심혈관질환의 주요 원인인 죽상동맥경화증은 동맥벽에 콜레스테롤 및 지질이 축적되어 거품세포가 형성되는 것을 특징으로 하는 만성 염증성 질환이다(Jebari-Benslaiman 등, 2022). 죽상동맥경화증의 초기 단계는 동맥벽에 침투한 low-density lipoprotein(LDL)을 대식세포가 포식하며 거품세포로 전환되면서 시작된다(Javadifar 등, 2021). 또한 후기 단계에서 거품세포는 염증과 플라크를 생성시켜 동맥 혈관을 좁아지게 만들고 혈전을 유발한다(Rafieian-Kopaei 등, 2014). 따라서 거품세포는 죽상동맥경화증의 초기와 후기에 중요한 지표이다. 거품세포는 콜레스테롤 방출을 억제하고 oxidized low-density lipoproteins(ox-LDL)의 과도한 흡수 및 콜레스테롤 에스테르화에 의해 생성되며 염증유도 물질을 분비하여 플라크 형성을 가속한다(Gui 등, 2022). 거품세포 내 지질은 막 단백질인 ATP-binding cassette cholesterol transporter A1(ABCA1)에 의해 간으로 운반되며, ABCA1은 콜레스테롤을 apolipoprotein A1(ApoA1)으로 유출을 촉진하여 대식세포 지질 침착을 완화해 항동맥경화성을 나타낸다고 보고된다(Wang과 Tall, 2003; Yin 등, 2010). Liver X receptor α(LXRα)와 peroxisome proliferator-activated receptor-γ(PPARγ)도 거품세포에서 콜레스테롤을 유출하며 ABCA1의 전사를 유도하여 거품세포 생성을 억제한다(Chinetti 등, 2001). 대식세포에서 scavenger receptor(SR)는 ox-LDL과 결합하는 막 단백질로 SR-A1과 cluster of differentiation 36(CD36)은 세포 내 지질을 축적해 거품세포 형성에 관여하며, lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor 1(LOX-1)은 내피세포의 ox-LDL의 흡수 증가를 유발하고 활성산소종을 증가시켜 내피 기능 장애를 유발한다(Chistiakov 등, 2016; Xu 등, 2013). 따라서 죽상동맥경화증의 예방 및 치료 전략 중 하나는 거품세포 내 콜레스테롤 유출을 증가시키고 염증과 지질 축적을 막는 것이다(Malekmohammad 등, 2021). 널리 사용되고 있는 죽상동맥경화증 치료 약물로는 아스피린, 스타틴, 안지오텐신 수용체 차단제가 있지만, 부정맥과 뇌출혈과 같은 부작용이 있는 것으로 알려져 있다(Kim과 Choi, 2017). 이에 최근에는 부작용이 적고 안전한 천연물을 사용하여 죽상동맥경화증을 예방하는 기능을 가진 소재에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다(Hamidy 등, 2020; Wang 등, 2017). Curcumin, artichoke, silymarin, panthenine 등과 같은 천연화합물의 항동맥경화증 효과가 밝혀지고 있다(Penson과 Banach, 2021). 파속 식물에 속하는 삼채(Allium hookeri)는 동남아시아가 원산지이며 식용 및 골다공증과 면역력 증강 등의 약용으로 사용된다(Ayam, 2011; Lee 등, 2014; Sharma 등, 2011). 삼채는 allicin, methyl thiosulfinate, cycloalliin 등의 천연화합물을 함유하고 있는데(Jun 등, 2016), 최근 삼채 뿌리와 잎에 항암, 항당뇨 효능과 같은 여러 생물학적 활성이 있다고 보고되고 있다(Bae와 Bae, 2012; Bok 등, 2019; Li 등, 2014). 그러나 삼채 뿌리 추출물이 항동맥경화증 효과에 미치는 영향은 연구가 미흡하다. 특히 거품세포 생성에 미치는 영향은 거의 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 삼채 뿌리 추출물이 인간 단핵구 THP-1 세포 유래 대식세포에서 콜레스테롤 유출, 지질 축적 및 염증 관련 유전자 발현에 미치는 메커니즘을 확인해 보고자 한다.

