사회와 기술의 발전으로 식량문제가 해결되고 질병의 치료가 가능해짐으로써 인간의 평균 수명이 증가하게 되었다. 그로 인해 100세 시대에 접어들면서 ‘웰빙(well-being)’에 대한 개념이 생겨났고 자기만족 또는 노화 방지를 목적으로 하는 화장품 산업에 대한 관심이 증가하였다. 이러한 관심은 단순한 미적가치를 벗어나 건강과 관련하여 특정한 의도나 목적을 포함한 ‘기능성 화장품’으로 발전하였다. 기능성 화장품 시장이 확대되면서 다양한 천연물, 특히 식물체를 이용한 기능성 소재 연구가 증가하였다. 식물체는 스스로를 포식자로부터 보호하기 위해 phytochemical이라고 하는 2차 대사산물을 생성하는데 이것이 인간에게는 세포손상 억제 및 면역기능 향상에 도움을 주는 물질로서 작용할 수 있다. 그에 해당하는 것이 페놀 화합물과 폴리페놀로, “페놀 화합물”이라는 표현은 방향족 고리에 하나 이상의 하이드록실 치환기를 가지는 상당한 범위의 물질을 포함한다(Urquiaga와 Leighton, 2000). 이러한 물질은 안전성 부분에서 우수하기 때문에 기능성 소재로 각광받으며 현재까지 많은 연구가 진행되고 있다(Choi 등, 2011).

근본적으로 기능성 화장품의 목적은 피부의 노화 방지에 있다. 노화의 원인은 피부의 산화와 피부 구성 성분의 감소에 있기 때문에 기능성 화장품 소재는 hyaluronic acid, collagen과 같은 피부 구성물질을 증가시키거나 멜라닌의 합성을 억제함으로써 피부의 탄력 복원 및 미백효과를 줄 수 있어야 한다. 또한 항산화 물질로써 산화 진행을 방지하여 피부의 노화를 막는 역할을 수행하게 되는데(Cho, 2011), 항산화란 인체에 해로운 활성산소(free radical, ROS)를 제거하여 세포의 산화를 막는 방법이다. 활성산소는 체내의 정상 세포를 공격하여 각종 질병과 노화의 원인이 된다. 그러나 인체에는 이러한 손상으로부터 보호하는 방어 체계가 존재한다. 이 방어 체계에는 생체에 존재하는 superoxide dismutase라는 항산화 효소가 관여하는데, 연령 증가에 따라 효소의 능력이 떨어지기 때문에 외부로부터 항산화 물질을 섭취해야 한다(Lee와 An, 2016). 그러므로 우수한 항산화 활성을 가지는 새로운 천연 항산화 물질의 개발과 연구는 계속해서 요구되고 있으며 활발히 진행되고 있다.

항산화제는 특히 색이 강한 과일 및 채소와 같은 color food에 많이 함유되어 있다(Cömert 등, 2020). 식물에 존재하는 항산화 성분으로 플라보노이드가 있는데, 플라보노이드는 다양한 천연물에 존재하며 항암, 항염, 항바이러스, 항균 등 다양한 생리활성을 지닌 헤테로 고리화합물이다. 천연물 유래의 플라보노이드는 안정성이 높으며, tyrosinase 저해 효과와 색소침착 저해를 통한 미백 화장료 조성물 및 악성 흑색종 치료제와 같은 약물에 관한 연구 내용이 보고되고 있다(Kim 등, 2017; Pillaiyar 등, 2017). 식물성 색소인 안토시아닌(anthocyanins)은 일종의 플라보노이드로, 당과 aglycone이 결합된 배당체이다. 이 안토시아닌의 aglycone인 안토시아니딘(anthocyanidin)의 종류 중 하나인 델피니딘(delphinidin)은 다양한 생리활성을 가지며 항산화제로 이용되고 있다.

제비고깔(Delphinium grandiflorum)은 미나리아재비과(Ranunculaceae) 제비고깔속(Delphinium)으로 2,900 m 산지의 초원이나 산기슭에서 볼 수 있는 다년생 초본 야생화이며 한국의 북부지방, 중국 만주 및 헤이룽강 지역에 분포해 있다. 개화 시기는 여름으로 평균 7월 17일 정도이고(Inouye 등, 2002), 7~8월경 줄기 끝에 꽃이 총상화서를 이뤄 3~15개의 꽃(양성화)이 피며, 델피니딘 색소를 함유하기 때문에 꽃은 보라색에서 남색 계열을 띤다. 열매는 골돌과로, 길이 1.4~1.9 cm로 곧으며 표면에 짧은 털이 있고 9~10월경에 여문다(Inouye와 McGuire, 1991). 국립생물자원관을 통해 제비고깔은 예로부터 위장병, 경련, 마비 등의 약용 목적으로 사용했다는 기록을 확인할 수 있었으며(Jung 등, 2006), 현재까지 제비고깔에 관한 연구는 항염증과 항암효과(Kwon 등, 2009), 세포증식 및 세포분화와 관련한 골다공증으로 인한 골 손실 억제 효과(Moriwaki 등, 2014; Vazquez-Calvo 등, 2017), 그리고 미백 관련 생리활성의 연구(Chung, 2016) 등이 보고되고 있으나 제비고깔꽃만을 이용한 기능성을 확인하기 위한 생리활성과 관련한 추가 연구가 필요한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 파란색 색소를 가진 제비고깔꽃에서 유래된 phenolic 성분의 생리활성 물질에 주목하여 항산화 효과를 비롯한 피부 미용에 관여하는 효소 저해 효과를 검증하여 기능성 화장품 소재로 적용 가능성을 확인하고자 한다.

