참마(Dioscorea japonica Thunb.)는 마과(Dioscoreaceae)에 속하는 덩굴성 다년생 초본으로 참마와 함께 장마(Dioscorea batatas Decne.)와 둥근마(Dioscorea bulbifera L.) 등의 종은 한국, 일본, 중국에서 보편적으로 야생하고 있다(Yang 등, 2009). 1990년대 이래 국내에서 재배되는 마의 생산량은 꾸준하게 증가하는 추세로 경상북도 안동시가 주된 생산지이며, 둥근 기둥 모양의 굵직한 뿌리가 식용이나 약용으로 사용된다(Jang 등, 2010). 참마의 주피를 제거한 뿌리줄기 그 자체를 건조하거나 찐 후에 건조한 것을 산약(山藥)이라고 한다(Kang 등, 2014). 이러한 마는 신체가 허약할 때 한방 약재로 쓰이는데 당뇨병, 폐결핵, 빈뇨증 및 자양, 익정, 지사 등의 효능이 있고, 소염, 해독, 진해, 거담, 이뇨, 신경통, 류머티즘에 효능이 있다고 알려져 있다(Choung과 Shim, 1996). 또한, 마는 알칼리성 식품으로 다양한 소화효소를 가지고 있어서 고구마나 감자와 같은 다른 지하 괴근과는 상이하게 익히지 않은 뿌리를 생으로 섭취해도 소화 흡수가 잘 된다고 알려져 있다(Shin, 2004). 특히 마는 mucin이 있어 점성이 높고, mannan과 같은 섬유질의 주성분과 함께 단백질과 무기질, 소량의 glucose, fructose 등으로 이루어져 있어 당뇨병이나 설사 등을 완화하는 효능이 우수하다고 알려져 있다(Lee와 Kim, 1998). 또한 약리적 성분으로 사포닌, 탄닌, 폴리페놀, 알라토인, 우론산, 아르기닌, 디오스게닌 등 다양한 생리 활성 물질들을 포함하고 있어(Kim 등, 2009), 지질대사(Kim, 1998), 혈당조절(Kwon 등, 2001), 항염증 및 항산화(Choi와 Koo, 2005), 항균 및 항혈전(Kwon 등, 2010) 활성 평가와 같은 여러 기능성 연구가 보고되고 있다.

발효는 식물성 식품에서 영양의 질을 높이고 바람직하지 않은 화합물을 제거하는 과정으로 발효과정 중에 많은 생화학적 변화가 일어나 영양성분의 비율이 바뀌면서 결론적으로 생체 활성 및 소화율과 같은 제품 특성에 영향을 준다(Zhang 등, 2012). 미생물 발효는 수십억 개의 프로바이오틱스를 생산할 뿐만 아니라 다량의 대사산물, 다당류 및 펩타이드를 포함하여 발효 제품의 항산화 능력과 영양 가치를 모두 강화시키며(Yao 등, 2018), 발효로 인해 페놀 화합물이 접합된 형태에서 유리 형태로 전환되면 건강과 관련된 기능이 향상된다(Torino 등, 2013). 따라서 효모, 유산균, 고초균 등 우리에게 긍정적인 작용을 하는 미생물을 사용해 발효하는 기술의 발전으로 천연 소재가 본래 가진 생리 활성 물질이 증진된 발효물을 생산하거나 기능성 물질 간의 상호작용으로 인해 상승된 효과의 제품을 얻는 연구가 지속되고 있다(Lee, 2014). 유용 미생물을 이용해 천연물을 발효하는 기술을 적용하여 그 활성 및 효능에 관한 선행 연구는 Bacillus sp.를 이용하여 발효한 산물의 혈전 용해 활성 및 항산화 효과(Kim 등, 2010), Lactobacillus brevis BJ20을 이용하여 제조한 발효 분말의 항산화 및 항염증 활성 효과(Kang 등, 2013), Aspergillus oryzae 발효 분말 차의 관능적 품질 및 항산화능(Lee 등, 2014), Lactobacillus plantarum 균주를 이용한 발효 다시마 효소 추출물의 항산화 활성(Han 등, 2015), Saccharomyces cerevisiae로 발효한 갈색거저리 유충이 비알코올성 지방간에 미치는 영향(Sim 등, 2020) 등이 있으며, 현재까지 활발한 연구가 진행되고 있다.

따라서 본 연구에서는 참마의 활용도 및 부가가치를 높이고자 발효 처리에 의한 참마의 균주별 특성 및 항산화 활성을 측정하여 참마의 활성에 어떠한 영향을 주는지 확인하고 새로운 기능성 소재로서의 가능성을 탐색하고자 하였다.