실험재료

본 실험에 사용된 건조된 삼채 뿌리 가루는 온라인 오픈마켓(Gmarket)에서 구입하였다. Lipopolysaccharide(LPS), ox-LDL, phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA), 3-(4-5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT)는 Sigma Aldrich에서 구입하였다. Protease & phosphatase inhibitor cocktail과 bicinchoninic acid(BCA) protein assay kit은 Thermo Scientific에서 구입하였다. 그 외 나머지 재료들은 Sigma Aldrich Co. 또는 Biosesang Inc.에서 구입하였다.

추출물의 제조

본 연구에 사용된 에탄올 추출물은 삼채 뿌리 분말 g당 10배의 80% 에탄올을 가하여 환류 냉각 95°C에서 8시간 교반하여 추출의 과정을 거치고 여과하여 얻었다. 이렇게 얻은 추출액을 회전진공농축기(rotary vacuum evaporator; N-1000, EYELA)로 감압농축, 건조하여 고형물의 함량을 산출하였다. 삼채 뿌리 추출물 수율(%)은 [추출 분말의 무게(g)/처음 사용한 시료(g)]×100으로 나타내었다. 삼채 80% 에탄올 추출물(AHEE)의 수율은 22.45%이다. 실험분석에 사용하기 위해 -80°C에서 보관하였다.

세포 배양

THP-1 세포는 인간 단핵구 세포로 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. THP-1 세포 배양을 위해 사용한 RPMI 1640(Welgene) medium 배지에 10% fetal bovine serum을 첨가하고 미생물의 오염이나 증식을 억제하기 위해 1% antibiotics(Welgene)를 첨가한 다음 95%의 습도가 유지되는 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다.

세포 생존율 측정

세포 생존율은 MTT assay를 사용하여 측정하였다. 24-well plate에 THP-1 세포를 1×10⁶ cells/mL 농도로 분주하여 PMA(1 μM)를 48시간 동안 처리해 대식세포로 분화시킨 후 AHEE(31~125 μg/mL)를 농도별로 처리하고 48시간 배양하였다. 세포 생존율을 분석하기 24시간 전 LPS(500 ng/mL)를 24시간 동안 처리하였다(Huang 등, 2012). MTT solution 100 mg/mL를 plate에 첨가하여 2시간 반응시킨 후, 상층액을 제거하고 100% dimethyl sulfoxide 1 mL로 formazan을 녹여준 후 분광광도계(EZRead 400 microplate reader, Biochrom)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율을 대조군의 흡광도 값과 비교하여, 세포 생존율(%)＝(시료 처리군의 흡광도/대조군의 흡광도)×100으로 산출하였다.

Oil red O 염색

THP-1 세포에 ox-LDL(20 μg/mL), LPS(500 ng/mL), AHEE(31~125 μg/mL)를 처리한 후 배지를 제거하고 4% 포르말린으로 30분 고정하였다. Phosphate-buffered saline(PBS)으로 세척 후 Oil red O solution 1 mL를 처리해 Leica microscope와 Leica Application Suite X software(Leica Microsystems)를 사용해 염색을 관찰하였다. 염색된 지질 밀도는 분광광도계(EZRead 400 microplate reader, Biochrom)를 사용해 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. Lipid contents(%)＝(시료 처리군의 흡광도/대조군의 흡광도)×100으로 계산하였다.

