느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica)는 느릅나무과(Ulmaceae)에 속하는 낙엽성 활엽교목으로 수피를 유백피(楡白皮) 또는 유피(楡皮), 뿌리의 껍질을 건조한 것을 유근피(楡根皮)라고 한다. 유근피에 대한 효능으로 항암작용, 항균작용, 항염과 같은 다양한 생리활성이 보고되어 있다(Lee와 Kang, 2019). 유근피에는 진통작용을 나타내는 성분으로 friedelin과 taraxerol 등의 분리연구가 이루어졌으며, β-sitosterol, tannin, stimasterol 등의 점액질을 함유하고 있어 이뇨, 완화제, 치습 등 많은 증상에 활용했다고 알려져 있다(Matsuzaki와 Hara, 1985). 또한, 유근피를 메탄올로 추출하였을 때 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), OH 라디칼 소거능과 강한 환원력을 보였으며(Jung 등, 2008), 유근피를 80% 에탄올 추출하였을 때 다른 농도의 에탄올 추출물보다 높은 항산화, 항염증, 항고혈압의 효과를 나타내었다고 보고되어 있다(Lee 등, 2013). 생체 내에서는 산화와 관련된 현상으로 hydroxy radical, superoxide anion, singlet oxygen 등의 활성산소 역할이 대두되어 이러한 활성산소를 제거하는 것에 관한 관심이 높아지고 있다(Luceri 등, 2018). 활성산소는 강한 산화력으로 인해 DNA 합성 억제, 세포막 분해와 파괴, 지방산화 등 심각한 생리적인 장애를 유발한다(Gardner와 Fridovich, 1991). 일반적으로 BHT, BHA 등의 합성 물질이 항산화제로 사용되어 왔지만, 이들에 대한 독성문제가 알려져 사용에 많은 문제가 되고 있기 때문에 천연 항산화제 개발이 필요한 시점이다(Jun 등, 2001). 체내에는 활성산소를 억제하는 superoxide dismutase(SOD)와 catalase 등의 항산화 효소가 존재하며, 이들은 활성산소종(ROS)을 제거하여 산화적 손상으로부터 세포를 보호한다(Xiao 등, 2017). 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 짧은 최대 수명을 갖는 생물로 인간의 유전자와 약 60% 유사한 생물이며, 에너지 대사 증후군 및 수명 연장 등 다방면에서 실험 모델로 이용되고 있다(Bargmann, 1998; Kampkötter 등, 2008). 본 연구에서는 유근피 에탄올 추출물을 계통분획법에 따라 분획하여 추출물과 각각의 분획에 대한 항산화 효능을 DPPH 자유라디칼 및 ABTS 라디칼 소거 활성과 superoxide 소거 활성으로 측정하여 가장 뛰어난 항산화 활성을 보인 ethyl acetate 분획을 확보하여 예쁜꼬마선충을 실험모델로 항산화 기전을 연구하였다. 먼저 예쁜꼬마선충 체내의 SOD, catalase 항산화 효소의 활성을 확인하였으며, 선충 세포 내 ROS 발생의 억제 능력을 확인하였다. 또한, juglone을 처리한 선충의 산화적 스트레스에 대한 저항력을 확인하고, 형질 전환된 mutant 선충 CF1553을 이용한 유전자 발현의 증가에 대한 여부를 확인하였다.

기기 및 시약

Agar, catalase, nitro blue tetrazolium(NBT), 2′,7′-dichlorodihydro-fluorscein-diacetate, juglone, xanthine, xanthine oxidase는 Sigma에서 구입하여 사용하였다. 흡광도 측정은 microplate reader(Tecan mmr SPARK Cyto)를 사용하였으며, GFP의 발현량 측정은 형광실체 현미경(Olympus)을 사용하였다.

실험재료

실험에 사용한 유근피는 두손애약초에서 구입하여 식품생명공학과 김준형 교수의 검수를 받아 사용하였으며, 표준품은 우석대학교 식품생명공학과에서 보관하고 있다.

