172)3)genistein 4′-O-glucoside (sophoricoside)258, 326sh432471, 455, 433, 271
Ac-Glu212)genistein 5-O-(6″-O-acetyl)glucoside260, 330sh474513, 497, 475, 271
29genistein 4′-O-(6″-O-acetyl)glucoside
(6″-O-acetylsophoricoside)
260, 330sh474513, 497, 475, 271
312)genistein 7-O-(4″-O-acetyl)glucoside
(4″-O-acetylgenistin)
260, 330sh474513, 497, 475, 271
353)genistein 7-O-(6″-O-acetyl)glucoside
(6″-O-acetylgenistin)
260, 327sh474513, 497, 475, 271
Mal-Glu9genistein 5-O-(6″-O-malonyl)glucoside258, 326sh518557, 541, 519, 271
24genistein 4′-O-(6″-O-malonyl)glucoside
(6″-O-malonylsophoricoside)
260, 331sh518557, 541, 519, 271
25genistein 7-O-(4″-O-malonyl)glucoside
(4″-O-malonylgenistin)
260, 331sh518557, 541, 519, 271
283)genistein 7-O-(6″-O-malonyl)glucoside
(6″-O-malonylgenistin)
260, 327sh518557, 541, 519, 271
Suc-Glu272)genistein 4′-O-(6″-O-succinyl)glucoside
(6″-O-succinylsophoricoside)
260, 329sh532571, 555, 533, 271
302)genistein 7-O-(4″-O-succinyl)glucoside
(4″-O-succinylgenistin)
260, 329sh532571, 555, 533, 271
33genistein 7-O-(6″-O-succinyl)glucoside
(6″-O-succinylgenistin)
260, 330sh532571, 555, 533, 271
Api-Glu5genistein 7-O-(6″-O-apiosyl)glucoside (ambocin)260, 327sh564603, 587, 565, 433, 271
6genistein 7-O-(2″-O-apiosyl)glucoside260, 331sh564603, 587, 565, 433, 271
Glycitein (m/z 285)Non343)glycitein257, 320sh284307, 285
Non-Glu33)glycitein 7-O-glucoside (glycitin)258, 319sh446485, 469, 447, 285, 270
Mal-Glu11glycitein 4′-O-(6″-O-malonyl)glucoside258, 326sh532571, 555, 533, 285, 270
18glycitein 7-O-(6″-O-malonyl)glucoside
(6″-O-malonylglycitin)
258, 320sh532571, 555, 533, 285, 270
Suc-Glu22glycitein 7-O-(6″-O-succinyl)glucoside
(6″-O-succinylglycitin)
258, 320sh546585, 569, 547, 285

1)Non, not acylation; Api, apiose; Glu, glucose; Ac, acetyl; Mal, malonyl; Suc, succinyl..

2)New isoflavones tentatively identified in soybean seed and fermented products..

3)Further confirmed in comparison with authentic standards..


Fig 1. Chemical structure of 36 isoflavone derivatives depending on position of glucoside or functional groups. (A) daidzein, genistein, glycitein three aglycones, and three genistein 5-O-glucosides. (B) Twenty isoflavone 7-O-glucosides. (C) Ten isoflavone 4′-Oglucosides.

Peak 810은 대두의 주요 성분으로 보고된 peak 15(daidzein 7-O-(6″-O-malonyl)glucoside, 6″-O-malonyldaidzin)와 유사하게 541[M+K]+, 525[M+Na]+, 503[M+H]+, 255[daidzein+H]+의 패턴을 나타냈으며(Lee 등, 2020; Wang과 Sporns, 2000), peak 15 앞에 연속으로 용출되는 유사배당체로 추정되었다(Table 1, Fig. 2, Fig. 3). 유사배당체 간의 구조적 차이에 따른 세부 fragment 특징을 relative abundance(RA, %)를 통해 살펴보면, peak 8, 1015 모두 모분자 m/z 503(RA 100%)을 가지며, m/z 255(daidzein)의 RA는 각각 54%, 63% 및 26%로 peak 8 및 10이 peak 15보다 크게 나타났다. 또한 이들 화합물은 peak 8(Rt, 14.44)< peak 10(Rt, 14.92)< peak 15(Rt, 15.82)의 순서로 용출(retention time, Rt, min)되었으며, 이러한 특징은 Yerramsetty 등(2011)Zhang 등(2017)의 결과와 유사하였다(Fig. 4A). 이를 토대로 peak 8 및 10은 daidzein 4′-O-(6″-O-malonyl)glucoside(6″-O-malonylisodaidzin) 및 daidzein 7-O-(4″-O-malonyl)glucoside(4″-O-malonyldaidzin)인 것으로 추정되었다. 마찬가지로 malonyl genistein 배당체 3종(peak 24, 2528) 및 malonyl glycitein 배당체 2종(peak 11 및 18) 역시 위와 유사한 특징을 나타내었으며(Lee 등, 2020; Yerramsetty 등, 2011), peak 24, 2528은 genistein 4′-O-(6″-Omalonyl) glucoside(6″-O-malonylsophoricoside), genistein 7-O-(4″-O-malonyl)glucoside(4″-O-malonylgenistin) 및 genistein 7-O-(6″-O-malonyl)glucoside(6″-O-malonylgenistin)으로, peak 1118은 glycitein 4′-O-(6″-O-malonyl)glucoside 및 glycitein 7-O-(6″-Omalonyl)glucoside(6″-O-malonylglycitin)로 각각 추정되었다(Table 1).