웨스턴 블롯 분석

LPS, ox-LDL, AHEE가 처리된 세포를 PBS로 세척 후 세포를 수확하여 cell pellet을 만들었다. Cell lysate를 만들기 위해 세포를 ice-cold PBS로 헹구고, RIPA buffer[150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 2 mM EDTA(pH 8.0)]와 protease & phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free(Thermo Scientific)를 첨가하여 교반하였다. 침전물은 16,343×g로 4°C에서 20분간 원심분리하여 제거한 후 상층액을 취해 whole cell lysate로 사용하였다. 핵단백질은 nuclear extraction buffer(20 mM HEPES, 0.4 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10% NP-40)로 추출하였다. Lysate의 단백질 농도는 BCA protein assay kit(Pierce)을 사용하여 정량하였다. Cell lysate를 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 분리한 후 nitrocellulose membrane(Novex, Invitrogen)에 이동시켰다. Membrane은 5% skim milk blocking buffer(20 mM Tris･Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween)에서 2시간 동안 blocking 하고 1차 항체를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 2차 항체를 첨가하여 2시간 동안 반응시킨 후 western blotting luminol reagent(Santa Cruz Biotechnology)를 이용해 ChemiDoc(Bio-Rad Laboratories)으로 결과를 분석하였다.

실시간 유전자 중합효소 연쇄반응 분석

총 RNA는 제조사의 방법(Thermo Fisher Scientific)에 따라 Trizol 시약을 사용하여 분리하였다. 총 RNA 농도 및 순도는 NanoDrop 2000 분광광도계(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 260 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 평가했다. Omniscript RT kit(QIAGEN)은 총 RNA 1 μg에서 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하였다. SYBR 기반 정량적 PCR은 CFX96 touch real-time PCR detection system(Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 수행하였다. 모든 반응은 3회 반복 실행되었다. β-Actin normalized 2^-ΔΔCT 값을 비교하여 결과를 분석하였다.

전염증성 사이토카인 생성량 측정

AHEE 처리가 사이토카인 분비에 미치는 영향을 확인해보고자 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)를 진행하였다. 대식세포로 분화한 THP-1 세포에 AHEE를 다양한 농도로 48시간 동안 배양한 후 harvest 24시간 전 ox-LDL 및 LPS로 처리한 상등액을 사용하였다. 측정 시 ELISA kit(Raybiotech)을 이용하였다. 표준곡선을 이용하여 값을 계산하였다.

형광염색법

THP-1 세포에 ox-LDL(20 μg/mL), LPS(500 ng/mL), AHEE(31~125 μg/mL)를 처리한 후 배지를 제거하고 4% 포르말린으로 30분 고정하였다. 그다음 nuclear factor-κB(NF-κB) 항체(1:100 희석, Santa Cruz Biotechnology)로 24시간 염색한 후 PBS로 세척 및 건조 후 2차 항체(1:2,000 희석, Invitrogen)와 함께 배양한 다음, DAPI(100 ng/mL)로 37°C에서 핵을 염색하였다. 염색 후 PBS로 3회 세척한 후 건조하여 Leica microscope와 Leica Application Suite X software(Leica Microsystems)를 사용해 염색을 관찰하였다.

통계처리

모든 실험은 3번 반복 실험을 하였으며, 그 결과를 평균±표준편차로 나타내었다. 각 실험 결과의 통계적 유의성을 검토하기 위해 SPSS(version 25.0, SPSS Inc.)를 이용하여 one-way ANOVA를 실시한 후 실험군 간의 사후 검증은 Duncan’s multiple range test에 의하여 판정하였다. P값이 0.05 미만일 때 유의성이 있다고 판단하였다.

