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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2023; 52(3): 259-267

Published online March 31, 2023 https://doi.org/10.3746/jkfn.2023.52.3.259

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Properties and Anti-Inflammatory Effects of Fermented Product Using Yeast on Roasted Coffee Beans Extracts

So Hyun Park1 , Kyung Eun Moon1, Hyeon Hwa Oh1, Do Youn Jeong2, and Young-Soo Kim1

1Department of Food Science and Technology, Jeonbuk National University
2Microbial Institute for Fermentation Industry (MIFI)

Correspondence to:Young-Soo Kim, Department of Food Science and Technology, Jeonbuk National University, 567, Baekje-daero, Deokjin-gu, Jeonju, Jeonbuk 54896, Korea, E-mail: ykim@jbnu.ac.kr

Received: December 7, 2022; Revised: January 18, 2023; Accepted: January 25, 2023

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

This study investigated the characteristics and anti-inflammatory effect of roasted coffee beans hot-water extracts fermentation with Saccharomyces cerevisiae SRCM102539. Live cell counts, soluble solids, pH, and total acidity of unfermented roasted coffee beans extracts (UFRCE) were 4.50 log CFU/mL, 21.27°Brix, 4.99, and 0.21%, respectively, and of fermented roasted coffee beans extracts (FRCE) were 6.72 log CFU/mL, 7.60°Brix, 4.56, and 0.30%, respectively. The organic acids present in FRCE were succinic acid (373.00 mg%), acetic acid (190.91 mg%), and citric acid (67.41 mg%). The glucose content of UFRCE was 23.89% (w/v), and the ethanol content of FRCE was 8.41% (w/v). The anti-inflammatory effects of the two extracts were evaluated using lipopolysaccharide (1 μg/ mL)-stimulated RAW 264.7 cells. FRCE inhibited nitric oxide and prostaglandin2 levels by 41.82% and 55.71%, respectively. Inhibition percentages of tumor necrosis factor-α and interleukin-1β for FRCE were 40.14% and 71.13%, respectively. Furthermore, FRCE inhibited the mRNA levels of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 by 58.01% and 41.23%, respectively. The study shows that fermentation with S. cerevisiae SRCM102539 increases the anti-inflammatory effect of roasted coffee beans extracts.

Keywords: anti-inflammatory, roasted coffee beans extracts, Saccharomyces cerevisiae SRCM102539

커피는 전 세계적으로 가장 널리 소비되고 있는 대표적인 기호 음료로 우리나라에서도 경제적인 발전과 서구화된 생활 방식으로 인하여 국내 커피 수입량 및 소비량이 꾸준히 증가하고 있다(Kim 등, 2018). 커피는 커피나무로부터 수확한 생두(green bean)에 열을 가하여 볶는 로스팅(roasting) 공정을 통해 원두(roasted bean)로 전환되며, 일반적으로 마이야르 반응(Maillard reaction)과 스트레커(Strecker) 분해반응으로 인한 물리・화학적인 특성 변화로 커피 특유의 풍미와 맛이 생성된다(Hwang과 Moon, 2022). 커피의 효능에 주요한 역할을 하는 물질에는 카페인(caffeine, 1,3,7-trimethylpurine-2,6-dione), 클로로젠산(chlorogenic acid, 3-O-caffeoylquinic acid) 등이 알려져 있으며(Kim 등, 2022), 이 중 클로로젠산은 NF-κB 신호전달 경로의 활성화를 약화하는 항산화 및 항염증 효능이 있다고 보고된다(Shan 등, 2009).

염증반응은 외부의 유해한 자극으로부터 신체를 방어하기 위해 가장 먼저 일어나는 병리학적 반응으로 조직의 손상에 대하여 구조나 기능을 회복시키는 체내 방어기전이지만, 염증반응이 만성적이고 과한 경우 세포나 조직의 기능장애를 일으켜 뇌 질환, 아토피, 심혈관 질환, 암 등 다양한 질병으로 발달할 수 있어, 염증을 일으키는 인자들을 찾아 조절 및 제거하고 기전을 밝히는 여러 연구가 진행되고 있다(Park 등, 2020). 대식세포(macrophage)는 급성 염증반응을 인식하여 세균이나 바이러스에 대항하고 세포를 파괴하는 면역세포로서 면역자극 물질인 lipopolysaccharide(LPS)에 노출되면 mitogen-activated protein kinases(MAPKs) 및 nuclear factor-kappa B(NF-κB)와 같은 신호전달 경로를 활성화하여 inducible nitric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2)로부터 nitric oxide(NO), prostaglandin E2(PGE2)와 같은 염증 매개 인자들과 interleukin(IL)-1β, IL-6, tumor necrosis factor(TNF)-α와 같은 전염증성 사이토카인을 유도하여 동맥경화, 염증성 장 질환, 감염성 질환 및 암을 비롯한 급성 및 만성 염증성 질환에서 면역반응을 더욱 악화시킨다(Baek 등, 2020; Jo와 Bang, 2022). 따라서 이들의 염증 매개 인자들과 전염증성 사이토카인의 생성을 억제할 수 있는 생리활성 물질에 관한 관심이 높아지고 있다(Song 등, 2022).

인간이 오래전부터 주류 및 제빵과 같은 발효 산업에 주로 이용해왔던 Saccharomyces cerevisiae는 인체에 무해한 GRAS(generally regarded as safe) 균주로 안전성을 입증받았으며, 단백질, 지질, 핵산, 비타민 등의 다양한 유용 물질을 생산하기 위한 원료로 사용되어 왔다(Lee 등, 2009). 현재까지 보고된 효모 발효의 기능성에 관한 연구로는 다시마 추출물에 S. cerevisiae 발효를 통한 항산화 및 항염증 효능(Eom 등, 2010), S. cerevisiae로 발효시킨 대추의 항염증 증진 효과(Jung과 Cho, 2011), 대황 추출물에 젖산균과 효모를 이용한 항염증 효능 비교(Kim 등, 2011), 효모를 이용한 발효 참당귀 분말 추출물의 이화학적 특성 및 생리활성 효과(Sim 등, 2019) 등이 보고되었지만, 커피 원두 추출물에 효모를 활용한 발효 및 기능성에 관한 연구는 미비한 상황이다. 따라서 본 연구에서는 커피 원두 추출물에 Saccharomyces cerevisiae SRCM102539를 이용하여 발효시키기 위한 발효 조건을 모색하고 발효 기간에 따른 발효물의 이화학적 특성에 대해 분석하여 발효 특성을 평가하였다. 또한 최종 발효물을 동결건조하여 효모 발효에 따른 커피 원두 추출물의 RAW 264.7 세포에 대한 항염증 효과를 평가하고자 하였다.

재료 및 시약

커피 원두는 브라질산 생두에 고초균을 발효시켜 로스팅된 것을 (재)발효미생물산업진흥원(Sunchang, Korea)으로부터 제공받아 사용하였다. 효모배양을 위한 배지 YPDA와 YPDB는 Becton, Dickinson & Co.(Franklin Lakes, NJ, USA), yeast extract는 Angel Yeast Co., Ltd.(Yichang, China), glucose는 대정화금(Siheung, Korea) 제품을 사용하였다. 유리당 및 유기산 정량을 위한 표준물질 glucose, succinic acid, citric acid, acetic acid는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포배양을 위하여 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), antibiotics(penicillin/streptomycin), fetal bovine serum(FBS), Dulbecco’s phosphate-buffered saline(DPBS)은 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용했으며, 세포 생존율 평가를 위해 cell counting kit-8(CCK-8, Dojindo Molecular Technologies Inc., Rockville, MD, USA) 제품을 사용하였다. 세포 배양액 내의 PGE2, TNF-α 및 IL-1β는 ELISA kit(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 측정하였다. Total RNA 추출은 Qiagen RNeasy mini kit(Qiagen, Hilden, Germany), cDNA 합성은 Go ScriptTM Reverse Transcription system(Promega, Madison, WI, USA), real-time PCR은 Fast SYBR™ Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) 제품을 사용하였다.

커피 원두 추출물의 제조와 효모 발효

커피 원두는 그라인더(The smart grinderTM pro, Breville, Sydney, Australia)를 이용하여 0.3 mm 이하 크기로 분쇄하였으며, 증류수를 20배수(w/v) 첨가하여 항온수조(TW-PC-1, Universal Scientific Industrial Co., Ltd., Shanghai, China)에서 열수 추출(85°C, 3시간)하였다. 효모 발효를 위한 혼합액(RCE)은 조성비(20% glucose, 1% yeast extract, 70% roasted coffee extract, 9% distilled water)로 제조하였다. (재)발효미생물산업진흥원으로부터 분양받은 Saccharomyces cerevisiae SRCM102539 균주는 YPDA(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose, 1.5% agar)에 도말하여 정치배양기(HB-101M, Hanbaek Scientific Co., Ltd., Bucheon, Korea)에서 활성화(30°C, 2일)한 후 YPDB(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose)에 접종하여 진탕배양기(SI-2S, Universal Scientific Industrial Co., Ltd.)에서 진탕 배양(30°C, 120 rpm, 12시간)한 것을 효모 전 배양액으로 하였다. RCE에 효모 전 배양액 1%(v/v)를 접종하여 정치 배양(30°C, 5일)하였고, 배양 기간에 1일 간격으로 샘플링하여 차후 분석용 시료로 사용하였다.

생균수 및 이화학적 특성 분석

생균수는 멸균 펩톤수를 이용하여 연속희석법으로 희석하고 YPDA에 도말한 후 배양(30°C, 2일)하여 생성된 균집락을 계수하여 log CFU/mL로 나타내었다. 수용성 고형분 함량은 당도계(PAL-1, ATAGO Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정한 후 °Brix 단위로 표기하였다. pH는 pH meter(PP-20, Sartorius, Gottingen, Germany)를 사용하여 측정하였고, 총산도는 시료 1 mL에 0.1 N NaOH(대정화금)를 첨가하여 pH 8.3에 도달할 때까지 소모된 양을 acetic acid의 환산계수를 곱하여 백분율(%)로 산출하였다.