실험재료

본 연구에서 sample로 사용된 제비고깔꽃은 동아플라워자재에서 구매하여 줄기로부터 꽃을 분리한 후 50°C dry oven(FO600M, Jeiotech)에 건조시킨 후, 40 mesh로 분쇄하고 분말화하여 시료로 사용하였다.

추출물 제조

실험을 위해 증류수와 에탄올을 추출용매로 사용하였으며, 물 추출물의 경우 제비고깔꽃 분말 0.5 g을 증류수 100 mL에 침지하여 추출물이 50 mL가 될 때까지 가열한 후 냉각하여 shaking incubator에서 200 rpm(8×g)으로 24시간 동안 교반 추출하였다. 에탄올 추출물의 경우, 제비고깔꽃 분말 0.5 g을 농도별(10~100%)로 조제한 에탄올 용액 50 mL에 첨가하여 shaking incubator에서 200 rpm(8×g)으로 24시간 동안 상온에서 교반하여 추출하였다. 각 추출물은 Whatman No. 1 filter paper(Whatman Inc.)로 여과한 뒤, 필요에 따라 농도별로 농축하여 사용하였다.

Total phenolic compounds(TPC) 측정

TPC 함량 측정은 Folin-Denis 방법(1912)을 이용하여 측정하였다. 시료 추출물 1 mL에 100% 증류수 5 mL와 에탄올 1 mL를 첨가하고 1 N Folin-Ciocalteu reagent 0.5 mL를 넣고 voltexing 한 후에 5분간 대기하였다. 그리고 5% Na₂CO₃ 1 mL를 첨가하여 1시간 동안 암반응시킨 후 725 nm의 파장에서 UV-vis photospectrometer(Optizen 3220 UV, Merasys Co., Ltd.)로 흡광도를 측정하였다. TPC의 계산은 gallic acid를 이용한 표준 곡선과 대조하여 그 양을 환산하여 계산하였다.

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성 측정

DPPH 라디칼 소거활성은 Blois의 방법(1958)에 준하여 측정하였다. 반응구는 농도별로(25~100 μg/mL) 제조한 물과 에탄올 시료 추출물 각 1.0 mL에 100 μM DPPH 3 mL를 넣고, 대조구에는 시료 대신 증류수 1 mL를 첨가하여 vortexing 한 후 실온에서 15분 동안 암반응시킨 다음, UV-vis photospectrometer(Optizen 3220 UV)를 이용하여 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Positive control은 ascorbic acid를 사용하였으며, DPPH 라디칼 소거 활성(%)은 (대조구의 흡광도－반응구의 흡광도/ 대조구의 흡광도)×100으로 계산하여 나타내었다.

2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 라디칼 저해 활성 측정

ABTS 라디칼 저해 활성은 Fellegrini 등의 방법(1999)에 준하여 측정하였다. 우선 7 mM ABTS 50 mL와 140 mM K₂S₂O₈ 0.88 mL를 혼합한 후, 암실에서 약 15시간 이상 반응시켜 라디칼을 형성하였으며, 이를 약 1:88 비율로 100% 에탄올과 섞어 734 nm에서 대조구의 흡광도 값이 약 0.7±0.02가 되도록 조절하여 ABTS solution으로 사용하였다. 반응구는 시료 추출물 0.2 mL에 ABTS solution 4 mL를 혼합하였고, 대조구에는 시료 대신 증류수 200 μL를 첨가하여 vortexing 한 후 2분간 반응시키고 734 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Positive control은 ascorbic acid를 사용하였으며, ABTS 라디칼 저해 활성(%)은 (대조구의 흡광도－반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 계산하여 나타내었다.