THP-1 세포 염증 환경에서 AHEE에 의한 NF-κB 발현 억제

대식세포의 염증을 유도하는 LPS 자극에 의해 면역 반응에 작용하는 전사인자인 NF-κB가 활성화되어 염증반응이 일어난다(Eum 등, 2013). LPS 처리에 의한 염증 환경에서 AHEE의 세포 독성을 알아보기 위해 MTT 분석 방법을 통해 세포 생존율을 측정하였다. Fig. 1A에서 보이는 바와 같이 LPS 처리군과 비처리군 모두에서 AHEE에 대한 세포 독성이 나타나지 않았다. 따라서 이후 실험에서 세포 독성이 나타나지 않은 안전한 범위에서 실험을 진행하였다. LPS로 유도된 핵 내 sirtuin 1(SIRT1) 및 NF-κB 발현이 AHEE에 의해 조절되는지 알아보기 위해 THP-1 대식세포에 15~125 μg/mL의 AHEE를 48시간 동안 처리한 후 LPS(500 ng/mL)를 처리하였고, 그 결과를 western blot을 통해 확인하였다. Fig. 1B와 같이 LPS 처리로 유도된 염증 환경에서 SIRT1 발현이 감소하였고 NF-κB 발현이 증가하였으나, AHEE에 의해 SIRT1 발현은 증가하였고 NF-κB의 발현은 감소하였다. 이러한 결과는 AHEE가 염증반응에 관여하는 NF-κB와 SIRT1의 발현 조절을 통해 염증 억제 효과가 있다는 것을 보여준다. 우리의 연구와 유사하게 Nguyen 등(2020)은 Lasia spinosa 잎 추출물(50~400 μg/mL)이 LPS로 염증이 유도된 RAW264.7 세포에서 NF-κB 활성화를 억제했다고 보고하였다. 또한, D’Eliseo 등(2019)은 kiwifruit 껍질 추출물(12.5~50 μg/mL)이 LPS로 염증이 유도된 THP-1 유래 대식세포에서 NF-κB의 발현을 감소시켰다고 보고하였다.

Fig 1. Effect of AHEE on cell viability of LPS-treated THP-1 cells and expression of inflammatory factor. (A) THP-1 monocytes were exposed to 1 μM of PMA for 48 h and pretreated with AHEE at several concentrations (0∼125 μg/mL) and then induced with or without 500 ng/mL LPS for 24 h. Cell viability was measured using the MTT assay. Experiments were performed in triplicate, and results are presented as the mean±SD. Different letters indicate significant differences (P<0.05) as determined by Duncan’s multiple range test. (B) The protein expression levels of NF-κB and SIRT1 were determined using immunoblotting. AHEE, Allium hookeri 80% ethanol extract; LPS, lipopolysaccharides; NF-κB, nuclear factor-κB; PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate. MTT, 3-(4-5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl- 2H-tetrazolium bromide.

AHEE 처리에 의한 거품세포 억제 효과

AHEE에 의해 거품세포에 존재하는 세포질 내의 지질 축적억제 효과를 확인하기 위해 Oil red O 염색으로 측정하였다. 무처리군에서는 Oil red O 염색에 대한 양성 반응이 관찰되지 않았고, ox-LDL(20 μg/mL)과 LPS(500 ng/mL) 병용 처리군에서는 진한 Oil red O 염색 양성반응이 관찰되었다(Fig. 2). 본 연구와 유사하게 Park 등(2015)은 ox-LDL을 처리한 J774A.1 세포에서 purple Perilla frutescens 추출물(1~10 μg/mL)이 지질 축적을 감소시켰다고 보고하였다. 또한, Lee 등(2012)은 시호 추출물(1~10 μg/mL)이 RAW264.7 세포에서 거품세포의 지질 축적을 억제했다고 보고하였다. 본 연구의 결과도 위의 선행연구와 유사한 결과를 보였으며, 세포 독성이 없는 농도에서 거품세포 내의 지질 축적억제를 보였다.

Fig 2. Downregulation of lipid accumulation by AHEE treatment in THP-1 foam cells. THP-1 differentiated macrophages were cultured in the absence or presence of AHEE (0∼125 μg/mL) prior to 24 h. Then, THP-1 cell was cultured in LPS (500 ng/mL) containing ox-LDL (20 μg/mL) for 24 h. (A) Cells were stained with Oil red O, microphotographs were obtained using an optical microscope at 400× magnification. (B) Stained cells were dissolved in isopropanol solution and the staining intensity was measured at 520 nm. AHEE, Allium hookeri 80% ethanol extract; LPS, lipopolysaccharides; ox-LDL, oxidized low-density lipoproteins.