Fig 2. HPLC chromatogram of 36 isoflavones (wavelength at 254 nm) from soybean seed (raw) (A), soybean seed (steamed) (B), cheonggukjang powder (C), cheonggukjang (D), and natto (E). Compounds names are presented according to peak number in Table 1. Internal standard (ISTD): 6-methoxyflavone 50 ppm.
Fig 3. Positive mass fragmentations (m/z, [M+H]+) of acylated isoflavone from the soybean seed and fermented products. (A) 6″-O-malonyldaidzin (m/z 503); (B) 6″-O-malonylgenistin (m/z 519); (C) 6″-O-malnoylglycitin (m/z 533); (D) 6″-O-succinyldaidzin (m/z 517); (E) 6″-O-succinylgenistin (m/z 533); (F) 6″-O-succinylglycitin (m/z 547).
Fig 4. ESI(+)-QTOF/MSS selected ions of m/z 255 (A, 6″-O-malonyldaidzin and its isomers; B, 6′′-O-succinyldaidzin and its isomers), m/z 2715, 16, 19, 20, 27, 30, and 33 (8: 6″-O-malnoyliso-daidzin, 10: 4″-O-malnoyldaidzin, 15: 6″-O-malnoyldaidzin, 16: 6″-O-succinylisodaidzin, 19: 4″-O-: 6″-O-succinyldaidzin, 27: 6″-O-succinylsophoricoside, 30: 4″-O-succinylgenistin, 33: 6″-O-succinylgenistin).

Acetyl daidzein 배당체로서 peak 13(Rt, 15.54) 및 14(Rt, 15.80)는 peak 23(Rt, 17.77)의 daidzein 7-O-(6″-O-acetyl)glucoside(6″-O-acetyldaidzin)와 유사하게 497[M+K]+, 481[M+Na]+, 459[M+H]+, 255[daidzein+H]+의 패턴을 나타내는 유사배당체로 추정되었다(Table 1, Fig. 2). Daidzein(m/z 255)의 RA를 기준으로 Peak 13(81%) 및 14(100%)는 peak 23(34%)보다 더 크게 생성되어 앞서 제시된 malonyl 배당체(peak 8, 1015)와 유사한 경향을 나타내었다. 따라서 peak 1314는 콩 증자 과정에서 신규 생성되는 daidzein 4′-O-(6″-O-acetyl)glucoside(6″-O-acetylisodaidzin) 및 daidzein 7-O-(4″-O-acetyl)glucoside(4″-O-acetyldaidzin)으로 추정되었다. Acetyl genistein 배당체(peak 2931) 역시 acetyl daidzein 배당체와 유사한 특징을 나타내어 peak 2931을 각각 genistein 4′-O-(6″-O-acetyl)glucoside(6″-O-acetylsophoricoside) 및 genistein 7-O-(4″-O-acetyl)glucoside(4″-O-acetylgenistin)으로 추정하였으며, 특히 4″-O-acetylgenistin은 콩 증자 과정에서 생성된 최초 화합물로 확인되었다.