사용 균주

발효에 사용된 균주는 Bacillus subtilis subsp. subtilis KACC 14549(BS), Saccharomyces cerevisiae KACC 48234(SC), Levilactobacillus brevis KACC 18270(LB), Lacticaseibacillus casei KACC 12413(LC), Lactiplantibacillus plantarum KACC 18510(LP)으로 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection)에서 분양받아 사용하였다. 휴면 상태의 균주를 Table 1의 조건으로 배양하였는데, 즉 BS는 Nutrient broth에서, SC는 YM broth에서, LB, LC, LP는 MRS broth에서 배양하였고, BS와 SC는 30°C, LB, LC, LP는 37°C에서 24시간씩 3회 계대 배양 후 600 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 0.4~0.6(1×10⁵ CFU/mL) 범위 안에 들게 조절한 후 발효 균주로 사용하였다.

Table 1 . List of strains used for fermentation experiments.

Strains.	Media.	Temp. (°C).
Bacillus subtilis subsp. subtilis KACC 14549. Saccharomyces cerevisiae KACC 48234. Levilactobacillus brevis KACC 18270. Lacticaseibacillus casei KACC 12413. Lactiplantibacillus plantarum KACC 18510.	NB. YM. MRS. MRS. MRS.	30. 30. 37. 37. 37.

참마 발효물 제조

본 실험에 사용된 참마는 경상북도 안동에서 2021년도에 재배된 것을 구매하였고, 수세 및 박피 후 과육을 0.3~0.5 cm 크기로 썰어 준비하여 45°C에서 2시간 동안 열풍건조를 진행하였다. 그 후 열풍 건조된 참마를 믹서기로 분쇄하여 얻은 분말 25 g에 증류수 500 mL를 넣고 실온에서 24시간 추출한 후 여과지로 여과하여 참마 물 추출물을 제조하였다. 참마 발효물의 제조 방법은 Jang 등(2019)의 방법을 참고하여 제조하였고,

Fig. 1과 같다. 참마 물 추출물에 탄소원으로 glucose(Junsei Chemical Co., Ltd., 1%, w/v)와 peptone(Difco Laboratorie, 1.5%, w/v)을 넣고 섞은 후 고압 멸균(121°C, 15 min)하여 식힌 다음 활성화된 5종의 발효 균주(BS, SC, LB, LC, LP)를 3%의 농도로 접종하여 균주마다 적정한 배양 온도에 맞춰 30~37°C의 incubator(650D, Fisher Scientific Inc.)에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 배양액을 재멸균(121°C, 15 min)한 다음 여과지(Whatman No. 2, Whatman International Ltd.)로 여과하였고, 여과액을 -50°C의 deep freezer(FR-300CW, Daehan CRYO Co.)에서 냉각시킨 후 동결건조기(FD8508, Ilshin)로 동결 건조한 분말을 용매로 증류수를 사용하여 원하는 농도로 희석해 항산화 및 효소 저해 활성 실험에 사용하였다. 무발효 대조군으로는 참마 물 추출물을 고압 멸균(121°C, 15 min)한 후 여과지로 여과한 뒤 동결 건조하여 얻은 분말을 사용하였다.

Fig 1. Procedure of fermented Dioscorea japonica Thunb. extracts.

참마 발효물의 수율 측정

균주별 참마 발효액의 수율 측정은 48시간 동안 배양한 후 이를 여과한 다음 동결건조기를 사용해 동결건조를 진행하여 얻은 동결건조 분말의 건조중량을 구한 후 발효액 제조에 사용한 원료 중량에 대한 백분율로 나타내었다.

A: 발효액을 동결 건조한 후 얻은 분말의 무게(g)

B: 추출물 제조에 사용한 원료 무게(g)

사용 균주에 따른 참마 발효액의 배양 특성

균주 성장에 따른 참마 발효액의 pH 측정은 48시간 동안 배양한 후 여과지에 여과한 다음 이루어졌으며, pH meter (pH-200L, iSTEK)를 사용하여 3회 반복 측정한 값을 평균과 표준편차로 나타내었다. 균주별 참마 발효액의 미생물 발효 정도를 확인하기 위한 혼탁도는 48시간 동안 배양한 후 여과된 발효액을 spectrophotometer(UV-1800, Shimadzu)를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였고, 3회 반복 측정한 값을 평균과 표준편차로 나타내었다. 균주별 참마 발효액의 생균수 측정은 48시간 동안 배양한 후 여과한 발효액을 멸균된 증류수에 희석하여 측정하였다. 발효 희석액을 충분히 교반한 후 BS, LB, LC, LP는 plate count agar 배지에, SC는 potato dextrose agar(PDA) 배지에 분주한 다음 BS와 SC는 30°C에서, LB, LC, LP는 37°C에서 배양하여 생균수를 측정하였으며, 모든 실험군은 3회 반복 측정하여 그 결과를 평균과 표준편차로 나타내었다.