AHEE 처리에 의한 거품세포 지질 수용체 발현 억제 효과

AHEE가 지질 축적과 관련된 단백질로 알려진 CD36, SR-A1, LOX-1의 발현에 미치는 영향을 확인하였다. Fig. 3에서 보이는 바와 같이 ox-LDL과 LPS 병용 처리군에서 CD36, LOX-1, SR-A1 유전자 발현은 증가했고, 이러한 발현은 AHEE 처리로 감소하였다.

Fig 3. Inhibition of SR-A1, CD36, and LOX-1 expression by AHEE treatment in THP-1 foam cells. The protein expression levels of SR-A1, CD36, and LOX-1 were determined using (A) immunoblotting. The relative mRNA expression levels are shown after normalization against β-actin mRNA expression. (B) CD36 and (C) LOX-1 levels. The data are expressed relative to the mRNA levels found in untreated cells, which was arbitrarily defined as 1. Experiments were performed at least in triplicate, and the results are presented as mean±SD. Data were analyzed by applying the 2^-ΔΔCT method. Different letters indicate significant differences (P<0.05) as determined by Duncan’s multiple range test. AHEE, Allium hookeri 80% ethanol extract; LPS, lipopolysaccharides; ox-LDL, oxidized low-density lipoproteins; SR-A1, scavenger receptor-A1; CD36, cluster of differentiation 36; LOX-1, lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor 1.

SR-A1, LOX-1 및 CD36은 지질 흡수를 촉진하는 scavenger 수용체이다(Crucet 등, 2013). 죽상동맥경화 진행 시 SR-A1과 CD36은 ox-LDL 흡수를 촉진해 초기 거품세포 형성과 염증 신호전달 경로의 조절에 관여한다(Manning-Tobin 등, 2009). 또한 LOX-1 발현의 증가는 거품세포 형성을 촉진한다고 알려져 있다(Kattoor 등, 2019). 우리의 연구 결과와 유사하게 Kao 등(2009)은 히비스커스에서 추출한 안토시아닌(50~200 μg/mL)이 ox-LDL(25 μg/mL)을 처리한 murine 대식세포에서 CD36의 발현을 감소시키고 PPARγ의 발현을 증가시켰다고 보고하였다. 또한 Chu 등(2009)은 ox-LDL(50 μg/mL)을 처리한 THP-1 세포에 Zanthoxylum ailanthoides 잎 추출물(50~100 μg/mL)을 처리했을 때 scavenger 수용체인 CD36 발현을 하향 조절하여 거품세포 형성을 예방시켰다고 보고하였다.

AHEE 처리가 콜레스테롤 유출에 미치는 영향

AHEE가 콜레스테롤 유출 관련 단백질로 알려진 ABCA1, LXRα, PPARγ의 발현에 미치는 영향을 확인하였다. Fig. 4에서 보는 바와 같이, ox-LDL과 LPS 병용 처리군에서 ABCA1, LXRα, PPARγ의 발현이 감소하였고, AHEE를 처리했을 때 농도 의존적으로 발현이 증가하였다. PPARγ/LXRα/ABCA1은 콜레스테롤 유출 및 죽상동맥경화증의 죽종 형성과 관련된 콜레스테롤 역수송 기전으로 알려져 있다(Xu 등, 2018). High-density lipoprotein(HDL) 콜레스테롤 운송에 관여하는 ABCA1은 체외로 콜레스테롤을 유출하여 세포의 콜레스테롤과 인지질의 항상성을 조절한다(Aiello 등, 2003; Joyce 등, 2003). 핵 수용체 LXRα는 세포 내 콜레스테롤을 HDL 및 ApoA1으로 유출을 촉진하며 콜레스테롤 유출 인자를 활성화하는 역할을 한다(Bonamassa와 Moschetta, 2013). 대식세포에서 활성화된 PPARγ는 LXRα를 통해 간접적으로 ABCA1 발현을 증가시켜 콜레스테롤 유출을 증가시키는 역할을 한다고 보고되었다(Chawla 등, 2001). Park 등(2012)은 sage weed 추출물(1~20 μg/mL)이 murine 대식세포에서 ABCA1 및 apo E의 단백질 발현량을 증가시켜 콜레스테롤 유출을 증가시켰고, Chen 등(2013)은 Hibiscus sabdariffa 잎(50~200 μg/mL) 추출물이 ox-LDL(50 μg/mL)을 처리한 대식세포인 J774A.1 세포에서 LXRα/ABCA1 기전을 상향 조절해 콜레스테롤 제거를 촉진하여 죽상동맥경화증을 지연시켰다고 알려져 있다. 본 연구에서는 낮은 농도의 ox-LDL과 LPS 병용 처리에서 발생할 수 있는 거품세포를 AHEE가 콜레스테롤 유출을 증가시켜 거품세포 형성을 억제한다는 것을 확인했다.

