간은 에너지대사와 내인성, 외인성 물질에 대한 해독 작용을 수행하는 기관으로 간손상은 알코올, 바이러스에 의한 감염, 약물의 오남용, 산화 자극에 의한 활성산소(reactive oxygen species, ROS) 생성 등 여러 가지 원인에 의해 생길 수 있다(Lee 등, 2018; Cichoż-Lach와 Michalak, 2014). 특히 과잉 생성된 ROS는 표적이 될 수 있는 단백질과 핵산 등을 손상시키고, 생체막의 구성성분인 불포화지방산을 과산화하여 체내 과산화지질의 축적을 증가시켜 간손상뿐만 아니라 피부 노화, 동맥경화, 뇌졸중, 당뇨병, 종양 생성과 같은 다양한 질환을 유발한다고 보고되고 있다(Gupta 등, 2014).

과산화지질의 체내 축적을 억제하기 위해 간세포를 포함한 생체 내 세포는 방어기전으로 superoxide dismutase (SOD), catalase(CAT)와 같은 효소계 산화 방어기전을 가지고 있다. 이는 세포막뿐만 아니라 세포 내 여러 부분에서도 특이적으로 작용하여 조직의 과산화를 억제한다(Vardi 등, 2008; Yoon 등, 2012). 생성된 활성산소는 항산화제를 통해 제거되는데 비타민 C, 비타민 E, β-카로틴, 플라보노이드 등이 대표적인 항산화제 물질로 알려져 있다(Gupta와 Sharma, 2006). 이러한 천연 항산화제뿐만 아니라 생체 내 활성산소 발생을 억제하기 위해 다양한 합성 항산화제가 개발되었으나, 간독성 등의 부작용 문제가 제기되어(Bondi 등, 2017) 안전한 천연 항산화제 개발의 필요성이 지속해서 요구되고 있다.

개양귀비(Papaver rhoeas L.)는 양귀비목 양귀비과 양귀비속의 두해살이풀로 일반적으로 관상용으로 이용되고 있으며 마약 성분이 없는 안전한 식물로 알려져 있다. 개양귀비는 유럽, 북아프리카 및 서아시아의 여러 지역에서 야생적으로 발견되며(Kati 등, 2013), 예전부터 설사와 복통, 심한 기침 등에 효능이 있어 민간요법이나 한약재로 사용되고 있다(Soulimani 등, 2001). 게다가 개양귀비의 어린잎은 샐러드, 꽃잎으로는 술이나 시럽을 만들고 씨는 기름을 짜는 데 사용하는 등 식용으로도 사용된다(Mitich, 2000; Schaffer 등, 2005). 식물 화학적 연구에 따르면 개양귀비 잎에는 퀘르세틴(quercetin), 켐페롤(kaempferol), 미리세틴(myricetin)과 같은 플라보노이드와 칼륨, 나트륨, 칼슘과 같은 미네랄을 포함한다고 알려져 있다(Kostic 등, 2010; Trichopoulou 등, 2000). 또한, 최근의 연구에서는 개양귀비의 잎에서 의약 소재로 활용 가능한 켈리도닌(chelidonine), 프로토핀(protopine), 크립토핀(cryptopine) 등이 확인되기도 하였으나(Oh 등, 2018; Grauso 등, 2020) 현재 우리나라의 경우 개양귀비는 대부분 화훼용으로 사용되어 식·의약 소재로서의 활용 가능한 연구가 미미한 실정이다.

이에 본 연구에서는 2종의 개양귀비(분홍색 꽃이 피는 개양귀비와 빨간색 꽃이 피는 개양귀비)를 이용한 항산화 활성 및 간세포 보호효과를 확인하고자 하였다. 각 부위에 따른 차이를 확인하기 위해 2종의 개양귀비는 전초, 잎 그리고 열매로 분리하여 50% 에탄올로 추출하였다. 이 추출물들을 이용하여 라디칼 소거 활성과 hydrogen peroxide(H₂O₂)를 처리한 인간 간암세포주인 HepG2 세포에서 산화 자극에 대한 세포 보호효과를 분석하여 기능성식품 소재로서의 활용 가능성을 알아보고자 하였다.