추출 및 분획

유근피 600 g을 분쇄 후 2 L의 에탄올을 가하여 6시간씩 50°C에서 3회 반복하여 열수 추출하였으며, 추출액을 수욕 상에서 감압농축(DH.WEV-1001V, DAIHAN Scientific)하여 에탄올 추출물 51.3 g을 얻었다. 에탄올 추출물을 증류수 1 L로 현탁시키고 상법에 따라 동량의 n-hexane(5.18 g), methylene chloride(0.54 g), ethyl acetate(4.65 g), n-butanol(8.44 g)의 순서대로 분획하여 각각의 분획을 확보하였으며 항산화 측정에 필요한 시료로 사용하였다.

DPPH 자유라디칼 소거 활성 측정

유근피 분획 시료를 에탄올을 용매로 제조하여 96-well plate에 50 μL를 가하고 0.2 mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhrazyl(DPPH)을 200 μL 가하였다. 10초간 진탕시킨 후 30분간 실온에서 반응시켜 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 시료에 대하여 3회 반복측정 하였으며, 대조약물로 L-ascorbic acid를 사용하였다(Yoshida 등, 1989).

ABTS 라디칼 소거 활성 측정

유근피 분획 시료에 대한 ABTS 라디칼 소거 활성 측정은 7.4 mM ABTS와 2.6 mM K₂S₂O₈을 동량 혼합하여 암소에서 24시간 동안 라디칼 형성을 유도한 후 ABTS 라디칼 용액의 흡광도 값이 0.7±0.03이 되도록 phosphate buffer saline(pH 7.4)을 이용하여 희석하여 사용하였다. ABTS 용액 100 μL와 농도별 시료 10 μL를 가하여 암소에서 10분간 반응시킨 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성은 3회 반복측정 하였으며, 대조약물로 L-ascorbic acid를 사용하였다(Re 등, 1999).

Xanthine 유래 superoxide 소거 활성 측정

Thunog 등(2007)의 방법에 따라 xanthine/xanhtine oxidase에 의해 생성되는 superoxide 라디칼 소거 활성 능력을 측정하였다. 100 μM nitro blue tetrazolium(NBT)과 250 μM xanthine을 포함한 20 mM phosphate buffer(pH 7.8)와 시료 10 μL를 혼합하여 5분간 반응시킨 후 xanthine oxidase(0.05 U/mL) 100 μL를 가하여 37°C에서 30분간 반응시켰다. 이후 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료에 대한 NBT의 환원 정도를 대조군과 비교하여 superoxide 라디칼 소거 활성을 측정하였다.

예쁜꼬마선충의 배양

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans, N2)은 Escherichia coli(OP50)가 도말된 nematode growth medium(NGM) agar plate 상에서 배양하였으며(20°C), 알을 따로 회수하기 위하여 M9 buffer로 3회 세척 후 bleaching solution(NaClO, 5 M KOH) 용액을 가하여 알을 회수하였다(Brenner, 1974). 시료는 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 용매로 하여, 멸균된 NGM plate(50°C)에 stock solution 상태로 첨가하였으며 최종 DMSO 농도는 0.1%(v/v)를 유지하였다.

선충 체내의 항산화 효소(SOD, catalase) 활성 측정

DMSO를 용매로 하여 농도별로 조제한 유근피 ethyl acetate 시료를 plate에 넣고 성장단계를 동일시 한 선충을 배양하였다. 성체가 된 후 2일째의 선충을 M9 buffer로 세척 후 분쇄하여 항산화 효소 활성 측정에 사용하였다(homogenization buffer: 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.5). SOD의 활성은 10 mM phosphate buffer(pH 8.0)를 용매로 한 반응혼합물(1.6 mM xanthine과 0.48 mM NBT) 0.49 mL를 만들고 난 후 농도별 시료 10 μL를 가하여 20°C에서 5분간 pre-incubation 시켰다. 5분 후 0.05 U/mL xanthine oxidase 100 μL를 가하고 37°C에서 20분간 incubation 한 후 69 mM의 SDS로 반응을 멈춘 Catalase activity는 25 mM H₂O₂에 농도별 시료 50 μL를 가하여 3분간 반응시키고 240 nm에서 흡광도를 측정하였다(Aebi, 1984).