Fig 4. Upregulation of ABCA1, LXRα, and PPARγ expression by AHEE treatment in THP-1 foam cells. The protein expression levels of ABCA1 were determined using (A) immunoblotting. Cells were harvested, and the expression of (B) the ABCA1 mRNA in ox-LDL and LPS-induced foam cells was evaluated. The protein expression levels of LXRα and PPARγ were determined using (C) immunoblotting. Cells were harvested, and the expression of the (D) LXRα and (E) PPARγ mRNA in ox-LDL and LPS-induced foam cells was evaluated. Data are presented as the means±SD. Data were analyzed by applying the 2^-ΔΔCT method. Different letters indicate significant differences (P<0.05) as determined by Duncan’s multiple range test. AHEE, Allium hookeri 80% ethanol extract; LPS, lipopolysaccharides; ox-LDL, oxidized low-density lipoproteins; ABCA1, ATP-binding cassette cholesterol transporter A1; LXRα, liver X receptor α; PPARγ, peroxisome proliferator-activated receptor-γ.

AHEE 처리에 의한 염증성 사이토카인 방출 및 관련 유전자 발현에 미치는 영향

삼채 추출물에는 ascorbic acid, phytosterol, 사포닌과 식이 유황이 포함된 것으로 알려져 있다(Ayam, 2011). 그중 식이 유황의 항염증 효과에 관한 연구 결과가 다수 보고되었다(Amirshahrokhi 등, 2011; Kim 등, 2009). AHEE가 ox-LDL 및 LPS에 의해 유발된 거품세포 형성에서 염증성 사이토카인 분비 및 NF-κB 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 염증성 사이토카인인 tumor necrosis factor-α(TNF-α)와 interleukin 6를 ELISA로 측정한 결과, ox-LDL과 LPS에 의해 유도된 거품세포 형성에서 상향 조절되었으나, AHEE 처리에 의해 유의적으로 억제되었다(Fig. 5A, 5B). 또한 Fig. 5C에서 보는 바와 같이 cyclooxygenase-2(COX-2)와 TNF-α 단백질 발현은 ox-LDL과 LPS 병용 처리로 증가하였으나, AHEE 처리에 의해 하향 조절되었다. 만성 염증은 동맥경화의 위험 인자이며, 사이토카인의 분비는 죽상동맥경화증의 발병을 촉진한다(Zhang 등, 2019). 혈관 내피세포에서 NF-κB 활성화는 염증성 유전자 발현 유도 및 플라크 형성부터 혈관 손상에 이르는 죽상동맥경화증의 여러 단계에 영향을 미친다(Morgan과 Liu, 2011). Fig. 6A와 같이 AHEE 처리에 의해 NF-κB 발현이 크게 감소했지만 SIRT1 발현은 증가하였다. AHEE는 ox-LDL과 LPS 병용 처리군과 비교하여 NF-κB mRNA 발현 수준을 감소시켰고 SIRT1 mRNA 발현 수준을 증가시켰다(P<0.05)(Fig. 6B, 6C). 또한, 면역 형광분석을 통해 AHEE가 ox-LDL과 LPS 병용 처리에 의해 유발된 p65의 핵 전위에 대한 억제 효과를 확인했다(Fig. 6D). 우리의 연구 결과와 유사하게 Liu 등(2009)은 Ginkgo biloba 추출물(10~100 μg/mL)이 ox-LDL 처리한 인간 정맥 내피세포에서 NF-κB 활성화를 감소시키고 핵으로 이동하는 것을 방지했다고 보고하였다. Jadeja 등(2011)은 Clerodendron glandulosum Coleb 추출물(10~200 μg/mL)이 ox-LDL 처리한 THP-1 세포에서 NF-κB의 발현을 억제하여 THP-1 유래 대식세포의 염증반응을 억제했다고 보고하였다. 이러한 결과는 AHEE가 ox-LDL 및 LPS에 의해 유발된 염증의 잠재적 억제제 역할을 할 수 있음을 의미한다.