Antioxidant protection factor(PF) 활성 측정

PF는 Andarwulan 등의 방법(1999)에 준하여 측정하였다. 먼저 β-carotene 용액을 제조하기 위해 0.05 g의 β-carotene과 50 mL의 chloroform을 혼합하여 플라스크에 넣은 후 은박지로 감싸서 농축시켰다. 그리고 0.02 mL linoleic acid, 0.184 mL Tween 40, 50 mL H₂O₂ solution을 첨가하여 β-carotene emulsion을 제조하였다. 이후 시료 추출물 0.1 mL에 emulsion 5 mL를 넣고 vortexing 하여 50°C로 맞춰둔 water bath에 넣어 30분간 빛을 차단하고 반응시킨 다음, ice water에서 5분간 냉각시킨 후에 470 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 butylated hydroxytoluene(BHT)을 사용하였으며, PF 값은 (반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)로 계산하여 나타내었다.

Thiobarbituric acid reactive substance(TBARS) 활성 저해능 측정

TBARS 활성 저해능 측정은 Buege와 Aust의 방법(1978)에 준하여 진행하였다. Emulsion 용액은 사용 직전에 제조하였으며, 5% linoleic acid와 1% Tween 40을 각각 100 mL씩 넣고 핸드믹서로 섞어 emulsion을 제조하였다. 이후 시료 추출물 0.2 mL에 emulsion 0.8 mL를 넣고 50°C의 water bath에서 16시간 이상 반응시켰다. Stock solution은 15% trichloroacetic acid(TCA), 0.375% thiobarbituric acid(TBA)와 4 mL 0.25 M HCl를 순서대로 넣어 제조하고, stock solution에 2% BHT를 섞어서 제조한 TBA reagent 4 mL를 첨가하였다. 이들을 잘 혼합하여 100°C 끓는 물에 중탕으로 15분간 가열한 후 control 색이 분홍빛으로 변했는지 확인한 다음 ice water에서 10분간 냉각시켰다. 그 후 760×g에서 20분간 원심분리기로 침전시켜 10분간 대기하고 532 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 BHT를 사용하였으며, TBARS 활성 저해능(%)은 (대조군의 흡광도－반응군의 흡광도/ 대조군의 흡광도)×100에 대입하여 나타내었다.

Elastase 저해 효과 측정

Elastase 저해 효과는 Kraunsoe 등의 방법(1996)에 준하여 측정하였다. 시료 추출물 0.1 mL에 0.2 M Tris-HCl buffer(pH 8.0)로 녹인 기질 0.8 mM N-succinyl-(Ala)3- p-nitroanilide(Sigma Aldrich Co.) 0.1 mL를 넣고 buffer(pH 8.0) 1 mL를 추가하였다. 그다음 buffer에 녹인 0.3125 U/mL porcine pancreatic elastase(Sigma Aldrich Co.) 0.1 mL를 넣고, vortexing 한 후 37°C의 water bath에서 20분간 반응시켰다. 반응 후 water bath에서 꺼내어 ice water에서 5분간 식힌 다음 410 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 (-)-epigallocatechin-3-O-gallate(EGCG)를 사용하였으며, elastase 저해 효과(%)는 (대조구의 흡광도－반응구의 흡광도/ 대조구의 흡광도)×100에 대입하여 나타내었다.

Collagenase 저해 효과 측정

Collagenase 저해 효과는 Wünsch와 Heindrich의 방법(1963)에 준하여 측정하였다. 시료 추출물 0.1 mL에 0.1 M tris-HCl과 4 mM CaCl₂를 첨가하여 제조한 buffer(pH 7.5)에 녹인 기질(0.4 mM 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg) 0.25 mL를 넣어주었다. 그다음 buffer(pH 7.5) 0.15 mL를 넣고 희석한 100 U/mL collagenase from clostridium histolyticum을 0.15 mL 추가하였다. 25°C의 water bath에서 20분간 반응시킨 후 종료 시약으로 6% citric acid를 0.5 mL 넣고 ethyl acetate를 2 mL 넣은 다음, voltexing 후 320 nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다. Positive control로 EGCG를 사용하였으며, 저해율(%)은 (대조구의 흡광도－반응구의 흡광도/ 대조구의 흡광도)×100에 대입하여 나타내었다.

수렴 효과 측정

수렴 효과는 Lee 등의 방법(2002)에 준하여 측정하였다. 피부 단백질과 유사한 혈액 단백질인 hemoglobin을 기질로 사용하여 e-tube에 시료 추출물 0.7 mL와 0.2 M의 sodium phosphate buffer(pH 7.5)에 녹인 0.4% hemoglobin 용액(Sigma Aldrich Co.)을 0.35 mL 넣고, buffer(pH 7.5) 0.35 mL를 추가하였다. 그리고 voltexing한 다음 원심분리기(FO600M, Jeiotech)로 5분 동안 450×g로 응고된 혈액 단백질을 가라앉히고 576 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. Positive control은 tannic acid를 사용했으며, 수렴 효과(%)는 (대조구의 흡광도－반응구의 흡광도/ 대조구의 흡광도)×100에 대입하여 나타내었다.

