Determination of the Pantothenic Acid and Pyridoxine Contents in Seasoning Products

Yubin Shin; Myoung-Gun Choung

doi:10.3746/jkfn.2023.52.7.708

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Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2023; 52(7): 708-715

Published online July 31, 2023 https://doi.org/10.3746/jkfn.2023.52.7.708

Determination of the Pantothenic Acid and Pyridoxine Contents in Seasoning Products

Yubin Shin and Myoung-Gun Choung

Department of Bio-Functional Material, Kangwon National University

Correspondence to:Myoung-Gun Choung, Department of Bio-Functional Material, Kangwon National University, 346, Hwangjo-gil, Dogye-eup, Samcheok, Gangwon 25949, Korea, E-mail: cmg7004@kangwon.ac.kr

Received: March 23, 2023; Revised: May 15, 2023; Accepted: May 21, 2023

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

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Abstract
서 론
재료 및 방법
결과 및 고찰
요 약
References

Seasoning is an ingredient used to enhance the taste of food, and it is one of the most commonly used ingredients in cooking. On the other hand, there has been limited research on the contents of pantothenic acid and pyridoxine in seasonings. Therefore, this study measured the contents of pantothenic acid and pyridoxine in 56 types of seasonings using HPLC/DAD and HPLC/FLD methods. The pantothenic acid and pyridoxine contents in seasonings were 0.0000∼15.326 mg/100 g and 0.0000∼0.385 mg/100 g, respectively. For spices, the pantothenic acid and pyridoxine contents were 0.000∼15.326 mg/100 g and 0.000∼0.385 mg/100 g, respectively. Fermented soybean products contained 0.000∼11.497 mg/100 g and 0.000∼0.173 mg/100 g pantothenic acid and pyridoxine, respectively. For sauces, the pantothenic acid and pyridoxine contents were 0.000∼0.880 mg/100 g and 0.000∼0.057 mg/100 g, respectively. Pantothenic acid was not detected in oils, but the pyridoxine contents were 0.000∼0.015 mg/100 g. Among the seasonings reviewed, the pantothenic acid (15.326±0.052 mg/100 g) and pyridoxine (0.385±0.004 mg/100 g) contents were particularly high in Sichuan powder. These results are expected to help improve dietary habits and promote public health.

Keywords: food analysis, seasoning, HPLC, pantothenic acid, pyridoxine

서 론

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Abstract
서 론
재료 및 방법
결과 및 고찰
요 약
References

매체의 발달, 기술의 발달 및 시장 개방으로 인해 새로운 형태의 생활양식이 만들어짐과 동시에 건강한 삶을 유지하기 위하여 식습관의 다변화가 이루어졌다(Park 등, 2022). 다양한 식문화에 의해 여러 종류의 양념들이 사용되고 있으며, 양념은 맛과 향을 향상시키기 위해 첨가되고, 맛과 향에 따라서 소비자들의 식품 선호도가 달라지기 때문에 이를 적합하게 사용하는 것이 중요하다(Jin 등, 2004; Titman, 2019; Yang과 Woo, 1987). 양념은 향신료와 더불어 풍미를 증가시킬 목적으로 사용되는 장류, 소스 및 유지 등을 포함하며(Encyclopedia of Korean Culture, 2023; García-Casal 등, 2016), 저렴할 뿐만 아니라 전 세계적으로 많은 사람이 식품 조리 시 사용하고 있다(Chavasit와 Photi, 2018).

국내 양념류의 시장 규모는 식품산업통계정보시스템(aTFIS, 2020)에 의하면 2016년에 비해 2020년에는 조미료 및 식품첨가물의 출하액이 약 15.8% 증가하였고, 간편식 시장 성장 및 내식 증가 등으로 인해 소스류의 생산량 및 수출액이 각각 약 22.4% 및 85.7%로 증가하였다(aT, 2021a). 그러나 장류의 생산량은 약 5.5% 감소하였는데, 이는 조리 시 편의성을 추구하는 소스류의 수요가 증가하면서 전통적인 장류의 소비량이 감소하였기 때문이다(aT, 2021b). 또한, 유지류의 경우 판매액이 6.5%로 증가하였다(KOSIS, 2022).

국내외적으로 양념류의 시장 규모가 계속 커지고 있지만 양념류에 대한 판토텐산(pantothenic acid, 비타민 B5) 및 피리독신(pyridoxine, 비타민 B6) 함량 연구는 극히 미비한 실정이다. 판토텐산 및 피리독신은 수용성 비타민 중 하나로 알려져 있는데, 비타민은 체내에서 합성되지 않아 식품을 통해 공급받아야 하는 필수 성분으로(Lee 등, 2005), 생체 내 조효소로 작용한다(Kim 등, 2015). 판토텐산은 coenzyme A 및 acyl 운반 단백질의 합성에 필요한 성분으로 이들은 탄수화물, 지방 및 단백질 대사에 관여한다(Said, 2015). 판토텐산 단독으로 결핍되는 것은 드물기 때문에 다른 비타민 B군 결핍과 함께 나타나며, 결핍 증상으로는 피부 증상, 경련 등이 알려져 있다(Youn, 2005). 또한, 피리독신은 아미노산 대사에 관여하는 성장기에 중요한 성분이다. 피리독신의 결핍 증상으로는 신경 장애로 인한 경련성 발작 및 과다행동장애가 나타날 수 있다(Youn, 2005).

양념은 요리의 풍미를 향상시키는 것 이상으로 식단에서 필수적인 역할을 하나(Dini와 Laneri, 2021), 양념류에 함유된 수용성 비타민 판토텐산 및 피리독신의 함량 정보는 제한적이다. 따라서 본 연구는 다양한 양념류에 함유된 판토텐산 및 피리독신 함량을 정량적으로 평가하여 국민 식생활 개선의 기초자료로 제공하고자 한다.

재료 및 방법

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Abstract
서 론
재료 및 방법
결과 및 고찰
요 약
References

실험재료

본 연구에 사용된 양념류의 시료는 농촌진흥청 국립농업과학원에서 국가표준식품성분표 제10개정판 발간을 위해 제공된 것으로, 총 56종의 양념류 시료 중 산초 분말, 시나몬 분말, 조미료 분말 등 17종의 조미료, 고추장, 된장, 간장 등 12종의 장류, 마요네즈, 굴소스, 꿀 등 18종의 소스류 및 버터, 카놀라유, 올리브유 등 9종의 유지류로 분류하여 분석 시료로 사용하였다.