청국장, 낫또와 같은 콩 발효 제품에서만 확인되는 8종의 화합물(peak 12, 16, 19, 20, 22, 27, 3033)은 모두 모분자 이온에서 succinylglucose(m/z 100+162)가 잘려나가는 패턴을 보였으며, malonylglucose 및 acetylglucose와 마찬가지로 positive ionized MS 패턴에서 탈에스테르화가 일어나지 않는 특징을 가지고 있다(Fig. 3). Toda 등(1999)Yang 등(2008)의 보고에 따르면, 이러한 succinyl배당체들은 기존 daidzin, genistin, glycitin 배당체에 succinic acid가 결합한 구조로서, 6″-O-succinyldaidzin, 6″-O-succinylgenistin 및 6″-O-succinylglycitin 3종만이 발효 과정(청국장 및 낫또) 중 B. subtilisB. natto균주에 의해 새롭게 발생하였으며, NMR 및 MS 구조 해석을 통해 확인되었다. 하지만 본 연구에서는 이들 3종을 포함한 succinyl daidzein 배당체 4종(peak 12, 16, 19, 20), succinyl genistein 배당체 3종(peak 27, 30, 33) 및 succinyl glycitein 배당체 1종(peak 22)이 고해상도 질량분석을 통해 확인되었다.

Succinyl daidzein 배당체 4종(peak 12, 16, 19, 20)은 555[M+K]+, 539[M+Na]+, 517[M+H]+, 255[daizein+H]+의 질량 패턴을 가진 유사배당체로 추정되었다(Fig. 3). 이들 중 주요성분인 daidzein 7-O-(6″-O-succinyl)glucoside(6″-O-succinyldaidzin, peak 20)는 기존의 6″-O-malonylglycitin(peak 18) 및 6″-O-acetyldaidzin(peak 23) 사이에서 용출된다고 보고된 바 있다(Toda 등, 1999; Yang 등, 2008). 또한, Zhang 등(2017)에 따르면, 아글리콘(이소플라본) 7-O-glucose에 유기산이 추가적으로 6″-OH 위치에서 아실화 될 경우 정량적 intensity가 높은 경향을 나타내고 있어 peak 20을 6″-O-succinyldaidzin로 확인할 수 있었다. 6″-O-succinyldaidzin를 포함한 유사배당체 4종은 peak 12(Rt, 15.49)< peak 16(Rt, 15.93)< peak 19(Rt, 16.27)< peak 20(Rt, 16.86)의 순서로 용출되었으며, peak 16, 1920에 대한 m/z 255(daidzein)의 RA는 각각 42%, 100% 및 23%였다(Fig. 4B). 이러한 RA 경향은 앞서 제시된 malonyl daidzein 배당체 3종(peak 8, 10, 15) 및 acetyl daidzein 배당체 3종(peak 13, 14, 23)과 유사하므로 peak 1619는 daidzein 4′-O-(6″-O-succinyl)glucoside(6″-O-succinylisodaidzin) 및 daidzein 7-O-(4″-O-succinyl)glucoside(4″-O-succinyldaidzin)로 추정되었으며, 청국장 및 낫또에서 분리된 최초 화합물로 확인되었다. 또한, 용출 시간에 있어 peak 12(4″-OH) 및 16(6″-OH)의 차이를 peak 19(4″-OH) 및 20(6″-OH)의 차이와 비교하여 신규화합물 peak 12를 daidzein 4′-O-(4″-O-succinyl) glucoside(4″-O-succinylisodaidzin)로 추정할 수 있었다(Table 1).

Succinyl genistein 배당체 3종(peak 27, 30, 33)은 571[M+K]+, 555[M+Na]+, 533[M+H]+, 271[genistein+H]+의 패턴을 나타냈으며(Fig. 3), 이들 중 주요성분인 genistein 7-O-(6″-O-succinyl)glucoside(6″-O-succinylgenistin, peak 33)에 대해 Yang 등(2008)이 제시한 533[succinyl genistin+H]+, 433[genistin+H]+, 271[genistein+ H]+의 질량 패턴과 유사하다. Peak 33은 6″-O-succinyldaidzin(peak 20)과 유사하게 높은 정량적 intensity를 나타내므로 6″-O-succinylgenistin으로 확인되었다. 6″-O-succinylgenistin을 포함한 유사배당체 3종은 peak 27(Rt, 18.80)< peak 30(Rt, 19.36)< peak 33(Rt, 20.05)의 순서로 용출되었으며, m/z 271(genistein)의 RA 기준으로 peak 27(100%) 및 30(69%)은 peak 33(22%)보다 높아(Fig. 4C) genistein 4′-O-(6″-O-succinyl)glucoside(6″-O-succinylsophoricoside) 및 genistein 7-O-(4″-O-succinyl)glucoside(4″-O-succinylgenistin)로 추정되었으며 청국장 및 낫또에서 분리된 최초 화합물로 확인할 수 있었다.