Tyrosinase 저해 효과 측정

Tyrosinase 저해 효과는 Kim 등의 방법(2006)을 이용하여 측정하였다. 시료 추출물 0.2 mL, 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.8)로 녹인 기질(1.5 mM L-tyrosinase) 0.4 mL, 그리고 buffer(pH 6.8) 2.3 mL를 넣었다. 효소는 250 kU/mL mushroom tyrosinase(Sigma Aldrich Co.)를 0.1 mL 추가하였다. 효소반응은 37°C water bath에서 20분간 반응시킨 후 ice water에서 5분간 식히고, 475 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosinase 저해 측정 실험의 positive control은 kojic acid를 사용하였으며, 저해율(%)은 (대조구의 흡광도－반응구의 흡광도/ 대조구의 흡광도)×100에 대입하여 나타내었다.

Hyaluronidase(HAase) 저해 효과 측정

HAase 저해 효과는 Dorfman과 Ott의 방법(1948)을 이용하여 측정하였다. 농도별(50~200 μg/mL phenolics) 시료 추출물 0.25 mL와 20 mM sodium phosphate buffer(pH 6.9)에 용해한 0.25 mL HAase(1,000 U/mL)를 혼합한 뒤 38°C에서 5분간 반응시켰다. 이후 0.3 M phosphate buffer(pH 5.3)에 녹인 기질(4 mg/mL)을 0.25 mL 추가하고 38°C에서 45분간 반응시킨 뒤, 0.04 M acetate buffer(pH 3.7)로 용해한 알부민 용액을 2.5 mL 첨가하였다. 그 다음 5분간 상온에서 방치시키고 600 nm에서 투과율을 측정하였다. 대조군으로는 ammonium pyrrolidinedithiocarbamate를 사용하였으며, 시료를 대신하여 0.25 mL를 넣어 반응시켰다. HAase 저해율(%)은 (1－시료의 투과율/ 대조군의 투과율)×100에 대입하여 나타내었다.

통계처리

본 연구의 결과는 평균±표준편차로 나타냈으며, SPSS software 25(SPSS Inc.)를 이용하여 결과의 평균값의 유의성을 검증하고자 평균분석 중 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였으며, Duncan의 방법으로 사후검정을 진행하여 P<0.05 수준에서 상호 비교 분석하였다.

제비고깔꽃 추출물의 TPC 함량 비교

식물체가 곤충이나 미생물 등 외부의 침입에 대해 방어기작으로 생산하는 2차 대사산물의 한 종류인 phytochemical 중 페놀 화합물은 분자구조 내의 -OH기가 단백질에 매우 잘 결합하는 특성으로 인해, 생리활성 단백질 등에 결합하여 효소활성 억제 및 항산화 등 다양한 생리적 기능을 가진다. 본 연구에서는 제비고깔꽃 추출물에 함유된 생리활성 성분인 TPC 함량을 측정하였다. 추출용매로 식품에 사용할 수 있는 물과 에탄올을 선정하여 0~100%까지 에탄올 농도별로 조절한 용매를 사용하여 에탄올 농도별로 추출 TPC 함량을 비교하였다. 그 결과는 Fig. 1과 같이 70% 에탄올 추출물에서 1 g당 페놀 함량이 13.38 mg으로 가장 높게 나타났으며, 물 추출물에서는 1 g당 13.37 mg으로 두 번째로 높게 나타났다. 이는 에탄올 농도에 따라 용출되어 나오는 총 페놀성 물질의 종류가 다르기 때문으로 판단된다. 이상의 결과를 바탕으로 이후 실험에서는 가장 높은 TPC 함량을 나타낸 물과 70% 에탄올을 용매로 사용하여 추출한 후 실험을 진행하였다.

Fig 1. Total phenolics content of Delphinium grandiflorum flower. Values are presented as mean±standard deviation (n=6). Means with different letters (a-e) are significantly different at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test.

제비고깔꽃으로부터 추출한 고형분(solid)과 추출물(phenolics)의 생리활성 비교

분말을 기준으로 한 동결건조물 고형분과 TPC 함량을 기준으로 하는 추출물 phenolics가 생리활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 제비고깔꽃 추출물의 solid와 phenolics를 동일 함량으로 제조한 후 TPC 함량, DPPH 라디칼 소거 활성, ABTS 라디칼 저해 활성을 측정 후 비교하였다. 제비고깔꽃 추출물의 phenolic 함량을 측정한 뒤, 농축하여 100 μg/mL phenolic을 함유하도록 water와 ethanol extracted phenolic을 만들었으며, water 및 ethanol extracted solid를 만들기 위하여 추출물을 다시 동결건조한 뒤, 고형분을 만들어 필요한 농도에 따라 재용해하여 사용하였다. 동결건조한 제비고깔꽃 고형분에 함유된 phenolic 성분의 함량을 측정한 결과, 물과 에탄올로 추출한 고형분에서 각각 1 mL당 7.83, 6.55 μg의 phenolic 함량을 나타내어(Fig. 2A), solid 100 μg에 함유된 phenolics의 TPC 함량은 순수한 phenolic의 양에 비해 1/16에 불과한 것으로 나타났다.