판토텐산 및 피리독신 분석에 사용된 potassium phosphate monobasic 및 sodium acetate와 표준 시약인 판토텐산(No. 21210, 순도 ≥98%) 및 피리독신(No. P5669, 순도 ≥98%)은 Sigma-Aldrich Co.에서 구매하여 사용하였으며, 본 연구에 사용된 초순수 증류수 및 acetonitrile은 J. T. Baker Co.에서 구매하였고, acetic acid는 Daejung Chemicals & Metals Co.에서 구매하여 분석에 사용하였다.

판토텐산 및 피리독신의 추출 및 전처리

양념류에 함유된 판토텐산 및 피리독신은 Kim 등(2017)의 추출 방법을 이용하였다.

판토텐산의 경우 균질화된 양념 시료 1~5 g을 정확하게 칭량하고, 20 mL의 초순수 증류수를 가하여 10분간 40°C 조건에서 초음파 추출(JAC 4020, KODO Technical Research Co., Ltd.)을 하였다. 그 후 3% acetic acid 2 mL를 첨가하여 10분간 같은 조건에서 초음파 추출하고, 최종 부피가 40 mL가 되도록 초순수 증류수를 이용하여 정용하였다. 이를 10분간 21,124×g로 원심분리(1730MR, Gyrozen)한 후 0.45 μm 실린지 필터(polyvinylidene difluoride filter media, PVDF, Whatman Inc.)로 여과한 것을 High Performance Liquid Chromatography(HPLC, Agilent) 분석용 샘플로 사용하였다.

피리독신의 경우 균질화된 양념 시료 1~5 g을 정확하게 칭량한 후 25 mL의 50 mM sodium acetate 용액(pH 4.5)을 가하여 40°C 조건에서 초음파 추출을 30분 진행하였다. 그 후 15 mL의 초순수 증류수를 첨가하여 원심분리한 것을 0.45 μm PVDF 실린지 필터로 여과하여 HPLC 분석용 샘플로 사용하였다.

HPLC 분석조건

판토텐산 및 피리독신 함량을 정량적으로 분석하기 위해 Kim 등(2014)의 HPLC 분석법을 적용하였다. 판토텐산은 HPLC/DAD(HPLC/diode array detector) 법을 사용하였으며, 피리독신은 HPLC/FLD(HPLC/fluorescence detector) 법을 사용하여 분석하였다. 자세한 분석법은 Table 1에 나타내었다.

Table 1 . HPLC operating condition for pantothenic acid and pyridoxine analysis

	Pantothenic acid
Instrument	HPLC (Agilent 1200 series)
Column	YMC-Pack ODS AM (250 mm×4.6 mm, 5 μm)
Column temp.	30°C
Detector	Diode array detector (200 nm)
Flow rate	1.0 mL/min
Injection volume	20 μL
Mobile phase	50 mM potassium phosphate monobasic (pH 3.5):acetonitrile＝95:5 (v/v) (Isocratic elution)
	Pyridoxine
Instrument	HPLC (Agilent 1260 infinity series)
Column	YMC-Pack Pro C18 Rs (250 mm×4.6 mm, 5 μm)
Column temp.	30°C
Detector	Fluorescence detector (Ex=290 nm, Em=396 nm)
Flow rate	1.0 mL/min
Injection volume	20 μL
Mobile phase	20 mM sodium acetate (pH 3.6):acetonitrile＝97:3 (v/v) (Isocratic elution)

판토텐산 및 피리독신의 함량 평가

양념류에 함유된 판토텐산 및 피리독신의 함량을 정량적으로 평가하고자 1,000 ppm의 표준용액을 조제하고, 이를 다시 여러 농도로 희석하여 표준검량선을 작성하였다. 각 양념류 분석시료의 HPLC 분석 peak area를 표준검량식에 대입하여 시험용액의 농도를 산출한 후, 아래의 식에 의해 함량을 계산하였다(MFDS, 2020).

비타민 B의 함량mg/100 g=S×a×b검체 채취량g×1001,000

S: 시험용액에 함유된 비타민 B의 농도(μg/mL)

a: 시험용액의 전체 용량(mL)

b: 시험용액의 희석배수

판토텐산 및 피리독신 분석법의 분석감도, 선택성 및 직선성 검증

분석법의 분석감도는 limit of detection(검출한계, LOD) 및 limit of quantitation(정량한계, LOQ)을 통해 검토하였다. LOD는 signal 대비 noise 비율(S/N ratio)이 3일 때를, LOQ는 signal 대비 noise 비율(S/N ratio)이 10일 때의 농도로 설정하였다(Kim 등, 2014). 선택성 및 분리효율을 검토하기 위하여 표준용액과 각 시료 추출물의 크로마토그램으로 HPLC peak의 분리 양상을 확인하였으며, 아울러 표준용액에 대한 HPLC peak의 이론단수(number of theoretical plate, N), 이론단 높이(height equivalent to theoretical plate) 및 peak 대칭성(peak symmetry, S)을 검토하였다(Choung, 2008). 직선성은 각 작성된 표준검량선을 바탕으로 R²값(결정계수)을 이용하여 직선성을 검증하였다. 성분별 표준검량선 농도로는 판토텐산의 경우 0.5~20 mg/L, 피리독신의 경우 0.01~10 mg/L로 설정하였다.

판토텐산 및 피리독신 분석법의 재현성 및 정확성 검증

분석법의 재현성을 검토하고자 in house quality control 시료로 강화 조제분유를 사용하였으며 intra-day(일내) 및 inter-day(일간) 각각 10회 및 15회 반복 추출하여 정량분석을 실시한 결과를 바탕으로 재현성을 평가하였고, 또한 표준인증물질(standard reference material, SRM)을 사용하여 정확성을 검증하였다. 본 연구에서 판토텐산 및 피리독신의 표준인증물질로는 SRM-3280(multivitamin)을 사용하였으며, 성분별 회수율 및 상대표준편차(RSD%, relative standard deviation)를 검토하였다.

통계처리

양념류의 판토텐산 및 피리독신의 함량 분석은 각 3회 반복으로 수행되었으며, SAS 9.4(Statistical Analysis System, SAS Institute Inc.) 프로그램을 이용하여 각 시료의 평균값에 대한 Duncan’s multiple range test를 수행하였다.