Succinyl glycitein 배당체 peak 22는 585[M+K]+, 569[M+Na]+, 547[M+H]+, 285[glycitein+H]+의 패턴을 나타냈으며(Fig. 3), Toda 등(1999)의 결과와 유사하게 6″-O-succinyldaidzin(peak 20)과 6″-O-acetyldaidzin(peak 23) 사이에 용출되어 glycitein 7-O-(6″-O-succinyl)glucoside(6″-O-succinylglycitin)인 것으로 확인할 수 있었다. Succinyl glycitein 배당체는 다른 아글리콘에 비해 생성된 배당체의 수가 적었는데, 이는 glycitein의 methoxy 그룹으로 인한 구조적 안정성 감소로 열처리 시 가장 영향을 많이 받는다고 보고된 바 있다(Lim 등, 2020). 현재까지 6″-O-succinylglycitin에 대한 연구는 거의 되어있지 않으며, 본 연구에서 처음으로 해당 화합물의 양이온 질량 패턴을 제시하였다(Table 1).

무처리 콩, 증자 콩, 청국장 및 낫또의 이소플라본 조성 및 함량 비교

무처리 콩, 증자 콩, 청국장 및 낫또 시료의 이소플라본 함량(mg/100 g, dry weight)은 294.95~411.93 mg/100 g의 분포를 나타냈으며, 아글리콘(daidzein, genistein, glycitein) 별로 제시되어 있다(Table 2). 무처리 콩의 주요 이소플라본 성분은 malonyl 배당체(peak 8-11, 15, 18, 24, 25, 28)가 대부분을 차지했고(75.9%), 일배당체(peak 1-4, 7, 22.5 %), 아글리콘(peak 32, 34, 36, 1.3%) 및 acetyl 배당체(peak 35, 0.1%) 순으로 확인되었다. 콩을 증자하였을 경우, 무처리 콩과 달리 일배당체(peak 1-4, 7, 17, 72.5%) 및 acetyl 배당체(peak 13, 14, 21, 23, 26, 29, 31, 35, 13.5%) 중심으로 확인되었다. 무처리 콩의 malonyl 배당체는 증자 처리를 한 후 약 7배가 감소하는 반면, 일배당체 및 아글리콘은 약 3배 증가하였으며, acetyl 배당체는 약 130 배로 급격히 증가하였다. 이는 가공과정에서 주요성분인 malonyl 배당체로부터 탈에스테르화를 통해 배당체로 전환되고, 이어 탈당화(de-glycosylation)를 거쳐 아글리콘이 되거나 처음부터 탈카복실화를 통해 acetyl 배당체로 전환될 수 있음을 보여주었다(Grün 등, 2001; Wang과 Sporns, 2000). Huang과 Chou(2008)의 연구에 따르면, 검은콩 종자를 증자(autoclave, 121°C, 15분)하였을 경우, 일배당체(68.9%), malonyl 배당체(19.6%), acetyl 배당체(9.1%) 및 아글리콘(2.4%)의 순으로 확인되었는데 이들의 조성 및 함량은 본 연구 결과와 유사하였다.

Table 2 . The contents of individual isoflavones in soybean seed and fermented products (mg/100 g, dry weight)1).

Peak No.Isoflavone
Soybean seed (raw)2)Soybean seed (steamed)2)Cheonggukjang powder3)Cheonggukjang3)Natto3)
228.35±1.25 105.90±3.04   75.23±0.67 40.95±0.61 97.21±1.30 
41.43±0.100.82±0.021.21±0.010.83±0.010.71±0.09
811.40±0.873.56±0.02NDNDND
100.69±0.690.88±0.040.29±0.001.31±0.01ND
12ND4)ND1.87±0.020.78±0.010.57±0.14
13ND0.98±0.01NDNDND
14ND1.50±0.040.95±0.050.51±0.060.68±0.01
1585.66±2.5412.24±0.582.43±0.0512.16±0.200.17±0.02
16NDND2.87±0.035.41±0.06ND
19NDND0.82±0.010.30±0.01ND
20NDND30.12±0.4615.05±0.1719.68±0.10
23ND16.61±0.362.64±0.020.50±0.018.00±0.09
322.57±0.167.20±0.0628.37±0.3019.38±0.2410.23±0.09
Daidzein derivatives130.10±5.61   149.69±4.17   146.79±1.63   97.18±1.37   137.24±1.82
11.25±0.044.86±0.031.94±0.022.61±0.042.73±0.03
50.23±0.000.24±0.000.85±0.01ND0.80±0.01
60.26±0.000.59±0.030.38±0.36ND3.15±0.02
742.02±3.54177.76±3.08112.43±0.8577.42±0.97128.99±0.92
94.03±0.010.42±0.02NDNDND
17ND0.10±0.021.45±0.010.94±0.011.22±0.02
21ND1.20±0.03NDND1.25±0.02
249.00±0.702.99±0.160.54±0.011.75±0.04ND
251.94±0.131.20±0.060.41±0.002.53±0.03ND
27NDND2.26±0.01ND1.07±0.00
28139.95±13.4620.87±0.845.61±0.0532.36±0.360.31±0.01
29ND2.60±0.21NDNDND
30NDND3.52±0.024.66±0.04ND
31ND2.48±1.210.99±0.010.88±0.011.94±0.00
33NDND35.40±0.1028.43±0.3525.37±0.21
350.47±0.0328.74±1.215.77±0.091.75±0.0215.91±0.06
361.96±0.246.44±0.2523.10±0.1618.55±0.4712.99±0.63
Genistein derivatives201.11±18.15   250.47±6.05   194.65±1.69   171.87±2.35 195.74±1.93   
34.52±1.169.10±0.8913.24±0.1513.03±0.1819.74±0.17
110.54±0.17NDNDNDND
187.89±1.510.82±0.050.50±0.013.43±0.05ND
22NDND4.85±0.045.14±0.052.07±0.01
26ND1.31±0.120.53±0.00ND1.51±0.04
340.07±0.020.53±0.003.32±0.024.31±0.051.84±0.02
Glycitein derivatives13.03±2.8711.76±1.0622.44±0.2225.91±0.3325.16±0.24
Total344.24±21.02    411.93±9.02   363.87±2.53   294.95±3.12   358.14±3.69  