재료

본 연구에 사용된 개양귀비(Papaver rhoeas L.)는 국립원예특작과학원 인삼특작부(Eumseong, Korea)에서 재배한 것을 개화시기에 맞춰 채취하고 시료로 사용하였다. 분홍색 꽃이 피는 개양귀비와 빨간색 꽃이 피는 개양귀비를 각각 전초, 잎, 열매로 나누어 활성을 평가하였다. Folin-Ciocalteu, sodium carbonate(Na2CO3), aluminum trichloride (AlCl3), gallic acid, quercetin, ascorbic acid, potassium acetate(CH₃COOK), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2′-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS), hydrogen peroxide(H₂O₂), 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구매하여 사용하였다.

추출물 제조

2종의 개양귀비는 수세하고 동결건조(PVTFD 10R, Ilsin, Yangju, Korea)하여 균일하게 분쇄 후 사용하였다. 시료 50 g에 중량 대비 20배의 50% 발효주정을 가하여 실온에서 160 rpm으로 19시간 동안 교반 추출하였다. 추출물은 감압 여과하고 34°C에서 감압농축(N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)한 후 동결건조하여 -20°C에서 보관하면서 시료로 사용하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 방법을 변형하여 측정하였다(Kim 등, 2019). 개양귀비 추출물 100 µL에 10% Folin-Ciocalteu 용액 200 μL를 가하고 실온에서 5분간 반응시켰다. 700 mM Na2CO3 용액 800 μL를 가하고 잘 혼합한 후 200 μL씩 96 well plate에 옮겨 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 표준물질로 사용하여 총 폴리페놀 함량을 산출하였고, gallic acid equivalents(mg GAE/g freeze-dried extract)로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량은 AlCl3 용액을 이용한 Kim 등(2019)의 방법을 변형하여 측정하였다. 개양귀비 추출물 100 μL에 10% AlCl3 용액 5 μL와 1 M CH₃COOK 용액 5 μL를 가하여 혼합하였다. 증류수 140 μL를 가하고 실온에서 30분간 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin을 표준물질로 사용하여 총 플라보노이드 함량을 계산하였고, quercetin equivalents(mg CE/g freeze-dried extract)로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거능

DPPH 라디칼 소거 활성 측정은 Blois 방법을 변형하여 측정하였다(Kim 등, 2019). 개양귀비 추출물 40 μL에 0.2 mM DPPH 용액 160 μL를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼 소거 활성은 시료 무첨가군에 대한 시료 첨가군의 흡광도 비로 계산하여 백분율(%)로 나타내었다. 양성대조군으로 L-ascorbic acid를 사용하여 개양귀비 추출물의 라디칼 소거 활성을 비교 평가하였다.

ABTS 라디칼 소거능

ABTS 라디칼 소거 활성은 Re 등(1999)의 방법을 변형하여 측정하였다(Kim 등, 2018). 7.4 mM ABTS 용액과 2.6 mM potassium persulfate 용액을 섞어 빛을 차단한 상태로 16시간 반응시켜 라디칼을 형성시켰다. 실험 직전 ABTS 라디칼 용액은 734 nm에서 흡광도 값이 1.0±0.05가 될 때까지 증류수로 희석하였다. 희석된 ABTS 용액 150 μL에 시료 50 μL를 혼합하고 실온에서 15분 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼 소거 활성은 시료 무첨가군에 대한 시료 첨가군의 흡광도 비로 계산하여 백분율(%)로 나타내었다. 양성대조군으로 L-ascorbic acid를 사용하여 개양귀비 추출물의 라디칼 소거 활성을 비교 평가하였다.

세포 배양

본 실험에 사용된 인간 간암세포주인 HepG2 세포는 한국세포주은행(KCLB; Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. 세포는 10% fatal bovine serum(FBS; Gibco, Waltham, MA, USA)과 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin(Invitrogen, Waltham, MA, USA)을 첨가한 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM; HyClone, Logan, UT, USA) 배지를 사용하여 5% CO₂가 공급되는 incubator에서 37°C로 배양하였다. 세포 밀도가 80% 이상으로 포화되었을 때 trypsin-EDTA(Invitrogen)를 처리하여 계대배양하며 실험에 사용하였다.