유기산, 유리당 및 에탄올 함량 분석

유기산, 유리당 및 에탄올 함량 분석은 Kim과 Song(2002)의 방법을 이용하여 측정하였다. 분석을 위한 시료는 희석하여 Sep-pak C18 cartridge(Waters Corp., Milford, MA, USA)에 통과시킨 다음, 0.22 μm membrane filter(Futecs Co., Ltd., Daejeon, Korea)로 여과하여 HPLC system(Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)으로 분석하였다. HPLC system의 분석조건은 Aminex HPX-87H Column(300×7.8 mm, 9 μm, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA), 이동상은 0.008 N H2SO4, 컬럼 온도는 35°C, 유속은 0.6 mL/min, 유기산 검출기는 UV-VIS detector(5410 UV Detector, Hitachi Ltd.), 에탄올 검출기는 RID detector(5450 RI Detector, Hitachi Ltd.)로 검출 파장은 210 nm였다. 분리된 유기산, 유리당 및 에탄올의 각 peak는 동일 조건에서 분석한 표준물질 mixture의 peak 면적비와 retention time을 비교하여 함량을 산출하였다.

항염증 평가를 위한 시료의 제조

커피 원두 추출물을 이용한 효모 발효물의 항염증 평가를 위한 시료는 알코올 발효가 완료된 최종 발효물인 5일 차 발효물(FRCE)과 비발효구(대조구)인 0일 차 발효물(UFRCE)로 하였다. 시료는 회전감압농축기(RV10 B S96, IKA-Werke GmbH & Co., KG, Staufen, Germanay)를 이용하여 에탄올을 증발시킨 후 회수된 시료를 동결건조기(FD8508, Ilshin Lab Co., Ltd., Dongducheon, Korea)에서 건조하여 분말 형태로 제조하였다. 분말 형태의 시료는 10% dimethyl sulfoxide를 이용하여 10 mg/mL의 농도로 제조했으며, Minisart® RC25 Syringe Filter(Sartorius)로 여과하고 -20°C 냉동고에 보관하면서 차후 실험에 사용하였다.

세포의 배양 및 세포독성 평가

Mouse 유래 macrophage cell line인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB No. 40071; Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 5% CO2가 공급되는 37°C incubator(MCO-18AC, Panasonic Healthcare Co., Ltd., Osaka, Japan)에서 배양하였다. RAW 264.7 세포는 96-well plate에 5×103 cells/well의 밀도로 분주하여 5% CO2가 공급되는 37°C incubator에서 24시간 배양하였다. 효모 최종 발효물 FRCE, 대조구 UFRCE는 0.1, 0.2, 0.5, 0.6 mg/mL 농도로 처리하였으며, 양성대조구로 사용된 클로로젠산(Sigma-Aldrich Co.)은 0.005, 0.15 mg/mL 농도로 처리하고 48시간 추가 배양하였다. 배양 48시간 후 상등액을 제거하고 DPBS 100 μL와 CCK-8 solution 10 μL를 첨가하여 암실의 5% CO2가 공급되는 37°C incubator에서 2시간 반응하였다. 반응 후에 microplate reader(US/ Eon, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 생존율은 시료 비첨가구의 흡광도 값에 대한 각 시료 및 양성대조구 첨가구의 흡광도 값을 백분율로 계산하여 나타내었다.

NO, PGE2 및 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β) 생성량 측정

RAW 264.7 세포는 96-well plate에 5×104 cells/well의 밀도로 분주하여 5% CO2가 공급되는 37°C incubator에서 24시간 배양하고, LPS(1 μg/mL)와 농도별로 희석된 시료(0.2, 0.5 mg/mL) 및 양성대조구(0.005, 0.15 mg/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. NO 생성량 측정은 Kim 등(1999)의 방법을 변형하여 진행하였으며, 세포배양액과 Griess reagent를 상온에서 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 nitrite 표준용액의 정량 곡선을 기준으로 NO 생성량을 산출하였다. 세포배양액의 PGE2 생성량은 PGE2 ELISA kit을 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 전염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β 생성량은 각각 Mouse TNF-α Quantikine ELISA kit과 Mouse IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA kit을 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다.

iNOS 및 COX-2 mRNA 수준 발현량 측정

RAW 264.7 세포는 96-well plate에 5×104 cells/well의 밀도로 분주하여 5% CO2가 공급되는 37°C incubator에서 24시간 배양하고, LPS(1 μg/mL)와 농도별로 희석된 시료 및 양성대조구를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 DPBS로 2회 세척하고 세포를 회수하여 RNeasy mini kit(Qiagen)의 지시대로 total RNA를 추출하였으며, GoStriptTM Reverse Transcription system(Promega)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 분석에 사용된 iNOS, COX-2 및 GAPDH primer 염기서열은 Table 1에 제시하였다. Real- time PCR 반응액은 cDNA, Fast SYBRTM Green Master Mix, iNOS 또는 COX-2 유전자의 forward, reverse primer(10 pmol/μL)와 H2O를 첨가하여 StepOnePlus real-time PCR system(Thermo Fisher Scientific Inc.)으로 분석하였다. 반응조건은 two step cycling protocol을 기준으로 95°C에서 20초 동안 predenaturation 후 95°C에서 3초, 60°C에서 30초씩 40 cycles을 반복하였다. Real-time PCR을 통해 증폭된 산물은 GAPDH(house keeping gene)의 발현량으로 보정하여 ΔΔCt method(Rao 등, 2013)를 이용해 정량하였으며, 시료 및 양성대조구 처리에 따른 iNOS 및 COX-2 mRNA 발현량의 비교는 LPS 단독 처리구에 대한 상대 발현 백분율(%)로 비교하였다.

Table 1 . The primer sequence of real-time qPCR

Target geneGene full nameDirectionPrimer sequence (5′→3′)
iNOSInducible nitric oxide synthaseForward
Reverse
ACATCGACCCGTCCACAGTAT
CAGAGGGGTAGGCTTGTCTC
COX-2Cyclooxygenase-2Forward
Reverse
TGAGCAACTATTCCAAACCAGC
GCACGTAGTCTTCGATCACTATC
GAPDH1)Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenaseForward
Reverse
AGGTCATCCCAGAGCTGAACG
CACCCTGTTGCTGTAGCCGTAT

1)GAPDH is housekeeping gene for RAW 264.7 cell line.



통계분석

각 실험에서 얻은 결과는 SPSS package program(Ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 평균과 표준편차로 나타내었다. 각 시료 사이에서 유의성은 P<0.05 수준에서 one-way ANOVA로 분산 분석한 후에 Duncan’s multiple range test로 비교하였다.

생균수 및 이화학적 특성 변화

제조된 RCE에 효모(Saccharomyces cerevisiae SRCM 102539)를 접종하여 1일 간격으로 생균수 및 이화학적 특성 변화를 분석한 결과는 Table 2와 같다. 발효 기간에 따른 생균수는 발효 0일 차 4.50 log CFU/mL에서 발효 2일 차에 8.07 log CFU/mL로 증가하였으며, 이후 발효가 진행됨에 따라 감소하여 발효 5일 차에는 6.72 log CFU/mL로 확인되었다. 커피 원두 추출물에 함유된 당의 함량은 0.077%(w/v)로, 당을 이용한 효모의 알코올 발효를 위하여 glucose 20%(w/v)로 보당하여 발효하였다. °Brix는 수용성 고형분 함량을 의미하는 단위로, 알코올 발효 중 °Brix 값은 효모의 당 소모 및 에탄올 생성과 높은 상관성을 갖는다(Jang과 Lee, 2020). 발효 기간에 따른 수용성 고형분 함량은 발효 전(발효 0일 차, UFRCE) 21.27°Brix에서 발효가 진행됨에 따라 감소하였으며, 발효 후(발효 5일 차, FRCE) 7.60°Brix로 4일 차와 큰 변화가 없어 최종 발효 완료 시점을 5일로 하였다. 이를 통해 수용성 고형분 함량의 감소에 따라 효모가 당을 소모하여 에탄올을 생성한 것을 간접적으로 확인할 수 있었다. 효모 발효의 이상발효 판단기준으로 사용되는 pH와 총산도의 변화는 발효 기간에 따라 발효 전 4.99에서 발효 후 4.56으로 감소하였고, 총산도는 초산을 기준으로 발효 전 0.21%(w/v)에서 발효 후 0.30%(w/v)로 소폭 증가하는 경향으로 변화가 미미하여 이상발효가 발생하지 않은 것으로 판단된다(Ga 등, 2019).

Table 2 . Live cell counts and physicochemical properties of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract with different fermentation period

ContentFermentation time (day)
012345
Live cell counts (log CFU/mL)4.50±0.05a1)2)7.65±0.04c8.07±0.04f7.93±0.02e7.74±0.06d6.72±0.02b
Physicochemical propertiesSoluble solid (°Brix)21.27±0.06e19.77±0.15d12.50±0.26c8.50±0.10b7.53±0.06a7.60±0.10a
pH4.99±0.03e4.55±0.03d4.24±0.01a4.40±0.02b4.50±0.02c4.56±0.02d
Total acidity (%)0.21±0.00a0.24±0.01b0.32±0.02c0.29±0.02c0.31±0.01c0.30±0.01c

1)Values are mean±SD (n=3).

2)Different small letters (a-f) in the same row indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).



유기산, 유리당 및 에탄올의 함량 변화

커피 원두 추출물을 이용한 효모 발효물의 발효 기간에 따른 유기산, 유리당 및 에탄올의 함량 변화를 분석한 결과는 Table 3과 같다. 커피 효모 발효물의 유기산으로는 citric acid, succinic acid, acetic acid 등 3종이 검출되었으며, UFRCE의 유기산 함량은 succinic acid(386.30 mg%), acetic acid(177.00 mg%), citric acid(78.13 mg%) 순으로 succinic acid의 함량이 가장 높았다. Succinic acid는 발효 후 373.00 mg%로 유의차가 없었으며, citric acid는 67.41 mg%로 발효 전보다 유의적으로 감소하였고 acetic acid는 190.91 mg%로 유의적으로 증가하였다. 이와 같은 결과는 효모 발효에 의한 acetic acid의 유의적인 증가가 총산도 및 pH 변화에 기인하는 것으로 판단된다.