1)All data are calculated as means±SD using internal standard (6-methoxyflavone)..

2)Soybean seed samples (raw and steamed) were performed in duplicate..

3)Fermented soybean products were performed in triplicate..

4)ND: Not determined..



청국장(294.95 mg) 및 분말(363.87 mg), 낫또(358.14 mg)의 주요 이소플라본은 배당체(청국장 46.0%, 분말 56.5%, 낫또 70.0%) 및 succinyl 배당체(peak 12, 16, 19, 20, 22, 27, 30, 33, 청국장 20.3%, 분말 22.5%, 낫또 13.6%)였으며(Table 2), Lee 등(2015)이 제시한 배당체의 조성 결과(청국장 79.8% 및 분말 51.4%, 낫또 85.4%)와 유사하였다. 본 연구에서 청국장 분말의 succinyl 배당체 중 succinyl daidzein, succinyl genistein 및 succinyl glycitein 배당체는 각각 총 이소플라본 함량의 9.8%, 11.3% 및 1.3%를 나타냈으며, 특히 6″-O-succinyldaidzin(peak 20, 8.3%) 및 6″-O-succinylgenistin(peak 33, 9.7%)은 주요성분으로 Yang 등(2008)에서 제시된 결과와 유사하였다.

발효 시 미생물의 β-glucosidase는 가수분해 작용으로 일배당체를 아글리콘으로 쉽게 전환시키지만, malonyl 또는 acetyl 배당체는 일배당체와 달리 아글리콘 전환이 어려운 상태에서 미생물의 esterase로 인해 malonyl 또는 acetyl 작용기만 분해되어 일배당체를 형성한다(Lim 등, 2020; Park 등, 2012). Park 등(2010)Toda 등(1999)에 따르면 콩 발효 중 타 미생물 대비 β-glucosidase의 활성이 약한 B. subtilis를 이용하였을 경우, malonyl 또는 acetyl 배당체는 일배당체로 전환된 상태에서 B. subtilis 만 보유하고 있는 특정 효소 succinyltransferase에 의해 succinyl 배당체로 생성될 수 있음을 제시하였다. 실제 B. subtilis를 이용하는 청국장 및 낫또의 경우, 발효시간에 있어 낫또의 12~20 시간 대비 청국장은 2~4일로서 길게 진행되기 때문에(Hu 등, 2010; Jang 등, 2006), 이들의 succinyl 배당체(청국장> 낫또) 및 일배당체(청국장< 낫또) 함량은 발효 가공 방법에 따라 유의적인 차이를 나타내는 것으로 판단되었다. 추후 다양한 조건(미생물, 발효시간, 온도 등)에 따른 콩 발표 식품에 대해 succinyl 배당체를 포함한 정밀한 이소플라본 평가가 필요하다. 또한 기존 이소플라본에 대해서는 항에스트로겐, 항산화, 신경보호, 항암, 항골다공증 및 심혈관계 질환개선 등의 다양한 효능이 보고되어 왔지만(Islam 등, 2020; Ko, 2014; Watanabe 등, 2002; Zaheer와 Akhtar, 2017), succinylated isoflavone의 경우 단지 뼈 건강(Toda 등, 1999), 뇌혈관질환 개선(Bao 등, 2020)의 연구에만 국한되어 있어 향후 다양한 질환을 대상으로 기존 이소플라본과 비교하여 이들의 잠재적 가능성을 밝히는 것이 필요할 것이다.