세포 생존율

세포 생존율은 Ez-Cytox cell viability assay kit(DAEIL Lab, Seoul, Korea)을 사용하였으며, 제조사에서 권장하는 실험 방법에 따라 측정하였다. HepG2 세포를 96 well plate에 최종농도 1×10⁵ cells/mL가 되도록 분주한 뒤 24시간 배양하였다. 개양귀비 추출물을 처리하고 1시간 후 1 mM H₂O₂를 처리하여 24시간 배양하였다. 반응 종료 후 Ez-Cytox 시약 20 μL를 넣어 4시간 반응시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 내 활성산소종(ROS) 소거 활성

세포 내 ROS는 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) 방법을 이용하여 측정하였다. 96 well black plate에 최종농도 1×10⁵ cells/mL가 되도록 분주한 뒤 24시간 배양하였다. 개양귀비 추출물을 처리하여 미리 1시간 배양하고 1 mM H₂O₂를 처리하여 산화 자극 후 30분 배양하였다. 배양 종료 후 phosphate buffered saline(PBS; Gibco, Paisley, Scotland, UK)로 3회 세척하고, 10 μM DCFH-DA 용액을 처리하여 15분 반응시켰다. 반응 종료 후 PBS로 3회 세척한 세포는 형광현미경(Leica, Wetzlar, Germany) 및 fluorescence microplate reader(Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 excitation 510 nm, emission 560 nm에서 형광도를 측정하였다.

항산화 효소 활성

항산화 지표 효소인 SOD, CAT를 대상으로 활성을 측정하였다. HepG2 세포를 96 well plate에 최종농도 1×10⁵ cells/mL가 되도록 분주한 뒤 24시간 배양하였다. 개양귀비 추출물을 처리하고 1시간 후 1 mM H₂O₂를 처리하여 24시간 배양한 세포는 수거하여 enzyme assay kit(BioVision Inc., Milpitas, MA, USA)을 사용하였으며 제조사에서 권장하는 실험 방법에 따라 측정하였다. SOD 활성을 측정하기 위해 수거된 세포를 lysis buffer(BioVision Inc.)로 용해한 후 원심분리(14,000×g, 5 min, 4°C)하고 상층액을 회수하여 효소 활성 평가를 위한 시료로 사용하였다. 96 well plate에 20 μL 시료, WST working solution 200 μL, dilution buffer 20 μL, enzyme working solution 20 μL를 넣고 37°C에서 20분 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. CAT 활성을 측정하기 위해 수거된 세포에 assay buffer로 용해한 후 원심분리(10,000×g, 15 min, 4°C)하고 상층액을 회수하여 효소 활성평가를 위한 시료로 사용하였다. 96 well plate에 60 μL 시료, assay buffer 18 μL, catalase reaction solution 12 μL를 넣고 25°C에서 30분 반응시킨 후, 10 μL stop solution을 넣어 반응을 종료시켰다. 용액에 developer mix 50 μL를 넣고 25°C에서 10분 반응시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계처리

모든 실험은 3회 이상 반복하여 평균±표준편차로 나타내었고, 실험으로부터 얻은 결과는 SPSS 통계프로그램(Statistical Package for the Social Science, ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 통계처리 하였다. 통계적 유의성 검정은 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance) 후 P<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test를 수행하였고, Student’s t-test로 P<0.05, P<0.01 수준에서 비교하였다.