Table 3 . Organic acid, free sugar and alcohol of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract with different fermentation period

ContentFermentation time (day)
012345
Organic acid (mg% (w/v))Citric acid78.13±0.39b1)2)82.51±0.16bc91.78±3.28d81.15±0.13bc86.28±0.24cd67.41±11.41a
Succinic acid386.30±2.27c264.24±0.42a319.55±1.56b257.94±5.92a321.09±23.56b373.00±15.45c
Acetic acid177.00±16.63a183.40±0.22ab197.46±0.72c175.84±1.02a195.13±1.02c190.91±0.16bc
Free sugar & alcohol (% w/v)Glucose23.89±0.13d21.25±0.14c8.45±0.01b0.41±0.02aND3)ND
EthanolND1.23±0.00a6.32±0.12b7.39±0.03c8.28±0.04d8.41±0.52d

1)Values are mean±SD (n=3).

2)Different small letters (a-d) in the same row indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

3)ND is an abbreviation for not detected.



커피 원두 추출물을 이용한 효모 발효물의 주요 유리당은 glucose로 확인되었으며, HPLC를 이용하여 분석한 UFRCE의 glucose 함량은 혼합액 제조 시 보당에 사용된 glucose 20%(w/v)와 멸균으로 용출된 양의 합인 23.89%(w/v)로 분석되었다. 발효가 진행됨에 따라 발효 4일 차부터 glucose는 모두 검출되지 않았으며, 효모가 에탄올 생성에 당을 모두 소비한 것으로 판단되었다. 에탄올은 발효가 진행됨에 따라 증가하였으며, FRCE의 에탄올 함량은 8.41%(w/v)로 분석되었다. 따라서 에탄올 함량이 최대이며 glucose가 효모에 의해 모두 소모된 5일 차 발효물을 최종 발효물로 선택하여 차후 실험에 사용하였다.

세포독성 평가

커피 원두 추출물을 이용한 효모 발효물의 세포독성 평가는 RAW 264.7 세포에 UFRCE 및 FRCE의 동결건조물을 0.1, 0.2, 0.5, 0.6 mg/mL 농도로 처리하여 분석하였다(Fig. 1). 커피 원두 추출물이 70% 함유된 UFRCE 및 이를 5일 동안 효모 발효한 FRCE에 함유된 페놀성 화합물 중 항염증 효능이 알려진 클로로젠산 함량을 HPLC system을 통해 분석했을 때, UFRCE 및 FRCE에 함유된 CGA(chlorogenic acid; 5-CGA↔3-CGA)의 함량이 10 μg/mg 이하로 확인되었다(데이터 미제시). 본 연구에서는 세포독성 및 항염증 실험의 양성대조구로 클로로젠산을 이용하여, UFRCE 및 FRCE 0.5 mg/mL 처리농도에 함유된 클로로젠산 함량인 0.005 mg/mL와 농도 의존성을 확인하고자 0.15 mg/mL의 두 농도를 설정하여 비교・분석하였다. UFRCE, FRCE 및 CGA의 세포독성은 ISO 10993-5(2009)의 방법을 참고하여 시료 비처리구의 생존율을 100%로 하였을 때 30% 이상 감소하는 시료 농도를 확인하였고, 오차 수준을 고려하여 세포 생존율은 80% 이상 유지된 시료 처리농도를 선택하였다. UFRCE의 세포 생존율이 0.6 mg/mL 처리 시 83.04%였고, FRCE의 세포 생존율은 0.1~0.6 mg/mL 처리농도에서 100% 이상의 생존율이 확인되었다. 한편, CGA는 0.005 mg/mL 및 0.15 mg/mL의 처리농도에서 세포독성이 확인되지 않았다. 따라서 추후 실험에서 시료 처리 시 세포 생존율에 독성을 미치지 않는 농도 UFRCE 및 FRCE의 0.2, 0.5 mg/mL CGA의 0.005, 0.15 mg/mL 농도에서 항염증 평가를 진행하였다.

Fig. 1. Effect of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract on cell viability in RAW 264.7 cells. The cells were treated with the indicated concentration of UFRCE, FRCE (0.1, 0.2, 0.5, and 0.6 mg/mL), and CGA (0.005, 0.15 mg/mL) for 48 h. UFRCE: unfermented roasted coffee extract, FRCE: fermented roasted coffee extract, CGA: chlorogenic acid (positive control). Results are mean± SD of duplicate data. Error bar indicates the standard deviation of mean, and means with the same letter (a-f) are not significantly different according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

NO 및 PGE2 생성량

NO는 생채 내 신호전달의 매개체로 면역 작용 및 신호전달 등의 다양한 생리활성에 관여하지만, iNOS에 의해 과분비된 NO는 세포 내 염증 및 세포사멸을 유발하는 염증반응의 중요한 지표로 사용된다(Baek 등, 2020). 대식세포에 LPS를 처리하여 자극 시 NO의 함량이 증가하고 처리하는 시료가 NO 생성을 억제하는 정도로 항염증 활성을 평가한다(Moon 등, 2021). RAW 264.7 세포에 LPS(1 μg/mL)를 처리하여 염증반응을 유도하고 UFRCE 및 FRCE를 각각 0.2, 0.5 mg/mL 농도로 처리하였으며, 같은 조건에서 LPS만을 단독 처리하였을 경우와 양성대조구로 CGA를 0.005, 0.150 mg/mL 농도로 처리하여 반응시켰을 때 NO의 생성량을 평가하였다(Fig. 2A). LPS 비처리구는 0.01 μM, 단독처리구에서 31.36 μM의 NO 생성량을 나타냈으며, 비발효구인 UFRCE의 NO 생성량은 농도 의존적으로 감소하여 0.5 mg/mL 처리농도에서 26.00% 감소하였다. Jung 등(2017)은 커피 추출물이 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 염증 인자를 감소시켜 항염증 효능을 나타냈다고 보고하였으며, 본 연구에서도 커피 추출물이 함유된 효모 비발효구에서도 NO 생성량 감소를 나타냈다. FRCE의 NO 생성량은 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 감소하여 0.2 mg/mL와 0.5 mg/mL 처리농도에서 각각 24.48 μM과 18.25 μM로 LPS 단독처리구보다 21.96%와 41.82% 감소하였다. 이와 같은 결과는 다시마 추출물 S. cerevisiae 발효 시 항염증 활성의 증가(Eom 등, 2010) 및 S. cerevisiae로 발효시킨 대추의 항염증 증진 효과(Jung과 Cho, 2011)에서 보고된 것과 같이 본 연구에서 효모 발효 후 NO 생성을 억제하는 효과가 증가하는 결과와 유사하였다. 따라서 비발효구인 UFRCE의 NO 생성량의 감소가 효모 발효를 통해 FRCE구에서 증가하여 항염증 활성이 증가하였다고 판단된다. 양성대조구인 CGA를 0.15 mg/mL로 처리하였을 때, FRCE 0.5 mg/mL 처리 효과와 유사한 효능을 보였으나, FRCE 0.5 mg/mL에 함유된 CGA의 양이 0.005 mg/mL 수준이었던 것을 고려하면 CGA 단독의 효과보다 커피 원두 추출물을 이용한 효모 발효 과정 중 생성된 성분들에 의해 NO 생성량이 감소한 것으로 추정된다. LPS 처리로 발현이 유도된 COX-2 유전자는 급성 염증반응에서 PGE2를 합성하고, PGE는 통증, 발열에 관여하는 염증 매개체로 면역반응과 염증반응에 관여하여 암 발생에 깊이 관여하고 있다(Lee와 Kim, 2015). LPS 처리 후 유도된 염증반응이 억제되었을 경우 PGE2의 생성량이 감소하는 것으로 항염증 효능을 평가하였다. 본 연구에서 PGE2의 생성량은 LPS를 단독 처리하였을 경우 4,647 pg/mL(Fig. 2B)였으며, FRCE, UFRCE 및 CGA 처리구에서 농도 의존적으로 감소하였다. FRCE 0.2 mg/mL 처리구는 UFRCE 0.5 mg/mL 처리구와 PGE2 생성량이 유사하였고, FRCE 0.5 mg/mL 처리 시 PGE2의 생성량은 2,058 pg/mL로 LPS 단독처리구보다 약 2배 이상 감소하는 효과를 보였다. 한편, CGA의 경우 0.15 mg/mL 처리구에서도 PGE2의 농도가 3,942 pg/mL로 감소 효과가 크지 않아 FRCE의 PGE2 생성량 감소 효과는 CGA의 영향보다는 효모 발효에 의한 영향으로 감소한 것으로 판단된다.

Fig. 2. Effect of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract on NO (A) and PGE2 (B) levels in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The cells were treated with the indicated concentration of UFRCE, FRCE (0.2, 0.5 mg/mL), and CGA (0.005, 0.15 mg/mL) then with LPS (1 μg/mL) for 24 h. -: not treated, +: treated, UFRCE: unfermented roasted coffee extract, FRCE: fermented roasted coffee extract, CGA: chlorogenic acid (positive control). Results are mean±SD of duplicate data. Error bar indicates the standard deviation of mean, and means with the same letter (a-h) are not significantly different according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