요 약

본 연구에서는 고해상도 질량분석(UPLC-DAD-QTOF/MS)을 이용하여 무처리 및 증자 콩, 시판되고 있는 청국장(분말 포함) 및 낫또 시료로부터 총 36종의 이소플라본 성분이 분리 및 동정 되었으며, 이들 중 10종의 화합물이 최초로 확인되었다(daidzein계 5종, genistein계 5종). 특히 발효 과정(청국장 및 낫또)에서 B. subtilis에 의해 새롭게 발생한 succinyl 배당체들은 기존 daidzin, genistin, glycitin 일배당체에 succinic acid가 결합한 구조로서, daidzein계 4종(신규 3종), genistein계 3종(신규 2종) 및 glycitein계 1종이었으며, 6″-O-succinyldaidzin 및 6″-O-succinylge nistin이 주요성분으로 확인되었다. 무처리 콩, 증자 콩, 청국장 및 낫또 시료의 이소플라본 함량(mg/100 g, 건조 중)은 294.95~411.93 mg/100 g의 분포를 나타냈으며, 이들의 조성에 있어 무처리 콩은 malonyl 배당체(75.9%)> 일배당체> 아글리콘> acetyl 배당체(0.1%)의 순인 반면, 증자콩은 일배당체(72.5%)> acetyl 배당체(13.5%)> malonyl배당체> 아글리콘의 순으로 확인되었다. 청국장 및 분말, 낫또의 이소플라본은 일배당체(청국장 46.0%, 분말 56.5%, 낫또 70.0%) 및 succinyl 배당체(청국장 20.3%, 분말 22.5%, 낫또 13.6%) 위주로 구성되어 있으며, 청국장 분말 기준 6″-O-succinyldaidzin, 6″-O-succinylgenistin 및 6″-O-succinylglycitin이 각각 8.3%, 9.7% 및 1.3%를 차지하였다. 본 연구에서 제시된 이소플라본 조성 및 함량은 청국장, 낫또 등 콩 발효 식품의 기초 자료로 활용될 수 있으며, 특히 발효 과정 중 사용되는 B. subtilis 균주는 succinyl 배당체를 생성하는 데 있어 중요한 역할을 하는 것으로 판단되어 미생물 균주별 발효시간, 온도 등 다양한 조건에 따른succinyl 배당체의 생성 비교 연구도 추가적로 필요할 것이다.

감사의 글

본 연구는 농촌진흥청의 국가연구개발사업(과제번호: PJ01417201) 전문연구원 및 학・연협동과정 지원사업에 의해 수행한 결과의 일부이며 지원에 감사드립니다.

Fig 1.

Fig 1.Chemical structure of 36 isoflavone derivatives depending on position of glucoside or functional groups. (A) daidzein, genistein, glycitein three aglycones, and three genistein 5-O-glucosides. (B) Twenty isoflavone 7-O-glucosides. (C) Ten isoflavone 4′-Oglucosides.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2021; 50: 950-961https://doi.org/10.3746/jkfn.2021.50.9.950

Fig 2.

Fig 2.HPLC chromatogram of 36 isoflavones (wavelength at 254 nm) from soybean seed (raw) (A), soybean seed (steamed) (B), cheonggukjang powder (C), cheonggukjang (D), and natto (E). Compounds names are presented according to peak number in Table 1. Internal standard (ISTD): 6-methoxyflavone 50 ppm.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2021; 50: 950-961https://doi.org/10.3746/jkfn.2021.50.9.950

Fig 3.

Fig 3.Positive mass fragmentations (m/z, [M+H]+) of acylated isoflavone from the soybean seed and fermented products. (A) 6″-O-malonyldaidzin (m/z 503); (B) 6″-O-malonylgenistin (m/z 519); (C) 6″-O-malnoylglycitin (m/z 533); (D) 6″-O-succinyldaidzin (m/z 517); (E) 6″-O-succinylgenistin (m/z 533); (F) 6″-O-succinylglycitin (m/z 547).
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Fig 4.