Fig 2. Comparison of radical scavenging activity by concentration of phenolics and solid from Delphinium grandiflorum flower. (A) Comparison of total phenolics content (100 μg/mL), (B) DPPH radical scavenging activity (100 μg/mL), (C) ABTS radical scavenging activity (100 μg/mL). Values are presented as mean±standard deviation (n=6). Means with different letters (a,b) are significantly different at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test.

동량의 고형분과 phenolic을 100 μg씩 적용하여 항산화 효과를 비교한 결과, phenolics의 경우 Fig. 2B와 같이 물 추출물과 70% 에탄올 추출물 모두 DPPH 라디칼 소거 활성이 86.00% 이상으로 나타났으며, solid의 경우 함유된 phenolic의 농도가 낮기 때문에 물 추출물과 70% 에탄올에서 각각 19.33%와 22.17%의 낮은 DPPH 라디칼 소거 활성이 나타나 phenolic에 비해 약 4배 이상 낮은 활성을 나타내었다. ABTS 라디칼 저해 활성 또한 Fig. 2C에서와 같이 100 μg/mL 농도에서 물 추출물과 에탄올 추출물 모두 100% 가까운 저해 효과를 나타내었다. 반면 solid의 경우, 물 추출물과 70% 에탄올에서 phenolics에 비해 약 10배 이상 낮은 것이 확인되었다. 따라서 제비고깔꽃 추출물의 생리활성은 추출물에서 용출된 phenolics에 의해 효과가 좌우되는 것으로 판단하여 phenolics의 농도를 중심으로 이후 실험을 진행하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성 비교

대표적인 항산화 활성의 한 종류인 DPPH 라디칼은 자유라디칼로써, 이에 대한 환원력이 클수록 높은 활성산소 소거 능력을 기대할 수 있어서 항산화 활성의 측정 지표로 사용된다. 제비고깔꽃 추출물의 DPPH 소거 활성을 측정한 결과 Fig. 3A와 같이 물 추출물의 25, 50, 75, 100 μg/mL phenolics 농도에서 각각 86.04, 87.92, 87.92, 90.07%의 저해율을 나타내었고, 70% 에탄올 추출물은 각각 93.38, 98.46, 99.81, 100.00%의 저해율을 나타내어 물 추출물보다 에탄올 추출물이 상대적으로 더 높은 결괏값을 나타내었으며, positive control로 사용한 ascorbic acid의 88.69~95.39% 저해율보다 더 우수한 황산화력을 나타내는 것으로 확인되었다. 이는 Jeon 등(2012)의 골담초 추출물의 DPPH 소거 활성 결과 에탄올 추출물이 200 μg/mL phenolics 농도에서 90%의 DPPH 소거 활성을 나타내었다고 보고한 것보다 제비고깔의 DPPH 소거 활성이 더욱 우수한 것으로 판단되었다. 따라서 제비고깔 추출물은 전체적으로 높은 수준의 천연항산화제로 활용이 가능할 것으로 판단되었다.

Fig 3. Effect of antioxidant activity by concentration of phenolics from Delphinium grandiflorum flower. (A) DPPH radical scavenging activity, (B) ABTS radical inhibition activity, (C) Antioxidant protection factor, (D) TBARS inhibition activity. Values are presented as mean±standard deviation (n=6). Means with different letters (a-d; A-D; α-γ) are significantly different at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test.

ABTS 라디칼 저해 활성 비교

ABTS 라디칼 decolorization은 시료의 항산화 물질에 의해 ABTS 자유라디칼이 제거되는 정도를 측정하여 친수성 및 lipophilic 물질의 항산화 활성을 판별할 수 있으며, 이 반응은 potassium persulfate로 인하여 생성되는 ABTS 자유라디칼이 추출물 내의 항산화 물질에 의해 제거되면서 청록색의 라디칼 탈색 정도를 측정하게 된다. ABTS 라디칼 저해 활성을 측정한 결과, Fig. 3B와 같이 25, 50, 75, 100 μg/mL의 phenolics 농도의 물 추출물에서 각각 39.44, 74.20, 94.34, 99.54%의 저해율을 나타내었고, 70% 에탄올 추출물은 각각 41.16, 67.88, 95.38, 100.00%의 항산화 활성을 나타내었다. Positive control로서 동일 농도의 ascorbic acid를 처리한 결과 29.23, 67.43, 99.33, 98.85%의 항산화 활성을 나타내었으며, 추출물의 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 유의적인 결과를 나타내었다. 또한 70% 에탄올 추출물이 물 추출물보다 높은 항산화 효과를 나타내었다. Jung 등(2006)은 황기 추출물의 보습 및 항산화 효과에 대해 보고하였으며, 정제수를 이용한 추출물보다 75% 에탄올 추출물에서 항산화 효과가 더 높게 나타나는 것으로 보고하였다. 이상의 결과를 통해 제비고깔 추출물은 수용성 물질에 대한 항산화 효과가 우수한 천연항산화제로 활용이 가능할 것으로 판단되었다.