세포배양액의 TNF-α 및 IL-1β 정량

염증반응을 매개하는 전염증성 사이토카인으로 알려진 TNF-α 및 IL-1β는 LPS로 자극된 대식세포에서 생성되어 낮은 농도에서는 체내 항상성 유지 및 세포의 성장에 관여하지만, 염증반응이나 상처 또는 자극으로 대량 생산 시 인체 질환을 악화시킨다(Hong 등, 2021). 따라서 LPS로 염증반응을 유도하고 전염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-1β 생성을 억제하는 것으로 항염증 효과를 평가하였다. 커피 추출물을 이용한 효모 발효물 처리에 따른 세포배양액 내 TNF-α와 IL-1β의 함량은 Fig. 3과 같다. UFRCE와 FRCE의 TNF-α 생성량은 0.5 mg/mL 처리농도에서 각각 23.20 ng/mL와 20.52 ng/mL였으며, 이는 LPS 단독처리구에 비해 각각 32.31%와 40.14% 억제능을 나타냈다(Fig. 3A). 이러한 결과는 효모 및 젖산균을 이용한 발효 대황이 LPS로 유도된 대식세포에서 TNF-α의 생성량을 억제한 것과 유사하게 나타났다(Kim 등, 2011). 한편, UFRCE와 FRCE의 IL-1β 생성량은 0.5 mg/mL 처리농도에서 각각 18.79 ng/mL와 14.32 ng/mL였으며, 이는 LPS 단독처리구에 비해 각각 62.10%와 71.13% 억제능을 나타냈다(Fig. 3B). FRCE, UFRCE 및 CGA는 농도 의존적으로 TNF-α 및 IL-1β 저해 활성을 보였지만, FRCE의 저해 활성이 가장 높은 것으로 확인되었다. 본 연구 결과 UFRCE 및 FRCE는 전염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β 생성을 저해하지만, FRCE가 비발효구인 UFRCE보다 더 높은 저해 활성을 나타내는 것을 바탕으로 효모 발효를 통해 항염증 효과가 증가한 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 3. Effect of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract on TNF-α (A) and IL-1β (B) levels in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The cells were treated with the indicated concentration of UFRCE, FRCE (0.2, 0.5 mg/mL), and CGA (0.005, 0.15 mg/mL) then with LPS (1 μg/mL) for 24 h. -: not treated, +: treated, UFRCE: unfermented roasted coffee extract, FRCE: fermented roasted coffee extract, CGA: chlorogenic acid (positive control). Results are mean±SD of duplicate data. Error bar indicates the standard deviation of mean, and means with the same letter (a-f) are not significantly different according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

iNOS 및 COX-2 유전자 mRNA 발현량

iNOS는 염증성 자극으로부터 발현되어 RAW 264.7 세포에서 NO를 생성하여 염증과 관련된 질병을 유발하며, COX-2는 염증 부위에서 발열과 통증에 작용하는 PGE2를 생성하고 TNF-α 및 IL-1β와 같은 전염증성 사이토카인을 증가시키는 요인 중 하나로 염증조직이나 암 조직에서 높게 나타난다(Kim 등, 2020). 따라서 이러한 염증 유발 인자의 발현량을 조사하기 위하여 real-time PCR을 통해 mRNA 수준에서 LPS 단독처리구(+) 대비 시료 처리에 따른 iNOS 및 COX-2 발현량을 비교하여 염증반응 저해 활성을 평가하고자 하였다(Fig. 4). iNOS는 LPS 단독처리구(+)의 발현량을 100%로 하였을 때 UFRCE와 FRCE를 0.5 mg/mL 처리농도에서 각각 49.71%와 41.99%로 발현량이 감소하였으며, CGA를 0.15 mg/mL 처리하였을 경우 80.98%로 FRCE의 iNOS 유전자 발현량의 저감 효과가 가장 높았다. COX-2는 LPS 단독처리구(+)의 발현량을 100%로 하였을 때 UFRCE와 FRCE를 0.5 mg/mL 처리농도에서 각각 79.99%와 58.77%로 발현량이 감소하였으며, CGA를 0.15 mg/mL 처리하였을 경우 83.03%로 FRCE의 COX-2 유전자 발현량의 저감 효과가 가장 높았다. 이전 S. cerevisiae로 발효시킨 대추의 항염증 증진 효과(Jung과 Cho, 2011)에서 일반 대추보다 S. cerevisiae를 이용한 발효 대추에서 iNOS 및 COX-2 유전자 발현량 저해 효과가 높은 것과 유사한 결과를 바탕으로 발효과정이 염증반응에 관여하는 유전자 발현을 조절한 것으로 판단되며, 커피 추출물을 이용한 효모 발효물에서 발효 전보다 발효 후 유전자 발현량의 감소로 항염증 효과가 증진됨을 본 연구를 통해 확인할 수 있었다. CGA의 iNOS 및 COX-2의 유전자 발현량을 감소시키는 효과는 0.15 mg/mL까지 농도 의존적으로 확인되었지만 FRCE 0.5 mg/mL에서의 효과보다 낮았다. 이와 같은 결과는 FRCE에 함유된 CGA의 함량이 0.005 mg/mL 이하임을 고려할 때, CGA의 항염증 효과라기보다 커피 추출액의 항염증 성분이 효모 발효를 통해 효능이 증가한 것으로 추정된다.

Fig. 4. Effect of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract on iNOS (A) and COX-2 (B) mRNA gene expression ratio in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The cells were treated with the indicated concentration of UFRCE, FRCE (0.2, 0.5 mg/mL), and CGA (0.005, 0.15 mg/mL) then with LPS (1 μg/mL) for 24 h. -: not treated, +: treated, UFRCE: unfermented roasted coffee extract, FRCE: fermented roasted coffee extract, CGA: chlorogenic acid (positive control). iNOS: inducible nitric oxide synthase, COX-2: cyclooxygenase-2, GAPDH: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, LPS: lipopolysaccharides. Results are mean±SD of duplicate data. Error bar indicates the standard deviation of mean, and means with the same letter (a-c) are not significantly different according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

본 연구는 브라질산 생두에 고초균 발효를 하여 로스팅된 원두를 이용하여 커피 추출액을 제조하였으며, 혼합액(RCE, 70% roasted coffee extract, 20% glucose, 1% yeast extract, 9% distilled water)에 Saccharomyces cerevisiae SRCM102539 균주를 접종하고 정치 배양(30°C, 5일)하여 효모 발효를 진행하였다. 효모 발효물의 발효 기간(5일)에 1일 간격으로 생균수, 이화학적 특성(수용성 고형분 함량, pH, 총산도), 유리당, 유기산 및 에탄올의 함량을 분석하였다. 효모 발효 전(0일 차, UFRCE), 후(5일 차, FRCE)의 생균수, 수용성 고형분 함량, pH 및 총산도의 변화는 4.50 log CFU/mL에서 6.72 log CFU/mL, 21.27°Brix에서 7.60 °Brix, 4.99에서 4.56, 0.21%에서 0.30%로 나타났다. HPLC 분석을 통한 UFRCE의 포도당 함량은 23.89%(w/v)였으나 FRCE에서는 검출되지 않았고, 에탄올 함량은 FRCE에서 8.41%(w/v)로 분석되었다. FRCE의 주요 유기산은 succinic acid(373.00 mg%), acetic acid(190.91 mg%,), citric acid(67.41 mg%) 3종이 검출되었다. Lipopolysaccharide(1 μg/mL)로 염증반응이 유도된 RAW 264.7 세포에 대한 FRCE의 항염증 효과는 NO 및 PGE2 생성량의 감소, 세포 외로 분비된 사이토카인(TNF-α, IL-1β) 생성억제율 및 염증 관련 유전자(iNOS, COX-2) 발현량을 mRNA 수준에서 평가하였다. FRCE 및 UFRCE는 0.5 mg/mL 이하 농도에서 세포 생존율에 영향을 미치지 않았고, 양성대조구로 chlorogenic acid를 사용하여 비교하였다. FRCE의 항염증 효과는 0.5 mg/mL 처리 시 LPS 단독 처리구에 비해 NO, PGE2, TNF-α 및 IL-1β 생성량을 각각 41.82%, 55.71%, 40.14% 및 71.13% 감소시켰고, mRNA 수준에서 iNOS 및 COX-2의 발현량을 각각 58.01% 및 41.23% 억제하였다. 이러한 결과를 바탕으로 커피 추출물을 이용한 효모 발효물이 효모 발효 과정을 통해 항염증 효능이 더 증대됨을 확인할 수 있었다.

본 논문은 농림축산식품부 지역 전략 식품산업 육성사업(과제명: 임산물 기반 동부권 발효식초개발, MIFI 2022-1)의 연구비 지원으로 이루어졌으며, 이에 감사드립니다.

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Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2023; 52(3): 259-267

Published online March 31, 2023 https://doi.org/10.3746/jkfn.2023.52.3.259

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

커피 원두 추출물을 이용한 효모 발효특성 및 항염증 효과

박소현1․문경은1․오현화1․정도연2․김영수1

1전북대학교 식품공학과
2(재)발효미생물산업진흥원

Received: December 7, 2022; Revised: January 18, 2023; Accepted: January 25, 2023

Properties and Anti-Inflammatory Effects of Fermented Product Using Yeast on Roasted Coffee Beans Extracts

So Hyun Park1 , Kyung Eun Moon1, Hyeon Hwa Oh1, Do Youn Jeong2, and Young-Soo Kim1

1Department of Food Science and Technology, Jeonbuk National University
2Microbial Institute for Fermentation Industry (MIFI)

Correspondence to:Young-Soo Kim, Department of Food Science and Technology, Jeonbuk National University, 567, Baekje-daero, Deokjin-gu, Jeonju, Jeonbuk 54896, Korea, E-mail: ykim@jbnu.ac.kr

Received: December 7, 2022; Revised: January 18, 2023; Accepted: January 25, 2023

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

This study investigated the characteristics and anti-inflammatory effect of roasted coffee beans hot-water extracts fermentation with Saccharomyces cerevisiae SRCM102539. Live cell counts, soluble solids, pH, and total acidity of unfermented roasted coffee beans extracts (UFRCE) were 4.50 log CFU/mL, 21.27°Brix, 4.99, and 0.21%, respectively, and of fermented roasted coffee beans extracts (FRCE) were 6.72 log CFU/mL, 7.60°Brix, 4.56, and 0.30%, respectively. The organic acids present in FRCE were succinic acid (373.00 mg%), acetic acid (190.91 mg%), and citric acid (67.41 mg%). The glucose content of UFRCE was 23.89% (w/v), and the ethanol content of FRCE was 8.41% (w/v). The anti-inflammatory effects of the two extracts were evaluated using lipopolysaccharide (1 μg/ mL)-stimulated RAW 264.7 cells. FRCE inhibited nitric oxide and prostaglandin2 levels by 41.82% and 55.71%, respectively. Inhibition percentages of tumor necrosis factor-α and interleukin-1β for FRCE were 40.14% and 71.13%, respectively. Furthermore, FRCE inhibited the mRNA levels of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 by 58.01% and 41.23%, respectively. The study shows that fermentation with S. cerevisiae SRCM102539 increases the anti-inflammatory effect of roasted coffee beans extracts.