선충 세포 내 ROS 분석

유근피 ethyl acetate 분획을 처리한 선충 내 ROS는 2′,7′-dichlorodihydro-fluorescein-diacetate(H₂DCF-DA)를 사용하여 측정하였다. 유근피 수용액이 첨가된 plate에 배양된 성장단계가 동일한 4일째의 선충을 100 μM juglone을 함유한 M9 buffer에 넣어 20°C에서 정확히 2시간 반응시킨 뒤 50 μL M9 buffer가 담긴 96-well plate에 옮겨 넣었다. 이후 50 μM H₂DCF-DA를 50 μL 가한 뒤 excitation 485 nm, emission 535 nm에서 흡광도를 측정하였다(Kim 등, 2015).

산화적 스트레스 저항성 평가

유근피 ethyl acetate 분획이 예쁜꼬마선충에게 산화적 스트레스에 미치는 영향을 알아보기 위해 성장단계를 동일시 한 선충을 농도별(250, 500 μg/mL) plate에 배양하였다. 7일째 선충을 juglone(1 mM)이 함유된 M9 buffer가 담긴 96-well plate에 옮긴 후 시간대별로 생존율을 측정하였다(Lee 등, 2005).

형질전환 선충세포 내 SOD-3::GFP 발현량 측정

형질전환 된 SOD-3::GFP를 포함한 CF1553 선충을 유근피 시료를 농도별로 제조한 배지에서 배양하였다. 성체가 된 지 3일째 선충을 4% sodium azide로 마취시키고 형광실체현미경으로 선충 체내 GFP의 발현을 관찰하였다. 발현강도를 정량하고 분석하기 위해 현미경을 이용하여 사진을 촬영하였으며 Image J software를 사용하여 분석하였다. 모든 실험은 3회 반복 측정하였다.

통계분석

통계 자료의 값은 평균값±표준오차(mean±SEM)로 표시하였으며, 그룹 간에 대한 통계적 유의성 검정은 Student’s t-test를 이용하여 분석하였다. 선충의 연속적인 생존도는 Log-rank test 분석 방법을 이용하였으며, P값은 P<0.05, P<0.01, P<0.001일 때 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

DPPH 자유라디칼 소거 활성 측정

유근피 분획에 대한 DPPH 자유라디칼 소거 활성은 Fig. 1에서와 같이 ethyl acetate 분획의 활성이 가장 뛰어나게 측정되었으며(IC₅₀ value, 11.11 μg/mL), 농도 의존적으로 증가함을 나타내었다. 대조군인 ascorbic acid(IC₅₀ value, 3.93 μg/mL)와 비교하였을 때보다 약간 낮게 측정되었으나 분획 중 가장 뛰어난 활성을 나타내었다.

Fig 1. DPPH free radical scavenging effects of the ethanol extract, and its fractions from the Ulmus dividiana var. japonica. Vit.C, vitamin C; EtOH, ethanol; n-Hex, n-hexane; MC, methylene chloride; EA, ethyl acetate; n-BuOH, n-butanol.

ABTS 라디칼 소거 활성 측정

유근피 분획에 대한 ABTS 라디칼 소거 활성은 Fig. 2에서와 같이 ethyl acetate 분획의 활성이 가장 뛰어나게 측정되었다(IC₅₀ value, 1.19 μg/mL). 또한, 농도 의존적으로 소거 활성이 증가함을 나타내었으며, 대조군인 ascorbic acid(IC₅₀ value, 1.21 μg/mL)보다 우수한 활성을 나타내었다.

Fig 2. BTS radical scavenging effects of the ethanol extract, and its fractions from the Ulmus dividiana var. japonica. Vit.C, vitamin C; EtOH, ethanol; n-Hex, n-hexane; MC, methylene chloride; EA, ethyl acetate; n-BuOH, n-butanol.