추출수율, 총 플라보노이드, 총 폴리페놀 함량

개양귀비 부위별 건조 분말 시료를 50% 발효주정으로 추출한 후 추출수율을 구했으며, 각 시료의 추출수율은 Table 1과 같다. 전체 시료의 추출수율은 18.44~21.75%의 범위로 확인되었다. 전초와 열매 추출물은 분홍색 꽃이 피는 개양귀비(PRP), 잎 추출물은 붉은색 꽃이 피는 개양귀비(PRR)의 추출수율이 높았다. 식물 추출물이 생리활성이 우수해도 추출수율이 낮은 경우 경제성이 떨어지기 때문에 추출수율은 산업화에 고려되어야 할 중요한 요인으로 작용한다. 식물 추출물의 추출수율이 10% 이상이면 경제성이 있다고 알려져 있는데(Hah 등, 2005), 본 연구에서 각 시료의 추출수율이 모두 10% 이상으로 확인되어 개양귀비가 경제적으로 활용 가능성이 있는 식물 소재로 판단되었다. 개양귀비 추출물 동결건조 분말 시료의 총 플라보노이드 및 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 시료 1 g당 quercetin mg 상당량으로 나타낸 총 플라보노이드 함량 범위는 9.12~18.20 mg QE/g이며, 빨간색 꽃이 피는 개양귀비 잎 추출물(PRRL)이 18.20 mg QE/g으로 가장 높았고 분홍색 꽃이 피는 개양귀비 잎 추출물(PRPL)이 15.19 mg QE/g으로 다른 부위의 추출물보다 높은 함량을 나타냈다. 또한 시료 1 g당 galic acid mg 상당량으로 나타낸 총 폴리페놀 함량 범위는 14.02~18.81 mg GAE/g으로 분홍색 꽃이 피는 개양귀비 열매 추출물(PRPF)이 18.81 mg GAE/g,빨간색 꽃이 피는 개양귀비 열매 추출물(PRRF)이 18.62 mg GAE/g으로 다른 부위의 추출물보다 높은 함량을 나타냈다. 시료의 부위별로 비교하였을 때, 잎과 열매 추출물이 많은 양의 플라보노이드와 폴리페놀을 함유하고 있었으며 전초 추출물(PRRW, PRPW)은 플라보노이드와 폴리페놀 함량이 유의적으로 낮게 나타났다. 일반적으로 폴리페놀 및 플라보노이드는 식물체의 잎이나 열매에서 높은 함량을 나타내며, 이는 항산화 활성과도 연관된다고 알려져 있다(Hwang 등, 2015). Kostic 등(2010)의 연구에 의하면 개양귀비 잎에는 퀘르세틴, 켐페롤과 같은 플라보노이드를 포함한다고 하였다. 또한, Montefusco 등(2015)의 연구에서 개양귀비 잎은 높은 페놀 화합물 및 플라보노이드를 함유하고 있으며 우수한 항산화 활성을 가진다고 보고하였다. 2종의 개양귀비 추출물(PRP, PRR)을 비교하였을 때, 총 플라보노이드 함량은 PRRL이 PRPL보다, PRRW가 PRPW보다 높았으며, 총 폴리페놀 함량은 PRPL이 PRRL보다, PRRW가 PRPW보다 높게 나타났다. 열매 추출물은 총 플라보노이드와 총 폴리페놀 함량에서 유의적인 차이를 확인할 수 없었다. 식물자원의 경우에는 동일 품종의 경우에도 재배지 특성, 재배 방법에 따라 기능성분의 함량이 다르게 나타난다(Baek 등, 2014). 그러나 동일 환경에서 동일 방법으로 재배된 PRP와 PRR의 페놀 화합물 및 플라보노이드 함량 차이는 환경 적응도에 기인한 것으로 PRR이 본 연구 진행을 위해 마련된 재배 환경에서 기능성분을 축적하기에 보다 적합했던 것으로 판단되었다. Choi 등(2019)은 적색 장미는 안토시아닌 색소의 영향으로 분홍색, 황색 및 흰색 장미보다 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 높다고 하였으며, Mlcek과 Rop(2011)의 연구에 따르면 총 안토시아닌 농도가 높을수록 총 플라보노이드 함량이 높으며 이는 강력한 항산화의 결정적인 요인 중 하나라고 보고하였다. 이러한 결과들은 본 연구에서 꽃을 포함하는 전초 추출물 중 PRRW의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 높은 결과와 유사하였다.

Table 1 . Extraction yields of Papaver rhoeas L. (PR) extracts.

Sample1)		Yield (%)2)
PRP	PRPW	21.69
	PRPL	20.98
	PRPF	21.70
PRR	PRRW	19.37
	PRRL	21.75
	PRRF	18.44

¹⁾PRP: pink flower PR, PRR: red flower PR, PRPW: whole extract of pink flower PR, PRPL: leaf extract of pink flower PR, PRPF: fruit extract of pink flower PR, PRRW: whole extract of red flower PR, PRRL: leaf extract of red flower PR, PRRF: fruit extract of red flower PR.

²⁾The values on the table are calculated in percentage (w/w) from the raw material (100%).

Table 2 . Contents of total flavonoid and total phenol of PR extracts.

Sample1)		Total flavonoid content (mg QE/g)2)	Total phenol content (mg GAE/g)3)
PRP	PRPW	9.12±0.37f*	14.02±0.32e*
	PRPL	15.19±0.36b*	17.40±0.19b*
	PRPF	14.11±0.42c	18.81±0.23a
PRR	PRRW	10.47±0.41e	14.88±0.12d
	PRRL	18.20±0.38a	16.65±0.15c
	PRRF	13.41±0.41d	18.62±0.32a

¹⁾Samples are the same as Table 1.

²⁾mg QE/g: mg quercetin equivalent per sample 1 g.

³⁾mg GAE/g: mg gallic acid equivalent per sample 1 g.