Keywords: anti-inflammatory, roasted coffee beans extracts, Saccharomyces cerevisiae SRCM102539

서 론

커피는 전 세계적으로 가장 널리 소비되고 있는 대표적인 기호 음료로 우리나라에서도 경제적인 발전과 서구화된 생활 방식으로 인하여 국내 커피 수입량 및 소비량이 꾸준히 증가하고 있다(Kim 등, 2018). 커피는 커피나무로부터 수확한 생두(green bean)에 열을 가하여 볶는 로스팅(roasting) 공정을 통해 원두(roasted bean)로 전환되며, 일반적으로 마이야르 반응(Maillard reaction)과 스트레커(Strecker) 분해반응으로 인한 물리・화학적인 특성 변화로 커피 특유의 풍미와 맛이 생성된다(Hwang과 Moon, 2022). 커피의 효능에 주요한 역할을 하는 물질에는 카페인(caffeine, 1,3,7-trimethylpurine-2,6-dione), 클로로젠산(chlorogenic acid, 3-O-caffeoylquinic acid) 등이 알려져 있으며(Kim 등, 2022), 이 중 클로로젠산은 NF-κB 신호전달 경로의 활성화를 약화하는 항산화 및 항염증 효능이 있다고 보고된다(Shan 등, 2009).

염증반응은 외부의 유해한 자극으로부터 신체를 방어하기 위해 가장 먼저 일어나는 병리학적 반응으로 조직의 손상에 대하여 구조나 기능을 회복시키는 체내 방어기전이지만, 염증반응이 만성적이고 과한 경우 세포나 조직의 기능장애를 일으켜 뇌 질환, 아토피, 심혈관 질환, 암 등 다양한 질병으로 발달할 수 있어, 염증을 일으키는 인자들을 찾아 조절 및 제거하고 기전을 밝히는 여러 연구가 진행되고 있다(Park 등, 2020). 대식세포(macrophage)는 급성 염증반응을 인식하여 세균이나 바이러스에 대항하고 세포를 파괴하는 면역세포로서 면역자극 물질인 lipopolysaccharide(LPS)에 노출되면 mitogen-activated protein kinases(MAPKs) 및 nuclear factor-kappa B(NF-κB)와 같은 신호전달 경로를 활성화하여 inducible nitric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2)로부터 nitric oxide(NO), prostaglandin E2(PGE2)와 같은 염증 매개 인자들과 interleukin(IL)-1β, IL-6, tumor necrosis factor(TNF)-α와 같은 전염증성 사이토카인을 유도하여 동맥경화, 염증성 장 질환, 감염성 질환 및 암을 비롯한 급성 및 만성 염증성 질환에서 면역반응을 더욱 악화시킨다(Baek 등, 2020; Jo와 Bang, 2022). 따라서 이들의 염증 매개 인자들과 전염증성 사이토카인의 생성을 억제할 수 있는 생리활성 물질에 관한 관심이 높아지고 있다(Song 등, 2022).

인간이 오래전부터 주류 및 제빵과 같은 발효 산업에 주로 이용해왔던 Saccharomyces cerevisiae는 인체에 무해한 GRAS(generally regarded as safe) 균주로 안전성을 입증받았으며, 단백질, 지질, 핵산, 비타민 등의 다양한 유용 물질을 생산하기 위한 원료로 사용되어 왔다(Lee 등, 2009). 현재까지 보고된 효모 발효의 기능성에 관한 연구로는 다시마 추출물에 S. cerevisiae 발효를 통한 항산화 및 항염증 효능(Eom 등, 2010), S. cerevisiae로 발효시킨 대추의 항염증 증진 효과(Jung과 Cho, 2011), 대황 추출물에 젖산균과 효모를 이용한 항염증 효능 비교(Kim 등, 2011), 효모를 이용한 발효 참당귀 분말 추출물의 이화학적 특성 및 생리활성 효과(Sim 등, 2019) 등이 보고되었지만, 커피 원두 추출물에 효모를 활용한 발효 및 기능성에 관한 연구는 미비한 상황이다. 따라서 본 연구에서는 커피 원두 추출물에 Saccharomyces cerevisiae SRCM102539를 이용하여 발효시키기 위한 발효 조건을 모색하고 발효 기간에 따른 발효물의 이화학적 특성에 대해 분석하여 발효 특성을 평가하였다. 또한 최종 발효물을 동결건조하여 효모 발효에 따른 커피 원두 추출물의 RAW 264.7 세포에 대한 항염증 효과를 평가하고자 하였다.

재료 및 방법

재료 및 시약

커피 원두는 브라질산 생두에 고초균을 발효시켜 로스팅된 것을 (재)발효미생물산업진흥원(Sunchang, Korea)으로부터 제공받아 사용하였다. 효모배양을 위한 배지 YPDA와 YPDB는 Becton, Dickinson & Co.(Franklin Lakes, NJ, USA), yeast extract는 Angel Yeast Co., Ltd.(Yichang, China), glucose는 대정화금(Siheung, Korea) 제품을 사용하였다. 유리당 및 유기산 정량을 위한 표준물질 glucose, succinic acid, citric acid, acetic acid는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포배양을 위하여 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), antibiotics(penicillin/streptomycin), fetal bovine serum(FBS), Dulbecco’s phosphate-buffered saline(DPBS)은 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용했으며, 세포 생존율 평가를 위해 cell counting kit-8(CCK-8, Dojindo Molecular Technologies Inc., Rockville, MD, USA) 제품을 사용하였다. 세포 배양액 내의 PGE2, TNF-α 및 IL-1β는 ELISA kit(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 측정하였다. Total RNA 추출은 Qiagen RNeasy mini kit(Qiagen, Hilden, Germany), cDNA 합성은 Go ScriptTM Reverse Transcription system(Promega, Madison, WI, USA), real-time PCR은 Fast SYBR™ Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) 제품을 사용하였다.

커피 원두 추출물의 제조와 효모 발효

커피 원두는 그라인더(The smart grinderTM pro, Breville, Sydney, Australia)를 이용하여 0.3 mm 이하 크기로 분쇄하였으며, 증류수를 20배수(w/v) 첨가하여 항온수조(TW-PC-1, Universal Scientific Industrial Co., Ltd., Shanghai, China)에서 열수 추출(85°C, 3시간)하였다. 효모 발효를 위한 혼합액(RCE)은 조성비(20% glucose, 1% yeast extract, 70% roasted coffee extract, 9% distilled water)로 제조하였다. (재)발효미생물산업진흥원으로부터 분양받은 Saccharomyces cerevisiae SRCM102539 균주는 YPDA(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose, 1.5% agar)에 도말하여 정치배양기(HB-101M, Hanbaek Scientific Co., Ltd., Bucheon, Korea)에서 활성화(30°C, 2일)한 후 YPDB(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose)에 접종하여 진탕배양기(SI-2S, Universal Scientific Industrial Co., Ltd.)에서 진탕 배양(30°C, 120 rpm, 12시간)한 것을 효모 전 배양액으로 하였다. RCE에 효모 전 배양액 1%(v/v)를 접종하여 정치 배양(30°C, 5일)하였고, 배양 기간에 1일 간격으로 샘플링하여 차후 분석용 시료로 사용하였다.

생균수 및 이화학적 특성 분석

생균수는 멸균 펩톤수를 이용하여 연속희석법으로 희석하고 YPDA에 도말한 후 배양(30°C, 2일)하여 생성된 균집락을 계수하여 log CFU/mL로 나타내었다. 수용성 고형분 함량은 당도계(PAL-1, ATAGO Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정한 후 °Brix 단위로 표기하였다. pH는 pH meter(PP-20, Sartorius, Gottingen, Germany)를 사용하여 측정하였고, 총산도는 시료 1 mL에 0.1 N NaOH(대정화금)를 첨가하여 pH 8.3에 도달할 때까지 소모된 양을 acetic acid의 환산계수를 곱하여 백분율(%)로 산출하였다.

유기산, 유리당 및 에탄올 함량 분석

유기산, 유리당 및 에탄올 함량 분석은 Kim과 Song(2002)의 방법을 이용하여 측정하였다. 분석을 위한 시료는 희석하여 Sep-pak C18 cartridge(Waters Corp., Milford, MA, USA)에 통과시킨 다음, 0.22 μm membrane filter(Futecs Co., Ltd., Daejeon, Korea)로 여과하여 HPLC system(Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)으로 분석하였다. HPLC system의 분석조건은 Aminex HPX-87H Column(300×7.8 mm, 9 μm, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA), 이동상은 0.008 N H2SO4, 컬럼 온도는 35°C, 유속은 0.6 mL/min, 유기산 검출기는 UV-VIS detector(5410 UV Detector, Hitachi Ltd.), 에탄올 검출기는 RID detector(5450 RI Detector, Hitachi Ltd.)로 검출 파장은 210 nm였다. 분리된 유기산, 유리당 및 에탄올의 각 peak는 동일 조건에서 분석한 표준물질 mixture의 peak 면적비와 retention time을 비교하여 함량을 산출하였다.

항염증 평가를 위한 시료의 제조

커피 원두 추출물을 이용한 효모 발효물의 항염증 평가를 위한 시료는 알코올 발효가 완료된 최종 발효물인 5일 차 발효물(FRCE)과 비발효구(대조구)인 0일 차 발효물(UFRCE)로 하였다. 시료는 회전감압농축기(RV10 B S96, IKA-Werke GmbH & Co., KG, Staufen, Germanay)를 이용하여 에탄올을 증발시킨 후 회수된 시료를 동결건조기(FD8508, Ilshin Lab Co., Ltd., Dongducheon, Korea)에서 건조하여 분말 형태로 제조하였다. 분말 형태의 시료는 10% dimethyl sulfoxide를 이용하여 10 mg/mL의 농도로 제조했으며, Minisart® RC25 Syringe Filter(Sartorius)로 여과하고 -20°C 냉동고에 보관하면서 차후 실험에 사용하였다.

세포의 배양 및 세포독성 평가

Mouse 유래 macrophage cell line인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB No. 40071; Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 5% CO2가 공급되는 37°C incubator(MCO-18AC, Panasonic Healthcare Co., Ltd., Osaka, Japan)에서 배양하였다. RAW 264.7 세포는 96-well plate에 5×103 cells/well의 밀도로 분주하여 5% CO2가 공급되는 37°C incubator에서 24시간 배양하였다. 효모 최종 발효물 FRCE, 대조구 UFRCE는 0.1, 0.2, 0.5, 0.6 mg/mL 농도로 처리하였으며, 양성대조구로 사용된 클로로젠산(Sigma-Aldrich Co.)은 0.005, 0.15 mg/mL 농도로 처리하고 48시간 추가 배양하였다. 배양 48시간 후 상등액을 제거하고 DPBS 100 μL와 CCK-8 solution 10 μL를 첨가하여 암실의 5% CO2가 공급되는 37°C incubator에서 2시간 반응하였다. 반응 후에 microplate reader(US/ Eon, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 생존율은 시료 비첨가구의 흡광도 값에 대한 각 시료 및 양성대조구 첨가구의 흡광도 값을 백분율로 계산하여 나타내었다.