Xanthine 유래 superoxide 소거 활성 측정

NBT의 환원력을 비교하는 superoxide quenching 활성은 Fig. 3에서와 같이 유근피 ethyl acetate 분획의 IC₅₀ 값이 15.38 μg/mL로 활성이 가장 좋았으며, 대조군인 ascorbic acid의 IC₅₀ 값 60.26 μg/mL보다 뛰어나게 측정되었다.

Fig 3. Xanthine-originated superoxide quenching activities of the ethanol extract and its fractions of Ulmus dividiana var.japonica. Vit.C, vitamin C; EtOH, ethanol; n-Hex, n-hexane; MC, methylene chloride; EA, ethyl acetate; n-BuOH, n-butanol

선충 체내 항산화 효소 활성 측정

유근피 시료를 처리한 선충을 이용하여 xanthine을 기질로 xanthine oxidase의 효소반응 과정 중에 생성되는 superoxide anion을 활용하여 선충 체내에 존재하는 SOD 활성을 측정하였다. Fig. 4A와 같이 유근피 ethyl acetate 분획 투여군에서 SOD의 활성이 농도 의존적으로 증가함을 확인하였으며, ethyl acetate 분획 500 μg/mL 투여군은 대조군과 비교하여 SOD 활성을 38.0%(P<0.001) 증가시켰다. 또한, 체내에서 hydrogen peroxide를 대사시키는 역할을 하는 catalase의 활성은 Fig. 4B와 같이 유근피 ethyl acetate 분획 500 μg/mL 투여군이 대조군에 비해 약 31.4% 증가시켰다(P<0.01)(Fig. 4).

Fig 4. Effects of antioxidant enzyme activities. Effects of Ulmus dividiana var. japonica ethyl acetate fraction on the antioxidant enzyme activity of wild N2 nematodes. (A) SOD activity was expressed by a percentage of the scavenge amount of control. (B) Catalase activity was calculated from the concentration of residual H₂O₂ measured by a spectrophotometric method. Differences compared with the control were considered significant at ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001 by one-way ANOVA.

선충 세포 내 ROS 감소 효능

유근피 ethyl acetate 분획의 선충 세포 내 ROS를 감소시키는 효능을 알아보기 위해 선충 체내의 ROS와 H2DCF-DA를 반응시켜 형광을 관찰하였다. ROS로 인한 120분까지의 형광 감소의 폭은 대조군과 비교하였을 때 ethyl acetate 분획 500 μg/mL 투여군에서 약 14.2% ROS를 감소시키는 효능을 나타내었으며, 120분 시점에서의 형광 감소폭은 대조군에 비해 21.3%(P<0.01) 유의성 있는 감소폭을 나타내었다(Fig. 5).

Fig 5. Analysis of intracellular ROS. Effects of Ulmus dividiana var. japonica ethyl acetate fraction on the intracellular ROS accumulation of wild-type N2 nematodes. The worms were incubated with 100 μM juglone for 2 h, and subsequently treated with the fluorescent probe H₂DCF-DA. Intracellular ROS accumulation was quantified spectrophotometrically at excitation 485 nm and emission 535 nm. Plates were read 0 for 120 min. Differences compared with the control were considered significant at ^**P<0.01 and ^***P<0.001 by one-way ANOVA.

산화적 스트레스 저항성 평가

산화적 스트레스 조건에서 유근피 ethyl acetate 분획이 선충의 생존율에 미치는 영향을 확인하였다. 선충에게 산화적 스트레스를 유발하기 위해 M9 buffer에 일정농도의 juglone을 함유시키고 96-well plate에 예쁜꼬마선충을 방치시켰다. 대조군 선충의 최고 생존시간은 29시간으로 측정되었으며, 유근피 ethyl acetate 분획 250 μg/mL에서는 생존시간을 32시간으로 증가시켰고, 500 μg/mL에서는 생존시간을 34시간으로 증가시킨 것을 확인하였다. 대조군의 평균 생존시간은 18.9±1.0시간이었으나 250 μg/mL 처리군의 평균 생존시간은 21.5±1.0시간, 500 μg/mL 처리군의 평균 생존시간은 22.5±1.1시간으로 생존시간을 14.0%, 19.2% 향상시켰다(Fig. 6, Table 1).