결과 및 고찰

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Abstract
서 론
재료 및 방법
결과 및 고찰
요 약
References

판토텐산 및 피리독신 분석법의 분석감도, 선택성 및 직선성 검증

판토텐산 및 피리독신의 분석 감도를 검증하기 위하여 성분별 표준용액의 LOD 및 LOQ를 확인하였으며, 그 결과를 Table 2에 나타냈다. 분석법의 선택성을 검토하고자 표준용액과 양념류 시료의 HPLC 크로마토그램을 비교, 검토하여 분리 양상을 확인하였다(Fig. 1). 아울러 HPLC 분석 컬럼의 분리 효율을 이론 단수, 이론단의 높이 및 피크 대칭성을 이용하여 검토한 결과, 각 성분이 우수하게 분리, 검출되는 것을 확인하였다. 또한, 각 성분의 농도별 표준용액 분석을 통해 작성된 표준 검량선의 직선성은 R²=0.999 이상으로 고도의 직선성을 나타낸 것을 확인하였다. 이와 같이 본 연구에 사용된 판토텐산 및 피리독신 분석법의 분석 감도, 선택성, 분리 효율 및 직선성을 검토한 결과(Table 2), 분석법의 추가적인 개선은 필요하지 않음을 확인하였다.

Table 2 . Comparison of the sensitivity, peak parameter and linearity of the HPLC method

Vitamin	Sensitivity		Selectivity			Linearity
	LOD¹⁾	LOQ²⁾	N³⁾	HETP⁴⁾	S⁵⁾	Calibration curve	R²
	(mg/L)		N³⁾	HETP⁴⁾	S⁵⁾	Calibration curve	R²
Pantothenic acid	0.009	0.029	7,664	0.033	0.953	y＝684.980x－1.130	0.999**
Pyridoxine	0.004	0.013	7,899	0.031	0.931	y＝4,029.966x＋0.524	0.999**

¹⁾Limit of detection. ²⁾Limit of quantification.

³⁾Number of theoretical plate. ⁴⁾Height equivalent to theoretical plate. ⁵⁾Peak symmetry.

Fig. 1. Representative HPLC chromatograms of pantothenic acid and pyridoxine in seasoning samples.

판토텐산 및 피리독신 분석법의 재현성, 정확성 및 정밀성 검증

판토텐산 및 피리독신 분석법의 재현성을 검토하기 위하여 시판 강화 조제분유를 이용하여 품질관리도표(quality control chart)를 작성하여 주기적으로 내부 분석 품질관리(in-house control)를 진행하면서 재현성을 검증하였다(Table 3). 그 결과 intra-day 및 inter-day 재현성 모두 상대표준편차가 4.2% 미만으로 양호한 양상임을 확인하였다. 또한, 정확성 및 정밀성을 검증하기 위하여 표준인증물질인 SRM-3280을 3회 반복, 추출 분석하고 표준인증값과 분석값을 상호 비교하고 회수율 및 상대표준편차를 계산하여 정확성 및 정밀성을 측정하였으며, 판토텐산의 경우 회수율 101.27%, 상대표준편차 0.008%, 피리독신은 회수율 94.70%, 상대표준편차 0.039%로 우수한 양상을 나타내어 본 분석에 사용된 추출 및 분석법은 재현성, 정확성 및 정밀성 부분에서도 추가적인 개선이 불필요함을 확인하였다.

Table 3 . Comparison of the precision and accuracy of the HPLC method

Vitamin	Precision		Accuracy
	RSD (%)¹⁾		Content (mg/g)			Recovery (%)	RSD (%)
	Intra-day (n=10)	Inter-day (n=15)	Material	Reference value	Analysis value	Recovery (%)	RSD (%)
Pantothenic acid	4.193	2.276	SRM-3280²⁾	7.300±0.960³⁾	7.393±0.001	101.274	0.008
Pyridoxine	1.392	1.439	SRM-3280	1.810±0.170	1.714±0.001	94.696	0.039

¹⁾Relative standard deviation. ²⁾Standard reference material. ³⁾Values are mean±SD of 3 replications.

판토텐산 및 피리독신의 함량 평가

17종의 조미료, 12종의 장류, 18종의 소스류 및 9종의 유지류로 이루어진 총 56종의 양념류에 함유된 판토텐산 및 피리독신의 함량을 Table 4~7에 나타냈다.

Table 4 . Comparison of pantothenic acid and pyridoxine contents of spices (mg/100 g)

Kind	Status	Sample	Type	Pantothenic acid	Pyridoxine
Spice	Liquid	Condiment		0.283±0.004^g1)	ND²⁾
		Cinnamon		ND	0.008±0.000^g
		Condiment		2.493±0.010^c	0.062±0.001^c
		Mixed grain		ND	0.021±0.000^f
		Mustard		2.277±0.013^d	0.057±0.002^d
		Peanut		1.845±0.032^e	0.027±0.001^e
		Red pepper		0.244±0.006^gh	0.056±0.002^d
	Powder	Salt	Bamboo	ND	ND
			Sea, coarse	ND	ND
			Glasswort	ND	ND
			Refined	ND	ND
			Sea, small particles	ND	ND
		Sichuan		15.326±0.052^a	0.385±0.004^a
		Sugar	Dark brown	0.893±0.004^f	ND
			Light brown	0.191±0.011^h	ND
			White	0.110±0.004ⁱ	ND
		Wasabi		5.249±0.101^b	0.139±0.000^b

¹⁾Each letter means differ significantly, based on Duncan’s multiple range test at P=0.05.

²⁾ND: Not detection.