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu’s reagent(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 시료의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과로 노란색에서 몰리브덴 청색으로 색의 변화를 나타내는 원리를 이용한 Folin-Denis 법(1912)을 참고하여 측정하였다. 각 시료 10 μL에 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent와 증류수를 1:2의 비율로 섞어 제조한 혼합시약 10 μL를 가하여 3분간 방치한 후 10% sodium carbonate(Duksan Chemical Co., NaCO₃, w/v) 150 μL를 첨가해 암실에서 1시간 동안 반응시킨 다음 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결괏값은 표준물질로 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 농도별 standard curve를 작성한 후 시료 1 g에 대한 mg gallic acid equivalents(GAE)로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(1999)의 방법을 사용하여 측정하였다. 각 시료 125 μL에 증류수 500 μL, 5% sodium nitrite(Thermo Fisher Scientific Co., NaNO₂, w/v) 37.5 μL를 넣고 5분 동안 반응시킨 후 10% aluminium chloride(Junsei Chemical Co., AlCl₃･6H₂O, w/v) 75 μL를 첨가하여 6분간 반응시킨 다음 1 M sodium hydroxide(Daejung Chemicals & Metals Co., NaOH, w/v) 250 μL를 첨가해 11분간 방치한 반응액의 흡광도를 510 nm에서 측정하였다. 결괏값은 표준물질로 catechin hydrate(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 농도별 standard curve를 작성한 후 시료 1 g에 대한 mg catechin equivalents(CE)로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거 활성 측정

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성은 Blois(1958)의 방법을 참고하여 측정하였다. 증류수를 사용하여 일정 농도로 희석한 시료와 0.2 mM DPPH 용액(Sigma-Aldrich Co.)을 각 100 μL씩 1:1의 비율로 섞어 교반한 후 암실에서 30분 동안 방치한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조군은 시료 대신 시료를 녹인 용매인 증류수로 대체하여 위와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였고, 아래의 식으로 계산하여 백분율로 나타낸 후 결괏값을 DPPH 농도를 50%로 소거시키는 시료의 농도인 IC₅₀(inhibitory concentration, mg/mL)으로 3회 반복 측정하여 평균값과 표준편차를 구해 표시하였다.

ABTS 라디칼 소거 활성 측정

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 라디칼 소거 활성은 Fellegrin 등(1999)의 방법을 참고하여 측정하였다. 증류수 5 mL에 140 mM potassium persulfate(K₂S₂O₈, Samchun Pure Chemical Co.) 88 μL, ABTS diammonium salt(Sigma-Aldrich Co.) 2알을 넣고 잘 섞어준 후 암실에서 12~16시간 반응시켰다. 이를 1:88의 비율로 95% 에탄올과 섞어 734 nm에서 측정한 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 조절하여 만든 ABTS solution을 시약으로 사용하였다. 증류수를 사용해 일정 농도로 희석하여 제조한 각 시료 50 μL와 ABTS solution 1 mL를 혼합하여 교반한 후 2.5분간 암실에서 반응시킨 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조군은 시료 대신 시료를 녹인 용매인 증류수로 대체하여 위와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였고, 아래의 식으로 계산하여 백분율로 나타낸 후 결괏값을 ABTS 농도를 50%로 소거시키는 시료의 농도인 IC₅₀(inhibitory concentration, mg/mL)으로 3회 반복 측정하여 평균값과 표준편차를 구해 표시하였다.