NO, PGE2 및 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β) 생성량 측정

RAW 264.7 세포는 96-well plate에 5×104 cells/well의 밀도로 분주하여 5% CO2가 공급되는 37°C incubator에서 24시간 배양하고, LPS(1 μg/mL)와 농도별로 희석된 시료(0.2, 0.5 mg/mL) 및 양성대조구(0.005, 0.15 mg/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. NO 생성량 측정은 Kim 등(1999)의 방법을 변형하여 진행하였으며, 세포배양액과 Griess reagent를 상온에서 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 nitrite 표준용액의 정량 곡선을 기준으로 NO 생성량을 산출하였다. 세포배양액의 PGE2 생성량은 PGE2 ELISA kit을 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 전염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β 생성량은 각각 Mouse TNF-α Quantikine ELISA kit과 Mouse IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA kit을 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다.

iNOS 및 COX-2 mRNA 수준 발현량 측정

RAW 264.7 세포는 96-well plate에 5×104 cells/well의 밀도로 분주하여 5% CO2가 공급되는 37°C incubator에서 24시간 배양하고, LPS(1 μg/mL)와 농도별로 희석된 시료 및 양성대조구를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 DPBS로 2회 세척하고 세포를 회수하여 RNeasy mini kit(Qiagen)의 지시대로 total RNA를 추출하였으며, GoStriptTM Reverse Transcription system(Promega)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 분석에 사용된 iNOS, COX-2 및 GAPDH primer 염기서열은 Table 1에 제시하였다. Real- time PCR 반응액은 cDNA, Fast SYBRTM Green Master Mix, iNOS 또는 COX-2 유전자의 forward, reverse primer(10 pmol/μL)와 H2O를 첨가하여 StepOnePlus real-time PCR system(Thermo Fisher Scientific Inc.)으로 분석하였다. 반응조건은 two step cycling protocol을 기준으로 95°C에서 20초 동안 predenaturation 후 95°C에서 3초, 60°C에서 30초씩 40 cycles을 반복하였다. Real-time PCR을 통해 증폭된 산물은 GAPDH(house keeping gene)의 발현량으로 보정하여 ΔΔCt method(Rao 등, 2013)를 이용해 정량하였으며, 시료 및 양성대조구 처리에 따른 iNOS 및 COX-2 mRNA 발현량의 비교는 LPS 단독 처리구에 대한 상대 발현 백분율(%)로 비교하였다.

Table 1 . The primer sequence of real-time qPCR.

Target geneGene full nameDirectionPrimer sequence (5′→3′)
iNOSInducible nitric oxide synthaseForward
Reverse
ACATCGACCCGTCCACAGTAT
CAGAGGGGTAGGCTTGTCTC
COX-2Cyclooxygenase-2Forward
Reverse
TGAGCAACTATTCCAAACCAGC
GCACGTAGTCTTCGATCACTATC
GAPDH1)Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenaseForward
Reverse
AGGTCATCCCAGAGCTGAACG
CACCCTGTTGCTGTAGCCGTAT

1)GAPDH is housekeeping gene for RAW 264.7 cell line..



통계분석

각 실험에서 얻은 결과는 SPSS package program(Ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 평균과 표준편차로 나타내었다. 각 시료 사이에서 유의성은 P<0.05 수준에서 one-way ANOVA로 분산 분석한 후에 Duncan’s multiple range test로 비교하였다.

결과 및 고찰

생균수 및 이화학적 특성 변화

제조된 RCE에 효모(Saccharomyces cerevisiae SRCM 102539)를 접종하여 1일 간격으로 생균수 및 이화학적 특성 변화를 분석한 결과는 Table 2와 같다. 발효 기간에 따른 생균수는 발효 0일 차 4.50 log CFU/mL에서 발효 2일 차에 8.07 log CFU/mL로 증가하였으며, 이후 발효가 진행됨에 따라 감소하여 발효 5일 차에는 6.72 log CFU/mL로 확인되었다. 커피 원두 추출물에 함유된 당의 함량은 0.077%(w/v)로, 당을 이용한 효모의 알코올 발효를 위하여 glucose 20%(w/v)로 보당하여 발효하였다. °Brix는 수용성 고형분 함량을 의미하는 단위로, 알코올 발효 중 °Brix 값은 효모의 당 소모 및 에탄올 생성과 높은 상관성을 갖는다(Jang과 Lee, 2020). 발효 기간에 따른 수용성 고형분 함량은 발효 전(발효 0일 차, UFRCE) 21.27°Brix에서 발효가 진행됨에 따라 감소하였으며, 발효 후(발효 5일 차, FRCE) 7.60°Brix로 4일 차와 큰 변화가 없어 최종 발효 완료 시점을 5일로 하였다. 이를 통해 수용성 고형분 함량의 감소에 따라 효모가 당을 소모하여 에탄올을 생성한 것을 간접적으로 확인할 수 있었다. 효모 발효의 이상발효 판단기준으로 사용되는 pH와 총산도의 변화는 발효 기간에 따라 발효 전 4.99에서 발효 후 4.56으로 감소하였고, 총산도는 초산을 기준으로 발효 전 0.21%(w/v)에서 발효 후 0.30%(w/v)로 소폭 증가하는 경향으로 변화가 미미하여 이상발효가 발생하지 않은 것으로 판단된다(Ga 등, 2019).

Table 2 . Live cell counts and physicochemical properties of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract with different fermentation period.

ContentFermentation time (day)
012345
Live cell counts (log CFU/mL)4.50±0.05a1)2)7.65±0.04c8.07±0.04f7.93±0.02e7.74±0.06d6.72±0.02b
Physicochemical propertiesSoluble solid (°Brix)21.27±0.06e19.77±0.15d12.50±0.26c8.50±0.10b7.53±0.06a7.60±0.10a
pH4.99±0.03e4.55±0.03d4.24±0.01a4.40±0.02b4.50±0.02c4.56±0.02d
Total acidity (%)0.21±0.00a0.24±0.01b0.32±0.02c0.29±0.02c0.31±0.01c0.30±0.01c

1)Values are mean±SD (n=3)..

2)Different small letters (a-f) in the same row indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05)..



유기산, 유리당 및 에탄올의 함량 변화

커피 원두 추출물을 이용한 효모 발효물의 발효 기간에 따른 유기산, 유리당 및 에탄올의 함량 변화를 분석한 결과는 Table 3과 같다. 커피 효모 발효물의 유기산으로는 citric acid, succinic acid, acetic acid 등 3종이 검출되었으며, UFRCE의 유기산 함량은 succinic acid(386.30 mg%), acetic acid(177.00 mg%), citric acid(78.13 mg%) 순으로 succinic acid의 함량이 가장 높았다. Succinic acid는 발효 후 373.00 mg%로 유의차가 없었으며, citric acid는 67.41 mg%로 발효 전보다 유의적으로 감소하였고 acetic acid는 190.91 mg%로 유의적으로 증가하였다. 이와 같은 결과는 효모 발효에 의한 acetic acid의 유의적인 증가가 총산도 및 pH 변화에 기인하는 것으로 판단된다.

Table 3 . Organic acid, free sugar and alcohol of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract with different fermentation period.

ContentFermentation time (day)
012345
Organic acid (mg% (w/v))Citric acid78.13±0.39b1)2)82.51±0.16bc91.78±3.28d81.15±0.13bc86.28±0.24cd67.41±11.41a
Succinic acid386.30±2.27c264.24±0.42a319.55±1.56b257.94±5.92a321.09±23.56b373.00±15.45c
Acetic acid177.00±16.63a183.40±0.22ab197.46±0.72c175.84±1.02a195.13±1.02c190.91±0.16bc
Free sugar & alcohol (% w/v)Glucose23.89±0.13d21.25±0.14c8.45±0.01b0.41±0.02aND3)ND
EthanolND1.23±0.00a6.32±0.12b7.39±0.03c8.28±0.04d8.41±0.52d

1)Values are mean±SD (n=3)..

2)Different small letters (a-d) in the same row indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05)..

3)ND is an abbreviation for not detected..



커피 원두 추출물을 이용한 효모 발효물의 주요 유리당은 glucose로 확인되었으며, HPLC를 이용하여 분석한 UFRCE의 glucose 함량은 혼합액 제조 시 보당에 사용된 glucose 20%(w/v)와 멸균으로 용출된 양의 합인 23.89%(w/v)로 분석되었다. 발효가 진행됨에 따라 발효 4일 차부터 glucose는 모두 검출되지 않았으며, 효모가 에탄올 생성에 당을 모두 소비한 것으로 판단되었다. 에탄올은 발효가 진행됨에 따라 증가하였으며, FRCE의 에탄올 함량은 8.41%(w/v)로 분석되었다. 따라서 에탄올 함량이 최대이며 glucose가 효모에 의해 모두 소모된 5일 차 발효물을 최종 발효물로 선택하여 차후 실험에 사용하였다.