조미료의 경우(Table 4) 산초 분말(15.326±0.052 mg/100 g), 고추냉이 분말(5.249±0.101 mg/100 g), 조미료 분말(2.493±0.010 mg/100 g) 순으로 판토텐산 함량이 높았으며, 시나몬 분말, 미숫가루 분말 및 소금류에서는 판토텐산이 검출되지 않았다. 미국 농무부(USDA-ARS, 2019d)에 따르면 소금의 경우 판토텐산이 검출되지 않았다는 결과를 보고하여 본 연구 결과와 동일한 결과임을 확인하였다. 피리독신의 경우 산초 분말(0.385±0.004 mg/100 g), 와사비 분말(0.139±0.000 mg/100 g), 조미료 분말(0.062±0.001 mg/100 g) 순으로 함량이 높았으며, 이들 간에는 유의한 함량 차이를 나타내었다. 반면 소금류와 설탕류에서는 피리독신이 검출되지 않았다. 산초 분말의 경우 수용성 비타민인 판토텐산 및 피리독신 함량이 본 연구에서 검토된 양념류 중에 가장 높았으며, 항암, 항염증 등 다양한 생리활성 성분이 함유되어 있어 산업적으로 활용 가능성이 있을 것으로 생각되며(Han 등, 2020), 추후 산초 분말 및 산초의 수용성 비타민에 관한 포괄적 연구가 필요하다고 판단된다. 또한, 소금의 경우 주성분은 염화나트륨이며 바다에서 유래한 여러 종류의 무기질을 함유하고 있으나 정제를 거칠수록 순수한 염화나트륨이 된다(Ha와 Park, 1998). 이러한 이유로 정제된 소금에는 유기물질인 비타민이 검출되지 않는 것으로 추측되며, USDA-ARS(2019d)의 결과에서도 소금에는 판토텐산 및 피리독신은 검출되지 않는 것으로 보고하여 본 연구 결과와도 일치하였다.

장류의 경우(Table 5) 판토텐산 함량이 청국장(11.497±0.062 mg/100 g), 개량된장(2.800±0.005 mg/100 g), 전통 간장(2.741±0.048 mg/100 g)의 순으로 높았던 것을 확인하였으며, 양조간장, 춘장, 초고추장 및 쌈장은 판토텐산이 검출되지 않았다. 피리독신의 경우 청국장은 발효 과정에서 원료 콩이 함유한 비타민 외에 새로운 비타민을 생성하기 때문에 다른 된장류보다 함량이 높게 나온 것으로 추측된다(Kim 등, 2003). 피리독신의 경우 고추장류가 다른 장류에 비해 비교적 피리독신 함량이 높았던 것을 확인하였는데, 이는 고추장을 조제할 때는 다양한 첨가물이 들어가기 때문에 피리독신 함량이 높게 나온 것으로 추측된다(Jang 등, 2022). 그러나 전통 고추장(0.100±0.001 mg/100 g)의 경우 개량 고추장(0.173±0.003 mg/100 g)에 비해 피리독신 함량이 적게 검출이 되었는데, 이는 제조 방법 및 특성, 제조 장소, 제조 시기 등 다양한 요소에 따라 성분의 차이가 있으므로(Park 등, 2017) 이런 결과가 도출되었을 것으로 생각한다. 또한 초고추장의 경우 판토텐산은 검출되지 않았으며, 다른 고추장류에 비해 피리독신 함량이 낮았다. 농식품 올바로(RDA, 2023)에 따르면 초고추장을 제조할 때는 식초가 첨가되는데, 대부분 시판되는 식초는 에틸알코올을 원료로 쓰는 속성 양조식초이기 때문에 비타민류가 거의 함유되어 있지 않으며(Jung 등, 2019; Kwon 등, 2000), 초고추장 조제 시 고추장을 식초로 희석하므로 상대적으로 초고추장이 순수 고추장류에 비해 판토텐산 및 피리독신 함량이 낮은 것으로 판단된다.

Table 5 . Comparison of pantothenic acid and pyridoxine contents of soybean fermented products (mg/100 g)

Kind	Status	Sample	Type	Pantothenic acid	Pyridoxine
Soybean fermented product	Liquid	Soy sauce	Brewing	ND¹⁾	0.040±0.001^e2)
			Common	0.592±0.008^e	ND
			Traditional	2.741±0.048^c	0.040±0.000^e
	Paste	Cheonggukjang		11.497±0.062^a	0.055±0.001^d
		Chunjang		ND	ND
		Red pepper paste	With vinegar	ND	0.078±0.001^c
			Common	0.281±0.008^f	0.173±0.003^a
			Traditional	0.162±0.003^g	0.100±0.001^b
		Soybean paste	Common	2.800±0.005^b	0.056±0.001^d
			Miso	ND	0.031±0.001^f
			Traditional	1.112±0.002^d	0.040±0.000^e
		Ssamjang		ND	0.040±0.001^e

¹⁾ND: Not detection.

²⁾Each letter means differ significantly, based on Duncan’s multiple range test at P=0.05.

소스류(Table 6)의 판토텐산 함량은 토마토케첩(0.880±0.025 mg/100 g), 짜장 분말(0.820±0.026 mg/100 g), 와사비 소스(0.593±0.042 mg/100 g) 순으로 높았고, 이들 간에 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다. 꿀은 종류별로 판토텐산 함량에 유의한 차이를 나타내었다. 꿀을 상업적으로 이용하기 위해서는 일부 조제 과정을 거치게 되는데, 이 과정에서 대부분 꽃가루가 제거되므로 이는 비타민 함량을 감소시키는 원인이 되며, 꿀에 판토텐산이 함유되어 있을 때는 판토텐산 함량이 상당히 높은 경우가 많았다는 결과가 보고된 바 있다(Ciulu 등, 2011). 아카시아꿀의 경우 판토텐산이 검출되지 않았다는 결과가 보고되어(Ciulu 등, 2012), 본 연구와 동일한 결과를 나타내었다. 피리독신의 경우 소불고기 소스(0.057±0.001 mg/100 g), 아카시아꿀(0.041±0.001 mg/100 g) 순으로 함량이 높았다. 최근 다양한 유용성분을 첨가한 불고기 소스의 개발 등 더 나은 영양학적 가치가 있는 소스류 제품이 계속 개발되고 있다는 보고(Cheon과 Lee, 2017; Park과 Byun, 2014) 등을 고려할 때, 소불고기 소스의 경우 다양한 유용성분이 함유된 부재료의 사용으로 인해 피리독신 함량이 소스류 중에 가장 높았던 것으로 판단된다.