Table 1 . Effects of ethyl acetate fraction of Ulmus dividiana var. japonica on the oxidative stress tolerance of C. elegans.

Stress condition	Fraction	Mean lifespan (h)	Maximum lifespan (h)	Change in mean lifespan (%)	Log-rank test
1 mM Juglone	Control	18.9±1.0	29	－	－
	250 μg/mL	21.5±1.0	32	14	**P<0.01
	500 μg/mL	22.5±1.1	34	19.2	***P<0.001

Fig 6. Effects of ethyl acetate fraction of the Ulmus dividiana var. japonica on the stress tolerance of wild-type N2 nematodes. For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96- well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test.

형질전환 선충 내 SOD-3::GFP 형광 측정

유근피 ethyl acetate 분획을 처리한 선충 내 산화적 스트레스에 저항하는 단백질의 발현 여부를 알아보기 위해 SOD 발현 유전자의 여부를 확인하였다. 측정에 사용한 선충은 SOD-3::GFP를 포함하는 형질전환 된 CF1553 선충이었으며 유근피 ethyl acetate 분획 250 μg/mL, 500 μg/mL 처리군이 대조군에 비해 증가한 SOD-3::GFP 발현율을 각각 9.5%(P<0.05), 16.1%(P<0.01)를 나타내었다(Fig. 7).

Fig 7. Effects of ethyl acetate fraction of the Ulmus dividiana var. japonica on the expression of SOD-3 (CF1553) was determined using transgenic nematodes. (A) Images of SOD-3::GFP expressions of CF1553 nematodes in presence or absence of the ethyl acetate fraction of Ulmus dividiana var. japonica. (B) The mean GFP-expressing intensity of CF1553 mutants was expressed as mean± SEM of values from 90 worms per each experiment. Data are expressed as the mean±standard deviation of three independent experiments (N=3). Differences compared with the control were considered significant at ^*P<0.05 and ^**P<0.01 by one-way ANOVA.