PF 비교

지질의 산화과정 중 생성되는 free peroxyl 라디칼은 β-carotene의 이중결합에 반응하여 불활성 물질을 형성하며, 이로 인해 자유라디칼에 의한 연쇄반응을 중단시켜 산화가 발생한다. 산화가 발생함으로써 β-carotene이 가진 고유의 오렌지색이 탈색되며, 이러한 탈색 정도를 통하여 항산화 활성을 측정하게 된다. PF의 측정은 Fig. 3C에서와 같이 물 추출물 25, 50, 75, 100 μg/mL phenolics 농도에서 각각 1.17, 1.22, 1.25, 1.26 PF 활성을 나타내었고, 70% 에탄올 추출물은 동일 농도에서 각각 1.13, 1.17, 1.22, 1.27 PF 활성을 나타내었으며, positive control인 BHT는 25, 50, 75, 100 μg/mL 농도에서 1.10, 1.07, 1.24, 1.25, 1.27 PF 활성을 나타내었다. 물 추출물과 70% 에탄올 추출물 모두 phenolics 농도 증가에 따라 농도 의존적으로 유의적인 증가를 나타냈다. Lim 등(2017)의 보고에 따르면, PF의 경우 일반적으로 1.2 PF를 기준으로 그 이상의 경우 지용성 물질에 대한 항산화 활성이 우수한 것으로 판단한다고 보고하였다. 따라서 본 연구에 사용된 제비고깔의 경우 지용성 물질에 대한 항산화 활성이 우수한 것으로 확인할 수 있었다.

TBARS 저해 효과 비교

지질의 산화과정 중 생성되는 저분자 malondialdehyde의 생성을 억제하여 지용성 항산화 효과를 나타내는 TBARS에 제비고깔꽃 추출물이 미치는 영향을 확인하였다. 제비고깔꽃 추출물의 TBARS 활성 저해능은 Fig. 3D와 같이 물 추출물 25, 50, 75, 100 μg/mL phenolics 농도에서 각각 10.65, 18.24, 22.31, 24.05%를 나타내었고, 70% 에탄올 추출물의 경우 각각 11.81, 29.61, 38.07, 69.55%의 억제 효과를 나타내었다. Positive control인 BHT는 25, 50, 75, 100 μg/mL 농도에서 각각 94.64, 98.32, 98.85, 97.60%의 억제 효과를 나타내었다. 물과 에탄올 추출물 모두 phenolics 농도 증가에 따라 유의적인 증가를 확인할 수 있었으나, 물 추출물에 비해 70% 에탄올 추출물이 TBARS 저해 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

Elastase 저해 효과 비교

피부의 노화에 미치는 가장 큰 외인성 인자는 자외선을 꼽을 수 있으며, 자외선으로 유도된 활성산소종(reactive oxygen species)은 피부노화에 직접 작용하여 광산화적 손상을 일으켜 collagenase와 elastase 등 주름발생과 연관된 효소의 발현을 촉진한다. 이러한 효소발현 촉진은 elastin 및 collagen 섬유 등을 분해하여 피부 구성단백질인 elastin과 구조단백질인 collagen이 분해되어 정상적인 피부 구조를 유지하지 못하게 한다. 이로 인하여 피부주름과 탄력성 손실을 발생시키게 되어 피부노화가 가속되게 된다(Pillai 등, 2005). 피부의 탄력과 노화 방지 역할을 하는 피부 단백질인 elastin 및 collagen 단백질을 분해하는데 관련이 있는 효소 중 elastase의 저해 활성 효과를 측정한 결과 Fig. 4A와 같이 70% 에탄올 추출물 50, 100, 200, 400 μg/mL phenolics 농도에서 각각 7.52, 22.46, 26.91, 41.21%의 저해율을 나타내어 400 μg/mL phenolics 농도에서 저해 효과가 가장 높은 것을 확인할 수 있었으나, 물 추출물에서는 elastase에 대한 저해 효과가 나타나지 않았다. Lee와 Cho(2018)는 이팝나무꽃 에탄올 추출물의 elastase 저해 효과를 측정한 결과, 50~200 μg/mL phenolics 농도에서 10.28~35.93%의 저해 효과를 나타내었다고 보고하였으며, 제비고깔꽃에서도 이와 유사한 elastase 저해 효과를 확인할 수 있었다.