Table 6 . Comparison of pantothenic acid and pyridoxine contents of sauces (mg/100 g)

Kind	Status	Sample	Type	Pantothenic acid	Pyridoxine
Sauce	Liquid	Vinegar	Brewing	ND¹⁾	ND
	Liquid	Jjajang	Retort	ND	0.008±0.001^fgh2)
	Paste	Light mustard		ND	0.007±0.000^gh
		Tomato		ND	0.032±0.001^c
		Wasabi		0.593±0.042^c	0.029±0.001^d
	Powder	Jjajang	Retort	0.820±0.026^b	ND
	Semi-fluid liquid	Bulgogi marinade	Retort	ND	0.057±0.001^a
		Curry	Retort	0.116±0.004^f	0.009±0.001^f
		Honey	Acacia	ND	0.041±0.001^b
			Chestnut	0.133±0.007^f	0.032±0.000^c
			Local	0.231±0.002^e	0.002±0.000ⁱ
			Multi flora	0.226±0.002^e	0.006±0.000^h
		Mayonnaise	Bottled	0.220±0.011^e	ND
		Oyster		0.273±0.005^d	ND
		Pasta		ND	0.009±0.001^fg
		Pork cutlet		ND	0.018±0.001^e
		Starch syrup		ND	ND
		Tomato ketchup		0.880±0.025^a	0.042±0.001^b

¹⁾ND: Not detection.

²⁾Each letter means differ significantly, based on Duncan’s multiple range test at P=0.05.

유지류(Table 7)의 모든 시료에서는 판토텐산이 검출되지 않았으며, 피리독신의 경우에는 마가린(0.015±0.002 mg/100 g) 및 참기름(0.014±0.001 mg/100 g)의 함량이 가장 높았는데, 이들은 통계적으로 유의한 차이가 없었음을 확인하였다. 유지류에 관한 판토텐산 및 피리독신의 연구는 극히 미비한 실정이었는데, USDA-ARS에 따르면 카놀라유, 아몬드 오일, 코코넛 오일 등 유지류에서는 피리독신 및 판토텐산이 검출되지 않았다고 보고하였으며(USDA-ARS, 2019a, 2019b, 2019c), 이는 수용성 비타민류는 물에 잘 용해되는 성질을 가지고 있으므로 지용성 기반의 매트릭스에서는 난용성의 특성을 나타내거나, 극히 미량 함유되어 있다고 하더라도 지질층 내부에 존재할 경우 추출이 용이하지 않을 것으로 판단된다.

Table 7 . Comparison of pantothenic acid and pyridoxine contents of oils (mg/100 g)

Kind	Status	Sample	Pantothenic acid	Pyridoxine
Oil	Solid	Butter	ND¹⁾	ND
	Solid	Margarine	ND	0.015±0.002^a2)
	Liquid	Canola	ND	ND
		Hot pepper	ND	ND
		Corn	ND	ND
		Grape seed	ND	ND
		Sesame	ND	0.014±0.001^a
		Soybean	ND	ND
		Sunflower	ND	0.009±0.000^b

¹⁾ND: Not detection.

²⁾Each letter means differ significantly, based on Duncan’s multiple range test at P=0.05.

보건복지부의 한국인 영양소 섭취기준(MOHW, 2020)에 따르면 판토텐산의 경우 일일 권장섭취량은 성인 남녀 기준 5 mg/d이며, 피리독신의 경우 일일 권장섭취량은 성인 남성 1.5 mg/d, 성인 여성 1.4 mg/d였다. 조미료의 경우 판토텐산 및 피리독신 모두에서 함량이 가장 높았던 산초 분말(판토텐산 15.326±0.052 mg/100 g 및 피리독신 0.385±0.004 mg/100 g)은 100 g 중 성인 남녀 판토텐산 일일 권장섭취량의 306.5%, 피리독신은 일일 권장섭취량 대비 성인 남성의 경우 25.7%, 성인 여성의 경우 27.5%를 나타내었다. 장류의 경우 청국장(11.497±0.062 mg/100 g)의 판토텐산 함량이 가장 높았는데, 청국장 100 g에는 성인 남녀 기준 일일 권장섭취량 대비 229.94%의 함량을 나타내었고, 피리독신의 경우 함량이 가장 높았던 개량 고추장(0.173±0.003 mg/100 g)은 성인 남성 기준 11.5%, 성인 여성 기준 12.4%의 함량을 포함하였다. 소스류의 경우 판토텐산의 함량은 토마토케첩(0.880±0.025 mg/100 g)에서 가장 높았으며, 이는 성인 남녀 기준 17.6%를 나타내었다. 피리독신 함량이 가장 높았던 소불고기 소스(0.057±0.001 mg/100 g)는 성인 남성 기준 3.8%, 성인 여성 기준 4.1%였다. 유지류의 경우 검토된 모든 시료에서 판토텐산이 검출되지 않아 판토텐산 섭취에는 적합하지 않았으며, 피리독신의 경우 가장 함량이 높았던 시료인 마가린(0.015±0.002 mg/100 g) 역시 성인 남성 기준 1%, 성인 여성 기준 1.1%만을 함유하였다. 그러나 본 연구에서 검토된 양념류들은 요리의 풍미를 증가시키기 위한 부재료로서 소량만이 사용되기 때문에 판토텐산 및 피리독신 등 미량 비타민의 충분한 섭취를 위해서는 영양소가 풍부한 콩류, 육류와 같은 급원 식품과 함께 섭취해야 할 것으로 판단된다(RDA, 2016).

Kim 등(2016)은 수용성 비타민의 경우 알칼리 조건 혹은 가열 상태에서 구조적 파괴가 일어나 함량이 감소한다고 보고한 바 있다. 또한, 조리 후에는 원재료 대비 수용성 비타민의 함량 및 잔존율이 감소한다는 결과가 보고된 바 있으므로(Kim 등, 2022), 본 연구에서 검토된 다양한 양념을 첨가하여 가열 조리 시에는 판토텐산 및 피리독신의 함량 또한 원재료 대비 감소할 것으로 예측된다.

본 연구에서 검토된 양념류에 함유된 판토텐산 및 피리독신의 함량 분포 특성을 box-whisker plot으로 나타내었다(Fig. 2). 조미료와 장류에서는 판토텐산 및 피리독신의 함량 분포가 비교적 넓은 양상을 나타내지만, 소스류와 유지류는 함량 분포가 극히 낮음을 확인하였다. 검토된 양념류 중에서 산초 분말이 판토텐산 및 피리독신 모두에서 특이적으로 함량이 높았던 것을 확인하였고, 산초 분말을 제외하면 판토텐산의 함량에서는 청국장이, 피리독신의 경우에는 고추장이 특이적으로 함량이 높은 양상임을 확인하였다.