FRAP 측정

Ferric reducing antioxidant power(FRAP) 측정 방법은 Benzie와 Strain(1996)의 방법을 응용하여 측정하였다. 40 mM HCl을 이용하여 제조한 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ, Sigma-Aldrich Co.)과 20 mM iron chloride hexahydrate(FeCl₃･6H₂O, Samchun Pure Chemical Co.), 300 mM acetate buffer(pH 3.6)를 각각 1:1:10(v:v:v)의 비율로 섞어 혼합한 후 37°C의 incubator에서 10분간 반응시켜 제조한 FRAP reagent를 시약으로 사용하였다. 시료 30 μL와 FRAP reagent 900 μL, 증류수 90 μL를 넣고 교반한 후 37°C의 incubator에서 10분 동안 반응시킨 다음 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. FRAP 활성은 ferrous sulfate heptahydrate(FeSO₄･7H₂O, Samchun Pure Chemical Co.)를 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5 mM의 농도로 제조하여 standard curve를 작성한 후 대입하여 환산하였으며, 시료 1 g에 대한 FeSO₄･7H₂O의 mM 함량인 mM FeSO₄･7H₂O equivalents(FE)로 3회 반복 측정한 값을 평균값과 표준편차로 표시하였다.

환원력 측정

환원력은 Oyaizu(1986)의 방법을 참고하여 측정하였다. 일정 농도로 희석하여 제조한 시료 추출물 1 mL에 1% potassium ferricyanide(Samchun Pure Chemical Co.) 1 mL, pH를 6.6으로 조절한 200 mM sodium phosphate buffer 1 mL를 첨가하여 섞어준 후 20분 동안 50°C의 수욕상에서 반응시킨 다음 10분간 냉각시켰다. 이 반응액에 10% trichloroacetic acid(Samchun Pure Chemical Co.) 용액 1 mL를 가하여 원심분리(2,700×g, 5 min) 한 후 상등액 0.5 mL를 취하여 증류수 0.5 mL와 0.1% ferric chloride(Samchun Pure Chemical Co.) 0.1 mL를 넣고 교반한 혼합액을 암실에서 10분간 반응시킨 다음 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 환원력은 흡광도 값 0~1의 범위를 0~100%의 범위로 환산하여 흡광도 값을 백분율로 나타내었고, 결괏값을 최대반응의 50%에 해당하는 환원력을 가지는 시료의 농도인 EC₅₀(effective concentration, mg/mL)으로 3회 반복 측정하여 평균값과 표준편차를 구하였다.

통계 처리

실험 결과의 데이터 분석은 SPSS 26.0(Statistical Package for the Social Sciences, SPSS Inc.)을 사용하여 3회 이상 반복 측정한 결과를 평균값과 표준편차로 구하였다. 각 측정값 간의 통계적 유의성을 검증하기 위하여 참마 발효물의 항산화 활성에 대한 결괏값은 분산분석(ANOVA)과 Duncan’s multiple range test를 95% 유의수준(P<0.05)에서 실시하여 검증하였고, 참마 과육 및 껍질 에탄올 추출물에 대한 항산화 활성 데이터는 Independent t-test로 95% 유의 수준(P<0.05)에서 실시하여 검증하였다.

참마 발효물의 수율

유용 균주별로 48시간 발효시킨 참마 발효물의 수율은 Table 2에 나타내었다. 발효물의 최종적인 수율이 나타내는 의미는 발효과정 중 생성되는 효소가 균주별로 다른데 그 효소의 특이적인 작용에 따른 소재의 전환 능력을 나타내며, 그렇게 얻은 고형분에는 탄수화물 및 질소화합물, 지방 구성물, 비타민 B 복합체와 같은 수용성 비타민, 무기질, 사포닌 등이 포함되어 있다(Bae, 2017). 대조군이 21.81%로 가장 낮은 값을 나타내었고, 5종의 단일 균주를 이용하여 발효시킨 참마 발효물이 58.91~66.44%의 범위로, SC 발효물이 발효물 중에서 가장 낮은 값을 나타내었고 LC 발효물이 가장 높은 값을 보였다. Kim 등(2012)의 연구에서 포도박을 여러 미생물로 발효하였을 때 모든 발효군이 대조군보다 높은 수율을 나타내었다고 보고해 본 연구 결과와 경향이 일치하였다.

Table 2 . Yield of fermented Dioscorea japonica Thunb. by various microorganisms.

Microorganism1).	Yield (%).
Control. SC. BS. LB. LP. LC.	21.81±0.65. 58.91±0.29. 66.16±0.22. 64.21±0.36. 60.79±0.91. 68.44±0.62.

¹⁾Control: non-fermented Dioscorea japonica Thunb., SC: Sac-charomyces cerevisiae, BS: Bacillus subtilis, LB: Levilacto-bac-illus brevis, LP: Lactiplantibacillus plantarum, LC: Lacti-caseibacillus casei..