Values are mean±SD (n>3 independent experiment).

Means with different letters (a-f) in the same column are significantly different (P<0.05).

^*P<0.05 compared with PRP and PRR of same parts.

라디칼 소거 활성

개양귀비 추출물의 항산화 활성을 in vitro에서 측정하기 위해 DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성을 통한 항산화 활성을 분석한 결과는 Table 3, 4와 같다. DPPH 라디칼 소거 활성은 1,000 μg/mL 농도에서 PRRL이 74.59%로 가장 높았고, PRPL 69.79%, PRRF 66.02%, PRPF 61.60% 순이었다. 그러나 PRRW 57.07%, PRPW 56.47%로 잎과 열매보다 낮은 활성을 나타냈다. ABTS 라디칼 소거 활성은 1,000 μg/mL 농도에서 PRRF가 81.98%로 가장 높았고, PRPF 80.80%, PRRL 79.28%, PRPL 78.63% 순이었다. ABTS 라디칼 소거 활성 평가에서도 전초 추출물인 PRRW 68.63 %, PRRW 67.15%로 잎과 열매보다 낮은 활성을 나타냈다. 이는 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 잎과 열매 추출물에서 높고 전초 추출물에서 낮았던 결과와 비례함을 확인할 수 있었으며, 개양귀비 추출물에 함유된 페놀 화합물 및 플라보노이드 함량과 연관된 것으로 판단된다. Isbilir와 Sagiroglu(2012)의 물, 에탄올, 에틸아세테이트를 이용한 개양귀비 잎 추출물의 DPPH 라디칼 소거능과 총 페놀함량이 서로 비례관계가 성립된다는 연구 결과는 본 연구 결과와유사하였다. 또한, 2종의 개양귀비 추출물(PRP, PRR)을 EC50 값으로 비교하였을 때, DPPH 라디칼 소거능은 잎 추출물의 활성이 가장 크게 나타났으며 PRR이 PRP보다 낮은 농도에서 활성을 나타냈다. ABTS 라디칼 소거능은 열매추출물의 활성이 가장 크게 나타났고, DPPH 라디칼 소거능과 동일하게 PRR이 PRP보다 높은 활성을 보였다.

Table 3 . DPPH radical scavenging activity of PR extracts.

Sample1)		Concentration (μg/mL)				EC50 (μg/mL)2)
		125	250	500	1,000
PRP	PRPW	7.34±0.56Cd	17.09±1.84Dc	32.88±1.58Eb	56.47±1.58Fa	864.91±15.23A*
	PRPL	13.84±1.84Bd*	22.16±1.66BCc	42.30±0.63Cb	69.79±1.85Ca	671.28±15.79E*
	PRPF	9.29±1.56Cd	18.71±1.95CDc	35.74±1.75Db	61.60±1.77Da*	784.98±8.36C*
PRR	PRRW	7.73±1.99Cd	17.22±2.17Dc	34.50±1.27DEb	57.07±0.23Fa	836.24±5.84B
	PRRL	9.03±0.85Cd	23.65±1.95Bc	45.09±1.36Bb	74.59±1.00Ba	631.88±8.38F
	PRRF	7.34±1.13Cd	18.97±2.88CDc	35.80±0.41Db	66.02±1.81Ea	742.45±12.20D
Ascorbic acid		92.98±0.23Aa	93.18±0.11Aa	93.76±0.23Aa	93.63±0.39Aa	29.69±0.43G

¹⁾Samples are the same as Table 1.

²⁾EC₅₀ means the concentration of sample that gives 50% of its maximal effect.

Values are mean±SD (n>3 independent experiment).

Means with different letters (a-d) in the same row are significantly different (P<0.05).

Means with different letters (A-G) in the same column are significantly different (P<0.05).

^*P<0.05 compared with PRP and PRR of same parts.

Table 4 . ABTS radical scavenging activity of PR extracts.