본 연구에서는 예쁜꼬마선충을 모델로 유근피 용매 분획에 대한 항산화 효과에 관하여 확인하였다. 예쁜꼬마선충은 노화를 촉진하는 표적을 탐색하기 위한 모델로 사용되고, 다양한 생체 활성 화합물의 선별에 널리 이용되고 있으며, 게놈 시퀀싱이 수행되어 유전 경로가 확보되어 있어 항산화 및 항노화 효과를 측정할 수 있는 좋은 모델로 사용되고 있다(Ayuda-Durán 등, 2019; Luo 등, 2019). 또한 DPPH 라디칼과 ABTS 라디칼은 항산화능이 있는 물질과 반응하면 탈색이 되는 원리를 이용한 실험법으로 천연소재로부터 항산화제 개발에 관한 연구에 널리 이용되고 있다(Dudonné 등, 2009). 본 연구에서는 유근피 용매 분획의 DPPH 자유라디칼 및 ABTS 라디칼 소거 활성을 먼저 측정하여 가장 뛰어난 항산화 활성을 나타낸 ethyl acetate 분획을 확보하였다. 본 연구의 유근피 ethyl acetate 분획에 대한 DPPH 자유라디칼 소거활성능(IC50 value, 11.11 μg/mL)(Fig. 1)은 이미 보고된 유근피 ethyl acetate 분획의 DPPH 라디칼 소거 활성과(SC₅₀ value, 134.33 μg/mL)(Yang 등, 2019) 유근피 acetone 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성(EC₅₀ value, 36.7 μg/mL)(In과 Kim, 2016)보다 뛰어난 자유라디칼 소거 활성으로 평가되었다. 또한, 유근피 ethyl acetate 분획의 ABTS 라디칼 소거활성능은(IC₅₀ value, 1.19 μg/mL)(Fig. 2) 이미 보고된 70% 메탄올을 용매로 추출한 유근피의 ABTS 라디칼 소거활성능(IC₅₀ value, 4.8 μg/mL)보다 뛰어난 소거 활성으로 평가되었다(Moon과 Lee, 2009). 감초의 추출조건에 따른 항산화 활성에 관한 연구 결과를 살펴보면 에탄올 추출물과 ethyl acetate 추출물의 항산화 활성이 가장 뛰어나다는 연구 결과가 보고되어 있으며, 에탄올의 함량이 높을수록 극성이 높은 용매일수록 항산화 활성이 뛰어나다는 결과가 보고되어 있다(Kim 등, 2006). 유근피 ethyl acetate 분획에 대한 라디칼 소거 활성이 우수한 이유가 이와 유사하다고 판단된다. Xanthine oxidase는 xanthine으로 인해 uric acid를 생성하여 체내에 염증을 유발하여 여러 질환을 일으키는 원인으로 작용하게 된다. 따라서 xanthine oxidase의 활성을 억제하면 항산화 및 항염증 등 효과를 기대할 수 있게 된다(Wyngaarden과 Holmes, 1977). Xanthine/xanthine oxidase에 의해 생성된 superoxide 라디칼 소거활성능을 측정한 결과 유근피 ethyl acetate 분획의 소거 활성(15.38 μg/mL)(Fig. 3)을 확인하였다. 유근피 ethyl acetate 분획의 항산화 효능평가를 예쁜꼬마선충을 실험모델로 몇 가지 확인한 결과, superoxide 라디칼을 제거하는 SOD와 hydrogen peroxide를 제거하는 catalase 활성을 농도 의존적으로 증가시켰음을 확인하였다(Fig. 4). 이러한 결과는 이미 보고된 암을 유발한 수컷 마우스에 70% 에탄올을 용매로 추출한 유근피 추출물을 투여 하였을 때 SOD와 catalase의 활성이 증가함을 보고한 결과와(Hong 등, 2006), 역류성 식도염을 유발시킨 수컷 마우스에게 water를 용매로 추출한 유근피 추출액을 농도별로 투여 하였을 때 농도 의존적으로 SOD와 catalase의 활성을 증가시켰다는 결과(Shin 등, 2016)와 유사한 결과임을 확인하였다. SOD는 호기적 대사를 하는 생물체가 갖는 항산화 효소로 산화로 인한 체내 세포의 손상에 대하여 방어하는 작용을 하며(Chow, 1979), catalase는 반응성이 강한 수산화기로부터 조직을 보호하며 과산화수소의 감소를 촉진하는 역할을 한다(Jakoby, 1978). 유근피 ethyl acetate 분획은 예쁜꼬마선충 내 SOD와 catalase의 활성을 농도 의존적으로 증가시켜 산화적 손상에 대한 방어기전에 도움을 주는 것으로 확인되었다. ROS는 체내의 SOD, catalase, glutathione 등의 항산화 효소의 활성을 저하시키고 각종 스트레스, 세포 손상 등을 유발하여 산화적 스트레스를 야기하여 노화와 퇴행성 질환 및 각종 암이나 염증 생성 등에 관여하는 것으로 보고되어 있다(Moloney와 Cotter, 2018). Juglone은 산화적 스트레스, 세포자살 및 괴사를 유발하는 물질로 ROS의 발생량을 증가시키게 된다(Ahmad와 Suzuki, 2019). Juglone으로 산화적 스트레스를 가한 선충 세포 내 ROS 축적에 관하여 확인한 결과 유근피 ethyl acetate 분획 처리군에게서 대조군에 비해 우수한 ROS의 축적억제 효능을 나타내었다(500 μg/mL, 14.2%)(Fig. 5). 이러한 결과는 씀바귀 ethyl acetate 분획을 처리한 선충 내 ROS 축적에 관한 결과(500 μg/mL, 14.2%)와 동일한 결과를 나타내었으며(Choi 등, 2022), 돼지감자꽃 ethyl acetate 분획을 처리한 선충 내 ROS 축적에 관한 결과(500 μg/mL, 12.7%)와 비교하였을 때, 보다 우수한 ROS 축적에 대한 감소 효능을 나타내었다(Kim 등, 2019). 유근피 ethyl acetate 분획을 투여한 예쁜꼬마선충의 산화적 스트레스에 대한 저항성을 확인한 결과(Fig. 6, Table 1), 유근피 ethyl acetate 분획(250 μg/mL) 투여군의 평균 생존시간(21.5±1.0)은 이미 보고된 예덕나무가지 ethyl acetate 분획(250 μg/mL) 투여군의 생존시간(15.3±1.0)에 비해 증가한 저항성을 나타내었다(Kim 등, 2020). 따라서 유근피 ethyl acetate 분획은 예쁜꼬마선충에게 산화적 스트레스에 대항하여 저항성을 높여 방어하는 기전에 도움을 주는 것으로 확인되었다. 형질 전환된 GFP-fused transgenic strain CF1553 모델은 GFP의 발현율에 따라 시료 중 산화적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 물질이 함유되어 있음을 확인할 수 있는 모델로 이용되고 있다(Seo 등, 2015). 유근피 ethyl acetate 분획 250 μg/mL, 500 μg/mL 투여군은 대조군에 비해 각각 9.5%, 16.1% 증가한 GFP의 발현율을 나타내었으므로(Fig. 7), 이는 유근피 ethyl acetate 분획이 선충에게 산화적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 단백질의 증가에 관여하는 것으로 확인되었다. Bong과 Park(2010)은 유근피에서 분리한 hederagenin 3-O-_β-D-glucopyranosyl(1→3)-_α-L-rham-nopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranoside (HDL)를 이용한 항산화 기전에 대한 조사에서, HDL이 CoCl₂에 의해 유발된 xanthine oxidase와 H₂O₂ 생성의 증가를 억제하였고, SOD와 catalase의 활성이 증가함을 보고하여 HDL을 이용한 독성이 없는 천연 항산화제 개발에 대한 자료를 제공한 바 있다. 본 연구 결과를 종합하였을 때 유근피 ethyl acetate 분획은 뛰어난 라디칼 소거 활성을 나타내었으며, 예쁜꼬마선충 체내 항산화 효소(SOD, catalase)의 활성을 농도 의존적으로 증가시켰고 선충 체내 발생하는 ROS의 축적을 억제하였으며, 산화적 스트레스에 대한 저항성을 나타내었다. 또한, 형질 전환된 CF 1553 선충에게 산화적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 단백질의 발현에 관여하는 것으로 확인되었다. 따라서 유근피 ethyl acetate 분획으로부터 분리한 단일 물질 수준에서 예쁜꼬마선충을 대상으로 항산화 효능평가에 관한 연구가 지속적으로 이루어진다면 활성산소와 관련된 각종 질환의 예방 또는 치료에 도움을 줄 수 있는 천연 항산화제 개발을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.