사용 균주에 따른 참마 발효액의 배양성 결과

참마의 발효 정도를 확인하기 위해 유용 미생물로 48시간 발효시킨 참마 발효물의 pH 변화를 측정한 결과는 Table 3과 같다. 발효하지 않은 대조군에서 5.18로 가장 높은 값을 나타내었고, 참마 발효물에서는 3.61~5.12의 범위로 나타나 여러 유용 발효 균주를 이용한 모든 발효물에서 대조군과 비교하여 pH가 낮아져 전체적으로 발효가 일어났음을 확인할 수 있었다. LP 균주를 이용한 발효물에서 3.61로 가장 낮은 pH 값을 나타냈으며, 이어서 LB, SC, LC, BS 발효군의 순서로 나타났다. Lee(2010)는 방풍통성산을 여러 균주로 발효했을 때 BS 균주에서 배양 후 pH의 변화가 대조군과 비교하여 거의 없었다고 보고하여 본 연구에서도 다른 발효 균주보다 BS 발효군이 pH 변화에 영향이 가장 적었다는 결과와 일치하였다. 또한 Seo(2017)의 연구에서 시료가 발효됨에 따라 pH가 감소하는 경향을 보였으며, 이를 미생물이 시료의 유기물을 분해하고 대사산물을 축적하는 발효과정 때문에 pH가 낮아졌다고 보고하였는데, 본 연구에서도 대조군보다 발효군에서 pH가 낮아진 이유가 이와 유사하다고 생각된다.

Table 3 . pH value, turbidity, and viable cell count in the broth of fermented Dioscorea japonica Thunb. extracts by various microorganisms.

Microorganism1).	pH value.	Turbidity (OD at 600 nm).	Viable cell count (log CFU/mL).
Control. SC. BS. LB. LP. LC.	5.18±0.02a2)3). 3.91±0.02d. 5.12±0.02b. 3.70±0.01e. 3.61±0.01f. 3.93±0.02c.	0.07±0.00e. 0.14±0.02d. 0.21±0.00b. 0.72±0.00a. 0.21±0.00b. 0.18±0.00c.	－. 8.22±0.01a. 7.51±0.09d. 7.62±0.06c. 7.12±0.08e. 7.81±0.04b.

¹⁾Refer to Table 2 for abbreviations..

²⁾Mean±SD (n=3)..

³⁾Different letters (a-f) within a same column differ significantly (P<0.05)..

유용 미생물로 48시간 발효시킨 참마 발효물의 혼탁도 변화측정 결과는 Table 3에 나타내었다. 혼탁도 측정은 미생물의 생장 정도를 측정하는 간접적인 방법으로 600 nm에서 흡광도를 측정하면 미생물 성장에 비례하여 흡광도 값이 증가한다(Alpen과 Mandel, 1960). 대조군의 혼탁도가 0.07로 가장 낮게 나타났고, 참마 발효액의 혼탁도는 0.14~0.72의 범위로 그중에서 SC 발효군이 가장 낮은 값을, LB 발효군이 가장 높은 값을 나타내었다.

다양한 유용 미생물을 이용하여 참마를 48시간 발효한 후 생성된 참마 발효물이 미생물 생장에 어떠한 영향을 주는지 알아보기 위해 생균수를 측정한 결과는 Table 3에 나타내었다. SC 발효군에서 8.22 log CFU/mL로 가장 높게 나타났고, 이어서 LC 발효군에서 7.81 log CFU/mL, LB 발효군에서 7.62 log CFU/mL, BS 발효군에서 7.51 log CFU/mL, LP 발효군에서 7.12 log CFU/mL의 순서로 각 발효물에서 유의적인 차이를 보였다. 모든 발효군에서 7.12~8.22 log CFU/mL의 범위로 높은 생균수를 보여 모든 균주 발효물에서 충분한 미생물 생장이 일어났음을 확인할 수 있어 본 실험에 사용하기에 적합하다고 생각된다.