Sample1)		Concentration (μg/mL)				EC50 (μg/mL)2)
		125	250	500	1,000
PRP	PRPW	18.35±0.51Fd	32.72±0.54Ec	38.08±0.84Fb	67.15±1.05Ea	678.89±9.46A*
	PRPL	34.46±0.69Bd*	47.71±0.67Dc*	57.12±0.94CDb*	78.63±0.60Da	374.26±1.07C*
	PRPF	34.33±0.84Cd	49.49±0.67Cc	56.26±0.90Db	80.80±1.48BCa	362.39±8.15C*
PRR	PRRW	20.26±1.09Ed	32.16±1.16Ec	46.14±0.15Eb	68.63±1.09Ea	622.70±8.90B
	PRRL	36.77±1.23Dd	54.39±0.80Bc	60.28±0.81Bb	79.28±0.35CDa	366.92±13.07C
	PRRF	35.84±1.04Bd	49.33±0.52Cc	57.78±0.74Cb	81.98±1.66Ba	343.04±10.15D
Ascorbic acid		94.80±0.20Aa	95.10±0.26Aa	95.00±0.26Aa	95.46±0.32Aa	52.04±0.33E

¹⁾Samples are the same as Table 1..

²⁾EC₅₀ means the concentration of sample that gives 50% of its maximal effect..

Values are mean±SD (n>3 independent experiment)..

Means with different letters (a-d) in the same row are significantly different (P<0.05)..

Means with different letters (A-G) in the same column are significantly different (P<0.05)..

*P<0.05 compared with PRP and PRR of same parts..

산화 자극에 대한 간세포 보호효과

개양귀비 추출물이 HepG2 세포 생존율에 미치는 영향을 분석한 결과는 Fig. 1, 2와 같다. 모든 개양귀비 추출물을 500 μg/mL 이하의 농도로 처리하였을 때, 세포독성을 보이지 않았다(Fig. 1). HepG2 세포에 산화 자극을 위한 H₂O₂의 농도는 약 50% 세포 생존율 감소를 보인 1 mM로 결정하였으며(data not shown), 산화 자극으로부터 개양귀비 추출물의 HepG2 세포 보호효과를 조사하기 위해 각 추출물을 농도별(0~500 μg/mL)로 처리하고 1시간 미리 배양한 다음 1 mM H₂O₂를 처리하여 24시간 후 세포 생존율을 확인한 결과는 Fig. 2와 같다. HepG2 세포에서 H₂O₂ 처리군의 세포 생존률은 51%로 감소하였고, 모든 개양귀비 추출물은 농도 의존적으로 H₂O₂에 의한 세포사멸을 억제하였다. 산화 자극에 대한 HepG2 세포 보호효과는 잎 추출물, 열매 추출물, 전초 추출물 순이었다. 특히, PRRL 처리군은 500 μg/mL의 농도에서 70% 이상 세포 생존율이 증가하여 세포 보호효과가 가장 크게 나타났다. PRPL과 PRPF가 67% 이상, PRRF, PRPW, PRRW는 66% 이상으로 세포 생존율이 증가하였다. 2종의 개양귀비 추출물(PRP, PRR)을 비교했을 때, 고농도(250 μg/mL 이상)에서 PRRL이 PRPL보다 유의적으로 높은 간세포 보호효과를 나타냈다. 이는 라디칼 소거 활성(DPPH, ABTS)의 결과와 비례함을 확인할 수 있었다. 세포 내에서 생성된 H₂O₂는 ROS를 형성시켜 세포에 산화 스트레스를 유발하는데 ROS는 superoxide radicals, peroxyl radicals, peroxynitrite 등 다양한 형태로 존재한다(Lambert와 Brand, 2009). 이러한 라디칼의 과다 생성 및 축적은 세포사멸을 유도하고 다양한 질병을 유발하기 때문에 세포를 보호하기 위해서는 세포 내 ROS의 형성을 억제하는 것이 매우 중요하다(Kim 등, 2013). 이에 본 연구에서는 개양귀비 추출물의 간세포 보호효과가 ROS 소거 활성과 관련하는지 확인하고, ROS에 의한 세포독성을 최소화하여 세포를 보호하는 항산화 방어시스템인 항산화 효소 활성을 평가하였다.

Fig 1. Effect of PR on viability of HepG2 cells. HepG2 cells were treated with PR at various concentrations for 24 h and the relative cell viability was assessed by EZ-cytox cell viability assay. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. Samples are the same as Table 1.

Fig 2. Protective effect of PR on against H₂O₂-induced cytotoxicity in HepG2 cells. HepG2 cells were treated with 1 mM H₂O₂ for 24 h after pre-treatment with or without PR for 1 h. After treatment, cell viability was assessed by EZ-cytox cell viability assay. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.01 compared with the control (None) group. *P<0.05, **P<0.01 compared with the H₂O₂ treated group. ^≠P<0.05 compared with PRP and PRR of same parts. Samples are the same as Table 1.