Fig 4.ESI(+)-QTOF/MSS selected ions of m/z 255 (A, 6″-O-malonyldaidzin and its isomers; B, 6′′-O-succinyldaidzin and its isomers), m/z 2715, 16, 19, 20, 27, 30, and 33 (8: 6″-O-malnoyliso-daidzin, 10: 4″-O-malnoyldaidzin, 15: 6″-O-malnoyldaidzin, 16: 6″-O-succinylisodaidzin, 19: 4″-O-: 6″-O-succinyldaidzin, 27: 6″-O-succinylsophoricoside, 30: 4″-O-succinylgenistin, 33: 6″-O-succinylgenistin).
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Table 1 . Characterization of thirty-six isoflavones from soybean seed and fermented products using UPLC-DAD-QTOF/MS.

AglyconesAcylations1)Peak No.Identified isoflavonesλmax (nm)MWFragment ions (m/z)
Daidzein (m/z 255)Non323)daidzein249, 302sh254277, 255
Glu23)daidzein 7-O-glucoside (daidzin)249, 302sh416455, 439, 417, 255
4daidzein 4′-O-glucoside (isodaidzin)250, 301sh416455, 439, 417, 255
Ac-Glu132)daidzein 4′-O-(6″-O-acetyl)glucoside
(6″-O-acetylisodaidzin)
249, 302sh458497, 481, 459, 255
142)daidzein 7-O-(4″-O-acetyl)glucoside
(4″-O-acetyldaidzin)
249, 300sh458497, 481, 459, 255
233)daidzein 7-O-(6″-O-acetyl)glucoside
(6″-O-acetyldaidzin)
249, 302sh458497, 481, 459, 255
Mal-Glu8daidzein 4′-O-(6″-O-malonyl)glucoside
(6″-O-malonylisodaidzin)
257, 301sh502541, 525, 503, 255
10daidzein 7-O-(4″-O-malonyl)glucoside
(4″-O-malonyldaidzin)
249, 304sh502541, 525, 503, 255
153)daidzein 7-O-(6″-O-malonyl)glucoside
(6″-O-malonyldaidzin)
249, 301sh502541, 525, 503, 255
Suc-Glu122)daidzein 4′-O-(4″-O-succinyl)glucoside
(4″-O-succinylisodaidzin)
250, 301sh516555, 539, 517, 255
162)daidzein 4′-O-(6″-O-succinyl)glucoside
(6″-O-succinylisodaidzin)
250, 301sh516555, 539, 517, 255
192)daidzein 7-O-(4″-O-succinyl)glucoside
(4″-O-succinyldaidzin)
256, 306sh516555, 539, 517, 255
20daidzein 7-O-(6″-O-succinyl)glucoside
(6″-O-succinyldaidzin)
250, 301sh516555, 539, 517, 255
Genistein (m/z 271)Non363)genistein260, 329sh270293, 271
Non-Glu1genistein 5-O-glucoside256, 322sh432471, 455, 433, 271
73)genistein 7-O-glucoside (genistin)260, 330sh432471, 455, 433, 271
172)3)genistein 4′-O-glucoside (sophoricoside)258, 326sh432471, 455, 433, 271
Ac-Glu212)genistein 5-O-(6″-O-acetyl)glucoside260, 330sh474513, 497, 475, 271
29genistein 4′-O-(6″-O-acetyl)glucoside
(6″-O-acetylsophoricoside)
260, 330sh474513, 497, 475, 271
312)genistein 7-O-(4″-O-acetyl)glucoside
(4″-O-acetylgenistin)
260, 330sh474513, 497, 475, 271
353)genistein 7-O-(6″-O-acetyl)glucoside
(6″-O-acetylgenistin)
260, 327sh474513, 497, 475, 271
Mal-Glu9genistein 5-O-(6″-O-malonyl)glucoside258, 326sh518557, 541, 519, 271
24genistein 4′-O-(6″-O-malonyl)glucoside
(6″-O-malonylsophoricoside)
260, 331sh518557, 541, 519, 271
25genistein 7-O-(4″-O-malonyl)glucoside
(4″-O-malonylgenistin)
260, 331sh518557, 541, 519, 271
283)genistein 7-O-(6″-O-malonyl)glucoside
(6″-O-malonylgenistin)
260, 327sh518557, 541, 519, 271
Suc-Glu272)genistein 4′-O-(6″-O-succinyl)glucoside
(6″-O-succinylsophoricoside)
260, 329sh532571, 555, 533, 271
302)genistein 7-O-(4″-O-succinyl)glucoside
(4″-O-succinylgenistin)
260, 329sh532571, 555, 533, 271
33genistein 7-O-(6″-O-succinyl)glucoside
(6″-O-succinylgenistin)
260, 330sh532571, 555, 533, 271
Api-Glu5genistein 7-O-(6″-O-apiosyl)glucoside (ambocin)260, 327sh564603, 587, 565, 433, 271
6genistein 7-O-(2″-O-apiosyl)glucoside260, 331sh564603, 587, 565, 433, 271
Glycitein (m/z 285)Non343)glycitein257, 320sh284307, 285
Non-Glu33)glycitein 7-O-glucoside (glycitin)258, 319sh446485, 469, 447, 285, 270
Mal-Glu11glycitein 4′-O-(6″-O-malonyl)glucoside258, 326sh532571, 555, 533, 285, 270
18glycitein 7-O-(6″-O-malonyl)glucoside
(6″-O-malonylglycitin)
258, 320sh532571, 555, 533, 285, 270
Suc-Glu22glycitein 7-O-(6″-O-succinyl)glucoside
(6″-O-succinylglycitin)
258, 320sh546585, 569, 547, 285