총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

유용 균주별로 48시간 발효시킨 참마 발효물의 총 폴리페놀 함량 측정 결과는 Table 4와 같다. 대조군이 3.66 mg GAE/g으로 가장 낮은 값을 나타냈으며, 발효 균주 중에서 SC 발효물이 9.42 mg GAE/g으로 가장 높은 값을 보였고, 이어서 LP 발효물이 8.40 mg GAE/g, LB 발효물이 8.25 mg GAE/g, BS 발효물이 8.17 mg GAE/g, LC 발효물이 6.82 mg GAE/g의 순서로 나타나 발효 추출물이 무발효 추출물보다 폴리페놀 함량이 약 1.9~2.6배 정도 높아졌음을 확인하였다. 이때 LP, LB, BS 발효물에서 유의적인 차이가 존재하지 않았다. Lee와 Hong(2016)의 연구에서 오디를 L. plantarum 균주를 이용하여 발효한 후 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 무발효군에서 100 g당 4.53 g, 발효군에서 10.75 g으로 약 2배 정도 증가하였음을 보고하여 본 연구 결과와 유사한 것으로 나타났다. 이렇게 발효에 의해 폴리페놀 함량이 증가한 이유는 발효 처리에 따른 총 페놀성 성분이 고분자 화합물로부터 유리되어 저분자 폴리페놀 화합물로 전환됨에 따라 추출이 용이해지고 구조적인 전환이 일어났기 때문으로 생각된다(Kil 등, 2015).

Table 4 . Total polyphenol contents and total flavonoid contents of fermented Dioscorea japonica Thunb. by various microorganisms.

Microorganism1).	Total polyphenol contents (mg GAE2)/g).	Total flavonoid contents (mg CE3)/g).
Control. SC. BS. LB. LP. LC.	3.66±0.23d4)5). 9.42±0.41a. 8.17±0.23b. 8.25±0.34b. 8.40±0.15b. 6.82±0.22c.	1.37±0.10a. 0.52±0.27c. 0.46±0.46d. 0.81±0.03b. 0.38±0.20e. 0.26±0.01f.

¹⁾Refer to Table 2 for abbreviations..

²⁾GAE: gallic acid equivalents..

³⁾CE: catechin equivalents..

⁴⁾Mean±SD (n=3)..

⁵⁾Different letters (a-f) within a same column differ significantly (P<0.05)..

유용 균주별로 48시간 발효시킨 참마 발효물의 총 플라보노이드 함량 측정 결과는 Table 4에 나타내었다. 대조군이 1.37 mg CE/g으로 가장 높은 값을 나타내었고, 그다음으로 LB 발효군(0.81 mg CE/g), SC 발효군(0.52 mg CE/g), BS 발효군(0.46 mg CE/g), LP 발효군(0.38 mg CE/g), LC 발효군(0.26 mg CE/g)의 순서로 높은 함량을 보였다. 끄라차이담 발효물의 항산화 활성 연구(Choi 등, 2018)에서 여러 균주를 사용하여 발효한 발효물 중 BS, SC 발효군이 무발효군보다 총 폴리페놀 함량이 1.1~1.6배로 증가했지만, 총 플라보노이드 함량은 무발효군이 모든 발효군과 비교하여 높은 값을 나타낸 경향이 본 연구 결과와 일치하였다. 플라보노이드는 폴리페놀류의 일종으로 식물에 의해 합성된 페놀 화합물의 가장 큰 부류로 화학적 구조에 의해 플라바놀(flavanols), 플라바논(flavanones), 플라본(flavonols), 안토시아니딘(anthocyanidins) 등 주요 하위 그룹으로 나누어진다. 이들은 분포 및 생리활성에 차이가 있으며 시험관 실험에서 플라보노이드는 효과적인 자유라디칼 억제제로 항산화 효과를 가진다(Park 등, 2007). Shi 등(2012)은 발효를 통한 폴리페놀 분해로 플라보노이드 함량이 증가할 수 있다고 보고하였으며, Lee 등(2012)은 비수용성 폴리페놀 성분이 발효과정에서 수용성 플라보노이드로 전환되어 총 폴리페놀 함량이 감소하는 현상이 통상적으로 일어나며, 특히 폴리페놀의 일종인 catechin 등이 플라보노이드로 전환되는데 이는 발효방법에 따라 차이를 보인다고 보고하였다. 또한 Kim(2014)은 발효 횟수에 비례하여 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 함께 증가한다는 연구 결과를 종합적으로 볼 때 본 연구에서 대조군과 비교하여 발효군의 총 폴리페놀 함량은 증가하였지만 플라보노이드 함량이 감소한 이유는 시료의 종류, 발효에 사용된 균주, 발효 시간 및 방법 등이 변수 요인으로 작용하였고 폴리페놀 성분이 분해되어 플라보노이드로 전환될 정도의 충분한 발효 공정이 부족했기 때문이라고 생각된다.

DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성

유용 균주별로 48시간 발효시킨 참마 발효물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과는 Table 5와 같다. 대조군의 IC₅₀값은 20.00 mg/mL로 나타났으며, 발효군의 IC₅₀값은 3.60~5.21 mg/mL의 범위에서 대조군과 비교하여 모든 발효군이 유의적으로 높은 활성을 나타내었다. 그중 SC 발효군과 BS 발효군이 각각 3.67, 3.60 mg/mL로 가장 우수한 활성을 나타내었으며, 이 둘의 유의적인 차이는 없었다. Jang 등(2015)이 발효 균주에 따른 삼채뿌리 열수 추출물의 DPPH 자유라디칼 소거 활성을 IC₅₀값으로 나타내어 비교･분석한 결과, 발효시키지 않은 미숙성 삼채뿌리의 경우 2,552.0 μg/mL, 발효군이 57.6~1,993.2 μg/mL로 나타나 발효로 인해 DPPH 라디칼 소거 활성이 높아진 것으로 보고하였다. Chae 등(2014)의 연구에서도 오디 착즙액을 토종 발효 미생물을 이용하여 발효한 발효주의 DPPH 라디칼 소거 활성을 IC₅₀값으로 측정하였을 때 오디 착즙액의 IC₅₀값이 114.60 μL/mL, 발효군의 IC₅₀값이 73.62 μL/mL로 나타나 본 연구 결과와 경향이 유사하여 발효 처리가 DPPH 라디칼 소거 활성 효능 증진에 밀접한 관련이 있는 것으로 생각된다.

Table 5 . DPPH and ABTS radical scavenging activity of fermented Dioscorea japonica Thunb. by various microorganisms.

Microorganism1).	DPPH IC50 value2) (mg/mL).	ABTS IC50 value3) (mg/mL).
Control. SC. BS. LB. LP. LC.	20.00±1.82a4)5). 3.67±0.32c. 3.60±0.01c. 4.07±0.01bc. 4.04±0.05bc. 5.21±0.02b.	10.03±0.09d. 11.09±0.70c. 9.71±0.15e. 15.59±0.71b. 15.32±0.22b. 23.04±0.19a.

¹⁾Refer to Table 2 for abbreviations..

²⁾Amount required for 50% reduction of DPPH radical scavenging activity..

³⁾Amount required for 50% reduction of ABTS radical scavenging activity..

⁴⁾Mean±SD (n=3)..

⁵⁾Different letters (a-e) within a same column differ significantly (P<0.05)..

유용 균주별로 48시간 발효시킨 참마 발효물의 ABTS 라디칼 소거 활성 측정 결과는 Table 5에 나타내었다. BS 발효군의 IC₅₀값이 9.71 mg/mL로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 무발효군, SC, LP, LB, LC 발효군의 순서로 높게 나타났다. 이때 각 시료의 IC₅₀값은 10.03, 11.09, 15.32, 15.59, 23.04 mg/mL로 LP와 LB 발효군을 제외한 모든 시료에서 유의적인 차이가 있었다. 일반적으로 DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성 사이에는 양의 상관관계를 보이나 Lee 등(2012)의 연구에서 DPPH 라디칼은 자유라디칼, ABTS 라디칼은 cation radical을 흡광도로 측정하는 방법으로 기질과 반응물질 사이의 결합 정도나 추출물의 특성에 따라 두 방법의 라디칼 제거 능력이 다를 수 있으며, DPPH 및 ABTS 라디칼이 서로 반응하는 페놀 물질 종류에 차이가 있다고 보고하여 본 연구 결과에서 ABTS 라디칼 소거 활성이 DPPH 라디칼 소거 활성과 다른 양상을 보여 모든 발효군 중 BS 발효군만이 무발효군과 비교하여 높은 값을 나타냈다고 생각된다.

FRAP 활성

유용 균주별로 48시간 발효시킨 참마 발효물의 FRAP 활성 측정 결과는 Table 6에 나타내었다. 대조군이 14.53 mM FE/g으로 가장 낮았으며, SC 발효군이 32.15 mM FE/g으로 가장 높은 값을 나타내 대조군과 비교하여 최대 2.2배 정도 활성이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 그다음으로 LB, BS, LP, LC 발효군의 순서로 높은 값을 나타내었으며, 모든 시료는 서로 유의적인 차이를 보였다. 명월초 발효물의 항산화 활성과 tyrosinase 저해 활성(Bae 등, 2019) 연구에서 대조군과 비교하여 미생물 발효 추출물의 FRAP 활성이 약 1.2~2.4배 정도 높은 활성을 나타내 본 연구와 경향이 일치하였다. FRAP 활성은 보통 시료의 항산화 성분 함량에 비례하여 Park 등(2007)의 연구에서 폴리페놀 함량과 FRAP 활성의 상관계수가 0.971의 높은 양의 상관관계를 나타내었다고 보고하였다. 따라서 본 연구의 시료인 참마가 발효 공정에 의해 폴리페놀 함량이 증가함에 따라 FRAP 활성 또한 높아진 것으로 생각된다.