세포 내 활성산소 억제 활성

HepG2 세포에서 H₂O₂ 처리에 의해 유발된 세포독성 및 세포사멸에 대한 개양귀비 추출물의 간세포 보호효과가 산화 자극에 대하여 직접적인 차단 효과인지 확인하기 위해 ROS 생성에 미치는 영향을 조사한 결과는 Fig. 3과 같다. 각 추출물을 농도별(0~500 μg/mL)로 처리하여 1시간 미리 배양하고 1 mM H₂O₂를 처리하여 30분 후 DCF-DA probe를 이용하여 ROS 소거 활성을 평가하였다. HepG2 세포에서 H₂O₂ 처리군은 무처리군과 비교하여 299% ROS 생성이 증가하였고, 모든 개양귀비 추출물은 농도 의존적으로 ROS 생성을 억제하였다(Fig. 3A). 특히, 개양귀비 잎 추출물의 활성이 전초 및 열매 추출물보다 세포 내 ROS 억제 활성이 크게 나타났다. HepG2 세포 내 500 μg/mL 농도에서 PRRL 222%, PRPL 225%로 ROS 생성이 감소하였다. 2종의 개양귀비 추출물(PRP, PRR)을 비교했을 때, 고농도(250 μg/mL 이상)에서 PRRL이 PRPL보다 유의적으로 높은 활성을 나타냈다. 이는 H₂O₂ 산화 자극에 대한 HepG2 세포 보호 활성의 결과와 비례함을 확인할 수 있었다. 가장 활성이 크게 나타난 개양귀비 잎 추출물(PRPL, PRRL)을 각각 처리하여 형광현미경으로 확인한 결과에서도 ROS 생성을 의미하는 초록 형광의 강도가 H₂O₂ 단독 처리군에서는 매우 강하게 나타났으나 PRPL 또는 PRRL을 500 μg/mL의 농도로 전처리했을 때 형광 강도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3B). 다량의 ROS는 DNA, 단백질, 세포 내 소기관 등을 손상시켜 여러 질병을 유발하고 세포사멸을 유도한다고 알려져 있다(Ishikawa 등, 2008). Parthasarathi 등(2015), Zhuang 등(2017)의 다양한 연구에서 기능성 소재를 처리했을 때, H₂O₂로 유도된 ROS를 소거함으로써 HepG2 세포의 손상을 억제할 수 있다고 보고하였다. 본 연구에서도 H₂O₂ 처리로 과도하게 증가한 ROS를 개양귀비 추출물의 전처리로 감소시킬 수 있었으며, 이로 인해 HepG2 세포 생존율이 증가했을 것으로 판단되었다.

Fig 3. Effect of PR on the generation of intracellular ROS levels in H₂O₂-treated HepG2 cells. (A) HepG2 cells were treated with 1 mM H₂O₂ for 30 min after pre-treatment with or without PR for 1 h. After staining with DCF-DA florescent dye, DCF fluorescence intensity was measured using a fluorescence microplate reader. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.01 compared with the control (None) group. *P<0.05, **P<0.01 compared with the H₂O₂ treated group. ^≠P<0.05 compared with PRP and PRR of same parts. (B) HepG2 cells were treated with 1 mM H₂O₂ for 30 min after pre-treatment with or without 500 μg/mL PRAL and PRSL for 1 h. The fluorescent images were obtained by a fluorescence microscope (magnification 200×, scale bar 100 μm). These images are representative of at least three independent experiments. Samples are the same as Table 1.