Fig 5. Inhibition of inflammatory cytokine secretion by AHEE treatment in co-treated with ox-LDL and LPS-induced foam cell. THP-1 foam cells were pretreated with different concentration of AHEE (0∼125 μM) for 48 h. The secretion of (A) TNF-α and (B) IL-6 was measured using an ELISA kit. The expression levels of TNF-α and COX-2 were measured using (C) immunoblotting. Cells were harvested, and the expression of (D) the COX-2 mRNA in ox-LDL and LPS-induced foam cells was evaluated. Data are presented as the means±SD. Different letters indicate significant differences (P<0.05) as determined by Duncan’s multiple range test. AHEE, Allium hookeri 80% ethanol extract; LPS, lipopolysaccharides; ox-LDL, oxidized low-density lipoproteins; TNF-α, tumor necrosis factor-α; IL-6, interleukin 6; COX-2, cyclooxygenase-2.

Fig 6. Inhibition of NF-κB p65 activation by AHEE treatment in co-treated with ox-LDL and LPS-induced foam cell. The levels of the NF-κB and SIRT1 proteins were measured using (A) immunoblotting. Cells were harvested, and the expression of the (B) NF-κB and (C) SIRT1 mRNA in ox-LDL and LPS-induced foam cells was evaluated. Data are presented as the means±SD. Different letters indicate significant differences (P<0.05) as determined by Duncan’s multiple range test. (D) THP-1 foam cells were treated with AHEE (0∼125 μg/mL) and fixed with 4% paraformaldehyde. After blocking with an appropriate buffer, cells were incubated with NF-κB p65 antibody. Next, DAPI staining was performed to confirm the nuclei in the cells. Signals were quantified using fluorescence microscopy at 400× magnification. AHEE, Allium hookeri 80% ethanol extract; LPS, lipopolysaccharides; ox-LDL, oxidized low-density lipoproteins; NF-κB, nuclear factor-κB; SIRT1, sirtuin 1.

본 연구는 삼채 에탄올 추출물인 AHEE의 거품세포 생성 및 염증 억제 효과에 관하여 연구하였다. 삼채는 양파, 부추, 파 등과 같은 백합과에 속하며, 국내에서 다양한 염증 질환과 암 질환 등의 약용으로 사용되어 왔다. 본 연구에서 인간 단핵구 세포인 THP-1 세포를 대식세포로 분화시킨 후 ox-LDL과 LPS를 병용 처리하여 죽상동맥경화증과 유사한 세포 환경을 만들었다. AHEE의 거품세포 생성 저해 효과를 확인하기 위해 THP-1 세포를 이용하여 Oil red O 염색 및 지질 축적 관련 인자인 CD36, SR-A1, LOX-1과 콜레스테롤 유출 관련 인자인 ABCA1, LXRα, PPARγ, 염증 관련 인자인 TNF-α, COX- 2, NF-κB의 단백질 발현을 western blot으로 측정하였다. 그 결과 THP-1 세포의 거품세포 내 지질 축적 감소를 확인하였다. 또한, 지질 축적 및 염증 관련 인자들의 단백질 발현 측정에서 모두 발현이 억제되었고 콜레스테롤 유출 관련 인자들은 증가함으로써 거품세포 생성을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 AHEE가 염증 및 죽상동맥경화증을 억제 또는 예방할 가능성이 있으리라 생각된다.

이 논문은 2022년도 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No. 2022R1F1A1062814).