Fig. 2. Box-whisker plot of pantothenic acid and pyridoxine in seasoning products.

이상으로 본 연구는 국내에서 소비되는 총 56가지의 양념을 조미료, 장류, 소스류, 유지류로 분류하여 판토텐산 및 피리독신의 함량을 정량적으로 분석하였고, 이 결과는 향후 국민 식생활 개선 및 건강증진의 기초자료로 활용될 수 있을 것이다.

요 약

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Abstract
서 론
재료 및 방법
결과 및 고찰
요 약
References

최근 다양한 식생활 문화로 인해 조리 시 많은 양념이 사용되고 있으나 양념류에 함유된 판토텐산 및 피리독신 함량 정보는 제한적인 실정이다. 따라서 본 연구는 총 56종의 양념류에 함유된 판토텐산 및 피리독신 함량을 HPLC/DAD 및 HPLC/FLD 법을 이용하여 정량적으로 분석하였다. 양념류에 함유된 판토텐산 및 피리독신 함량은 각각 0.0000~15.326 mg/100 g 및 0.0000~0.385 mg/100 g이었다. 조미료류의 경우 판토텐산은 0.000~15.326 mg/100 g 함량 범위였으며, 피리독신은 0.000~0.385 mg/100 g의 함량 범위로 존재하였다. 장류의 경우 판토텐산은 0.000~11.497 mg/100 g, 피리독신은 0.000~0.173 mg/100 g이었다. 소스류의 경우 판토텐산은 0.000~0.880 mg/100 g, 피리독신은 0.000~0.057 mg/100 g이었다. 유지류에서는 판토텐산이 검출되지 않았으며, 피리독신은 0.000~0.015 mg/100 g의 함량을 나타내었다. 검토된 양념류 중 산초 분말이 판토텐산(15.326±0.052 mg/100 g) 및 피리독신(0.385±0.004 mg/100 g) 모두에서 특이적으로 함량이 높았던 것을 확인하였고, 이 연구의 결과는 향후 국민 식생활 개선 및 건강증진에 기여할 것으로 생각된다.

References

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Abstract
서 론
재료 및 방법
결과 및 고찰
요 약
References

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Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2023; 52(7): 708-715

Published online July 31, 2023 https://doi.org/10.3746/jkfn.2023.52.7.708

양념류에 함유된 판토텐산 및 피리독신 함량 평가

신유빈․정명근

강원대학교 바이오기능성소재학과

Received: March 23, 2023; Revised: May 15, 2023; Accepted: May 21, 2023

Determination of the Pantothenic Acid and Pyridoxine Contents in Seasoning Products

Yubin Shin and Myoung-Gun Choung

Department of Bio-Functional Material, Kangwon National University

Correspondence to:Myoung-Gun Choung, Department of Bio-Functional Material, Kangwon National University, 346, Hwangjo-gil, Dogye-eup, Samcheok, Gangwon 25949, Korea, E-mail: cmg7004@kangwon.ac.kr

Received: March 23, 2023; Revised: May 15, 2023; Accepted: May 21, 2023

Abstract

Keywords: food analysis, seasoning, HPLC, pantothenic acid, pyridoxine

서 론

재료 및 방법

실험재료

판토텐산 및 피리독신의 추출 및 전처리

양념류에 함유된 판토텐산 및 피리독신은 Kim 등(2017)의 추출 방법을 이용하였다.

HPLC 분석조건

Table 1 . HPLC operating condition for pantothenic acid and pyridoxine analysis.

	Pantothenic acid
Instrument	HPLC (Agilent 1200 series)
Column	YMC-Pack ODS AM (250 mm×4.6 mm, 5 μm)
Column temp.	30°C
Detector	Diode array detector (200 nm)
Flow rate	1.0 mL/min
Injection volume	20 μL
Mobile phase	50 mM potassium phosphate monobasic (pH 3.5):acetonitrile＝95:5 (v/v) (Isocratic elution)
	Pyridoxine
Instrument	HPLC (Agilent 1260 infinity series)
Column	YMC-Pack Pro C18 Rs (250 mm×4.6 mm, 5 μm)
Column temp.	30°C
Detector	Fluorescence detector (Ex=290 nm, Em=396 nm)
Flow rate	1.0 mL/min
Injection volume	20 μL
Mobile phase	20 mM sodium acetate (pH 3.6):acetonitrile＝97:3 (v/v) (Isocratic elution)

판토텐산 및 피리독신의 함량 평가

$비 타 민 B 의 함 량 (m g / 100 g) = \frac{S \times a \times b}{검 체 채 취 량 (g)} \times \frac{100}{1, 000}$

S: 시험용액에 함유된 비타민 B의 농도(μg/mL)

a: 시험용액의 전체 용량(mL)

b: 시험용액의 희석배수

판토텐산 및 피리독신 분석법의 분석감도, 선택성 및 직선성 검증

판토텐산 및 피리독신 분석법의 재현성 및 정확성 검증

통계처리

결과 및 고찰

판토텐산 및 피리독신 분석법의 분석감도, 선택성 및 직선성 검증

Table 2 . Comparison of the sensitivity, peak parameter and linearity of the HPLC method.

Vitamin	Sensitivity		Selectivity			Linearity
	LOD¹⁾	LOQ²⁾	N³⁾	HETP⁴⁾	S⁵⁾	Calibration curve	R²
	(mg/L)		N³⁾	HETP⁴⁾	S⁵⁾	Calibration curve	R²
Pantothenic acid	0.009	0.029	7,664	0.033	0.953	y＝684.980x－1.130	0.999**
Pyridoxine	0.004	0.013	7,899	0.031	0.931	y＝4,029.966x＋0.524	0.999**

¹⁾Limit of detection. ²⁾Limit of quantification..

³⁾Number of theoretical plate. ⁴⁾Height equivalent to theoretical plate. ⁵⁾Peak symmetry..

Fig 1. Representative HPLC chromatograms of pantothenic acid and pyridoxine in seasoning samples.

판토텐산 및 피리독신 분석법의 재현성, 정확성 및 정밀성 검증

Table 3 . Comparison of the precision and accuracy of the HPLC method.