세포독성 평가

커피 원두 추출물을 이용한 효모 발효물의 세포독성 평가는 RAW 264.7 세포에 UFRCE 및 FRCE의 동결건조물을 0.1, 0.2, 0.5, 0.6 mg/mL 농도로 처리하여 분석하였다(Fig. 1). 커피 원두 추출물이 70% 함유된 UFRCE 및 이를 5일 동안 효모 발효한 FRCE에 함유된 페놀성 화합물 중 항염증 효능이 알려진 클로로젠산 함량을 HPLC system을 통해 분석했을 때, UFRCE 및 FRCE에 함유된 CGA(chlorogenic acid; 5-CGA↔3-CGA)의 함량이 10 μg/mg 이하로 확인되었다(데이터 미제시). 본 연구에서는 세포독성 및 항염증 실험의 양성대조구로 클로로젠산을 이용하여, UFRCE 및 FRCE 0.5 mg/mL 처리농도에 함유된 클로로젠산 함량인 0.005 mg/mL와 농도 의존성을 확인하고자 0.15 mg/mL의 두 농도를 설정하여 비교・분석하였다. UFRCE, FRCE 및 CGA의 세포독성은 ISO 10993-5(2009)의 방법을 참고하여 시료 비처리구의 생존율을 100%로 하였을 때 30% 이상 감소하는 시료 농도를 확인하였고, 오차 수준을 고려하여 세포 생존율은 80% 이상 유지된 시료 처리농도를 선택하였다. UFRCE의 세포 생존율이 0.6 mg/mL 처리 시 83.04%였고, FRCE의 세포 생존율은 0.1~0.6 mg/mL 처리농도에서 100% 이상의 생존율이 확인되었다. 한편, CGA는 0.005 mg/mL 및 0.15 mg/mL의 처리농도에서 세포독성이 확인되지 않았다. 따라서 추후 실험에서 시료 처리 시 세포 생존율에 독성을 미치지 않는 농도 UFRCE 및 FRCE의 0.2, 0.5 mg/mL CGA의 0.005, 0.15 mg/mL 농도에서 항염증 평가를 진행하였다.

Fig 1. Effect of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract on cell viability in RAW 264.7 cells. The cells were treated with the indicated concentration of UFRCE, FRCE (0.1, 0.2, 0.5, and 0.6 mg/mL), and CGA (0.005, 0.15 mg/mL) for 48 h. UFRCE: unfermented roasted coffee extract, FRCE: fermented roasted coffee extract, CGA: chlorogenic acid (positive control). Results are mean± SD of duplicate data. Error bar indicates the standard deviation of mean, and means with the same letter (a-f) are not significantly different according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

NO 및 PGE2 생성량

NO는 생채 내 신호전달의 매개체로 면역 작용 및 신호전달 등의 다양한 생리활성에 관여하지만, iNOS에 의해 과분비된 NO는 세포 내 염증 및 세포사멸을 유발하는 염증반응의 중요한 지표로 사용된다(Baek 등, 2020). 대식세포에 LPS를 처리하여 자극 시 NO의 함량이 증가하고 처리하는 시료가 NO 생성을 억제하는 정도로 항염증 활성을 평가한다(Moon 등, 2021). RAW 264.7 세포에 LPS(1 μg/mL)를 처리하여 염증반응을 유도하고 UFRCE 및 FRCE를 각각 0.2, 0.5 mg/mL 농도로 처리하였으며, 같은 조건에서 LPS만을 단독 처리하였을 경우와 양성대조구로 CGA를 0.005, 0.150 mg/mL 농도로 처리하여 반응시켰을 때 NO의 생성량을 평가하였다(Fig. 2A). LPS 비처리구는 0.01 μM, 단독처리구에서 31.36 μM의 NO 생성량을 나타냈으며, 비발효구인 UFRCE의 NO 생성량은 농도 의존적으로 감소하여 0.5 mg/mL 처리농도에서 26.00% 감소하였다. Jung 등(2017)은 커피 추출물이 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 염증 인자를 감소시켜 항염증 효능을 나타냈다고 보고하였으며, 본 연구에서도 커피 추출물이 함유된 효모 비발효구에서도 NO 생성량 감소를 나타냈다. FRCE의 NO 생성량은 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 감소하여 0.2 mg/mL와 0.5 mg/mL 처리농도에서 각각 24.48 μM과 18.25 μM로 LPS 단독처리구보다 21.96%와 41.82% 감소하였다. 이와 같은 결과는 다시마 추출물 S. cerevisiae 발효 시 항염증 활성의 증가(Eom 등, 2010) 및 S. cerevisiae로 발효시킨 대추의 항염증 증진 효과(Jung과 Cho, 2011)에서 보고된 것과 같이 본 연구에서 효모 발효 후 NO 생성을 억제하는 효과가 증가하는 결과와 유사하였다. 따라서 비발효구인 UFRCE의 NO 생성량의 감소가 효모 발효를 통해 FRCE구에서 증가하여 항염증 활성이 증가하였다고 판단된다. 양성대조구인 CGA를 0.15 mg/mL로 처리하였을 때, FRCE 0.5 mg/mL 처리 효과와 유사한 효능을 보였으나, FRCE 0.5 mg/mL에 함유된 CGA의 양이 0.005 mg/mL 수준이었던 것을 고려하면 CGA 단독의 효과보다 커피 원두 추출물을 이용한 효모 발효 과정 중 생성된 성분들에 의해 NO 생성량이 감소한 것으로 추정된다. LPS 처리로 발현이 유도된 COX-2 유전자는 급성 염증반응에서 PGE2를 합성하고, PGE는 통증, 발열에 관여하는 염증 매개체로 면역반응과 염증반응에 관여하여 암 발생에 깊이 관여하고 있다(Lee와 Kim, 2015). LPS 처리 후 유도된 염증반응이 억제되었을 경우 PGE2의 생성량이 감소하는 것으로 항염증 효능을 평가하였다. 본 연구에서 PGE2의 생성량은 LPS를 단독 처리하였을 경우 4,647 pg/mL(Fig. 2B)였으며, FRCE, UFRCE 및 CGA 처리구에서 농도 의존적으로 감소하였다. FRCE 0.2 mg/mL 처리구는 UFRCE 0.5 mg/mL 처리구와 PGE2 생성량이 유사하였고, FRCE 0.5 mg/mL 처리 시 PGE2의 생성량은 2,058 pg/mL로 LPS 단독처리구보다 약 2배 이상 감소하는 효과를 보였다. 한편, CGA의 경우 0.15 mg/mL 처리구에서도 PGE2의 농도가 3,942 pg/mL로 감소 효과가 크지 않아 FRCE의 PGE2 생성량 감소 효과는 CGA의 영향보다는 효모 발효에 의한 영향으로 감소한 것으로 판단된다.

Fig 2. Effect of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract on NO (A) and PGE2 (B) levels in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The cells were treated with the indicated concentration of UFRCE, FRCE (0.2, 0.5 mg/mL), and CGA (0.005, 0.15 mg/mL) then with LPS (1 μg/mL) for 24 h. -: not treated, +: treated, UFRCE: unfermented roasted coffee extract, FRCE: fermented roasted coffee extract, CGA: chlorogenic acid (positive control). Results are mean±SD of duplicate data. Error bar indicates the standard deviation of mean, and means with the same letter (a-h) are not significantly different according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

세포배양액의 TNF-α 및 IL-1β 정량

염증반응을 매개하는 전염증성 사이토카인으로 알려진 TNF-α 및 IL-1β는 LPS로 자극된 대식세포에서 생성되어 낮은 농도에서는 체내 항상성 유지 및 세포의 성장에 관여하지만, 염증반응이나 상처 또는 자극으로 대량 생산 시 인체 질환을 악화시킨다(Hong 등, 2021). 따라서 LPS로 염증반응을 유도하고 전염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-1β 생성을 억제하는 것으로 항염증 효과를 평가하였다. 커피 추출물을 이용한 효모 발효물 처리에 따른 세포배양액 내 TNF-α와 IL-1β의 함량은 Fig. 3과 같다. UFRCE와 FRCE의 TNF-α 생성량은 0.5 mg/mL 처리농도에서 각각 23.20 ng/mL와 20.52 ng/mL였으며, 이는 LPS 단독처리구에 비해 각각 32.31%와 40.14% 억제능을 나타냈다(Fig. 3A). 이러한 결과는 효모 및 젖산균을 이용한 발효 대황이 LPS로 유도된 대식세포에서 TNF-α의 생성량을 억제한 것과 유사하게 나타났다(Kim 등, 2011). 한편, UFRCE와 FRCE의 IL-1β 생성량은 0.5 mg/mL 처리농도에서 각각 18.79 ng/mL와 14.32 ng/mL였으며, 이는 LPS 단독처리구에 비해 각각 62.10%와 71.13% 억제능을 나타냈다(Fig. 3B). FRCE, UFRCE 및 CGA는 농도 의존적으로 TNF-α 및 IL-1β 저해 활성을 보였지만, FRCE의 저해 활성이 가장 높은 것으로 확인되었다. 본 연구 결과 UFRCE 및 FRCE는 전염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β 생성을 저해하지만, FRCE가 비발효구인 UFRCE보다 더 높은 저해 활성을 나타내는 것을 바탕으로 효모 발효를 통해 항염증 효과가 증가한 것을 확인할 수 있었다.

Fig 3. Effect of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract on TNF-α (A) and IL-1β (B) levels in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The cells were treated with the indicated concentration of UFRCE, FRCE (0.2, 0.5 mg/mL), and CGA (0.005, 0.15 mg/mL) then with LPS (1 μg/mL) for 24 h. -: not treated, +: treated, UFRCE: unfermented roasted coffee extract, FRCE: fermented roasted coffee extract, CGA: chlorogenic acid (positive control). Results are mean±SD of duplicate data. Error bar indicates the standard deviation of mean, and means with the same letter (a-f) are not significantly different according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

iNOS 및 COX-2 유전자 mRNA 발현량

iNOS는 염증성 자극으로부터 발현되어 RAW 264.7 세포에서 NO를 생성하여 염증과 관련된 질병을 유발하며, COX-2는 염증 부위에서 발열과 통증에 작용하는 PGE2를 생성하고 TNF-α 및 IL-1β와 같은 전염증성 사이토카인을 증가시키는 요인 중 하나로 염증조직이나 암 조직에서 높게 나타난다(Kim 등, 2020). 따라서 이러한 염증 유발 인자의 발현량을 조사하기 위하여 real-time PCR을 통해 mRNA 수준에서 LPS 단독처리구(+) 대비 시료 처리에 따른 iNOS 및 COX-2 발현량을 비교하여 염증반응 저해 활성을 평가하고자 하였다(Fig. 4). iNOS는 LPS 단독처리구(+)의 발현량을 100%로 하였을 때 UFRCE와 FRCE를 0.5 mg/mL 처리농도에서 각각 49.71%와 41.99%로 발현량이 감소하였으며, CGA를 0.15 mg/mL 처리하였을 경우 80.98%로 FRCE의 iNOS 유전자 발현량의 저감 효과가 가장 높았다. COX-2는 LPS 단독처리구(+)의 발현량을 100%로 하였을 때 UFRCE와 FRCE를 0.5 mg/mL 처리농도에서 각각 79.99%와 58.77%로 발현량이 감소하였으며, CGA를 0.15 mg/mL 처리하였을 경우 83.03%로 FRCE의 COX-2 유전자 발현량의 저감 효과가 가장 높았다. 이전 S. cerevisiae로 발효시킨 대추의 항염증 증진 효과(Jung과 Cho, 2011)에서 일반 대추보다 S. cerevisiae를 이용한 발효 대추에서 iNOS 및 COX-2 유전자 발현량 저해 효과가 높은 것과 유사한 결과를 바탕으로 발효과정이 염증반응에 관여하는 유전자 발현을 조절한 것으로 판단되며, 커피 추출물을 이용한 효모 발효물에서 발효 전보다 발효 후 유전자 발현량의 감소로 항염증 효과가 증진됨을 본 연구를 통해 확인할 수 있었다. CGA의 iNOS 및 COX-2의 유전자 발현량을 감소시키는 효과는 0.15 mg/mL까지 농도 의존적으로 확인되었지만 FRCE 0.5 mg/mL에서의 효과보다 낮았다. 이와 같은 결과는 FRCE에 함유된 CGA의 함량이 0.005 mg/mL 이하임을 고려할 때, CGA의 항염증 효과라기보다 커피 추출액의 항염증 성분이 효모 발효를 통해 효능이 증가한 것으로 추정된다.