Fig 4. Effect of (A) elastase and (B) collagenase inhibition activity by concentration of phenolics from Delphinium grandiflorum flower. Values are presented as mean±standard deviation (n=6). Means with different letters (a-d; A-C) are significantly different at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test. NS: not significant.

Collagenase 저해 효과 비교

피부 구조단백질인 collagen의 분해효소인 collagenase에 대해 제비고깔꽃 추출물의 억제 효과를 살펴본 결과 Fig. 4B와 같이 70% 에탄올 추출물 50, 100, 200, 400 μg/mL phenolics 농도에서 각각 15.84, 29.57, 68.64, 82.58%의 저해율을 나타내었으며, 농도 의존적으로 억제 효과가 높아지는 것을 확인하였다. 반면, 물 추출물의 경우 elastase 실험 결과와 같이 collagenase에 대한 저해 효과도 확인할 수가 없었다. Positive control로 사용한 EGCG는 동일한 50, 100, 200, 400 μg/mL 농도에서 0.00, 19.56, 30.66, 41.06%의 효과를 나타내었으며, 이상의 결과로 제비고깔꽃 70% 에탄올 추출물은 모든 phenolics 농도에서 EGCG보다 2배에 가까운 저해 효과를 확인할 수 있었다. Lee 등(2017a)의 주름조개풀 에탄올 추출물의 collagenase 저해 효과 측정 결과, 50~200 μg/mL phenolics 농도에서 20~67%의 저해 효과를 나타내었다고 보고하여 제비고깔꽃의 에탄올 추출물의 collagenase 저해 효과가 더 우수한 것으로 확인되었다. 이상의 결과를 통해 제비고깔 추출물을 화장품에 적용한다면 피부 구조단백질 분해를 억제하여 주름 발생을 억제하는 효과를 나타낼 수 있을 것으로 판단하였다.

수렴 효과 비교

수렴 작용에는 피부 단백질이 플라보노이드 물질인 폴리페놀과 결합하여 가교결합을 형성하고 피부가 수축되어 피부 모공이 줄어들어 수렴 작용이 일어난다(Okuda, 1986). 본 연구에서는 혈액 단백질인 hemoglobin이 제비고깔꽃 추출물과 결합하여 단백질이 응고되어 가라앉은 정도를 흡광도로 측정하여 수렴 효과의 효능 정도를 판단하였다. 제비고깔꽃 추출물의 수렴 효과를 측정한 결과, Fig. 5와 같이 70% 에탄올 추출물 200, 400 μg/mL phenolics 농도에서 각각 40.93, 44.82%의 활성을 나타낸 반면, 물 추출물의 경우 전 농도에서 수렴 효과를 확인할 수 없었다. 또한 같은 농도 조건에서 positive control인 tannic acid는 200, 400 μg/mL 농도에서 각각 25.19, 96.69%의 활성을 나타내었으며, 저농도의 제비고깔꽃 70% 에탄올 추출물에서는 tannic acid보다 높은 수렴성을 나타내지만, 고농도로 올라가면 tannic acid의 수렴 효과가 더 높아지는 것을 확인할 수 있었다. Lee 등(2017b)이 층꽃나무 에탄올 추출물 50~200 μg/mL phenolics 농도에서 수렴 효과를 측정하여 각각 15~50%의 효과를 나타내었다고 보고한 것과 비교하였을 때, 제비고깔꽃의 에탄올 추출물이 우수한 효과를 가진 것을 확인할 수 있었다. 따라서 제비고깔꽃 추출물 처리에 의한 수렴현상으로 매끈한 피부를 유지하기 위한 모공축소 효과를 얻을 수 있을 것으로 판단되었다.

Fig 5. Astringent activity by concentration of phenolics from Delphinium grandiflorum flower. Values are presented as mean ±standard deviation (n=6). Means with different letters (a,b; A-C) are significantly different at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test. NS: not significant.