본 연구에서는 에탄올을 용매로 유근피를 추출하고 계통분획법에 따라 n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate, n-butanol 순으로 분획하여 DPPH 자유라디칼과 ABTS 라디칼 소거 활성 및 xanthine 유래 superoxide 라디칼 소거 활성을 측정하여, ethyl acetate 분획에서 가장 뛰어난 항산화 활성이 나타남을 확인하였다. 유근피 ethyl acetate 분획이 예쁜꼬마선충 내 항산화 효소인 superoxide dismutase(SOD)와 catalase의 활성을 농도 의존적으로 증가시켰으며, 예쁜꼬마선충 내 ROS의 발생량을 농도 의존적으로 현저히 감소시켰다. 또한, 산화적 스트레스를 유도하기 위하여 juglone을 투여한 선충의 생존율에 미치는 영향을 확인한 결과 유근피 ethyl acetate 분획을 처리한 선충의 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 이와 관련하여 형질 전환된 예쁜꼬마선충 GFP-fused transgenic strain CF1553을 실험모델로 산화적 스트레스 저항성을 갖는 SOD-3::GFP의 발현량을 측정하였다. 이 또한 마찬가지로 유근피 ethyl acetate 처리군에게서 농도 의존적으로 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과를 종합하였을 때 유근피 ethyl acetate 분획은 항산화와 관련된 질병의 예방 및 치료, 천연 항산화제 개발에 어느 정도 기여할 수 있을 것으로 사료된다.