항산화 효소 활성

HepG2 세포에서 H₂O₂ 처리로 유발된 산화 자극에 대한 개양귀비 추출물의 간세포 보호 활성이 항산화 효소인 SOD와 CAT의 활성과 관련하는지 확인한 결과는 Fig. 4, 5와 같다. HepG2 세포에 개양귀비 추출물을 각각 500 μg/mL 농도로 처리하여 1시간 동안 미리 배양하고 1 mM H₂O₂를 처리하여 24시간 후 단백질을 추출하였다. SOD와 CAT의 활성평가 결과, H₂O₂ 처리군과 비교하여 모든 개양귀비 추출물을 전처리했을 때 효소 활성이 유의적으로 증가하였다. 특히, 개양귀비 잎 추출물의 효소 활성이 전초 및 열매 추출물보다 높게 나타났다. HepG2 세포에서 H₂O₂ 처리군은 무처리군과 비교하여 SOD의 활성은 70%로 감소하였으나, 500 μg/mL 개양귀비 추출물을 처리하였을 때 PRRL 84%, PRPL 80%로 활성이 증가하였다. PRRW 79%, PRPW 77%, PRRF 74% 그리고 PRPF 73% 순이었다. CAT의 경우, H₂O₂ 처리군은 무처리군과 비교하여 CAT의 활성은 52%로 감소하였으나 500 μg/mL 개양귀비 추출물을 처리하였을 때 PRRL 87%, PRPL 81%로 활성이 증가하였다. PRRW 72%, PRPW 66%, PRRF 59% 그리고 PRPF 57% 순이었다. 2종의 개양귀비 추출물(PRP, PRR)을 비교했을 때, SOD와 CAT 모두 PRP보다 PRR의 활성이 높게 나타났다. 이는 HepG2 세포 내 H₂O₂로 인해 발생한 ROS 억제 활성의 결과와 비례함을 확인할 수 있었다. SOD와 CAT와 같은 항산화 효소는 H₂O₂에 의해 유발된 산화 스트레스를 저하시킨다고 보고되어 있다(Steiling 등, 1999). 즉, SOD는 자유라디칼을 hydrogen peroxide로 바꿔주고, CAT에 의해 H₂O와 O₂로 전환되어 배출되면서 세포를 산화 자극으로부터 보호한다고 알려져 있다(Kang 등, 2006). Orr와 Sohai(1994)의 연구에 따르면 항산화 효소 활성이 증가할수록 수명이 연장된다고 하였는데, 본 연구에서 개양귀비 추출물이 항산화 효소인 SOD와 CAT의 활성을 증가시켜 HepG2 세포의 생존율을 증가시켰을 것으로 생각된다.

Fig 4. Effect of PR on the superoxide dismutase (SOD) activity in H₂O₂-treated HepG2 cells. HepG2 cells were treated with 1 mM H₂O₂ for 24 h after pre-treatment with or without 500 μg/mL PR for 1 h. After treatment, SOD activity was assessed by enzyme assay kit. Data are presented as the mean± SD of three independent experiments. Different letters (a-e) above the bars are significantly different at P<0.05. Samples are the same as Table 1.

Fig 5. Effect of PR on the catalase (CAT) activity in H₂O₂-treated HepG2 cells. HepG2 cells were treated with 1 mM H₂O₂ for 24 h after pre-treatment with or without 500 μg/mL PR for 1 h. After treatment, SOD activity was assessed by enzyme assay kit. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. Different letters (a-f) above the bars are significantly different at P<0.05. Samples are the same as Table 1.

본 연구에서는 2종의 개양귀비(PRA, PRS)를 전초, 잎, 열매로 나누고 50% 주정으로 추출하여 각각의 시료를 DPPH 또는 ABTS 측정을 통한 항산화 활성과 인간 간암세포인 HepG2 세포를 이용하여 ROS 억제 활성 및 항산화 효소 활성을 조사하였다. 개양귀비 부위별 추출물의 총 플라보노이드 및 총 페놀화합물은 2종 모두 잎과 열매 추출물이 전초 추출물보다 함량이 높았다. DPPH와 ABTS에 의한 라디칼 소거 활성도 잎, 열매, 전초 순으로 높았다. 모든 개양귀비 추출물은 H₂O₂로 자극한 HepG2 세포의 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰고 그중에서 잎 추출물의 활성이 가장 크게 나타났다. HepG2 세포 내 ROS 소거 활성과 항산화 효소 중 SOD, CAT의 활성이 모든 추출물에서 증가했지만 잎 추출물을 전처리했을 때 가장 크게 증가하였다. 이상의 결과로 2종의 개양귀비 추출물 모두 잎 추출물에서 라디칼 소거 활성 및 간세포 보호효과가 크게 나타났으며, 이는 개양귀비 잎에 함유된 페놀 화합물 및 플라보노이드에 기인한 것으로 사료된다. 특히, 2종의 개양귀비 추출물 중 PRR이 PRP보다 총 플라보노이드 및 총 페놀 화합물의 함량이 높았으며 항산화 활성이 비교적 높게 나타났다. 이상의 결과로 2종의 개양귀비 중 PRR을 천연 생리활성물질로 활용하는 것이 더 효과적이라고 판단되었다.

본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업과학기술연구개발사업(과제번호: PJ01511502)의 지원에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.