1)Non, not acylation; Api, apiose; Glu, glucose; Ac, acetyl; Mal, malonyl; Suc, succinyl..

2)New isoflavones tentatively identified in soybean seed and fermented products..

3)Further confirmed in comparison with authentic standards..


Table 2 . The contents of individual isoflavones in soybean seed and fermented products (mg/100 g, dry weight)1).

Peak No.Isoflavone
Soybean seed (raw)2)Soybean seed (steamed)2)Cheonggukjang powder3)Cheonggukjang3)Natto3)
228.35±1.25 105.90±3.04   75.23±0.67 40.95±0.61 97.21±1.30 
41.43±0.100.82±0.021.21±0.010.83±0.010.71±0.09
811.40±0.873.56±0.02NDNDND
100.69±0.690.88±0.040.29±0.001.31±0.01ND
12ND4)ND1.87±0.020.78±0.010.57±0.14
13ND0.98±0.01NDNDND
14ND1.50±0.040.95±0.050.51±0.060.68±0.01
1585.66±2.5412.24±0.582.43±0.0512.16±0.200.17±0.02
16NDND2.87±0.035.41±0.06ND
19NDND0.82±0.010.30±0.01ND
20NDND30.12±0.4615.05±0.1719.68±0.10
23ND16.61±0.362.64±0.020.50±0.018.00±0.09
322.57±0.167.20±0.0628.37±0.3019.38±0.2410.23±0.09
Daidzein derivatives130.10±5.61   149.69±4.17   146.79±1.63   97.18±1.37   137.24±1.82
11.25±0.044.86±0.031.94±0.022.61±0.042.73±0.03
50.23±0.000.24±0.000.85±0.01ND0.80±0.01
60.26±0.000.59±0.030.38±0.36ND3.15±0.02
742.02±3.54177.76±3.08112.43±0.8577.42±0.97128.99±0.92
94.03±0.010.42±0.02NDNDND
17ND0.10±0.021.45±0.010.94±0.011.22±0.02
21ND1.20±0.03NDND1.25±0.02
249.00±0.702.99±0.160.54±0.011.75±0.04ND
251.94±0.131.20±0.060.41±0.002.53±0.03ND
27NDND2.26±0.01ND1.07±0.00
28139.95±13.4620.87±0.845.61±0.0532.36±0.360.31±0.01
29ND2.60±0.21NDNDND
30NDND3.52±0.024.66±0.04ND
31ND2.48±1.210.99±0.010.88±0.011.94±0.00
33NDND35.40±0.1028.43±0.3525.37±0.21
350.47±0.0328.74±1.215.77±0.091.75±0.0215.91±0.06
361.96±0.246.44±0.2523.10±0.1618.55±0.4712.99±0.63
Genistein derivatives201.11±18.15   250.47±6.05   194.65±1.69   171.87±2.35 195.74±1.93   
34.52±1.169.10±0.8913.24±0.1513.03±0.1819.74±0.17
110.54±0.17NDNDNDND
187.89±1.510.82±0.050.50±0.013.43±0.05ND
22NDND4.85±0.045.14±0.052.07±0.01
26ND1.31±0.120.53±0.00ND1.51±0.04
340.07±0.020.53±0.003.32±0.024.31±0.051.84±0.02
Glycitein derivatives13.03±2.8711.76±1.0622.44±0.2225.91±0.3325.16±0.24
Total344.24±21.02    411.93±9.02   363.87±2.53   294.95±3.12   358.14±3.69  

1)All data are calculated as means±SD using internal standard (6-methoxyflavone)..

2)Soybean seed samples (raw and steamed) were performed in duplicate..

3)Fermented soybean products were performed in triplicate..

4)ND: Not determined..


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