Fig 4. Effect of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract on iNOS (A) and COX-2 (B) mRNA gene expression ratio in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The cells were treated with the indicated concentration of UFRCE, FRCE (0.2, 0.5 mg/mL), and CGA (0.005, 0.15 mg/mL) then with LPS (1 μg/mL) for 24 h. -: not treated, +: treated, UFRCE: unfermented roasted coffee extract, FRCE: fermented roasted coffee extract, CGA: chlorogenic acid (positive control). iNOS: inducible nitric oxide synthase, COX-2: cyclooxygenase-2, GAPDH: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, LPS: lipopolysaccharides. Results are mean±SD of duplicate data. Error bar indicates the standard deviation of mean, and means with the same letter (a-c) are not significantly different according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

요 약

본 연구는 브라질산 생두에 고초균 발효를 하여 로스팅된 원두를 이용하여 커피 추출액을 제조하였으며, 혼합액(RCE, 70% roasted coffee extract, 20% glucose, 1% yeast extract, 9% distilled water)에 Saccharomyces cerevisiae SRCM102539 균주를 접종하고 정치 배양(30°C, 5일)하여 효모 발효를 진행하였다. 효모 발효물의 발효 기간(5일)에 1일 간격으로 생균수, 이화학적 특성(수용성 고형분 함량, pH, 총산도), 유리당, 유기산 및 에탄올의 함량을 분석하였다. 효모 발효 전(0일 차, UFRCE), 후(5일 차, FRCE)의 생균수, 수용성 고형분 함량, pH 및 총산도의 변화는 4.50 log CFU/mL에서 6.72 log CFU/mL, 21.27°Brix에서 7.60 °Brix, 4.99에서 4.56, 0.21%에서 0.30%로 나타났다. HPLC 분석을 통한 UFRCE의 포도당 함량은 23.89%(w/v)였으나 FRCE에서는 검출되지 않았고, 에탄올 함량은 FRCE에서 8.41%(w/v)로 분석되었다. FRCE의 주요 유기산은 succinic acid(373.00 mg%), acetic acid(190.91 mg%,), citric acid(67.41 mg%) 3종이 검출되었다. Lipopolysaccharide(1 μg/mL)로 염증반응이 유도된 RAW 264.7 세포에 대한 FRCE의 항염증 효과는 NO 및 PGE2 생성량의 감소, 세포 외로 분비된 사이토카인(TNF-α, IL-1β) 생성억제율 및 염증 관련 유전자(iNOS, COX-2) 발현량을 mRNA 수준에서 평가하였다. FRCE 및 UFRCE는 0.5 mg/mL 이하 농도에서 세포 생존율에 영향을 미치지 않았고, 양성대조구로 chlorogenic acid를 사용하여 비교하였다. FRCE의 항염증 효과는 0.5 mg/mL 처리 시 LPS 단독 처리구에 비해 NO, PGE2, TNF-α 및 IL-1β 생성량을 각각 41.82%, 55.71%, 40.14% 및 71.13% 감소시켰고, mRNA 수준에서 iNOS 및 COX-2의 발현량을 각각 58.01% 및 41.23% 억제하였다. 이러한 결과를 바탕으로 커피 추출물을 이용한 효모 발효물이 효모 발효 과정을 통해 항염증 효능이 더 증대됨을 확인할 수 있었다.

감사의 글

본 논문은 농림축산식품부 지역 전략 식품산업 육성사업(과제명: 임산물 기반 동부권 발효식초개발, MIFI 2022-1)의 연구비 지원으로 이루어졌으며, 이에 감사드립니다.

Fig 1.

Fig 1.Effect of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract on cell viability in RAW 264.7 cells. The cells were treated with the indicated concentration of UFRCE, FRCE (0.1, 0.2, 0.5, and 0.6 mg/mL), and CGA (0.005, 0.15 mg/mL) for 48 h. UFRCE: unfermented roasted coffee extract, FRCE: fermented roasted coffee extract, CGA: chlorogenic acid (positive control). Results are mean± SD of duplicate data. Error bar indicates the standard deviation of mean, and means with the same letter (a-f) are not significantly different according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2023; 52: 259-267https://doi.org/10.3746/jkfn.2023.52.3.259

Fig 2.

Fig 2.Effect of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract on NO (A) and PGE2 (B) levels in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The cells were treated with the indicated concentration of UFRCE, FRCE (0.2, 0.5 mg/mL), and CGA (0.005, 0.15 mg/mL) then with LPS (1 μg/mL) for 24 h. -: not treated, +: treated, UFRCE: unfermented roasted coffee extract, FRCE: fermented roasted coffee extract, CGA: chlorogenic acid (positive control). Results are mean±SD of duplicate data. Error bar indicates the standard deviation of mean, and means with the same letter (a-h) are not significantly different according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2023; 52: 259-267https://doi.org/10.3746/jkfn.2023.52.3.259

Fig 3.

Fig 3.Effect of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract on TNF-α (A) and IL-1β (B) levels in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The cells were treated with the indicated concentration of UFRCE, FRCE (0.2, 0.5 mg/mL), and CGA (0.005, 0.15 mg/mL) then with LPS (1 μg/mL) for 24 h. -: not treated, +: treated, UFRCE: unfermented roasted coffee extract, FRCE: fermented roasted coffee extract, CGA: chlorogenic acid (positive control). Results are mean±SD of duplicate data. Error bar indicates the standard deviation of mean, and means with the same letter (a-f) are not significantly different according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2023; 52: 259-267https://doi.org/10.3746/jkfn.2023.52.3.259

Fig 4.

Fig 4.Effect of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract on iNOS (A) and COX-2 (B) mRNA gene expression ratio in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The cells were treated with the indicated concentration of UFRCE, FRCE (0.2, 0.5 mg/mL), and CGA (0.005, 0.15 mg/mL) then with LPS (1 μg/mL) for 24 h. -: not treated, +: treated, UFRCE: unfermented roasted coffee extract, FRCE: fermented roasted coffee extract, CGA: chlorogenic acid (positive control). iNOS: inducible nitric oxide synthase, COX-2: cyclooxygenase-2, GAPDH: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, LPS: lipopolysaccharides. Results are mean±SD of duplicate data. Error bar indicates the standard deviation of mean, and means with the same letter (a-c) are not significantly different according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2023; 52: 259-267https://doi.org/10.3746/jkfn.2023.52.3.259

Table 1 . The primer sequence of real-time qPCR.

Target geneGene full nameDirectionPrimer sequence (5′→3′)
iNOSInducible nitric oxide synthaseForward
Reverse
ACATCGACCCGTCCACAGTAT
CAGAGGGGTAGGCTTGTCTC
COX-2Cyclooxygenase-2Forward
Reverse
TGAGCAACTATTCCAAACCAGC
GCACGTAGTCTTCGATCACTATC
GAPDH1)Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenaseForward
Reverse
AGGTCATCCCAGAGCTGAACG
CACCCTGTTGCTGTAGCCGTAT

1)GAPDH is housekeeping gene for RAW 264.7 cell line..


Table 2 . Live cell counts and physicochemical properties of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract with different fermentation period.

ContentFermentation time (day)
012345
Live cell counts (log CFU/mL)4.50±0.05a1)2)7.65±0.04c8.07±0.04f7.93±0.02e7.74±0.06d6.72±0.02b
Physicochemical propertiesSoluble solid (°Brix)21.27±0.06e19.77±0.15d12.50±0.26c8.50±0.10b7.53±0.06a7.60±0.10a
pH4.99±0.03e4.55±0.03d4.24±0.01a4.40±0.02b4.50±0.02c4.56±0.02d
Total acidity (%)0.21±0.00a0.24±0.01b0.32±0.02c0.29±0.02c0.31±0.01c0.30±0.01c

1)Values are mean±SD (n=3)..

2)Different small letters (a-f) in the same row indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05)..


Table 3 . Organic acid, free sugar and alcohol of fermented product by yeast using roasted coffee bean extract with different fermentation period.

ContentFermentation time (day)
012345
Organic acid (mg% (w/v))Citric acid78.13±0.39b1)2)82.51±0.16bc91.78±3.28d81.15±0.13bc86.28±0.24cd67.41±11.41a
Succinic acid386.30±2.27c264.24±0.42a319.55±1.56b257.94±5.92a321.09±23.56b373.00±15.45c
Acetic acid177.00±16.63a183.40±0.22ab197.46±0.72c175.84±1.02a195.13±1.02c190.91±0.16bc
Free sugar & alcohol (% w/v)Glucose23.89±0.13d21.25±0.14c8.45±0.01b0.41±0.02aND3)ND
EthanolND1.23±0.00a6.32±0.12b7.39±0.03c8.28±0.04d8.41±0.52d

1)Values are mean±SD (n=3)..

2)Different small letters (a-d) in the same row indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05)..

3)ND is an abbreviation for not detected..


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