Vitamin	Precision		Accuracy
	RSD (%)¹⁾		Content (mg/g)			Recovery (%)	RSD (%)
	Intra-day (n=10)	Inter-day (n=15)	Material	Reference value	Analysis value	Recovery (%)	RSD (%)
Pantothenic acid	4.193	2.276	SRM-3280²⁾	7.300±0.960³⁾	7.393±0.001	101.274	0.008
Pyridoxine	1.392	1.439	SRM-3280	1.810±0.170	1.714±0.001	94.696	0.039

¹⁾Relative standard deviation. ²⁾Standard reference material. ³⁾Values are mean±SD of 3 replications..

판토텐산 및 피리독신의 함량 평가

17종의 조미료, 12종의 장류, 18종의 소스류 및 9종의 유지류로 이루어진 총 56종의 양념류에 함유된 판토텐산 및 피리독신의 함량을 Table 4~7에 나타냈다.

Table 4 . Comparison of pantothenic acid and pyridoxine contents of spices (mg/100 g).

Kind	Status	Sample	Type	Pantothenic acid	Pyridoxine
Spice	Liquid	Condiment		0.283±0.004^g1)	ND²⁾
		Cinnamon		ND	0.008±0.000^g
		Condiment		2.493±0.010^c	0.062±0.001^c
		Mixed grain		ND	0.021±0.000^f
		Mustard		2.277±0.013^d	0.057±0.002^d
		Peanut		1.845±0.032^e	0.027±0.001^e
		Red pepper		0.244±0.006^gh	0.056±0.002^d
	Powder	Salt	Bamboo	ND	ND
			Sea, coarse	ND	ND
			Glasswort	ND	ND
			Refined	ND	ND
			Sea, small particles	ND	ND
		Sichuan		15.326±0.052^a	0.385±0.004^a
		Sugar	Dark brown	0.893±0.004^f	ND
			Light brown	0.191±0.011^h	ND
			White	0.110±0.004ⁱ	ND
		Wasabi		5.249±0.101^b	0.139±0.000^b

¹⁾Each letter means differ significantly, based on Duncan’s multiple range test at P=0.05..

²⁾ND: Not detection..

Table 5 . Comparison of pantothenic acid and pyridoxine contents of soybean fermented products (mg/100 g).

Kind	Status	Sample	Type	Pantothenic acid	Pyridoxine
Soybean fermented product	Liquid	Soy sauce	Brewing	ND¹⁾	0.040±0.001^e2)
			Common	0.592±0.008^e	ND
			Traditional	2.741±0.048^c	0.040±0.000^e
	Paste	Cheonggukjang		11.497±0.062^a	0.055±0.001^d
		Chunjang		ND	ND
		Red pepper paste	With vinegar	ND	0.078±0.001^c
			Common	0.281±0.008^f	0.173±0.003^a
			Traditional	0.162±0.003^g	0.100±0.001^b
		Soybean paste	Common	2.800±0.005^b	0.056±0.001^d
			Miso	ND	0.031±0.001^f
			Traditional	1.112±0.002^d	0.040±0.000^e
		Ssamjang		ND	0.040±0.001^e

¹⁾ND: Not detection..

²⁾Each letter means differ significantly, based on Duncan’s multiple range test at P=0.05..

Table 6 . Comparison of pantothenic acid and pyridoxine contents of sauces (mg/100 g).

Kind	Status	Sample	Type	Pantothenic acid	Pyridoxine
Sauce	Liquid	Vinegar	Brewing	ND¹⁾	ND
	Liquid	Jjajang	Retort	ND	0.008±0.001^fgh2)
	Paste	Light mustard		ND	0.007±0.000^gh
		Tomato		ND	0.032±0.001^c
		Wasabi		0.593±0.042^c	0.029±0.001^d
	Powder	Jjajang	Retort	0.820±0.026^b	ND
	Semi-fluid liquid	Bulgogi marinade	Retort	ND	0.057±0.001^a
		Curry	Retort	0.116±0.004^f	0.009±0.001^f
		Honey	Acacia	ND	0.041±0.001^b
			Chestnut	0.133±0.007^f	0.032±0.000^c
			Local	0.231±0.002^e	0.002±0.000ⁱ
			Multi flora	0.226±0.002^e	0.006±0.000^h
		Mayonnaise	Bottled	0.220±0.011^e	ND
		Oyster		0.273±0.005^d	ND
		Pasta		ND	0.009±0.001^fg
		Pork cutlet		ND	0.018±0.001^e
		Starch syrup		ND	ND
		Tomato ketchup		0.880±0.025^a	0.042±0.001^b

¹⁾ND: Not detection..

²⁾Each letter means differ significantly, based on Duncan’s multiple range test at P=0.05..

Table 7 . Comparison of pantothenic acid and pyridoxine contents of oils (mg/100 g).

Kind	Status	Sample	Pantothenic acid	Pyridoxine
Oil	Solid	Butter	ND¹⁾	ND
	Solid	Margarine	ND	0.015±0.002^a2)
	Liquid	Canola	ND	ND
		Hot pepper	ND	ND
		Corn	ND	ND
		Grape seed	ND	ND
		Sesame	ND	0.014±0.001^a
		Soybean	ND	ND
		Sunflower	ND	0.009±0.000^b

¹⁾ND: Not detection..

²⁾Each letter means differ significantly, based on Duncan’s multiple range test at P=0.05..

Fig 2. Box-whisker plot of pantothenic acid and pyridoxine in seasoning products.

Fig 1.

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Fig 1.Representative HPLC chromatograms of pantothenic acid and pyridoxine in seasoning samples.

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2023; 52: 708-715https://doi.org/10.3746/jkfn.2023.52.7.708

Fig 2.

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Fig 2.Box-whisker plot of pantothenic acid and pyridoxine in seasoning products.

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2023; 52: 708-715https://doi.org/10.3746/jkfn.2023.52.7.708

Table 1 . HPLC operating condition for pantothenic acid and pyridoxine analysis.

	Pantothenic acid
Instrument	HPLC (Agilent 1200 series)
Column	YMC-Pack ODS AM (250 mm×4.6 mm, 5 μm)
Column temp.	30°C
Detector	Diode array detector (200 nm)
Flow rate	1.0 mL/min
Injection volume	20 μL
Mobile phase	50 mM potassium phosphate monobasic (pH 3.5):acetonitrile＝95:5 (v/v) (Isocratic elution)
	Pyridoxine
Instrument	HPLC (Agilent 1260 infinity series)
Column	YMC-Pack Pro C18 Rs (250 mm×4.6 mm, 5 μm)
Column temp.	30°C
Detector	Fluorescence detector (Ex=290 nm, Em=396 nm)
Flow rate	1.0 mL/min
Injection volume	20 μL
Mobile phase	20 mM sodium acetate (pH 3.6):acetonitrile＝97:3 (v/v) (Isocratic elution)

Table 2 . Comparison of the sensitivity, peak parameter and linearity of the HPLC method.