Table 6 . FRAP value and reducing power of fermented Dioscorea.

japonica Thunb. by various microorganisms.

Microorganism1).	FRAP value (mM FE2)/g).	Reducing power EC50 value3) (mg/mL).
Control. SC. BS. LB. LP. LC.	14.53±0.62f3)4). 32.15±0.64a. 28.17±0.58c. 30.87±0.20b. 26.59±0.93d. 20.61±0.27e.	>100. 0.84±0.04b. 1.07±0.09a. 0.89±0.04b. 0.81±0.02b. 1.10±0.03a.

¹⁾Refer to Table 2 for abbreviations..

²⁾FE: FeSO₄･7H₂O equivalents..

³⁾Amount required for 50% effective of reducing power..

³⁾Mean±SD (n=3)..

⁴⁾Different letters (a-f) within a same column differ significantly (P<0.05)..

환원력

유용 균주별로 48시간 발효시킨 참마 발효물의 환원력을 측정한 결과는 Table 6과 같다. 대조군의 EC₅₀값은 100 mg/mL 이상으로 모든 발효 추출물을 무발효 추출물과 비교하였을 때 매우 우수한 활성을 나타내었다. 이때 LP, SC, LB 발효군이 각각 0.81, 0.84, 0.89 mg/mL로 발효군 중에서 가장 높은 활성을 보였다. Kim 등(2013)이 발효 미생물을 이용하여 인삼꽃을 발효한 후 2.5, 5, 10, 20 mg/mL의 농도로 각각 무발효 추출물과 발효물을 제조하여 환원력을 측정한 결과, 무발효 추출물에 비해 모든 균주 발효 추출물에서 더 높은 환원력을 나타내었다고 보고하였다. 또한 Park 등(2009)의 연구에서 발효 더덕 추출물의 환원력을 흡광도로 측정한 결과, 생더덕 추출물은 1 mg/mL에서 0.34, 발효 더덕 추출물은 0.65로 나타나 발효 처리를 하는 것이 대조군보다 높은 환원력을 보여 본 연구 결과와 경향이 유사하였다.

참마 발효물의 균주별 배양 특성 측정 결과, 발효군이 대조군과 비교하여 낮은 pH를 나타내 모두 발효가 일어났음을 확인하였고, 그중에서 LP 발효군이 3.61로 가장 낮은 값을 나타냈다. 혼탁도는 발효군 중에서 LB 발효군이 0.72로 가장 높은 값을 나타내었다. 미생물 생장에 미치는 영향을 알기 위한 생균수를 보았을 때 모두 7 log CFU/mL 이상의 생균수를 나타내어 생장이 잘 일어났음을 확인할 수 있었고, 그중에서 SC 발효군이 PDA 배지에서 8.22 log CFU/mL로 가장 높은 값을 나타내었다. 추출 수율은 대조군이 21.81%로 가장 낮았으며, 발효군에서 58.91~68.44%의 범위로 나타났고 발효군 중에서 SC 발효군이 가장 낮은 값을, LC 발효군이 가장 높은 값을 보였다. 참마 발효물의 항산화 효과를 측정한 결과, 총 플라보노이드 함량과 ABTS 라디칼 소거 활성을 제외한 총 폴리페놀, DPPH 라디칼 소거 활성, FRAP 활성, 환원력에서 무발효군보다 참마를 미생물로 발효 한 모든 발효군의 항산화능이 높아진 것을 확인하였다. 그중에서 총 폴리페놀 함량과 FRAP 활성은 SC 발효군이 가장 높은 활성을 나타내었고, DPPH 라디칼 소거 활성은 SC, BS 발효군이, 환원력은 SC, LB, LP 발효군이 유의적으로 가장 우수한 활성을 보였다. ABTS 라디칼 소거 활성의 경우 BS 발효군만 대조군보다 높은 활성을 보였다. 이상의 연구 결과를 종합하였을 때 Saccharomyces cerevisiae를 이용하여 참마를 발효하였을 때 다른 미생물 발효군에 비해 미생물의 생장과 항산화 활성이 증진된 결과를 보였기 때문에 참마를 효모인 S. cerevisiae로 발효하는 것이 여러 산업 분야에서 참마의 이용 가치를 높이는데 기여할 수 있다고 판단된다.