HAase 저해 효과 비교

Hyaluronic acid(HA)는 collagen, elastin 단백질과 같이 피부의 주요 구성 성분 중 하나로 노화가 진행될수록 감소하며, 피부보습, 주름형성, 피부탄력에 영향을 미친다(Chung 등, 2001). 피부에 존재하는 HA는 점질다당류의 구성 성분으로 피부 내 보습력이 우수하여 피부수분저장고로 불리며, 피부 영양성분 및 세포 성장인자의 저장과 확산, 세포의 분열과 분화, 이동 등에 관여한다(Dai 등, 2007). HA는 수분을 받아들여 세포외 기질을 수화시키고, 피부조직 내 수분 항상성을 유지하는 데 관여하는 중요한 인자이다(Harada와 Takahashi, 2007). HAase는 글루코사민으로 구성된 고분자 다당류인 HA를 분해함으로써 염증반응에 관여한다. 체내 알레르기 발생 시에 HAase의 활성이 증가하며 항알레르기 약물에 의해서 해당 활성이 억제되므로 HAase 활성 저해와 항염증 및 항알레르기 작용과의 관련성이 인정되고 있다(Meyer, 1947). 염증반응 인자인 HAase 저해 활성 측정 결과, Fig. 6과 같이 물 추출물 50, 100, 200, 400 μg/mL phenolics 농도에서 각각 21.48, 27.33, 31.06, 24.52%의 저해율을 나타내었고, 70% 에탄올 추출물은 각각 11.71, 12.68, 11.92, 16.81%의 저해율을 나타내었다. 물 추출물은 200 μg/mL phenolics 농도에서 가장 높은 저해 효과를 나타내었고 70% 에탄올 추출물보다 우수한 효과를 보였다. Go 등(2020)은 그린볼 사과 추출물의 HAase 저해 활성 측정 결과 0~200 μg/mL phenolics 농도에서 물 추출물은 28.35~35.04%의 HAase 저해 활성을 나타내었다고 보고하였으며, Kang 등(2004)의 연구에 따르면 오가피, 우슬, 갈근, 복분자도 10% 이상의 HAase 저해 활성을 나타내었다고 보고하였다. 이러한 결과를 비교하면 제비고깔꽃 추출물의 처리 농도를 높인다면 피부에 발생하는 트러블인 염증 효과를 억제할 수 있는 효능을 얻을 수 있으리라 판단되었다.

Fig 6. Hyaluronidase inhibition activity by concentration of phenolics from Delphinium grandiflorum flower. Values are presented as mean±standard deviation (n=6). Means with different letters (a-c; α-δ) are significantly different at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test. NS: not significant. PDTC: ammonium pyrrolidinedithiocarbamate.

제비고깔꽃 추출물의 페놀 화합물 함량을 정량한 결과, 70% 에탄올 추출물에서 13.38±0.38 mg/g, 물 추출물에서 13.37±0.64 mg/g으로 가장 높게 나타났다. 제비고깔꽃 유래의 고형분(solid)과 추출물(phenolics)의 생리활성을 비교하기 위하여 동일한 농도인 100 μg/mL로 제조하여 생리활성을 비교한 결과, phenolics의 경우 물 추출물과 70% 에탄올 추출물 모두 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능이 동일 농도의 고형분에 비해 각각 4배, 10배 정도 높은 것으로 확인되었다. 따라서 제비고깔꽃 추출물의 생리활성은 추출물에 함유된 phenolics에서 기인하는 것으로 판단하였다. 제비고깔꽃 추출물 100 μg/mL phenolics 농도에서 나타내는 항산화 효과 중 DPPH 라디칼 소거 활성은 물 추출물과 에탄올 추출물에서 각각 90.07%와 100.00%, ABTS 라디칼 소거능은 각각 99.54%와 100.00%, antioxidant protection factor는 각각 1.26 PF와 1.27 PF를 나타내었으며, TBARS 활성 저해능은 각각 24.05%와 69.55%를 나타내어 높은 항산화 효과를 나타내는 것으로 판단되었고 항산화 효과들은 phenolics 함량 증가에 따라 농도 의존적으로 효과가 높아지는 것으로 확인되었다. 또한, 주름개선 효과를 나타내는 elastase와 collagenase 억제 효과를 살펴본 결과, elastase 억제 효과는 70% 에탄올 추출물 400 μg/mL phenolics 농도에서 41.21%의 저해율을 나타내었으며, 동일 농도에서 collagenase 저해 효과는 82.58%의 저해율을 나타내어 매우 우수한 주름생성 억제 효능을 나타내는 것으로 확인되었다. 모공축소 효과를 나타내는 수렴 효과는 70% 에탄올 추출물 400 μg/mL phenolics 농도에서 44.82%의 활성을 나타내었으며, 염증 억제 효과를 나타내는 hyaluronidase 억제 효과는 물 추출물과 70% 에탄올 추출물 400 μg/mL phenolics 농도에서 각각 24.52%와 16.81%의 저해율을 나타내었다. 이상의 결과로 제비고깔꽃 추출물은 항산화, 항염증, 주름개선 및 모공축소 효과를 얻을 수 있는 기능성 화장품 원료 및 미용식품 소재로의 활용이 가능할 것이라 판단되었다.

이 논문은 2022학년도 경북대학교 연구년 교수 연구비에 의하여 연구되었음.