Vitamin	Sensitivity		Selectivity			Linearity
	LOD¹⁾	LOQ²⁾	N³⁾	HETP⁴⁾	S⁵⁾	Calibration curve	R²
	(mg/L)		N³⁾	HETP⁴⁾	S⁵⁾	Calibration curve	R²
Pantothenic acid	0.009	0.029	7,664	0.033	0.953	y＝684.980x－1.130	0.999**
Pyridoxine	0.004	0.013	7,899	0.031	0.931	y＝4,029.966x＋0.524	0.999**

¹⁾Limit of detection. ²⁾Limit of quantification..

³⁾Number of theoretical plate. ⁴⁾Height equivalent to theoretical plate. ⁵⁾Peak symmetry..

Table 3 . Comparison of the precision and accuracy of the HPLC method.

Vitamin	Precision		Accuracy
	RSD (%)¹⁾		Content (mg/g)			Recovery (%)	RSD (%)
	Intra-day (n=10)	Inter-day (n=15)	Material	Reference value	Analysis value	Recovery (%)	RSD (%)
Pantothenic acid	4.193	2.276	SRM-3280²⁾	7.300±0.960³⁾	7.393±0.001	101.274	0.008
Pyridoxine	1.392	1.439	SRM-3280	1.810±0.170	1.714±0.001	94.696	0.039

¹⁾Relative standard deviation. ²⁾Standard reference material. ³⁾Values are mean±SD of 3 replications..

Table 4 . Comparison of pantothenic acid and pyridoxine contents of spices (mg/100 g).

Kind	Status	Sample	Type	Pantothenic acid	Pyridoxine
Spice	Liquid	Condiment		0.283±0.004^g1)	ND²⁾
		Cinnamon		ND	0.008±0.000^g
		Condiment		2.493±0.010^c	0.062±0.001^c
		Mixed grain		ND	0.021±0.000^f
		Mustard		2.277±0.013^d	0.057±0.002^d
		Peanut		1.845±0.032^e	0.027±0.001^e
		Red pepper		0.244±0.006^gh	0.056±0.002^d
	Powder	Salt	Bamboo	ND	ND
			Sea, coarse	ND	ND
			Glasswort	ND	ND
			Refined	ND	ND
			Sea, small particles	ND	ND
		Sichuan		15.326±0.052^a	0.385±0.004^a
		Sugar	Dark brown	0.893±0.004^f	ND
			Light brown	0.191±0.011^h	ND
			White	0.110±0.004ⁱ	ND
		Wasabi		5.249±0.101^b	0.139±0.000^b

¹⁾Each letter means differ significantly, based on Duncan’s multiple range test at P=0.05..

²⁾ND: Not detection..

Table 5 . Comparison of pantothenic acid and pyridoxine contents of soybean fermented products (mg/100 g).

Kind	Status	Sample	Type	Pantothenic acid	Pyridoxine
Soybean fermented product	Liquid	Soy sauce	Brewing	ND¹⁾	0.040±0.001^e2)
			Common	0.592±0.008^e	ND
			Traditional	2.741±0.048^c	0.040±0.000^e
	Paste	Cheonggukjang		11.497±0.062^a	0.055±0.001^d
		Chunjang		ND	ND
		Red pepper paste	With vinegar	ND	0.078±0.001^c
			Common	0.281±0.008^f	0.173±0.003^a
			Traditional	0.162±0.003^g	0.100±0.001^b
		Soybean paste	Common	2.800±0.005^b	0.056±0.001^d
			Miso	ND	0.031±0.001^f
			Traditional	1.112±0.002^d	0.040±0.000^e
		Ssamjang		ND	0.040±0.001^e

¹⁾ND: Not detection..

²⁾Each letter means differ significantly, based on Duncan’s multiple range test at P=0.05..

Table 6 . Comparison of pantothenic acid and pyridoxine contents of sauces (mg/100 g).

Kind	Status	Sample	Type	Pantothenic acid	Pyridoxine
Sauce	Liquid	Vinegar	Brewing	ND¹⁾	ND
	Liquid	Jjajang	Retort	ND	0.008±0.001^fgh2)
	Paste	Light mustard		ND	0.007±0.000^gh
		Tomato		ND	0.032±0.001^c
		Wasabi		0.593±0.042^c	0.029±0.001^d
	Powder	Jjajang	Retort	0.820±0.026^b	ND
	Semi-fluid liquid	Bulgogi marinade	Retort	ND	0.057±0.001^a
		Curry	Retort	0.116±0.004^f	0.009±0.001^f
		Honey	Acacia	ND	0.041±0.001^b
			Chestnut	0.133±0.007^f	0.032±0.000^c
			Local	0.231±0.002^e	0.002±0.000ⁱ
			Multi flora	0.226±0.002^e	0.006±0.000^h
		Mayonnaise	Bottled	0.220±0.011^e	ND
		Oyster		0.273±0.005^d	ND
		Pasta		ND	0.009±0.001^fg
		Pork cutlet		ND	0.018±0.001^e
		Starch syrup		ND	ND
		Tomato ketchup		0.880±0.025^a	0.042±0.001^b

¹⁾ND: Not detection..

²⁾Each letter means differ significantly, based on Duncan’s multiple range test at P=0.05..

Table 7 . Comparison of pantothenic acid and pyridoxine contents of oils (mg/100 g).

Kind	Status	Sample	Pantothenic acid	Pyridoxine
Oil	Solid	Butter	ND¹⁾	ND
	Solid	Margarine	ND	0.015±0.002^a2)
	Liquid	Canola	ND	ND
		Hot pepper	ND	ND
		Corn	ND	ND
		Grape seed	ND	ND
		Sesame	ND	0.014±0.001^a
		Soybean	ND	ND
		Sunflower	ND	0.009±0.000^b

¹⁾ND: Not detection..

²⁾Each letter means differ significantly, based on Duncan’s multiple range test at P=0.05..

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